QUY TRÌNH sản XUẤT VACCINE bại LIỆT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG
=====***=====

1959

BÁO CÁO: MÔN CÔNG NGHỆ SẢN
XUẤT VACCINE
CHỦ ĐỀ: QUY TRÌNH SẢN XUẤT
VACCINE BẠI LIỆT
GVHD: Th.s Văn Hồng Cầm
NHÓM: 10
LỚP:
55SH
Nha Trang 5 / 4 / 2017

ĐẶT VẤN ĐỀ
1


Bệnh bại liệt do virus Polio là một bệnh nhiễm khuẩn cấp tính rất nguy hiểm đối với
trẻ em. Bệnh có thể gây hậu quả liệt cơ vận động và để lại di chứng suốt đời, đặc biệt
nghiêm trọng nếu như gây liệt hô hấp có thể đe dọa tới tính mạng.
Để ngăn chặn bệnh bại liệt, biện pháp dự phòng đặc hiệu là sử dụng vaccine bại liệt. có
2 loại vaccine phòng bệnh bại liệt là vaccine bất hoạt của Salk (IPV) và vaccine uống
giảm độc lực của Sabin (OPV). Vaccine Sabin kích thích cơ thể tạo nên miễn dịch tại
chỗ và miễn dịch dịch thể. Tuy nhiên, dùng vaccine Sabin có nhược điểm là chủng
Sabin được tạo ra từ chủng hoang dại làm giảm độc lực nên trong quá trình phát triển
tự nhiên, virus Sabin có thể gây đột biến và có xu hướng trở về cội nguồn của nó, có
độc lực đặc biệt là typ 3. Vaccine IPV chỉ gây miễn dịch dịch thể, ngăn ngừa virus xâm

nhập vào hệ thần kinh trung ương. Vaccine virus bại liệt này đã bị bất hoạt nên có thể
phối hợp với OPV để phòng bệnh bại liệt. Trong quá trình thanh toán bệnh bại liệt việc
sử dụng vaccine sống giảm độc lực của Sabin là thích hợp và hiệu quả nhất. Đến nay,
Việt Nam mặc dù bệnh bại liệt đã được thanh toán từ năm 2000 song vẫn chưa cần
thiết cho trẻ mới sinh uống phòng bệnh bại liệt vaccine OPV. Dự kiến của Tổ chức Y tế
thế giới đến năm 2005 sẽ thanh toán bệnh bại liệt trên phạm vi toàn cầu, nhưng trên
thực tế chưa thể thực hiện được. Năm 2001, 3 khu vực đã được công nhận thanh toán
bại liệt bao gồm: Trung Mỹ, Tây thái bình dương và châu Âu, … còn các vùng khác
vẫn chưa thanh toán được bệnh bại liệt: Tây Á, Đông Nam Á, Trung Đông và Nam
Phi… Do đó dịch bại liệt có thể lan tràn sang các nước đã thanh toán bệnh bại liệt.
Indonexia là nước đã thanh toán được bệnh bại liệt năm 2000 nhưng do virus bại liệt
hoang dại từ Trung Phi xâm nhập vào đã gây ra những ca bại liệt mới, lan thành vụ
dịch nhỏ, có tới hơn 300 ca mắc bai liệt do virus hoang dại và hơn 40 trường hợp có
liên quan đến virus vaccine. Như vậy để bảo vệ thành quả thanh toán bệnh bại liệt là
vô cùng khó khăn.
A. TỔNG QUAN

I.

Bệnh bại liệt:
1. Nguyên nhân gây bệnh :

Bệnh bại liệt (Poliomyelitis) là một bệnh nhiễm virut cấp tính lây truyền theo
đường tiêu hóa do virut Polio gây lên, có thể lan truyền thành dịch. Bệnh được nhận
biết qua biểu hiện của hội chứng liệt mềm cấp. Virut Polio sau khi vào cơ thể sẽ đến
hạch bạch huyết, tại đây một số ít virut Polio xâm nhập vào hệ thống thần kinh trung
ương gây tổn thương ở các tế bào sừng trước tủy sống và tế bào thần kinh vận động
của vỏ não.
2

2. Biểu hiện lâm sàng:
-

Thể liệt mềm cấp điển hình: Chiếm 1% với các triệu chứng sốt, chán ăn, nhức
đầu, buồn nôn, đau cơ các chi, gáy và lưng, dần dần mất vận động dẫn đến liệt
không đối xứng. Mức độ liệt tối đa là liệt tủy sống, liệt hành tủy dẫn đến suy hô
hấp và tử vong. Liệt ở chi, không hồi phục làm bệnh nhân khó vận động hoặc
mất vận động.

-

Thể viêm màng não vô khuẩn: Sốt, nhức đầu, đau cơ, cứng gáy.

-

Thể nhẹ: Sốt, khó ngủ, nhức đầu, buồn nôn, nôn, táo bón, có thể hồi phục trong
vài ngày.

-

Thể ẩn, không rõ triệu chứng là thể thường gặp, song thể nhẹ có thể chuyển biến
sang nặng.
3. Nguồn truyền nhiễm:

-

Người là nguồn chứa duy nhất, đặc biệt là ở những người nhiễm vi rút bại liệt
thể ẩn, nhất là trẻ em.

-

Nguồn truyền bệnh là bệnh nhân ở các thể lâm sàng và người lành mang vi rút.
Họ đào thải rất nhiều vi rút bại liệt theo phân làm ô nhiễm nguồn nước và thực
phẩm. Vi rút lây truyền sang người chủ yếu qua đường phân – miệng. Vi rút bại
liệt chủ yếu từ phân ô nhiễm vào nguồn nước, thực phẩm rồi vào người qua
đường ruột.
4. Cơ thể cảm thụ:
- Người có sức thụ bệnh cao với virut bại liệt.
- Tuổi hay gặp là trẻ em 2-8 tuổi, đặc biệt là trẻ 2-4 tuổi chiếm tới 60-80%.
- Trẻ sơ sinh và người lớn có thể bị nhưng ít hơn và thường là không điển hình.
- Bệnh thường tản phát, đôi khi thành dịch ở những tập thể nhỏ như nhà trẻ,
trường mẫu giáo, trường phổ thông cơ sở. Gặp ở thành phố nhiều hơn nông thôn
và hay xảy ra vào cuối mùa xuân, đầu mùa hè hàng năm.
- Sau khi bị bệnh bại liệt bệnh nhân thường có miễn dịch bền vững, hiếm khi mắc
lại.
5. Cơ chế bệnh sinh:
-

Từ khi xâm nhập vào cơ thể đến khi vào hệ thần kinh trung ương gây bệnh.
Triệu chứng lâm sàng điển hình (liệt), virut bại liệt phải hai lần vào máu và khu
trú ở một số phủ tạng. Quá trình diễn biến qua 3 giai đoạn:

3


-

 Giai đoạn xâm nhập và tăng sinh ở đường tiêu hoá: Virut vào cơ thể
qua hầu, họng trong 24 giờ đầu đã đến các hạch bạch huyết quanh họng,

vào niêm mạc tiểu tràng, mảng Peyer và tăng sinh ở đó (có thể phân lập
được virut ở nhầy họng và phân trong giai đoạn này).
 Giai đoạn nội tạng: Từ niêm mạc đường tiêu hoá, virut vào máu (lần 1)
sau đó đến các nội tạng (tim, gan, tuỵ, thượng thận, hô hấp...). Tại đây
chúng tiếp tục tăng sinh và gây ra các biểu hiện lâm sàng của thời kỳ
tiền liệt.
 Giai đoạn xâm nhập và tăng sinh ở thần kinh trung ương: virut từ
các nội tạng vào máu (lần 2) và vào hệ thần kinh trung ương, chủ yếu là
các neuron vận động ở sừng trước tuỷ sống.
Đối với thể không điển hình (không có liệt), virut chỉ xâm nhập tới các hạch
bạch huyết, niêm mạc đường tiêu hoá hoặc tới máu mà không vào hệ thần kinh
trung ương, sau đó bị đào thải theo phân ra ngoài.

6. Phân loại của bệnh bại liệt:
-

Bại liệt trong lịch sử đã được chia thành nhiều loại, tùy thuộc chủ yếu vào một
phần của cơ thể bị ảnh hưởng. Phân loại này không cứng nhắc, và chồng chéo
lên nhau có thể xảy ra trong số các hình thức khác nhau.
 Bại liệt cột sống: Đây là hình thức phổ biến nhất của bệnh bại liệt tấn
công các tế bào thần kinh nhất định (tế bào thần kinh vận động) trong tủy
sống và có thể gây tê liệt các cơ bắp kiểm soát hơi thở và trong cánh tay
và chân. Đôi khi các tế bào thần kinh chỉ bị hư hỏng, trong trường hợp
này có thể phục hồi một số mức độ của các chức năng cơ bắp. Nhưng
nếu các tế bào thần kinh bị phá hủy hoàn toàn, tê liệt là không thể đảo
ngược, mặc dù vẫn giữ được cảm giác.
 Bệnh bại liệt hành tủy: Virus ảnh hưởng đến các tế bào thần kinh vận
động trong não, nơi mà các trung tâm của các dây thần kinh sọ nằm. Các
dây thần kinh có liên quan đến khả năng để xem, nghe, ngửi, nếm và
nuốt. Ảnh hưởng đến sự chuyển động của cơ bắp trên khuôn mặt và gửi

tín hiệu đến tim, ruột và phổi. Hành tủy bệnh bại liệt có thể gây trở ngại
với bất kỳ của các chức năng này nhưng đặc biệt có khả năng ảnh hưởng
đến khả năng để thở, nói và nuốt và có thể gây tử vong mà không hỗ trợ
hô hấp.
 Bệnh bại liệt bulbospinal : Một sự kết hợp của cả hai, hành tủy và bệnh
bại liệt cột sống, hình thức này có thể dẫn đến tê liệt chân tay, và cũng có
thể ảnh hưởng đến hơi thở, nuốt và chức năng tim.

4


II.

Virus Bại Liệt

Virut Bại liệt (VRBL) được Landsteiner và Popper phát hiện năm 1909 sau khi tiêm
dịch tủy sống của một trẻ bị chết vì bại liệt và não khỉ.

Hình 1: Virus Polio
1. Phân loại virut:
-

-

Virut Bại liệt có tên là virut Polio. Là thành viên của nhóm virut đường ruột, họ
Picornaviridae. Virut bại liệt có 3 type kháng nguyên khác nhau và không gây
miễn dịch chéo.
 Type I: Điển hình là chủng Brunhilde.
 Type II: Điển hình là chủng Lansing.
 Type III: Điển hình là chủng Leon.

Trong đó type I là nguyên nhân chính của các vụ dịch lớn chiếm 80-90%. Trong
khi đó , type II và III gặp ít hơn tùy theo từng nước và từng vùng địa lí khác
nhau.

2. Hình thái học và vật liệu di truyền:
-

Virut bại liệt (poliovirus) là một virut hình cầu 20 mặt, đường kính 30nm, có
cấu tạo là ARN và protein, không có màng ngoài. Trọng lượng phân tử 6,8 x 10 6
dalton.Tỷ trọng của virut là 1,34 g/ cm 2 trong caseum chloride. Bao bọc xung
quanh lõi RNA sợi đơn dương là một vỏ capsid. Capsid bao gồm 60 tiểu đơn vị
( Capsome) giống hệt nhau xếp đối xứng, mỗi tiểu đơn vị được cấu tạo bởi một trong 4
chuỗi polypeptid là VP1, VP2, VP3, VP4. Bằng phương pháp hiển vi điện tử và
siêu cấu trúc người ta biết chi tiết về cấu trúc của hạt virut hoàn chỉnh.
5


-

Có 3 chủng poliovirus đã được xác định gồm poliovirus tuýp 1 (PV1), tuýp 2
(PV2), và tuýp 3 (PV3)— mỗi tuýp này cần các protein capsid hơi khác nhau.
Cả ba đều là các virus độc hại và có thể tạo ra cùng các triệu chứng bệnh. PV1
là dạng phổ biến nhất, và có mối quan hệ gần gũi nhất liên quan đến bệnh tê liệt.

B. QUY TRÌNH SẢN XUẤT VACINE BẠI LIỆT
-

Sơ đồ tóm tắt quy trình công nghệ sản xuất vaccine bại liệt bất hoạt từ chủng
Sabin nghiên cứu ứng dụng quy trình của Nhật Bản:

Vero đến đời thứ 135
(Ngân hàng tế bào dùng sản xuất - MWCB)
Từ đây lấy để dùng sản xuất

Vero 140 + 1 passage dùng sản xuất

Nuôi trên bình roux
Tăng sinh ở 330C – 33,50C,
Gây nhiễm
Mẻ gặt đơn
Kiểm tra vô trùng
Thử nghiệm nhận dạng
Mẻ hỗn hợp vaccine
Kiểm tra vô trùng
Kiểm tra hiệu giá
Thử nghiệm nhận dạng
Kiểm tra an toàn đặc hiệu
Cô đặc và tinh chế vaccine
6


Kiểm tra hiệu giá
Kiểm tra độ tinh khiết của virus
Bất hoạt (Formalin tỷ lệ 1:4000) 37°C/12 ngày
Kiểm tra độ bất hoạt
Vaccine đơn giá sau bất hoạt
Kiểm tra vô trùng
Định lượng D- antigen
Kiểm tra nhận dạng
Sản phẩm vaccine thành phẩm

 GIẢI THÍCH QUY TRÌNH SẢN XUẤT:
1. Chủng virut Sabin gồm 3 tuyp do Viện bại liệt Nhật Bản cung cấp:
-

Chủng bại liệt tuyp 1: WHO-IS-90C, chủng có nguồn gốc từ chủng Sabin ( SO),
được cấy truyền 2 lần( SO+2).
Chủng bại liệt tuyp 2: IIS-90A, Chủng có nguồn gốc từ chủng Sabin (SO), được
cấy chuyền 2 lần (SO+2).
Chủng bại liệt tuyp 3:IIS-79A
Chủng có nguồn gốc từ chủng Sabin (SO), được cấy truyền 3 lần (SO). Và 2 lần
chọn lọc bằng cách tạo đám hoại tử (SO+3+2 plaque).

2. Chuẩn bị tế bào:
-

Tế bào thường trực vero: Do Trung tâm Kiểm soát bệnh tật và dự phòng
(CDC),Atlanta, Mỹ cung cấp từ đời thức 135
- Tế bào thường trực( vero)
 Tế bào gốc được nhận từ CDC, đời 135. Từ đó cấy truyền đến đời 140 là
ngân hàng tế bào dùng sản xuất (MWCB). Nuôi trên chai thủy tinh 1,2 lít
(250cm2 chai Roux)
 Tế bào vero từ nito lỏng lấy ra, nuôi và cấy chuyền. Dùng trysin-versen tách,
dùng môi trường M199 có 5-10% huyết thanh bào thai bê. Một chai thường
cấy chuyền thành 4-5 chai. Sau 3-4 ngày chọn chai kín 1 lớp gây nhiễm với
chủng Sabin như trên tế bào thận khỉ. Quá trình nuôi ở 370C, sử dụng môi
trường nuôi là DMEM hoặc M199 và môi trường gây nhiễm là M199.
3. Gây nhiễm virut:

7

-

Hỗn dịch: được pha trong môi trường LH3E ( hoặc EAGLE glucose cao,
M199 glucose cao), theo liều gây nhiễm 1 CCID 50/300 tế bào.Mỗi bình roux
có 34 triệu tế bào. Thời gian hấp phụ 1 giờ ở 33 độ C. Sau đó cho thêm đủ
100ml môi trường duy trì.

-

Ủ ở 330C- 33,50C theo dõi sự hủy hoại của tế bào trên các môi trường đó
thông thường khoảng  72 giờ. Gặt các vaccine thô, để riêng rẽ, giữ ở -20 0C.
Lọc vô trùng qua hệ thống lọc 3µm/0,45µm/0,22µm. Kiểm tra hiệu giá bằng
phương pháp vi lượng. So Sánh hiệu giá thu được từ các môi trường duy trì
khác nhau. Lựa chọn loại môi trường nào cho hiệu giá cao thì sử dụng để sản
xuất.

4. Quá trình cô đặc và tinh chế kháng nguyên:
-

Quá trình cố đặc và tinh chế kháng nguyên gồm các bước sau:
Sinh khối virus
Ly tâm 4000 vòng/ phút x 60 phút/ 60c
Lọc qua hệ thống màng lọc 3/ 0,45 / 0,22
Sau khi lọc 5-6h thì lấy mẫu để kiểm tra hiệu giá
Lọc qua hệ thống siêu lọc Vivaflow
Kiểm tra hiệu giá của virus
Cô đặc bằng siêu ly tâm
Lọc 0,22
Kiểm tra hiệu giá của virus

Tinh chế qua cột DEAE Sepharose CL-6B
Kiểm tra độ tinh khiết của virus
Sản phẩm sau tinh chế: kháng nguyên bại liệt đã tinh sạch
a. Quá trình cô đặc và tinh chế kháng nguyên bằng siêu lọc:

8


-

-

-

-

Vacxin thu được từ phương pháp sản xuất vacxin bại liệt sống trên nuôi tĩnh
hoặc động được lấy từ -20oC ra đông tan lần 3, ly tâm 4000 vòng/phút/1 giờ/6 oC
để bỏ cặn tế bào. Lấy nước nổi, lọc qua 3μm/0,45μm/0,22μm (lấy mẫu kiểm tra
hiệu giá trước khi siêu lọc).
Tiếp tục dùng hệ thống siêu lọc để cô đặc vacxin. Hệ thống lọc tiếp tuyến
Vivaflow 200cm2 của Trung tâm hiện nay là loại dùng cho quy mô phòng thí
nghiệm ( thể tích 100ml đến 5 lít). Kênh tuần hoàn “Flip-Flow” mỏng tạo dòng
chảy với vận tốc tiếp tuyến lớn mà chỉ cần công suất bơm nhỏ và không cần giá
lọc chịu áp lực. mặt ngoài trong suốt, để dàng kiểm soát thể tích giữ và tình
trạng của màng. Một module có diện tích 200cm 2 có thể có 5000ml thành 100ml
trong vòng 6-7 giờ (lấy mẫu kiểm tra hiệu giá)
Chất liệu học là polyethersulfone, cỡ lọc 100.000 M WCO. Độ tương thích hóa
học pH 1-14. Thể tích giữ của module là 1,5ml, thể tích tuần hoàn tối thiểu
<10ml; thể tích không thu hồi được <0,5ml.

Điều kiện hoạt động: dòng bơm 200 đến 400ml/phút; áp suất tối đa 3bar; nhiệt
độ tối đa 60oC. Quá trình siêu lọc đã loại bỏ một số thành phần muối vô cơ, các
axit amin phân tử nhỏ, các mảnh nhỏ của xác tế bào, nước có trọng lượng phân
tử nhỏ hơn 100.000 dalton vừa làm cho hỗn dịch đặc lại đồng thời loại bỏ một
số protein tạp.

Hình 2: Hệ thống lọc tiếp tuyến Vivaflow
b. Quá trình cô đặc và tinh chế kháng nguyên bằng siêu ly tâm.
-

Sau cô đặc tiếp tục tinh chế bằng siêu ly tâm. Quá trình siêu ly tâm gồm 2
bước:

9


 Bước 1: Ly tâm 36.000 vòng/phút/60C/4 giờ. Lấy cặn, bỏ nước nổi ( kiểm tra
nước nổi để xác định có bị mất khi siêu ly tâm không). Trong nước nổi có
một số protein có trọng lượng phân tử < 100.000dalton đã bị loại. Cặn được
hòa vào dung dịch PB 0,1M để lắc nhẹ qua đêm ở 4 oC. Sử dụng siêu âm phá
tế bào và làm tách rời các hạt virut.
 Bước 2: Ly tâm 15.000 vòng/phút/6oC/30 phút. Lấy nước nổi, bỏ cặn ( kiểm
tra cặn xem múc độ mất virut). Trong cặn bỏ đi có một số protein tạp có
trọng lượn phân tử > trọng lượng phân tử hạt virut đã bị loại. Lấy mẫu kiểm
tra hiệu giá sau siêu ly tâm.

Hình 3: Máy siêu ly tâm
5. Tinh chế
-

- Mẫu sau siêu ly tâm được lọc vô trùng trước khi chạy tinh sạch.
Dùng cột DEAE Sephrose CL-6B: đệm 0,1 M PB để tinh khiết vaccine.
Tùy lượng mẫu và loại cột để tính Gel sử dụng
Rửa Gel
Nhồi cột Gel
Chạy mẫu
Lấy các phân đoạn thu được
Chạy điện di để chọn các phân đoạn sạch
Kiểm tra các hiệu giá các phân đoạn sạch.

-

-

Đổi đệm trong quá trình siêu lọc: đệm 0,1M PB, không có các cation Ca 2+,
Mg2+, PO42- và đỏ phenol: Mẫu sau siêu lọc được tiếp xúc siêu lọc bằng cách
thêm liên tục đệm bằng lượng hỗn dịch được cô đặc cuối cùng cho tới khi mẫu
cuối cùng trắng hoàn toàn.
Thời gian bằng thời gian siêu lọc.

10


Hình 4: Cột tinh chế
6. Kiểm tra vaccine tinh chế qua các giai đoạn:
-

Sử dụng phương pháp điện di để xem sự xuất hiện protein đặc hiệu của
Polio ở các phân đoạn 35,5 kDa; 30,0 kDa; 26,4 kDa và 7,4 kDa so với
thang chuẩn.

 Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide
-

Điện di trên gel polyacrylamide thường được sử dụng để tách riêng các băng
protein có trọng lượng phân tử khác nhau. Trong phương pháp này, gel được đổ
giữa hai bản thủy tinh mỏng theo phương thẳng đứng.
 Công thức đổ gel:
(1) Công thức đổ gel cô:
 H2 O
 Tris-HCl 0,5M Ph=8,8
 Glycerol 50%
 SDS 10%
 APS 10%
 Bis-acrylamide
 TEMED

2,46 ml
1,25 ml
2 ml
50 µl
50 µl
4,2 ml
8 µl

(2) Công thức đổ gel tách:





H2 O
Tris-HCl 0,5M Ph=6,8
SDS 10%
APS 10%

1,7 ml
312,5 µl
12,5 µl
25 µl
11


 Bis-acrylamide
425 µl
 TEMED
2 µl
 Xừ lý mẫu: 50 µl mẫu + 12 µl dịch đệm phá (SDS sample 5X). Sau đó ủ 100 0C
trong thời gian 10 phút
 Mẫu sau khi đã được xử lý, tra vào trong bản gel 15 µl/l giếng.
 Quá trình chạy điện di được tiến hành dưới hiệu điện thế 300V, cường đọ dòng
điện cố định là 40 Ma, thời gian 45 phút.
-

Sau khi chạy xong, bản gel được gỡ ra và nhuộm trong dung dịch Comasie
Brilliant blue, lắc khoảng 2 giờ trên máy lắc, sau đó đổ dịch nhuộm, thay bằng
dịch tẩy, lắc trong 30
7. Bất hoạt kháng nguyên bằng formandehyt:
Trung tâm áp dụng quy trình công nghệ của Nhật Bản nên dùng
Formaldehyt để bất hoạt. Thời gian bất hoạt 12 ngày. Kiểm tra bại liệt sống

còn tồn dư để xác định nồng độ Formaldehyt phù hợp để bất hoạt và thời
gian bất hoạt thích hợp. Bất hoạt dùng formalin theo tỷ lệ 1:4000. Sử dụng
chai Nalgen bề mặt trong có tráng silicon để tránh hấp thụ lên bề mặt chai.
Nút kỹ cho vào túi kín không cho nước ngấm vào, ngâm trong bể điều nhiệt
370C trong 12 ngày. Kiểm tra bại liệt sống để xác định ngày thứ bao nhiêu
thì bị bất hoạt hoàn toàn. Lúc đầu ngày nào cũng lấy mẫu, sau khi nắm được
khoảng thời gian hỗn hợp dịch bị bất hoạt hoàn toàn thì sẽ lấy mẫu vào ngày
thứ 3, sau đó lấy vào ngày thứ 9 và ngày thứ 12. Lọc mẫu đang bất hoạt vào
ngày thứ 6. Trung hòa formalin khi bất hoạt kết thúc (lấy mẫu). Vaccine
được tinh chế và bất hoạt sẽ được kiểm tra và xác định kháng nguyên D.
8. Pha vaccin:
Pha vaccine theo tỷ lệ đơn vị kháng nguyên D. Với vaccine Việt Nam
đang nghiên cứu theo quy trình của Nhật Bản pha theo 2 công thức :
 Công thức thứ nhất ( công thức của Nhật Bản trước đây ):

-

Typ 1 : 30 đơn vị kháng nguyên D (Du).

-

Typ 2 :30 đơn vị kháng nguyên D (Du).

-

Typ 3 : 50 đơn vị kháng nguyên D (Du).

 Công thức thứ 2 ( công thức của Nhật Bản hiện nay ):
12

-

Typ 1 : 3 đơn vị kháng nguyên D.

-

Typ2 : 100 đơn vị khán nguyên D.

-

Typ 3 : 100 đơn vị khán nguyên D.

-

Dung dịch pha loãng là M199 không có ion Ca 2+, Mg2+, PO42- không chỉ thị màu
chất bảo quản là 2-phenoxyethanol 0,5% (0,005 ml/ml)
Lọc vô trùng và đóng lọ. pH= 7,1 7,3. Bảo quản từ 4-80C

-

9. Kiểm tra chất lượng của vaccine:
 Xác định hiệu giá vaccin đơn typ qua các giai đoạn sản xuất:
- Dùng phương pháp chuẩn độ vi lượng được xác định bằng liều ngây hủy
hoại 50% tế bào (CCID50). Tế bào được sử dụng là tế bào Hep-2C.
- Pha loãng mẫu hỗn hợp virus bậc 10 từ 10-1-10-9 bằng môi trường MEM 2%
huyết thanh bê.
- Sử dụng pipet man loại 200 nhỏ 100 vào mỗi giếng của giếng 96 giếng.
- Nhỏ từ từ nồng độ 10-5 -10-9 vào mỗi ống nồng độ nhỏ 8 giếng.
- Tế bào Hep2C được nuôi kín một lớp trên bình roux trong môi trường vô

trùng MEM 10% huyết thanh bê, tách tế bào bằng dung dịch trypsin +
EDATA ( 0,125% + 0,05) rửa bằng Hanks (-), đếm tế bào bằng buông đếm,
pha hỗn hợp tế bào có mật độ 100.000 TB/ ml.
- Nhỏ 100 tế bào đã được chuẩn bị ở trên đĩa 96 giếng, dùng băng dính dán
kín. Để đĩa vào tủ ấm 360C.
- Đọc kết quả vào ngày thứ 5 và ngày thứ 7
- Đối với giếng chứng tế bào thay 100 hỗ hợp dịch virus bằng 100l MEM 2%
huyết thanh bê.
-

Tính kết quả bằng phương pháp Karber:
Lg CCID50 = L – d(S- 0,5)
L: Lg của độ pha loãng thấp thấp nhất sử dụng trong phòng thí nghiệm.
D: sự chênh lệch lg của các bậc pha loãng.
S: tổng số phần trăm giếng hủy hoại trong thử nghiệm.

13


 Xác định type của vaccin đơn type bằng thử nghiệm nhận dạng:
-

Sử dụng phương pháp trung hòa ( trung hòa virus bằng kháng thể đặc
hiệu).

-

Dựa vào hiệu giá của vaccine ta pha loãng vaccine thành hỗn hợp virus
có hiệu giá CCID50 bằng MEM 2% huyết thanh bê.

-

Làm tương tự như đối chứng typ 1, 2, 3. Dùng pipet man loại 200l nhỏ
50 vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng, mỗi mẫu nhỏ 12 giếng. Kháng huyết
thanh đặc hiệu cho mỗi typ 1,2,3 được pha từ KHT 20 đơn vị/0,1 ml
thành KTH 0,5 đơn vị/ml. Dùng MEM 2% huyết thanh bê bào thai để
pha.

-

Sau khi chuẩn bị KHT 0,5 đơn vị/ml, dùng pipet man loại 200l đỏ vào
mỗi giếng 50l như vậy mỗi mẫu có 12 giếng thì 4 giếng nhỏ KHT typ 1;
4 giếng nhỏ KHT typ 2 và 4 giếng nhỏ typ 3.

-

Đối với mỗi giếng chứng tế bào ta thay bằng môi trường MEM 2%
huyết thanh bào thai bê. Dùng băng dính dán chặt đĩa, để đĩa vào tủ ấm ở
360C trong 3 giờ. Tế bào He-2C nuôi bằng MEM 10% huyết thanh bê
bào thai được tách như trên, đếm và pha hỗn hợp dịch 100.000 tb/ml.

-

Sau 3 giờ ủ ở 360 C, nhỏ 100l hỗn hợp dịch tế bào vào mỗi giếng rồi tiếp
tục ủ ở 360C và đọc kết quả vào ngày thứ 7.

-

Đọc kết quả:
 Giếng chứng typ1:

4 giếng có KHT typ 1 tế bào không bị hủy hoại
4 giếng có KHT typ 2 tế bào bị hủy hoại
4 giếng có KHT typ 3 tế bào bị hủy hoại
 Giếng chứng typ 2:
4 giếng có KHT typ 2 tế bào không bị hủy hoại
4 giếng có KHT typ 1 tế bào bị hủy hoại
4 giếng có KHT typ 3 tế bào bị hủy hoại
14


 Giếng chứng typ 3:
4 giếng có KHT typ 3 tế bào không bị hủy hoại
4 giếng có KHT typ 1 tế bào bị hủy hoại
4 giếng có KHT typ 2 tế bào bị hủy hoại
 Giếng mẫu cần xác định typ nếu là typ 1 khi ( giống hình ảnh đối
chứng virus typ1)
4 giếng có KHT typ 1 tế bào không bị hủy hoại.
4 giếng có KHT typ 2 tế bào bị hủy hoại
4 giếng có KHT typ 3 tế bào bị hủy hoại
 Giếng mẫu cần xác định typ nếu là typ 2 khi ( giống hình ảnh đối
chứng virus typ 2)
4 giếng có KHT typ 2 tế bào không bị hủy hoại
4 giếng có KHT typ 3 tế bào bị hủy hoại
4 giếng có KHT typ 1 tế bào bị hủy hoại
 Giếng mẫu cần xác định typ nếu là typ 3 khi ( giống hình ảnh đối
chứng virus typ 3)
4 giếng có KHT typ 3 tế bào không bị hủy hoại
4 giếng có KHT typ 1 tế bào bị hủy hoại
4 giếng có KHT typ 2 tế bào bị hủy hoại.

-

 Kiểm tra an toàn đặc hiệu của vaccine đơn typ trên súc vật thử
nghiệm.
Tiêm trên 4 loại động vật nhỏ để kiểm tra virut ngoại lai
 Chuột ổ giống Swiss ( trong 24 giờ sau sinh) ít nhất 10 con. Mỗi con
tiêm 0,1ml vào phúc mạc và 0,01ml vào não. Theo dõi trong 2 tuần
sau tiêm.
 Chuột trưởng thành giống Swiss trọng lượng từ 15-20g/con ít nhất 20
con. Mỗi con tiêm 0,5 ml vào phúc mạc và 0,03 ml vào não. Theo dõi
trong 3 tuần sau tiêm.
15


 Thỏ trọng lượng 1,5- 2,5kg ít nhất 10 con. Mỗi con tiêm 1 ml trong
da tiêm 5-7 nốt tiêm và 9 ml vào dưới da đùi. Theo dõi trong 3 tuần
sau tiềm.
 Chuột lang trong lượng 200-300g ít nhất 5 con. Mỗi con tiêm 5 ml
vào phúc mạc. Theo dõi trong 42 ngày sau tiêm.
- Mỗi loại súc vật đều có để động vật đối chứng không tiêm mẫu.
- Theo dõi súc vật, đọc kết quả vào ngày cuối của thời gian theo dõi: ít nhất
80% súc vật thử nghiệm khỏe mạnh, tăng trọng bình thường. Nếu chết trong
24 giờ đầu không tính vào kết quả.Sau 24 giờ cần xác định nguyên nhân
chết, nếu chết liên quan đến an toàn vaccine thì không được đưa vào kết quả.
 Xác định quy trình bất hoạt của virut bại liệt.
- Phát hiện virut bại liệt sống tồn dư trong quá trình bất hoạt (thử nghiệm an
toàn)
- Hỗn hợp dịch được lọc bằng màng lọc 0,45µm và 0,22µm.
- Pha dung dịch formalin 37% theo tỉ lệ 1:20

- Cứ 100ml cho 0,5 ml formalin 37% ( 1: 20)
- Cho vào bể điều nhiệt 370C có recorder theo dõi nhiệt độ trong suốt thời gian
bất hoạt. Thời gian bất hoạt là 12 ngày.
- Lấy mẫu sau bất hoạt 3,7,9 và 12 ngày.
- Phương pháp thẩm tách loại formaldehyde
- Áp dụng phương pháp thẩm tích của Viện sức khỏe Quốc gia Nhật Bản bằng
cách sử dụng typ li tâm cùng với đệm PB 0,1M loại bỏ formaldehyde ra khỏi
các mẫu vaccine đơn giá bất hoạt sau 3,7,9,12 ngày
- Phương pháp kiểm tra virut sống tồn dư trên tế bào
- Sử dụng 0,1ml mẫu vaccine đơn giá bất hoạt sau 3,7,9,12 ngày đã thẩm tách
cho 1 giếng tế bào vero trên phiến 96 giếng, ủ 360C.
- Đọc kết quả vào ngày thứ 3,5,7
- Mẫu vacxin còn virut sống thì tế bào bị hủy hoại (CPE), hiệu giá sẽ được
tính theo công thức Kaber.
- Mẫu vacxin không còn virut sống thì tế bào bình thường không bị hủy hoại
trong suốt thời gian theo dõi.
- Theo yêu cầu của WHO virut bị bất hoạt hoàn toàn sẽ không có sự hủy hoại
của tế bào trong suốt thời gian quan sát sau nhiễm.
 Kiểm tra protein đặc hiệu của virut bại liệt.
- Kiểm tra protein đặc hiệu của virut trong vacxin nghiên cứu:
 Kiểm tra bằng phương pháp Western- Blot
Phương pháp Western- Blot để thử khả năng phản ứng của kháng thể
trong huyết thanh bệnh nhân, kháng thể chuẩn, vacxin hoặc protein thực
hiện theo ( Towwbin et at.1979). Hoặc protein được điện di trên gel
polyacrylamide 12,5% sau đó được chuyển sang màng polyvinyl-idene16


difluoride (PVDF), nhuộm màng tạm thời bằng dung dịch Ponceau 0,1% để
đánh dấu vị trí của các băng Maker chuẩn. Phủ màng bằng sữa 5% trong
dung dịch đệm Tris-HCL Buffed Solution (TBS 1X). Dùng màng này để

phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng Polio trong huyết thanh bệnh nhân ( đối
với các bệnh nhân đã được uống hoặc tiêm vacxin polio). Huyết thanh bệnh
nhân được pha loãng 500 lần trong dung dịch đệm TBS 1X chưa 5% sữa rồi
cho phản ứng với các băng có trên màng. Kháng thể kháng polio được phản
ứng kháng thể kháng IgG của người có gắn enzym Horseradish peroxidase
(HRP). Phản ứng hiện màu được thực hiện với cơ chất 4- choloronatphol.
 Phương pháp tính đơn vị kháng nguyên D
-

Viện bại liệt Tokyo Nhật Bản đã nhiều năm nghiên cứu đã có hệ số hiệu giá
của từng typ để chuyển đổi và dùng hiện nay là Du:
Typ 1: 7,191 lgCCID50/ ml – 1 Du
Typ2 : 6,881 lg CCID 50/ ml -1 Du
Typ3: 6,662 lg CCID50/ ml – 1Du
(Du : Antigen – D unit )

 Kiểm tra tính vô trùng của vaccin đơn giá và vaccin thành phẩm.
-

Sử dụng phương pháp nuôi cấy ống trực tiếp trên 2 loại môi trường :
thioglycolat và soybean casein, môi trường đó 20ml/ống thử. Mỗi bộ ống
thử gồm 1 ống thioglycolate và 1 ống soybean casein.

-

Bộ mẫu thử 5 bộ ống thử, 1 ml mẫu/ống thử

-

Mỗi lô môi trường: thioglycolate và soybean casein trước khi dùng để thử vô

trùng đểu phải được kiểm tra độ nhạy và tính ứng chế.

-

Sau thử nghiệm môi trường thioglycolate được ủ 33-35 0C, môi trường
soybean casein được ủ 20-250C

-

Thời gia theo dõi: ít nhất là 2 tuần, nếu nghi ngờ thì phải cấy truyền.

-

Mẫu thử nghiệm đạt vô trùng trong 2 tuần mẫu chị thị của môi trường
thioglycolate không mất và đông thời môi trường soybean casein trong suốt
không bị vẩn đục.
17


-

Xác định hàm lượng fomandehyde/ liều của vaccine bán thành phẩm và
thành phẩm.
Đo cường độ màu của 3,5 diacetyl – 1,4 dihydroluthidin ở bước sóng 415
nm. Phức chất này được tạo thành do fomandehyde phản ứng với
acetylaceton với sự có mặt của muối amonia trong môi trường axit nhẹ.
Dựng đường chuẩn và dựa theo đường chuẩn để tính hàm lượng
formaldehyde.

-

Kiểm tra đáp ứng miễn dịch trên khỉ
Phương pháp thực hiện:
 Bước 1: Chọn khỉ khoảng 1 năm tuổi có trọng lượng 1 kg đến 1,5 kg,
khỏe mạnh, huyết thanh khỉ tại nồng độ ¼ âm tính với 3 typ bại liệt.
 Bước 2: Pha mẫu vaccine và tiêm khỉ: Mẫu vaccine IPV s pha theo
công thức của Nhật Bản trước đây và mẫu được pha 3 nồng độ:
A,B,C. Nồng độ A là nồng độ đặc, nồng độ B là nồng độ pha loãng
1/3 bằng môi trường M199 và nồng độ C là nồng độ pha loãng
vaccine 1/9 bằng môi trường M199. Mỗi nồng độ tiêm 5 khỉ và mỗi
con khỉ được dùng 3 liều vaccine cách nhau 21 ngày. Mẫu vaccine
IPVs pha theo công thức Nhật Bản hiện nay chỉ sử dụng 1 nồng độ
đặc A và sử dụng 5 khỉ, mỗi khỉ tiêm 3 liều, cách nhau 21 ngày.
 Bước 3: Thu mẫu máu và tách huyết thanh máu lấy 4 thời điểm như
nhau M0 máu được lấy trước khi tiêm liều thứ nhất; M1 máu được
lấy ngay trước khi tiêm liều thứ 2 và sau khi tiêm liều thứ 1 là 21
ngày; M2 máu được lấy trước khi tiêm liều thứ 3 và sau khi tiêm liều
thứ 2 sau 21 ngày; M3 máu được lấy sau khi tiêm liều thứ 3 là 21
ngày. Lấy 3 ml máu khỉ vào ống facol vô trùng, ly tâm 3000
vòng/phút/ 10 phút, tách huyết thanh, bảo quản -20 0C cho đến khi sử
dụng.
 Bước 4: Xác định hiệu giá kháng thể trung hòa bằng phương pháp
trung hòa vi lượng.

-

Huyết thanh được pha loãng ¼ bằng dung dịch nước muối sinh lý 0,9% và bất
hoạt tại 560C trong 30 phút, sau đó được pha loãng bậc 2 thành 7 nồng độ.

-

Pha loãng vaccine bại liệt typ 1,2,3 thành 100 CCID50/ 0,1 ml.
18


-

Sử dụng 0,05 ml huyết thanh khỉ mỗi nồng độ với 0,05ml vaccine 100
CCID50/0,1 ml tại nhiệt độ 370C trong 180 phút.

-

Cho thêm 0,1 ml hỗn hợp dịch tế bào He-2C với nồng độ 100.000 đến 150.000
tế bào/ml.

-

Ủ đĩa ở 370C trong 7 ngày. Đọc kết quả ngày thứ 4,5,7.

-

Đọc kết quả: Hiệu giá kháng thể là nồng độ pha loãng nhất , là tại đó tế bào bình
thường không bị hủy hoại.

-

Nhận định kết quả : khỉ có đáp ứng miễn dịch khi huyết thanh có hiệu giá kháng
thể và khỉ có đáp ứng miễn dịch bảo vệ khi hiệu giá kháng thể 1/16 tại thời
điểm sau mũi tiêm thứ 3 (M3)

C. So sánh ưu, nhược điểm của vaccine OPV và vaccine IPV:
IPV
Ưu
điểm

OPV

 Bảo quản dễ dàng, thuận lợi hơn
OPV.
 Không có khả năng quay trở lại độc
lực như ở virus Sống OPV
 Có thể dùng an toàn cho người bị
suy giảm hoặc ức chế miễn dịch.

19

 Giá thành rẻ.
 Vaccin tạo ra được
đáp ứng miễn dịch
dịch thể và đáp
ứng
miễn dịch
qua trung gian tế
bào.


Nhược
điểm

 Hiệu giá ban đầu thấp, cần

phải tiêm nhắc lại.

 Có khả năng gây
ra
bệnh bại liệt ở 1 trường

 Giá thành cao.
 Sinh đáp ứng miễn dịch

hợp trên 1-2 triệu liều
vaccine.

dịch thể.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
 />
%20vaccin%20b%E1%BA%A1i%20li%E1%BB%87t.pdf?token=AWxPCWRokBcokODMqzZieQO7EQ3StUG4nZrpjYmm9M0PmBoShKHlqf0rWtW0oQ3QDxhOwH1oUCMdDhZiFEOyRGp8HDT68wwVTMIBTIKPAXKgcs8EKeDrz8zVTd36jP42v6P7vqod39fhtA
qraibrM
 /> /> />
20


21