Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase và tinh sạch bằng sắc ký lọc gel từ chủng nấm mốc trichoderma SPP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
ENZYME XYLANASE VÀ TINH SẠCH BẰNG
SẮC KÝ LỌC GEL TỪ CHỦNG NẤM MỐC
TRICHODERMA SPP.

Ngành:

MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : KS. ĐỖ THỊ TUYẾN
Sinh viên thực hiện

: LÊ NGỌC MỸ

MSSV: 1191111028

Lớp: 11HSH02

TP. Hồ Chí Minh, 2013


LỜI CAM ĐOAN
Tôi là sinh viên Lê Ngọc Mỹ, lớp 11HSH02 xin cam đoan không sao chép đồ
án/khóa luận tốt nghiệp của người khác dưới mọi hình thức nào. Đây là nghiên cứu
hoàn toàn của riêng tôi, những số liệu trong đồ án tốt nghiệp hoàn toàn trung thực và

chưa được công bố bởi tác giả nào. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan trên.


LỜI CÁM ƠN
Trong thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp em đã được áp dụng những lý thuyết
đã học vào thực tế và thêm được những kinh nghiệm bổ ích cho công việc sau này. Em
xin chân thành cảm ơn :
Viện sinh học nhiệt đới TP.HCM đã cho phép em làm đồ án tốt nghiệp tại Viện,
cung cấp những thiết bị, máy móc hiện đại giúp ích rất nhiều cho việc thực hiện đồ án.
Ks. Đỗ Thị Tuyến đã hướng dẫn, giúp đỡ cho em rất tận tình, giải thích những
thắc mắc trong khi thực hiện đồ án tốt nghiệp, cung cấp đầy đủ các tài liệu để em hoàn
thành đồ án một cách tốt nhất.
Các thầy cô trong khoa Môi trường và Công nghệ Sinh học trường Đại học Kỹ
Thuật Công nghệ TP.HCM đã tận tình dạy dỗ và truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cho
em trong những năm học vừa qua.
Và em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ đã luôn đồng hành, chia sẽ, động
viên. Các bạn trên Viện và bạn Nguyễn Thị Hoài An đã giúp đỡ em thực hiện tốt đồ án
tốt nghiệp.


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
ENZYME XYLANASE VÀ TINH SẠCH BẰNG
SẮC KÝ LỌC GEL TỪ CHỦNG NẤM MỐC
TRICHODERMA SPP.

Ngành:

MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : KS. ĐỖ THỊ TUYẾN
Sinh viên thực hiện

: LÊ NGỌC MỸ

MSSV: 1191111028

Lớp: 11HSH02

TP. Hồ Chí Minh, 2013


LỜI CAM ĐOAN
Tôi là sinh viên Lê Ngọc Mỹ, lớp 11HSH02 xin cam đoan không sao chép đồ
án/khóa luận tốt nghiệp của người khác dưới mọi hình thức nào. Đây là nghiên cứu hoàn
toàn của riêng tôi, những số liệu trong đồ án tốt nghiệp hoàn toàn trung thực và chưa
được công bố bởi tác giả nào. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan trên.


LỜI CÁM ƠN
Trong thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp em đã được áp dụng những lý thuyết
đã học vào thực tế và thêm được những kinh nghiệm bổ ích cho công việc sau này.
Em xin chân thành cảm ơn :
Viện sinh học nhiệt đới TP.HCM đã cho phép em làm đồ án tốt nghiệp tại
Viện, cung cấp những thiết bị, máy móc hiện đại giúp ích rất nhiều cho việc thực hiện

đồ án.
Ks. Đỗ Thị Tuyến đã hướng dẫn, giúp đỡ cho em rất tận tình, giải thích những
thắc mắc trong khi thực hiện đồ án tốt nghiệp, cung cấp đầy đủ các tài liệu để em hoàn
thành đồ án một cách tốt nhất.
Các thầy cô trong khoa Môi trường và Công nghệ Sinh học trường Đại học Kỹ
Thuật Công nghệ TP.HCM đã tận tình dạy dỗ và truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm
cho em trong những năm học vừa qua.
Và em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ đã luôn đồng hành, chia sẽ, động
viên. Các bạn trên Viện và bạn Nguyễn Thị Hoài An đã giúp đỡ em thực hiện tốt đồ
án tốt nghiệp.


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2013

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .........................................................................v
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. vi
DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ ........................................................................... viii
LỜI MỞ ĐẦU .............................................................................................................1
1. Đặt vấn đề .........................................................................................................1
2. Mục đích nghiên cứu.........................................................................................3
3. Nhiệm vụ nghiên cứu ........................................................................................3
4. Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................................3
5. Kết cấu của Đồ án Tốt nghiệp...........................................................................3
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................4
1.1. Giới thiệu chung về cơ chất xylan, enzyme xylanase.......................................4
1.1.1. Cơ chất xylan ..............................................................................................4
1.1.2. Hệ enzyme xylanase....................................................................................5

1.1.3. Hệ xylanase của Trichoderma spp. ............................................................5
1.1.4. Cảm ứng sinh tổng hợp enzyme thủy phân xylan .......................................6
1.2. Giới thiệu chung về nấm sợi Trichoderma spp. ...............................................6
1.2.1. Phân loại Trichoderma spp ........................................................................6
1.2.2. Đặc điểm sinh học của Trichoderma spp. ..................................................7
1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Trichoderma spp. .....................................7
1.2.4. Một số ứng dụng của Trichoderma ............................................................8
1.3.

Vai trò của giống trong công nghệ sản xuất enzyme ....................................9

1.4.

Yêu cầu giống vi sinh vật trong công nghệ enzyme....................................10

i


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.5.

2013

Cơ chất cảm ứng nấm mốc sinh tổng hợp xylanase ....................................11

1.5.1. Bã mía ......................................................................................................11
1.5.2. Cám mì ....................................................................................................11
1.6.

Phƣơng pháp lên men bán rắn thu nhận enzyme và các yếu tố ảnh hƣởng

đến sinh tổng hợp xylanase trong điều kiện nuôi cấy bán rắn ...............................12
1.6.1.

Độ ẩm của môi trường nuôi cấy ...........................................................12

1.6.2.

Sự thông khí ..........................................................................................13

1.6.3.

Nguồn carbon .......................................................................................13

1.6.4.

Nguồn nitrogen .....................................................................................13

1.6.5.

pH..........................................................................................................14

1.6.6.

Các nguyên tố khoáng...........................................................................14

1.7.

Phƣơng pháp tách chiết và tinh sạch chế phẩm enzyme .............................15

1.8.

Sợ lƣợc về sắc ký lọc gel .............................................................................16

1.8.1.

Bản chất của phương pháp ......................................................................16

1.8.2.

Đặc tính của gel .......................................................................................17

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ......................................................18
2.1.

Nguyên liệu..................................................................................................18

2.2.

Hóa chất và thiết bị ......................................................................................18

2.2.1.

Hóa chất ................................................................................................18

2.2.2.

Thiết bị ..................................................................................................18

2.3.

Phƣơng pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase từ nấm

mốc Trichoderma spp. ...........................................................................................19
2.3.1.

Phương pháp mô tả hình thái Trichoderma .........................................19

2.3.2.

Xác định số lượng bào tử nấm mốc bằng buồng đếm hồng cầu...........19

2.3.3.

Phương pháp đo đường vành khuyên phân giải ...................................20

ii


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2013

2.3.4. Quy trình khảo sát một số yếu tố ..............................................................21
2.3.5. Thuyết minh quy trình...............................................................................22
2.4.

Bố trí thí nghiệm ..........................................................................................24

2.4.1.

Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi để tách chiết enzyme xylanase ..
...............................................................................................................24

2.4.2.

Khảo sát các tác nhân tủa enzyme xylanase .........................................26

2.4.3.

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme xylanase ..........30

2.5.

Phƣơng pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu và xử lí kết quả .................34

2.5.1.

Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu....................................34

2.5.2.

Xử lý số liệu ..........................................................................................37

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN..............................................................38
3.1.

Quan sát hình thái Trichoderma spp. trên môi trƣờng PGA .......................38

3.1.1.

Quan sát đại thể ....................................................................................38

3.1.2.

Quan sát vi thể ......................................................................................39

3.2.

Định tính enzyme xylanase của Trichoderma spp. .....................................40

3.3.

Định lƣợng mốc giống Trichoderma spp. ...................................................41

3.4.

Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp xylanase của

Trichoderma spp. ...................................................................................................41
Khảo sát dung môi và tỷ lệ dung môi để tách chiết enzyme xylanase .....51

3.5.1.
3.5.2.

Khảo sát quá trình tinh sạch enzyme xylanase từ dịch chiết bằng

phương pháp kết tủa ...........................................................................................53
3.5.3.

3.6.

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến chế phẩm enzyme xylanase .........58

Tinh sạch enzyme xyalanse bằng phƣơng pháp chạy sắc ký lọc gel...........60

CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................62
4.1. Kết luận ...........................................................................................................62

iii


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2013

4.2. Đề nghị ............................................................................................................63
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................64
PHỤ LỤC A ................................................................................................................1
PHỤ LỤC B ................................................................................................................2
PHỤ LỤC C ................................................................................................................4

iv


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2013

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BM

Bã mía

CM

Cám mì

DNS

Acid 2-hydroxyl-3,5-dinitrobenzoic

DC

Dịch chiết

HT

Hoạt tính

HL

Hàm lƣợng

HTR

Hoạt tính riêng

IU (UI)

Unit Internation, đơn vị quốc tế

v


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2013

DANH MỤC BẢNG
STT

Bảng

Nội dung

Trang

1

1.1

Thành phần hóa học của bã mía

11

2

1.2

Thành phần hóa học của cám mì

11

3

1.3

4

2.1

Bảng số liệu dựng đƣờng chuẩn Bradford

35

5

2.2

Tỷ lệ pha loãng dung dịch Xylose chuẩn

36

6

3.1

7

3.2

8

3.3

9

3.4

10

3.5

11

3.6

12

3.7

13

3.8

14

3.9

15

3.10

16

3.11

Nồng độ chất khoáng cần thiết cho sinh trƣởng nấm
mốc và xạ khuẩn

Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của
Trichoderma spp. với tỷ lệ cơ chất khác nhau
Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của
Trichoderma spp. có độ ẩm môi turờng khác nhau
Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của
Trichoderma spp. có pH khác nhau
Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của
Trichoderma spp. có nồng độ dinh dƣỡng khác nhau
Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của
Trichoderma spp. có thời gian nuôi cấy khác nhau
Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của
Trichoderma spp. có tỷ lệ giống khác nhau
Kết quả khảo sát các dung môi để tách chiết enzyme
xylanase
Kết quả tỷ lệ nƣớc cất để tách chiết enzyme xylanase
Kết quả khảo sát tỷ lệ cồn dùng để tủa enzyme
xylanase
Kết quả khảo sát tỷ lệ acetone dùng để tủa enzyme
xylanase

Kết quả khảo sát tỷ lệ nồng độ muối dùng để tủa

vi

14

42

44

45

47

48

50

51
52
53

55
56


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2013

enzyme xylanase
17

3.12

18

3.13

19

3.14

20

3.15

So sánh kết quả tủa enzyme xylanase
Kết quả ảnh hƣởng của pH đến chế phẩm enzyme
xylanase
Kết quả ảnh hƣởng của nhiệt độ đến chế phẩm
enzyme xylanase
Hiệu suất tinh sạch

vii

57
58

59

61


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2013

DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ
DANH MỤC HÌNH
STT

Hình

Nội dung

Trang

1

1.1

Sơ đồ cấu trúc cách tế bào thực vật

4

2

1.2

Trichoderma spp.

6

3

3.1

Hình thái đại thể của Trichoderma spp.

38

4

3.2

Hình thái vi thể của Trichoderma spp. ở 24h

39

5

3.3

Hình thái vi thể của Trichoderma spp. ở 36h

39

6

3.4

Hình thái vi thể của Trichoderma spp. ở 48h

39

7

3.5

Kết quả vành phân giải Xylanase của Trichoderma spp.

40

DANH MỤC ĐỒ THỊ
STT

Đồ thị

Nội dung

Trang

Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng Protein và hoạt tính
1

3.1

Xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có

42

tỷ lệ cơ chất khác nhau
Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng Protein và hoạt tính
2

3.2

Xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có

44

độ ẩm khác nhau
Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng Protein và hoạt tính
3

3.3

Xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có

46

độ ẩm khác nhau
Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng Protein và hoạt tính
4

3.4

Xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có

47

độ ẩm khác nhau
5

3.5

Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng Protein và hoạt tính
Xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có

viii

49


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2013

độ ẩm khác nhau
Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng Protein và hoạt tính
6

3.6

Xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có

50

độ ẩm khác nhau
7

3.7

8

3.8

9

3.9

10

3.10

11

3.11

12

3.12

13

3.13

14

3.14

15

3.15

Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của
các dung môi tách chiết enzyme xylanase
Biểu diễn tỷ lệ nƣớc cất để tách chiết enzyme xylanase

51
52

Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính enxyme
xylanase từ các phân đoạn tủa bằng cồn

54

Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính enxyme
xylanase từ các phân đoạn tủa bằng acetone

55

Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính enxyme
xylanase từ các phân đoạn tủa bằng muối

56

Biểu diễn kết quả so sánh tủa enzyme xylanase từ các
tác nhân tủa

57

Biểu diễn hoạt tính xylanase theo pH của chế
phẩm enzyme xylanase

58

Biểu diễn hoạt tính xylanase theo nhiệt độ của
chế phẩm enzyme xylanase
Sắc ký đồ trên excel khi chạy sắc ký enzyme xylanase

ix

59
60


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2013

LỜI MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ngày nay, công nghệ vi sinh – hóa sinh phát triển nhanh chóng tạo điều kiện
cho nghiên cứu phát triển, giúp ứng dụng vào thực tế nông nghiệp cũng nhƣ công
nghiệp thực phẩm rất có hiệu quả. Việc sử dụng các chế phẩm enzyme trong nông
nghiệp và công nghiệp thực phẩm đƣợc sử dụng nhiều trong thực tế sản xuất nhằm
nâng cao chất lƣợng cũng nhƣ năng suất của sản phẩm, đồng thời tiết kiệm chi phí
sản xuất. Vì vậy, việc nghiên cứu và sản xuất ra enzyme và các chế phẩm enzyme
ngày càng đƣợc quan tâm nhiều hơn.

Việt Nam là một nƣớc nhiệt đới có nền nông nghiệp khá phát triển, phong
phú và đa dạng trên đà phát triển mạnh. Lƣợng phế phẩm và phụ phẩm của nông
nghiệp, công nghiệp cũng rất dồi dào nhƣng lại không đƣợc xử lý đúng mức. Theo
đó các chất thải hữu cơ cũng gia tăng lên không ngừng. Trong đó phụ liệu của nhà
máy mía đƣờng là một ví dụ điển hình và chiếm khoảng 20% mía nguyên liệu. Theo
đánh giá của ngành mía đƣờng, nếu công suất nhà máy là 1000 tấn/ngày thì mỗi
ngày nhà máy thải ra môi trƣờng khoảng 25 tấn bã mía gây ô nhiễm nghiêm trọng.
Chính vì thế, đang có nhiều hƣớng giải quyết lƣợng bã mía sau sản xuất trên
một số nhà máy sử dụng bã mía làm nhiên liệu đốt lò hơi, cách này rất lãng phí mà
lại ô nhiễm môi trƣờng sống. Còn các nhà máy khác lại cố gắng tận dụng bã mía
vào các mục đích tốt hơn nhƣ làm ván ép, thức ăn gia súc…Nhƣng những biện pháp
trên chƣa khả thi vì thành phần ván ép từ bã mía chƣa tốt và chắc bền nhƣ ván ép từ
gỗ, còn thức ăn gia súc không thực sự đảm bảo nguồn dinh dƣỡng cho vật nuôi
cũng nhƣ tốn nhiều chi phí cho sản xuất. Nếu để lâu bã mía sẽ bị vi sinh vật mùn
hóa, lúc này có thể làm phân bón cho cây trồng nhƣng phải mất một thời gian rất
lâu để vi sinh vật phân hủy vì thế không có khả năng giải quyết đƣợc thực trạng
lƣợng bã mía tồn đọng ngày càng nhiều, hao tốn diện tích.
Enzyme là một protein đặc biệt đƣợc sinh vật tổng hợp và tham gia các phản
ứng sinh hóa, là thành phần không thể thiếu trong mọi tế bào sinh vật. Chúng đóng
vai trò quyết định mối quan hệ giữa cơ thể sống và môi trƣờng.

1


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2013

Cuối thế kỷ 19 và suốt thế kỷ 20, ngành công nghệ enzyme rất phát triển và
phát triển thành ngành công nghiệp sản xuất enzyme dựa vào hoạt động sống của vi

sinh vật. Công nghệ sản xuất enzyme đã đem lại những thuận lợi to lớn cho nhiều
nƣớc.
Từ lâu, xylanase đã đƣợc ứng dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm nhƣ:
làm bánh mỳ, nƣớc hoa quả, rƣợu vang, bia, thu nhận đƣờng xylose. Xylanase đã,
đang và ngày càng đƣợc bổ sung nhiều hơn vào thức ăn chăn nuôi. Kết quả cho
thấy, bổ sung xylanase một cách độc lập hay kết hợp với các enzyme khác vào thức
ăn làm tăng đáng kể khối lƣợng và giảm thiểu bệnh tật ở vật nuôi. Xylanase có tác
dụng phân giải xylan, một thành phần quan trọng của hemicellulose có nhiều trong
thức ăn của vật nuôi, giải phóng đƣờng xylose và xylooligosaccharide dẫn đến làm
giảm độ nhớt của thức ăn, giúp cho vật nuôi tiêu hóa và hấp thụ chất dinh dƣỡng tốt
hơn, cải thiện hệ vi sinh vật đƣờng ruột theo hƣớng có lợi.
Ở Việt Nam, nguồn vi sinh vật sinh enzyme trong đó có Xylanase khá phong
phú, phần lớn có nguồn gốc từ nấm và vi khuẩn. Đây là một thuận lợi lớn cho sự
phát triển lĩnh vực nghiên cứu và sản xuất Xylanase từ vi sinh vật. Mặt khác, nƣớc
ta là một nƣớc nông nghiệp nên hàng năm các phế phụ phẩm nông nghiệp nhƣ rơm,
lõi ngô, bã mía, bã sắn, vỏ lạc... rất lớn, đây là nguồn cung cấp chất lên men rẻ tiền
và dễ kiếm.
Muốn thu đƣợc enzyme có hiệu suất cao cần phải tiến hành phân lập, và
chọn giống vi sinh vật để chọn những chủng hoạt động mạnh, đồng thời phải lựa
chọn cơ chất cảm ứng và thành phần môi trƣờng tối ƣu cũng nhƣ tiêu chuẩn hóa
điều kiện nuôi cấy.
Ở Việt Nam hiện nay, công nghệ enzyme vẫn chƣa phát triển, nguồn enzyme
còn hạn chế phụ thuộc vào enzyme nhập khẩu từ nƣớc ngoài. Vì vậy, việc nghiên
cứu và phát triển công nghệ enzyme để ứng dụng vào công nghiệp, đời sống là rất
cần thiết.

2


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2013

Từ những lý do trên chúng tôi xây dựng đề tài: “Khảo sát một số yếu tố ảnh
hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme xylanase và tinh sạch bằng sắc ký
lọc gel từ nấm mốc Trichoderma spp.”.
2. Mục đích nghiên cứu
Tìm ra môi trƣờng tốt nhất để chủng nấm mốc Trichoderma spp. thực hiện
tối ƣu hóa môi trƣờng
Tinh sạch enzyme xylanase đƣợc thu nhận từ nấm mốc Trichoderma spp.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
Khảo sát thành phần môi trƣờng cảm ứng để chủng nấm mốc Trichoderma
spp. cho hoạt lực enzyme cao nhất. Các thành phần của môi trƣờng ảnh hƣởng đến
hoạt lực enzyme bao gồm: tỷ lệ cám mì : bã mía, độ ẩm, nồng độ dinh dƣỡng, pH,
thời gian nuôi cấy, tỷ lệ giống.
Tách chiết và tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel.
4. Phƣơng pháp nghiên cứu
Phƣơng pháp Bradford dùng để xác định hàm lƣợng protein.
Phƣơng pháp Xylose dùng để xác định hoạt tính enzyme xylanase.
Phƣơng pháp tủa enzyme bằng các tác nhân khác nhau.
Phƣơng pháp tinh sạch enzyme xylanase bằng sắc ký lọc gel.
5. Kết cấu của Đồ án Tốt nghiệp
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Chƣơng 2: Vật liệu và phƣơng pháp
Chƣơng 3: Kết quả và biện luận
Chƣơng 4: Kết luận và kiến nghị

3

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2013

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cơ chất xylan, enzyme xylanase
1.1.1. Cơ chất xylan
Xylan là thành phần chính của hemicelluloses thực vật, đứng thứ hai sau
cellulose và chiếm khoảng một phần ba nguồn carbon hữu cơ có thể phục hồi trên
trái đất (Prade, 1995). Trong đó, hemicelluloses là phức hợp polysaccharide gồm
xylan, xyloglucan, glucomannan và arabinogalactan (Shallom, D và Shoham, Y ,
2003). Phức hợp này cùng với cellulose, pectin và một lƣợng nhỏ glycoprotein và
các hợp chất phenolic hình thành vách tế bào sơ cấp. Sau đó, vách tế bào sơ cấp
đƣợc phát triển thành vách thứ cấp.
Ngoài thành phần chính là cellulose và hemicelluloses, trong vách thứ cấp
còn có thêm lignin – đƣợc hình thành bởi quá trình đồng hóa các dẫn xuất
phenylpropan nhƣ cumaryl alcohol, coniferyl alcohol và sinapyl alcohol tạo nên
thành phần polymer của vách tế bào thực vật (Kulkarni, N et al, 1999). Ba thành
phần chính trong cấu trúc vách tế bào thực vật kết hợp với nhau nhờ các liên kết
cộng hóa trị và không cộng hóa trị. Xylan đƣợc tìm thấy ở điểm giao giữa lignin và
cellulose, đây là giao điểm quan trọng của sự gắn kết và toàn vẹn của vách tế bào
thực vật (Beg, Q.K., et al. 2001).

Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc vách tế bào thực vật

4


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2013

Xylan đƣợc tìm thấy trong một lƣợng lớn trong gỗ cứng của thực vật hạt kín
(15 – 30%) và gỗ mềm của thực vật hạt trần (7 – 10%), cũng nhƣ trong cây hàng
năm (< 30%) (Singh, S, et al., 2003). Xylan là polysaccharide phức, có cấu trúc thay
đổi giữa các loài thực vật khác nhau. Thực vật trên cạn có xylan là chuỗi D-xylose
đƣợc nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucoside, tảo biển tổng hợp xylan với cấu
trúc khác là D-glucose nối với nhau bằng liên kết β-1,3-glucoside. Nhìn chung,
xylan là polysaccharide có cấu trúc gồm các đơn vị xylose liên kết với liên kết β1,4-glucoside (Whistler và Richards, 1970). Phần lớn xylan là heteropolysacharide,
có các nhóm thế khác nhau trong khung sƣờn và chuỗi bên (Biely, 1995). Các nhóm
thế phổ biến trên khung sƣờn xylan là acetyl, arabinofuranosyl và glucuronysyl
(Whitsler và Richards, 1970). Với các nhóm thế khác nhau nhƣ vậy, xylan đƣợc
phân loại thành homoxylan thẳng, arabinoxylan, acetyxylan, glucuronoxylan và
glucu-arabinoxylan.
1.1.2. Hệ enzyme xylanase
Xylanase thủy phân liên kết β-1,4 trong khung sƣờn xylan. Xylanase đƣợc
biết thuộc họ 10 và 11 (hơn 300 trình tự gen đã đƣợc biết) và khoảng hơn 20 gen
xylanase đƣợc xếp vào họ 5, 8, 43 (Shallom, Shoham, 2003).
Cho đến nay, đã có 87 xylanase đƣợc xác định cấu trúc lập thể. Hầu hết
xylanase của vi sinh vật là protein đơn phân tử. Ngày nay, xylanase đa phân tử ngày
càng đƣợc miêu tả nhiều hơn. Những enzyme này chứa những cấu trúc đƣợc coi là
vùng xúc tác (catalytic domain) hoặc một số vị trí gắn với carbohydrate. Những
enzyme xylanase chứa CBDs có hiệu quả thủy phân cao trên cơ chất kết tinh và
nồng độ cao trên bề mặt cơ chất lỏng.
1.1.3. Hệ xylanase của Trichoderma spp.
Vi sinh vật sinh ra nhiều loại endoxylanase với các đặc tính lý hóa, cấu trúc,
hoạt tính và hiệu suất rất đa dạng và phức tạp. Các chủng Trichoderma sản xuất ra
tất cả các enzyme thủy phân xylan. Nhiều loài đã đƣợc phân tách và giải trình tự.

5

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2013

Hệ enzyme thủy phân xylan đƣợc sản xuất bởi chủng Trichoderma, chủ yếu là
T.reesei, là những enzyme đƣợc xác định rõ trong nhóm thủy phân vách tế bào.
1.1.4. Cảm ứng sinh tổng hợp enzyme thủy phân xylan
Xylanase là enzyme cảm ứng đƣợc vi sinh vật tiết vào môi trƣờng nuôi cấy
có mặt xylan hoặc cơ chất giàu xylan (Balakrishnan và cộng sự, 1997). Xylan là
polymer cao phân tử không thể xâm nhập vào tế bào. Do vậy, sự sinh tổng hợp
xylanase đƣợc cảm ứng chủ yếu bởi các phân đoạn của xylan nhƣ xylose, xylobiose,
xylooligosacharide của xylose, có trọng lƣợng phân tử thấp đƣợc tạo ra trong môi
trƣờng nhờ một lƣợng nhỏ enzyme xúc tác (Bastawde 1992, Kulkarni và cộng sự,
1999).
Nhiều nghiên cứu cho rằng, ligocellulose có trong cám mì, trấu, bã mía…là
yếu tố cảm ứng vi sinh vật sinh xylanase (Beg và cộng sƣ, 1998, Puchart và cộng
sự, 1999). Các loại nấm sợi sử dụng xylan nhƣ nguồn carbon để cảm ứng sinh tổng
hợp xylanase.

1.2. Giới thiệu chung về nấm sợi Trichoderma spp.
1.2.1. Phân loại Trichoderma spp
Lớp: Euascomycetes
Bộ: Hypoceales
Họ: Hypocreaceae
Giống: Trichoderma

Hình 1.2. Trichoderma spp.
Có 5 loài chính: Trichoderma Harzianum, Trichoderma koningii,

Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma pseudokoningii, Trichoderma viride.

6


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2013

1.2.2. Đặc điểm sinh học của Trichoderma spp.
Trichoderma là nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng cách đính bào tử từ
khuẩn ty. Khuẩn lạc có màu trắng hoặc từ lúc trắng đến lục, vàng xanh, lục xỉn đến
lục đậm.
Khuẩn ty không màu, cuống sinh bào tử phân nhiều nhánh, ở cuối nhánh
phát triển thành khối tròn mang các bào tử không có vách ngăn, không màu, liên kết
nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy. Bào tử hình cầu, hình elip hoặc
hình thuôn, có thành trơn hoặc nhám. Các chủng Trichoderma có tốc độ phát triển
nhanh, đƣờng kính khuẩn lạc lớn hơn 9cm sau 5 ngày trên môi trƣờng thạch đĩa OA
(oatmeal agaro) ở 20ºC.
1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Trichoderma spp.
Trichoderma phân bố chủ yếu ở trong đất và phân hủy gỗ, xác thực vật. Các
loài Trichoderma là thành phần chiếm ƣu thế trong hệ vi sinh vật đất với môi
trƣờng sống biến đổi đa dạng. Trichoderma rất khó tìm thấy trên thực vật sống và
không sống nội kí sinh thực vật (Gary J Samuels, 2000). Các chủng Trichoderma
spp. đƣợc tìm thấy rất nhiều trong môi trƣờng tự nhiên, đặc biệt trong môi trƣờng
đất, chúng phát triển trên nhiều loại cơ chất khác nhau (gỗ, các loài nấm khác, …),
chúng cũng tồn tại khi nồng độ CO2 ở mức cao (10%) và sống đƣợc ở đất acid và
base (pH 3 – 8). Hầu hết các loài Trichoderma sống hoại sinh, thƣờng gặp trên xác
bã thực vật, ở những nơi ẩm ƣớt… Trichoderma có thể sử dụng nhiều nguồn thức
ăn khác nhau từ carbonhydrate, amino acid đến ammonia.

Theo Garrett (1956), khả năng cạnh tranh dinh dƣỡng cao của Trichoderma
spp. Do các đặc tính sau:
- Sinh trƣởng mạnh và bào tử nảy mầm rất nhanh.
- Có khả năng sinh tổng hợp các enzyme thủy phân cao.
- Có khả năng tạo chất kháng sinh.
- Chịu đƣợc chất kháng sinh.

7


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2013

Các loài Trichoderma spp. khác nhau thì yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm cũng
khác nhau. Chẳng hạn nhƣ Trichoderma hamatum, Trichoderma pseudokoningii có
khả năng sống trong môi trƣờng có độ ẩm rất cao, Trichoderma viride và
Trichoderma polysporum thích hợp ở nhiệt độ thấp, Trichoderma harzianum phân
bố ở vùng có khí hậu ấm áp.
1.2.4. Một số ứng dụng của Trichoderma
1.2.4.1.

Bảo vệ thực vật

Trichoderma đƣợc sử dụng nhƣ một tác nhân kiểm soát sinh học. Chúng có
khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại nấm gây bệnh thực vật, đồng thời kích
thích sự tăng trƣởng của cây trồng. Quá trình kiểm soát sinh học bởi Trichoderma
theo các cơ chế sau:
Sự kí sinh nấm: Trichoderma có khả năng cảm ứng tiết ra một lƣợng lớn các
enzyme chitinase, glucanase, cellulose, protease… thủy phân vách tế bào sợi nấm

gây bệnh làm cho chúng không phát triển đƣợc và bị tiêu diệt.
Khả năng tiết kháng sinh: Trichoderma còn có khả năng tiết một số chất
kháng sinh dễ bay hơi hoặc không bay hơi và một số hợp chất ức chế tăng trƣởng.
Ngoài ra, Trichoderma có khả năng cạnh tranh chất dinh dƣỡng và không
gian, làm bất hoạt hệ enzyme ở nấm gây bệnh.
1.2.4.2.

Cải thiện năng suất cây trồng

Ngày nay, các nƣớc có nền công nghiệp phát triển có xu hƣớng sử dụng phân
bón hữu cơ sinh học thế hệ mới, thực chất là sự kết hợp giữa phân bón vi sinh và
thuốc trừ sâu sinh học, dựa trên cơ sở đấu tranh sinh học để khắc phục những hạn
chế khi sử dụng phân bón hóa học, thuốc trừ sâu mà vẫn cho năng xuất cây trồng.
Khi khảo sát các loài Trichoderma ở các lớp đất sâu, ngƣời ta thấy rằng
Trichoderma làm tăng số lƣợng các rễ nằm sâu trong đất, điều này góp phần giúp
các cây lƣơng thực nhƣ ngô có khả năng chống chịu hạn tốt.
Vài loài Trichoderma có khả năng kích thích sự nẩy mầm và sự ra hoa. Đã
có nhiều công trình khoa học chứng minh rằng Trichoderma harzianum và

8


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2013

Trichoderma koningii kích thích sự nẩy mầm và tăng trƣởng của cây. Đối với các
hoa đƣợc trồng trong nhà kính, Trichoderma harzianum đẩy mạnh sự ra hoa bằng
cách rút ngắn ngày ra hoa hay tăng số lƣợng hoa.
Xử lý ô nhiễm môi trường

1.2.4.3.

Trichoderma harzianum có khả năng làm giảm bớt sự tập trung của các hợp
chất tự do 2, 4, 6-trichlorophenol; 4,5-dichloroguaiacol và alcohol oxidase trong
môi trƣờng chứa muối khoáng.
Trichoderma harzianum CCT – 4790 phân giải 60% thuốc diệt cỏ Duirion
trong đất trong 24 giờ, đây là một tiềm năng tốt để xử lý sinh học các hóa chất ô
nhiễm trong đất và trong đầm lầy.
Trichoderma reesei Rut-30 có thể xử lý chất thải sinh hoạt đô thị, hứa hẹn
một nguồn sản xuất enzyme cellulose rẻ tiền, đồng thời giảm lƣợng rác thải.
Các lĩnh vực khác

1.2.4.4.

Các enzyme ngoại bào đƣợc tổng hợp từ Trichoderma bao gồm cellulase,
hemicellulase, đƣợc ứng dụng rỗng rãi trong nhiều ngành công nghiệp nhƣ: sản xuất
thức ăn gia súc, sản phẩm thực phẩm và đồ uống, công nghiệp dệt và sản xuất
giấy…

1.3.

Vai trò của giống trong công nghệ sản xuất enzyme
Trong công nghệ enzyme từ vi sinh vật, giống đóng vai trò quyết định:
-

Giống vi sinh vật quyết định đến năng suất của enzyme.

-

Giống vi sinh vật ảnh hƣởng đến chất lƣợng sản phẩm sinh học (hay là
hoạt tính enzyme).

-

Giống vi sinh vật quyết định vốn đầu tƣ cho sản xuất.

-

Giống vi sinh vật quyết định giá thành cho sản phẩm. Nhƣ vậy giống vi
sinh vật có ý nghĩa to lớn trong phát triển công nghệ vi sinh vật.

9


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.4.

2013

Yêu cầu giống vi sinh vật trong công nghệ enzyme
Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và đƣợc

sản xuất theo quy mô công nghiệp. Do đó giống vi sinh vật ứng dụng trong công
nghệ enzyme cần có những yêu cầu và những chuẩn mực nhất định. Đó là:
Giống vi sinh vật phải tạo ra sản phẩm mà ta mong muốn. Sản phẩm này
phải có số lƣợng và chất lƣợng cao hơn các sản phẩm phụ khác. Vì vậy trong quá
trình trao đổi chất, để chuyển hóa một khối lƣợng sinh chất khổng lồ lớn gấp hàng
nghìn lần cơ thể mình trong một khoảng thời gian cực kỳ ngắn thì cơ thể vi sinh vật

cần tổng hợp nhiều chất và tạo ra nhiều loại sản phẩm khác nhau. Chính vì thế
giống vi sinh vật dùng cho sản xuất một sản phẩm nào đó, thì sản phẩm này phải
trội hơn các sản phẩm khác cả về số lƣợng và chất lƣợng.
Cho năng suất sinh học cao. Có khả năng thích nghi nhanh và phát triển
mạnh trong điều kiện sản xuất công nghiệp.
Có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm tại địa phƣơng nơi
nhà máy hoạt động.
Giống sử dụng trong các quá trình sản xuất hiện đại phải là những vi sinh vật
thuần khiết, có tốc độ sinh sản nhanh.
Có tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo ra sản phẩm mong muốn, dễ tách sản
phẩm ra khỏi tạp chất.
Ổn định trong bảo quản và dễ dàng bảo quản.
Để tạo thuận lợi nhất về chủng giống vi sinh vật cung cấp cho quá trình lên
men công nghiệp ta cần tiến hành phân lập giống vi sinh vật thuần khiết.

10