Định danh vùng gene 16s DNa chủng vi khuẩn lam có khả năng gây độc tố ở hồ dầu tiếng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ĐỊNH DANH VÙNG GENE 16S DNA CHỦNG VI KHUẨN
LAM CÓ KHẢ NĂNG GÂY ĐỘC TỐ Ở HỒ DẦU TIẾNG

Ngành:

Công Nghệ Sinh Học

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

Giảng viên hướng dẫn : TS. Hoàng Quốc Khánh

HVCH. Ngô Đức Duy
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1311101028

: Khưu Văn Quang
Lớp: 13DSH06

TP. Hồ Chí Minh, 2017


LỜI CAM ĐOAN
Người thực hiện đề tài xin cam đoan những nội dung trong đồ án tốt nghiệp
này là do người thực hiện đề tài làm tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM, dưới sự
hướng dẫn của TS.Hoàng Quốc Khánh và HVCH.Ngô Đức Duy. Các số liệu và kết
quả nghiên cứu trong đồ án này là trung thực, không sao chép từ bất cứ bài báo cáo

nào đã được công bố trước đây. Nội dung luận văn có tham khảo và sử dụng các tài
liệu, thông tin được đăng tải trên các tác phẩm, tạp chí khoa học và các trang web
theo danh mục tài liệu của đồ án. Nếu sai người thực hiện đề tài xin chịu hoàn toàn
trách nhiệm và mọi kỷ luật của khoa và nhà trường đề ra.

Sinh viên thực hiện

Khưu Văn Quang


LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian làm đồ án tốt nghiệp ở Viện Sinh Học Nhiệt Đới TPHCM,
được sự hướng dẫn tận tình của các Thầy Cô, các anh chị và các bạn, em đã hoàn
thành tốt bài báo cáo này. Em xin chân thành cảm ơn đến:
Thầy Ngô Đức Duy phòng vi sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới
TPHCM. đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực
hiện đồ án tốt nghiệp này.
Thầy Hoàng Quốc Khánh và thầy Nguyễn Hoàng Dũng phòng vi sinh ứng
dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới TPHCM đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho em làm đồ
án tốt nghiệp tại đây, nhiệt tình hướng dẫn và hỗ trợ để em thực hiện tốt đồ án tốt
nghiệp.
Chị Lê Quỳnh Loan đã luôn bên cạnh giúp đỡ, chia sẽ kiến thức, kinh nghiệm
và tất cả các anh chị, các bạn đang nghiên cứu ở phòng Vi Sinh, Viện Sinh Học
Nhiệt Đới TP.HCM đã nhiệt tình giúp đỡ và chỉ dạy cho em nhiều điều trong suốt
quá trình nghiên cứu.
Toàn thể các Thầy Cô khoa CNSH-TP-MT trường Đại Học Công Nghệ Thành
Phố Hồ Chí Minh là những người đã tận tâm dạy dỗ và truyền đạt kiến thức cho em
được ngày hôm nay.
Các bạn trong lớp 13SH06 đã quan tâm, giúp đỡ và chia sẽ mọi thứ với tôi
trong suốt quãng đường thời sinh viên.

Cuối cùng, con xin cảm ơn Ba Mẹ đã nuôi nấng, chăm sóc, dạy dỗ và cho con
ăn học thành người có ích cho xã hội.
Sinh Viên Thực Hiện

Khưu Văn Quang


1 MỤC LỤC
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC HÌNH ẢNH
DANH MỤC CÁC BẢNG
MỞ ĐẦU……………………………………………………...…………………1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................................5
1.1. Tổng quan về tin sinh học ................................................................................5
1.1.1. Sự ra đời của tin sinh học .............................................................................5
1.1.2. Khái niệm Tin sinh học.................................................................................5
1.1.3. Vai trò và xu hướng phát triển của tin sinh học............................................6
1.1.4. Cây phát sinh loài .........................................................................................6
1.1.5. Công cụ và cách tiến hành ............................................................................7
1.1.6. Đánh giá kết quả ...........................................................................................8
1.2. Tổng quan về định danh sinh học phân tử .......................................................8
1.2.1. Các phương pháp ly trích và thu nhận DNA tổng số ...................................9
1.2.2. Phương pháp PCR và ứng dụng..................................................................11
1.3. Tổng quan về vi khuẩn lam ............................................................................13
1.3.1. Giới thiệu về vi khuẩn lam .........................................................................13
1.3.2. Hình thái và cấu trúc tế bào ........................................................................14
1.3.3. Phân loại vi khuẩn lam ...............................................................................15
1.3.4. Hiện tượng nở hoa của vi khuẩn lam ..........................................................16
1.3.5. Độc tố microcystins ....................................................................................17

1.3.6. Hai hợp chất gây mùi hôi geosmin và 2-methylisoborneol ........................20
1.3.7. Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn lam và độc tố của vi khuẩn lam ...........21
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................25
2.1. Thời gian và địa điểm.....................................................................................25

i


2.2. Vật liệu, thiết bị và hóa chất...........................................................................25
2.2.1. Dụng cụ và thiết bị ......................................................................................25
2.2.2. Nguồn mẫu ..................................................................................................25
2.2.3. Hóa chất ......................................................................................................25
2.3. Phương pháp thu mẫu ....................................................................................27
2.3.1. Phương pháp phân lập ................................................................................27
2.3.2. Phương pháp nuôi tăng sinh khối và thu sinh khối vi khuẩn lam...............27
2.3.3. Định danh chủng vi khuẩn lam bằng sinh học phân tử...............................28
Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR: ..............................................32
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ......................................................35
3.1. Kết quả ly trích và thu nhận DNA bộ gene của hình thái vi khuẩn lam ........35
3.2. Kết quả đo nồng độ DNA bộ gene sau khi ly trích và thu nhận ....................36
3.3. Kết quả khuếch đại đoạn gen 16S DNA bằng kỹ thuật PCR .........................37
3.3.1. PCR với cặp mồi CYA371F, 373R ............................................................37
3.3.2. PCR với cặp mồi CYA-F, CYA-R .............................................................38
3.4. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn lam .....................39
3.5. Kết quả giải trình tự vùng gen 16S DNA của các chủng vi khuẩn lam .........39
3.5.1. Mẫu 2 (chủng Microsystis) .........................................................................39
3.5.2. Mẫu 10 (chủng Anabaena) ..........................................................................40
3.5.3. Mẫu 29 (chủng Cylindropermopsis) ...........................................................40
3.5.4. Mẫu 31(chủng plantothrix) .........................................................................41
3.6. Kết quả so sánh trình tự gen trên ngân hàng NCBI và xây dựng cây phát sinh

loài .........................................................................................................................41
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .........................................................44
4.1. Kết luận ..........................................................................................................44
4.2. Đề nghị ...........................................................................................................45
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................46
PHỤ LỤC

ii


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DNA

Deoxyribo Nucleic Axit

RNA

Ribonucleic Acid

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

NCBI

National Center for Biotechnology Information

PCR

Polymerase chain reaction

UV

Ultraviolet

TAE

Tris acetate ethylenediaminetetraacetic acid

MCs

Microcystins

MIB

Methylisoborneol

ITB

Institute of Tropical Biology

CTAB

Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide

Cs

Cộng sự

SDS

Sodium dodecyl sulfate

Bp

Base pairs

UV

Ultra violet

iii


DANH MỤC HÌNH ẢNH
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Vi khuẩn lam nở hoa ở Hồ Dầu Tiếng ........................................... ..........17
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của 3 loại độc tố microcystins thường gặp ................... 18
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của Geosmin và 2-methylisoborneol MIB .................... 21
Hình 2.1. Sinh khối vi khuẩn lam ............................................................................. 28
Hình 2.2. Quy trình phản ứng PCR ........................................................................... 31
Hình 3.1. Kết quả thu nhận DNA bộ gene của vi khuẩn lam gồm 4 chủng trên gel
agarose 1,5 ................................................................................................................. 35
Hình 3.2. Kết quả điện di trên gel agarose của các sản phẩm PCR với cặp mồi
CYA371F, 373R ....................................................................................................... 37
Hình 3.3. Kết quả điện di trên gel agarose của các sản phẩm PCR với cặp mồi
CYA-F, CYA-R ........................................................................................................ 38
Hình 3.4. Kết quả điện di trên gel agarose của các chủng vi khuẩn lam sau khi tinh
sạch ............................................................................................................................ 39
Hình 3.5. Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gene 16S DNA của các

chủng Microcystis, Anabaena, Plantothrix, Cylindropermopsis với vi khuẩn lam
trên ngân hàng NCBI……………...………………………………………….……42

iv


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Chu trình nhiệt của cặp mồi CYA371F và 373R ...................................32
Bảng 2.2.Chu trình nhiệt của cặp mồi CYA-F và CYA-R .....................................33
Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ DNA bộ gene sau thu nhận ....................................36

v


Đồ Án Tốt Nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Việc gia tăng dân số, phát triển các ngành công nghiệp, nông nghiệp đã và đang
làm gia tăng nguồn dinh dưỡng (chủ yếu là ni tơ và phốt pho) đáng kể vào các thủy
vực. Ô nhiễm dinh dưỡng diễn ra ngày càng quan trọng tại các thủy vực như sông,
hồ, đầm nuôi trồng thủy sản...luôn đi kèm với hiện tượng nở hoa nước mà thực chất
là sự phát triển mạnh mẽ của quần xã thực vật nổi trong đó chủ yếu do vi khuẩn lam
(VKL).
Vi khuẩn lam là một trong những sinh vật xuất hiện đầu tiên trên trái đất cách
đây hàng tỷ năm và tồn tại cho đến ngày nay. Cùng với vi tảo, vi khuẩn lam đóng
một vai trò quan trọng trong sinh thái thủy vực như cung cấp nguồn năng lượng sơ
cấp cho các chuỗi thức ăn trong thủy vực, đồng thời giải phóng một lượng oxy vào
không khí thông qua quá trình quang hợp. Tuy nhiên, bên cạnh những đóng góp tích

cực thì hiện tượng tăng trưởng bùng phát hay còn gọi là nở hoa của vi khuẩn lam
gây nhiều ảnh hưởng xấu lên chất lượng môi trường nước, tài nguyên thủy sản và
cân bằng hệ sinh thái. Trong đó một số loài nhóm vi sinh này có khả năng sản sinh
độc tố. Ở nước ta, vi khuẩn lam sinh độc và độc tố của chúng thường xuất hiện
trong các thủy vực nước ngọt. Chúng có khả năng sản sinh ra các loại độc tố như
neurotoxin (độc tố thần kinh) và hepatotoxin (độc tố gan). Độc tố nhóm vi sinh này
tác động nguy hiểm tới sinh vật thủy sinh và sức khỏe con người. Do đó Tổ chức Y
tế thế giới (WHO) quy định nồng độ giới hạn trong nước uống không được vượt
quá là 1 µg/L. Ngoài ra một số chủng này còn sinh ra các hợp chất gây mùi hôi
trong nước.
Ở Việt Nam ô nhiễm môi trường nước mà chủ yếu là ô nhiễm chất hữu cơ, chất
dinh dưỡng, kéo theo bùng nổ thực vật nổi, trong đó có tảo độc đang diễn ra rất phổ
biến do tác động của các hoạt động con người trong các lưu vực sông, hồ....Tại các
hồ như hồ Ba Bể, hồ Tây, hồ hoàn Kiếm, hồ Dầu Tiếng, hồ Trị An, hồ Núi Cốc...

1


Đồ Án Tốt Nghiệp

đều quan sát thấy sự hiện diện của vi khuẩn lam độc chủ yếu là các loài thuộc
Microcystis, Anabaena, Plantothrix, Cylindropermopsis...
Hồ Dầu Tiếng là hồ chứa nước nhân tạo có chức năng như ngăn lũ, cấp nước sinh
hoạt, tưới tiêu, rửa mặn, cải thiện chất lượng nước và nuôi trồng thủy sản. Là nguồn
cung cấp trực tiếp hoặc gián tiếp nước sinh hoạt và tưới tiêu cho hàng triệu dân ở
Tây Ninh, Bình Dương và TP.Hồ Chí Minh.
Hiện nay, các nghiên cứu đã cho thấy thành phần vi khuẩn lam tại hồ Dầu Tiếng
rất đa dạng và hiện tượng nở hoa tại đây đang là một vấn đề quan trọng và mang
tính cấp bách. Vi khuẩn lam nở hoa và độc tố của chúng sinh ra sẽ gây ảnh hưởng
rất lớn tới sinh vật thủy sinh, động vật sống xung quanh hồ và sức khỏe con người.

Phần lớn các nghiên cứu ở nước ta hiện nay chỉ tập trung vào đánh giá sự đa dạng
của nhóm vi sinh này tại các thủy vực, đặc điểm hình thái cũng như chỉ nghiên cứu
độc tính trên thực vật hoặc động vật thủy sinh. Chưa có nhiều nghiên cứu tập trung
về định danh vùng gene 16S DNA chủng vi khuẩn lam. Và đây là đề tài khảo sát về
sự hiện diện của các chủng vi khuẩn lam có khả năng gây độc tố ở hồ Dầu Tiếng
hiện nay.
2. Mục đích nghiên cứu
Mục đích của đề tài là định danh vùng gene 16S DNA chủng vi khuẩn lam có
khả năng gây độc tố ở Hồ Dầu Tiếng.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
Phân lập một số loài vi khuẩn lam tại hồ Dầu Tiếng.
Định danh vi khuẩn lam tới chi dựa theo hình thái học và sinh học phân tử.
Khảo sát sự hiện diện có mặt chủ yếu của loài vi khuẩn lam ở hồ Dầu Tiếng.
4. Phƣơng pháp nghiên cứu
Phương pháp thu mẫu, phân lập mẫu và nuôi tăng sinh khối, thu sinh khối vi
khuẩn lam.

2


Đồ Án Tốt Nghiệp

Phương pháp tách chiết và thu nhận bộ gene DNA (theo phương pháp CTAB).
Phương pháp PCR dựa trên đoạn mồi 16S DNA.
Sử dụng phương pháp sinh học phân tử giải trình tự đoạn gene 16S DNA loài vi
khuẩn lam.
Đề tài có sử dụng các phần mềm như ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120,
seaview 4.32.0.0.
Ngân hàng gene />Các tài liệu phục vụ nghiên cứu được tham khảo từ các nghiên cứu, các bài báo
khoa học, các luận văn khoa học được sưu tầm trên internet.

5. Các kết quả đạt đƣợc
Sau quá trình nghiên cứu đề tài đã tách chiết được 4 chủng vi khuẩn lam dựa vào
các bước định danh sinh học phân tử, dựa trên các nghiên cứu trong và ngoài nước
thì cả 4 loài vi khuẩn lam này đều có khả năng gây bệnh nguy hiểm trên thực vật,
động vật nguyên sinh và cả con người. Và đã chọn lọc được đoạn mồi thích hợp để
định danh 4 chủng vi khuẩn lam là Microcystis, Anabaena, Plantothrix,
Cylindropermopsis.
6. Kết cấu đề tài
Đề tài gồm 4 chương
Chương 1: Tổng quan
Trình bày về sự ra đời, khái niệm, vai trò và xu hướng phát triển của tin sinh học
để dựng cây phát sinh loài. Giới thiệu về kỹ thuật PCR và các ứng dụng chủ yếu của
PCR để sử dụng trong định danh vi khuẩn lam. Giới thiệu tổng quan về vi khuẩn
lam, hình thái, cấu trúc tế bào, phân loại và hiện tượng nở hoa của loài vi khuẩn
lam, tình hình nghiên cứu vi khuẩn lam trong và ngoài nước.
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3


Đồ Án Tốt Nghiệp

Trình bày thời gian và địa điểm thu mẫu, những hóa chất, máy móc thiết bị phục
vụ nghiên cứu và toàn bộ các quy trình, thao tác thực hiện các phương pháp
nghiên cứu như thu mẫu, phân lập, nuôi tăng sinh khối, thu sinh khối, định danh,
phương pháp ly trích DNA, đo OD, điện di, tinh sạch DNA và giải trình tự gene.
Chương 3: Kết quả và biện luận
Trình bày và biện luận những kết quả chi tiết của toàn bộ quá trình thực hiện
nghiên cứu.
Chương 4: Kết luận và đề nghị

Tổng kết lại những kết quả nghiên cứu đã đạt được và đưa ra những đề nghị liên
quan nhằm hoàn thiện đề tài.

4


Đồ Án Tốt Nghiệp

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về tin sinh học
1.1.1. Sự ra đời của tin sinh học
Do sự xuất hiện của các thông tin về cấu trúc, chức năng và trình tự protein,
DNA từ đó dẫn tới nhu cầu quản lý, so sánh và dự đoán cấu trúc và chức năng của
chúng.
Ngoài ra, sự phát triển của các ngành khoa học khác như là công nghệ thông tin,
máy tính đã hình thành môn khoa học mới đó là Tin sinh học (bioinformatics).
1.1.2. Khái niệm Tin sinh học
Tin sinh học (bioinformatics) là môn học về cách sử dụng máy tính để giải
quyết những vấn đề của khoa học sự sống, chủ yếu là vấn đề cơ sở dữ liệu phong
phú của bộ gen, trình tự protein…
Tin sinh học (bioinformatics) là một lĩnh vực khoa học sử dụng các công nghệ
của các ngành toán học ứng dụng, tin học, thống kê, khoa học máy tính, trí tuệ nhân
tạo, hóa học và hóa sinh (biochemistry) để giải quyết các vấn đề sinh học. Một thuật
ngữ thường được dùng thay thế cho tin sinh học là sinh học tính
toán (computational biology). Tuy nhiên, tin sinh học thiên về việc phát triển các
giải thuật, lý thuyết và các kĩ thuật thống kê và tính toán để giải quyết các bài toán
bắt nguồn từ nhu cầu quản lý và phân tích dữ liệu sinh học. Trong khi đó, sinh học
tính toán thiên về kiểm định các giả thuyết (hypothesis) được đặt ra của một vấn đề
trong sinh học nhờ máy tính thực nghiệm trên dữ liệu mô phỏng, với mục đích
chính là phát hiện và nâng cao tri thức về sinh học (ví dụ: dự đoán mối quan hệ

tương tác giữa các protein, dự đoán cấu trúc bậc 2 phân tử của protein, v.v.).
Ngoài ra nó còn giải quyết những vấn đề về kỹ thuật như mô hình cấu trúc ba
chiều của phân tử và các hệ thống sinh học.

5


Đồ Án Tốt Nghiệp

Các ngành của Tin sinh học bao gồm: tin sinh học genome, tin sinh học protein,
tin sinh học tiến hóa, tin sinh học nông nghiệp, tin sinh học y học, phát triển các
công cụ và cơ sở nền.
Thuật ngữ bioinformatics có thể định nghĩa một cách ngắn gọn là sự kết hợp giữa
công nghệ sinh học và công nghệ thông tin với mục tiêu giúp hiểu biết và khám phá
những nguyên lý trong sinh học (National Center for Biotechnology Information).
1.1.3. Vai trò và xu hướng phát triển của tin sinh học
1.1.3.1. Vai trò của Tin sinh học
- Tập hợp, lưu trữ, sắp xếp, truy xuất cơ sở dữ liệu.
- Hỗ trợ cho việc tìm kiếm, phân tích, xử lý và dự đoán các kết quả nghiên cứu.
- Hỗ trợ trong các nghiêm cứu về cấu trúc không gian phân tử.
- Hỗ trợ trong nghiên cứu đa dạng và tiến hóa của sinh vật
1.1.3.2. Xu hướng phát triển của Tin sinh học
Những lĩnh vực của Tin sinh học đang được tập trung nghiên cứu:
+ Quản lí cơ sở dữ liệu.
+ Phân tích, biên dịch dữ liệu.
+ Phát triển các thuật toán.
+ Các cấu trúc cơ sở dữ liệu.
+ Thiết kế các giao diện và hiển thị.
1.1.4. Cây phát sinh loài
Cây phát sinh loài là (tiếng Anh: phylogenic tree) miêu tả lịch sử tiến hóa của

một nhóm các loài (species) với những đặc tính khác nhau nhưng cùng có mối quan
hệ họ hàng với nhau và cùng hình thành từ một tổ tiên chung trong quá khứ. Có
nhiều hướng nghiên cứu khác nhau để chứng minh đặc điểm phát sinh chủng loại
này. Trước hết, người ta có thể so sánh trình tự các đoạn DNA (thuộc sinh học phân

6


Đồ Án Tốt Nghiệp

tử hay hệ gene học (genomics); hoặc so sánh các hóa thạch (fossil) hoặc các di chỉ
(record) của cổ sinh vật học (thuộc khảo cổ học - paleontology).
Các nhà sinh học tổ chức và phân tích các mối quan hệ tiến hóa thông qua các
phương pháp khác nhau, bao gồm phát sinh chủng loài học (phylogenetics), ngoại
hình học (phenetics) và miêu tả theo nhánh học (cladistics). Các sự kiện chính xảy
ra trong quá trình tiến hóa của sự sống được xây dựng thành biểu đồ thời gian của
tiến hóa (evolutionary timeline) dựa trên các hiểu biết hiện nay của khoa học.
Chúng ta có thể tạo cây phát sinh loài từ các trình tự đoạn gene có được so sánh
với những trình tự trong ngân hàng dữ liệu gene bằng cách sử dụng chương trình
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) cho kết quả những loài nào có số
trình tự tương đồng cao nhất với chủng đang khảo sát. Sau đó sử dụng các phần
mềm tin sinh học như ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview 4.32.0.0 để
xây dựng cây phát sinh loài, tập hợp những thông tin có liên quan đến tiến hóa.
Một cây phát sinh loài gồm các thành phần sau:
- Một nhánh (một đơn vị huyết thống) là một nhóm vi sinh vật hay nhóm gene
bắt nguồn từ tổ tiên chung. Trong phân tích cây phát sinh loài, chiều dài
nhánh phát sinh diễn tả mức độ phân hóa giữa các loài.
- Nút giao điểm của các nhánh.
- Hệ thống phát sinh loài dựa trên các phân tử mà đặc biệt là trình tự gene được
sử dụng phổ biến trong định danh phân loại.

1.1.5. Công cụ và cách tiến hành
Seaview 4 là một phần mềm (giao diện Windows) dùng để so sánh tương đồng
nhiều trình tự DNA và protein. Nó mô tả kết quả bằng hệ thống các màu sắc và làm
nổi bậc những nét đặc trưng trong những đoạn tương đồng.
MEGA5 5.0.1.120 là một phần mềm dùng để vẽ cây phát sinh loài. Phần mềm
này thực hiện đọc kết quả so sánh từ những tập tin dạng PHYLIP hoặc MEGA của
chương trình seaview 4.32.0.0.

7


Đồ Án Tốt Nghiệp

Mở chương trình seaview 4 trên desktop.
 Lựa chọn chức năng Multiple Alignment Mode.
 Từ menu File, chọn Load Sequences. Trong hộp Open, chọn các tập tin chứa
các trình tự cần so sánh. Nhấn nút Open.
 Chọn Do Complete Alignment trong Menu Alignment. Xác định vị trí cho
tập tin xuất rồi nhấn nút Align.
1.1.6. Đánh giá kết quả
Kết quả xuất hiện các trình tự so sánh tương đồng. Các vị trí trình tự giống nhau
sẽ được thể hiện cùng một màu sắc (mỗi loại nucleotide một màu) và được đánh dấu
*. Vị trí giống nhau.
Ta có thể nhận xét mức độ tương đồng của các trình tự thông qua sự tương
đồng về màu sắc và dạng đồ thị bên dưới.
Để tạo cây phát sinh loài dạng PHYLIP chúng ta cần thực hiện các bước:
+ Trong menu Trees, chọn chức năng Draw N-J Trees.
+ Trong hộp DRAW TREE ta chọn nút OK để lưu tập tin dạng *.ph
+ Mở chương trình Tree View trên desktop. Từ menu File, chọn Open.
+ Trong hộp Open chọn tập tin *.ph và File of type là All tree files.

Một trang kết quả cây phát sinh loài bằng cách nhấn vào các nút Phylogram,
Rectanglar Cladogram, Cladogram, Radial tree.
1.2. Tổng quan về định danh sinh học phân tử
Có nhiều cách để định danh sinh học phân tử như: PCR, southern blotting,
northern blotting, western blotting, immunohistochemistry, microarray… nhưng
phương pháp chủ yếu định danh đối với loài vi khuẩn lam là PCR.

8


Đồ Án Tốt Nghiệp

1.2.1. Các phương pháp ly trích và thu nhận DNA tổng số
1.2.1.1. Nguyên tắc và yêu cầu
Ly trích và thu nhận DNA tổng số là nhu cầu cần thiết bởi các thực nghiệm
của công nghệ gene đều tiến hành với DNA (hay RNA).
Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận
một lượng nucleic acid đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
DNA là phân tử có kích thước lớn, do đó mối quan tâm hàng đầu của các kĩ thuật
tách chiết nucleic acid là thu nhận được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối
đa không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gãy do nghiền, lắc mạnh)
hay hóa học (phân tử bị thủy giải bởi các enzyme nội bào giải phóng ra môi trường
khi tế bào bị phá vỡ).
Các nucleic acid cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế
hoạt động của các enzyme nội bào (desoxyribonuclease - DNase và ribonuclease RNase).
1.2.1.2. Một số phương pháp ly trích và thu nhận DNA tổng số
Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng, mức độ đa dạng của vi sinh vật thay đổi
theo từng môi trường. Những vi sinh vật tìm thấy thường là những tế bào đơn hoặc
là những quần thể vi sinh vật. Sự phức tạp tính di truyền của cộng đồng vi sinh vật
được đánh giá thông qua việc xác định bởi sự tổ hợp DNA, chưa kể sự có mặt của

những bộ gene hiếm và những vi sinh vật chưa được khám phá.
Sự ra đời của kỹ thuật dựa trên phân tử acid nucleic đã dẫn tới sự thay đổi lớn
trong việc phát hiện vi sinh vật trong môi trường tự nhiên. Với những kỹ thuật này
đã phát hiện một số thay đổi lớn về việc tìm hiểu cấu trúc và sự vận động của các vi
sinh vật cộng đồng trong môi trường tự nhiên. Ly trích DNA thường bị ảnh hưởng
bởi các yếu tố như không ly trích hoàn toàn tế bào vi khuẩn hoặc DNA bị hư hỏng.
Rõ ràng việc áp dụng một quy trình ly trích DNA phù hợp với các mẫu cụ thể là rất
cần thiết cho việc đánh giá đúng đa dạng vi sinh vật. Phương pháp ly trích DNA cần

9


Đồ Án Tốt Nghiệp

phải đơn giản, nhanh chóng và hiệu quả. Chất lượng DNA là rất quan trọng ảnh
hưởng đến hiệu quả khuếch đại DNA về sau. Do đó ly trích DNA được coi như một
bước phân tích độc lập trong phân tích đa dạng vi sinh vật. Việc ly trích thường kết
hợp với các chất tẩy, các tác nhân vật lý, các dung môi và enzyme để thu được
nucleic acid (Haruta và cộng sự (2002); Tomoyukihori và cộng sự (2006).
Do đó, việc tách chiết DNA vi sinh vật để phục vụ cho nghiên cứu và ứng
dụng là rất cần thiết. Quá trình ly trích DNA cần phải đảm bảo về độ tinh khiết và
độ nguyên vẹn về cấu trúc để có thể thực hiện được các khâu nghiên cứu tiếp theo.
Có rất nhiều phương pháp ly trích DNA tổng số, tùy thuộc vào mục đích
nghiên cứu mà lựa chọn các phương pháp ly trích DNA tổng số cho phù hợp.
Những phương pháp ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên
thường được sử dụng:
-

Phương pháp Sodium Dodecyl Sulfate (SDS): Được xem là phương pháp
thích hợp nhất, đơn giản và nhanh chóng thu nhận DNA của vi sinh vật

với hiệu quả cao, phục vụ cho quá trình PCR tiếp theo. J Zhou và cộng sự
(1996) đã sử dụng phương pháp ly trích với nồng độ muối cao (1,5 M
NaCl) và ủ mẫu trong 2 - 3 giờ trong sự hiện diện của SDS, hexadecyl
trimethyl ammonium bromide, và proteinase K.

-

Phương pháp Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide (CTAB): Đây là
phương pháp dùng trong chiết xuất acid nucleic có hiệu quả cao, CTAB
là một dung môi có khả năng hòa tan cao acid nucleic, vì vậy mà CTAB
được dùng với vai trò là chất chính trong tách chiết acid nucleic. Ly trích
DNA của vi khuẩn sử dụng phương pháp CTAB được mô tả bởi Ausubel
và cộng sự (1992). Ly trích DNA cần phải có cả hai yếu tố là hiệu suất và
độ tinh khiết. Trong nghiên cứu của Jara C. (2008), phương pháp ly trích
tốt nhất là phương pháp CTAB.

-

Phương pháp Benzyl chloride: Đây là phương pháp ly trích DNA tương
đối hiệu quả. Nó có thể phá vỡ thành tế bào vi khuẩn kết hợp với việc gia

10


Đồ Án Tốt Nghiệp

nhiệt đến 650C. Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, nhanh chóng
và mang lại kết quả khá cao. Phương pháp này được Zhu và cộng sự
(1993) sử dụng để ly trích DNA của cả thực vật, nấm và vi khuẩn.
-

Phương pháp đóng băng và tan băng: Là phương pháp do Ellingsue và
cộng sự (2002). Phương pháp này sử dụng kỹ thuật đóng băng và tan
băng ở - 65oC trong ba chu kỳ nhằm ức chế phá vỡ vách tế bào, giải
phóng các thành phần bên trong tế bào, tạo điều kiện thuận lợi cho việc ly
trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên.

1.2.2. Phương pháp PCR và ứng dụng
1.2.2.1. Kỹ thuật PCR
Phương pháp PCR do Kary Mullis và cộng sự phát minh (1985) tạo nên bước
tiến nhảy vọt trong sinh học phân tử và kỹ thuật gene. Đây là một kĩ thuật sinh hóa
và sinh học phân tử hiện đại cho sự khuếch đại nhanh đoạn DNA thông qua con
đường sao chép của enzyme bên ngoài sinh vật sống. Hiện nay, PCR đã trở thành
một kĩ thuật thông dụng được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm sinh học
và y dược để phát hiện các bệnh di truyền, tạo ra các đột biến gene, chuẩn đoán
bệnh truyền nhiễm, tạo dòng gene.
PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên
mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao
của khuôn này thành hàng triệu bản sao mà không qua tạo dòng, nhờ hoạt động của
enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này. Kỹ thuật
PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm
giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy
được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho
các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel. Như vậy, để khuếch đại một
trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA,
đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên
biệt, các mồi này gồm một mồi xuôi và một mồi ngược.

11

Đồ Án Tốt Nghiệp

Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch
của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này
được kéo dài để hình thành mạch mới.
Mồi xuôi (forward primer): Bắt cặp với mạch khuôn DNA và kéo dài theo
chiều phiên mã.
Mồi ngược (reverse primer): Bắt cặp mạch mã của DNA và kéo dài ngược
chiều phiên mã.
Thành phần cơ bản của phản ứng PCR gồm có: DNA mẫu, mồi xuôi, mồi
ngược, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR buffer, MgCl2, Taq polymerase.
1.2.2.2. Các ứng dụng chủ yếu của PCR
Có thể nói sinh học hiện đại nói chung, sinh học phân tử nói riêng không thể
thiếu ứng dụng của kỹ thuật PCR.
Trong kỹ thuật gene, PCR sử dụng thường xuyên trong tách dòng gene, xây
dựng ngân hàng gene, lập bản đồ gene và giải trình tự bộ gene.
PCR được dùng trong chẩn đoán bệnh do virus, vi khuẩn và các đột biến di
truyền.
PCR được dùng để tạo đột biến invitro, trong công nghệ protein tái tổ hợp, tạo
ra nhiều protein có tính năng vượt trội mà trong tự nhiên chưa hề có.
Nghiên cứu nguồn gốc phát sinh loài và phân loại phân tử.
1.2.2.3. Đoạn gene 16S rDNA
Gene rDNA (ribosomal DNA) là nhóm gene mã hóa RNA của ribosome, đóng
vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quan hệ phát. rDNA được quan tâm nghiên
cứu vì nó là một gene có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hóa cho bất kì protein
nào. Các bản sao của gene nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới
quá trình tiến hóa. Hơn nữa, ribosome hầu như tồn tại ở mọi sinh vật và có cùng
nguồn gốc tiến hóa. Phần lớn phân tử rDNA tương đối bảo tồn nên được xem là cơ

12


Đồ Án Tốt Nghiệp

sở để tìm ra sự tương đồng và các khác biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau. Các
primer thiết kế dựa trên những oligonucleotide có tính bảo tồn cao được sử dụng
cho tất cả sinh vật nhằm khuếch đại các vùng tương đương dùng trong so sánh.
Ngoài ra, nhiều primer và probe cũng được thiết kế dựa trên các vùng trình tự
không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh sinh vật.
Gene rDNA được quan tâm nghiên cứu từ rất sớm. Bằng cách tách gene,
khuếch đại và đọc trình tự, người ta đã đọc được rất nhiều trình tự rDNA. Đặc biệt
phương pháp đọc trình tự trực tiếp sản phẩm PCR ra đời tạo rất nhiều thuận lợi cho
các nghiên cứu liên quan đến rDNA.
Để phát hiện sự hiện diện DNA của vi khuẩn lam, cặp mồi CYA (Urbach và
cộng sự, 1992; Hotto và cộng sự, 2005; Pham và cộng sự, 2015) đã được sử dụng để
khuếch đại một đoạn 1200 bp của đoạn gene 16S rDNA phổ biến cho hầu hết các
chủng vi khuẩn lam. Ngoài ra một số loài vi khuẩn lam thuộc chi Planktothricoides
và Microcystis được phát hiện dựa trên cặp mồi CYA371F và 373R (Savichtcheva
và cộng sự, 2011) khuếch đại một đoạn gen khoảng 1500 bp.
1.3. Tổng quan về vi khuẩn lam
1.3.1. Giới thiệu về vi khuẩn lam
Vi khuẩn lam (danh pháp khoa học: Cyanobacteria) hay Tảo Lam (blue – green
algae) là một trong những nhóm sinh vật có sức sống mãnh liệt, có khả năng thích
ứng với hầu hết các điều kiện môi trường nên chúng có mặt ở mọi nơi: trên mặt đất,
ao hồ, sông suối và ven biển (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2007). Vi khuẩn lam
đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái thủy vực, là sinh vật sơ cấp trong môi
trường nước. Cùng với vi tảo, vi khuẩn lam cung cấp năng lượng sơ cấp cho những
sinh vật ở bậc cao hơn trong tháp năng lượng (Đào Thanh Sơn và cộng sự, 2013).
Khi chết chúng tạo ra nhiều bùn bã hữu cơ, là nguồn thức ăn quan trọng cho nhiều

loài sinh sinh vật. Nhiều loài vi khuẩn lam làm tăng độ phì nhiêu của đất bằng khả
năng cố định đạm (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2007). Ngoài ra, một số loài vi
khuẩn lam còn dùng để làm sạch các nguồn nước thải (Dương Thị Hoàng Oanh và

13


Đồ Án Tốt Nghiệp

cộng sự, 2011). Trong điều kiện môi trường thuận lợi ở các thủy vực giàu dinh
dưỡng, vi khuẩn lam dễ dàng phát triển mạnh và gây hiện tượng “nước nở hoa” gây
độc cho môi trường và ảnh hưởng bất lợi đến các sinh vật khác (Đặng Ngọc Thanh
và cộng sự, 2002; Dương Thị Hoàng Oanh và cộng sự, 2011).
Bằng việc tạo ra oxy ở dạng khí như là một phụ phẩm của quá trình quang hợp,
các vi khuẩn lam được người ta cho là đã chuyển đổi khí quyển mang tính khử ở
thời kỳ đầu thành khí quyển mang tính ôxi hóa, một công việc đã thay đổi mãnh
liệt thành phần sự sống trên Trái Đất bằng sự kích thích đa dạng sinh học và dẫn tới
sự gần như tuyệt chủng của các sinh vật không chịu được ôxy. Theo thuyết nội cộng
sinh, các lục lạp được tìm thấy trong thực vật và tảo nhân chuẩn đã tiến hóa từ các
tổ tiên là vi khuẩn lam thông qua cơ chế nội cộng sinh.
1.3.2. Hình thái và cấu trúc tế bào
Hình thái của vi khuẩn lam có thể được chia thành nhiều dạng bao gồm đơn
bào, đa bào, dạng tập đoàn hay dạng sợi. Tế bào nhóm vi sinh này không mang roi.
Sinh sản bằng cách chia đôi. Các tế bào có thể được bao bọc trong một khối nhầy có
màu vàng nhạt hoặc không màu trong suốt quá trình sinh trưởng để tạo thành tập
đoàn. Một số chủng dạng sợi, dạng chuỗi. Cấu trúc đa bào bao gồm một chuỗi các
tế bào gọi là trichome. Trichome có thể thẳng hoặc cuộn xoắn.
Cấu trúc tế bào khá đơn giản, chưa có nhân điển hình, chưa có màng phân cách
giữa nhân và tế bào chất, cấu trúc thành tế bào là lớp peptidoglycan tương tự như
cấu tạo thành tế bào của vi khuẩn gram âm; bao gồm 2 lớp: Lớp peptidoglican cứng,

dính liền với màng tế bào. Lớp lipopolisacharide ở phía ngoài.
Một đặc điểm đặc trưng của vi khuẩn lam là sự hiện diện của không bào khí
(khí thể) trong tế bào, chúng có thể làm cho tế bào nổi. Một số chủng thuộc các chi
như Anabaena thường sẽ hình thành những tế bào đặc biệt khác với tế bào dinh
dưỡng gọi là dị bào, đây là nơi xảy ra quá trình cố định nitơ. Ngoài ra nhóm vi sinh
vật này còn có tế bào nghỉ.

14


Đồ Án Tốt Nghiệp

1.3.3. Phân loại vi khuẩn lam
Trước đây thường nhầm lẫn là Tảo lam (Cyanophyta). Thực ra đây là những
cơ thể nhân nguyên thuỷ, không liên quan gì đến tảo , ngoài khả năng quang hợp
hiếu khí (quang tự dưỡng vô cơ) và dùng H2O làm chất cho điện tử trong quá trình
quang hợp. Vi khuẩn lam chứa chlorophyll a và phycocyanin - phycobiliprotein.
Một số loài có sắc tố đỏ phycoerythrin. Chúng phối hợp với sắc tố lục tạo nên màu
nâu. Màng liên kết với phycobilisom. Đơn bào hoặc đa bào dạng sơi. Không di
động hoặc di động bằng cách trườn (gliding), một số loài có túi khí (gas vesicles).
Nhiều loại có dị tế bào (heterocysts) và có khả năng cố định nitơ. Vi khuẩn lam có
mặt ở khắp mọi nơi, trong đất, trên đá, trong suối nước nóng, trong nước ngọt và
nước mặn. Chúng có năng lực chống chịu cao hơn so với thực vật đối với các điều
kiện bất lợi như nhiệt độ cao, pH thấp. Một số loài có khả năng sống cộng sinh với
các cơ thể khác như Rêu, Dương xỉ, Tuế...Nhiều loài cộng sinh với nấm để tạo ra
Địa y (Lichen). Vi khuẩn lam có thể là sinh vật xuất hiện sớm nhất trên Trái Đất.
Vi khuẩn lam được chia thành 5 bộ theo đặc điểm hình thái: Chroococcales,
Oscillatorriales, Nostocales, Stigonematales và Pleurocapsales (theo NCBI; 2005):
1.3.3.1. Bộ Chroococcales
Hình que hoặc hình cầu đơn bào, không có dạng sợi hay dạng kết khối

(aggregate), phân đôi hoặc nẩy chồi, không có dị tế bào (heterocytes). Hầu hết
không di động. Tỷ lệ G+C là 31-71%. Các chi tiêu biểu là: Chamaesiphon,
Chroococcus, Gloeothece, Gleocapsa, Prochloron.
1.3.3.2. Bộ Oscillatorriales
Dạng sợi (filamentous), dạng lông (trichome) không phân nhánh chỉ có ở các
tế bào dinh dưỡng, phân đôi trên mặt phẳng, có kiểu đứt đoạn (fragmentation),
không có dị tế bào, thường di động. Tỷ lệ G+C là 34-67%. Các chi tiêu biểu là:
Lyngbya, Osscillatoria, Prochlorothrix, Spirulina, Pseudanabaena.

15


Đồ Án Tốt Nghiệp

1.3.3.3. Bộ Nostocales
Dạng sợi, dạng lông (trichome) không phân nhánh có thể chứa các tế bào biệt
hoá (specialized cell), phân đôi trên mặt phẳng, có kiểu đứt đoạn tạo thành đoạn
sinh sản (hormogonia), có tế bào dị hình, thường di động có thể sản sinh bào tử
màng dày (akinetes). Tỷ lệ G+C là 38-47%. Các chi tiêu biểu là : Anabaena,
Cylindrospermum, Aphanizomenon, Nostoc, Scytonema, Calothrix.
1.3.3.4. Bộ Stigonematales
Lông (trichome) dạng sợi, phân nhánh hoặc do các tế bào nhiều hơn một chuỗi
tạo thành, phân đôi theo nhiều mặt phẳng, hình thành đoạn sinh sản (hormogonia),
có tế bào dị hình, có thể sản sinh bào tử màng dày ( alkinetes), có hình thái phức tạp
và biệt hóa (differentiation). Tỷ lệ G+C là 42-44%. Các chi tiêu biểu là: Fischerella,
Stigonema, Geitlerinema.
1.3.3.5. Bộ Pleurocapsales
Hình que hoặc hình cầu đơn bào, có thể tạo dạng kết khối (aggregate), phân
cắt nhiều lần tạo ra các baeocytes, không có dị tế bào. Chỉ có các baeocytes là có di
động. Tỷ lệ G+C là 40-46%. Các chi tiêu biểu là: Pleurocapsa, Dermocapsa,

Chroococcidiopsis.
1.3.4. Hiện tượng nở hoa của vi khuẩn lam
Hiện tượng nở hoa của vi khuẩn lam xảy ra rất nhiều các thủy vực bị phú
dưỡng. Nguyên nhân là do sự gia tăng đột biến số lượng tế bào trôi nổi như
Microcystis, Anabaena, Oscillatoria... trên mặt nước. Hiện tượng nở hoa thường
xảy ra vào mùa hè ở vùng ôn đới khi nhiệt độ môi trường cao. Tuy nhiên ở vùng
nhiệt đới, sự nở hoa của nhóm vi sinh này có thể xảy ra quanh năm. Nguyên nhân
của hiện tượng nở hoa là sự gia tăng hàm lượng nitơ và photpho trong nước tạo điều
kiện thuận lợi cho chúng phát triển mạnh. Tuy nhiên do có khả năng nổi trên mặt
nước nên có lợi thế trong việc hấp thu lượng ánh sáng mạnh hơn, bên cạnh đó khả
năng cố định nitơ của một số loài khi hàm lượng dinh dưỡng trong môi trường giảm
giúp cho chúng cạnh tranh tốt hơn so với các loài tảo khác. Hiện tưởng nở hoa gây

16


Đồ Án Tốt Nghiệp

ra rất nhiều vấn đề cho hệ sinh thái thủy vực như biến đổi màu của nước, gây mất
mỹ quan ao/hồ, làm ô nhiễm nguồn nước, gây mùi hôi, đặc biệt là gây độc các sinh
vật sống khác trong hệ thống thủy sinh.
Ở Việt Nam hiện tượng nở hoa của vi khuẩn lam cùng với sản sinh ra nhiều loại
độc tố trong đó có MCs thường có hàm lượng cao nhất đã được ghi nhận ở nhiều
thuỷ vực khác nhau như hồ Thành Công, hồ Núi Cốc, hồ Hoàn Kiếm, hồ Dầu
Tiếng, hồ Trị An.

Hình 1.1. Vi khuẩn lam nở hoa ở hồ Dầu Tiếng
(Nguồn: Phạm Thanh Lưu)
1.3.5. Độc tố microcystins
Microcystins (MCs) là độc tố vi khuẩn lam phát hiện ở hầu hết các thủy vực

nước ngọt và nước lợ khắp nơi trên thế giới. Đây là độc tố được nghiên cứu nhiều
nhất.
MCs là loại độc tố dạng vòng hepatotoxic peptides thuộc nhóm độc tố cylic
peptides (Hình 1.2). Có cấu tạo gồm 7 amino acid khác nhau, với 2 amino acid cuối
cùng của dãy peptide nối liền lại hình thành nên phức hợp vòng. Có trọng lượng

17