Kiểm tra độ tinh sạch đoạn gene 16s RDNA trong xác định loài bằng phương pháp DGGE

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KIỂM TRA ĐỘ TINH SẠCH ĐOẠN GENE 16S rDNA
TRONG XÁC ĐỊNH LOÀI BẰNG PHƯƠNG PHÁP DGGE

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. Hoàng Quốc Khánh
CN Ngô Đức Duy
Sinh viên thực hiện

: Hà Trầm Xuân

MSSV: 0851110305

Lớp: 08DSH6

TP. Hồ Chí Minh, 2012


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................ iv

DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................v
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ .................................................. vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ...................................................................................... vii
LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................5
1.1.

Tổng quan về nhóm vi sinh vật ..................................................................... 5

1.2.

Các phương pháp ly trích và thu nhận DNA genomic .................................. 5

1.2.1.

Phương pháp ly trích và thu nhận DNA tổng số vi sinh vật trong

môi trường tự nhiên .............................................................................................................. 5
1.2.2.

Phương pháp ly trích và thu nhận DNA tổng số vi sinh vật từ dịch

nuôi cấy. .................................................................................................................................. 7
1.3.

Các ứng dụng của phương pháp PCR............................................................ 7

1.3.1.

Ứng dụng phương pháp PCR trong xác định trình tự nucleic acid. ....... 7

1.3.2.

Ứng dụng phương pháp PCR trong quá trình xác định loài vi sinh

vật.

.................................................................................................................................... 7

1.3.3.

Ứng dụng phương pháp PCR trong phát hiện các tác nhân vi sinh

vật gây bệnh nhiễm trùng. .................................................................................................. 9
1.3.4.

Ứng dụng phương pháp PCR trong quá trình thúc đẩy nhanh công

nghệ giải trình tự. ................................................................................................................. 9
1.3.5.

Ứng dụng phương pháp PCR trong chẩn đoán và sàng lọc bệnh di

truyền. .................................................................................................................................. 10
1.4.

Phương pháp DGGE và ứng dụng ............................................................... 10

1.5.

Định danh nhóm vi khuẩn ........................................................................... 12

i


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.5.1.

Định danh bằng phương pháp truyền thống................................................ 12

1.5.2.

Định danh nhóm vi khuẩn bằng sinh học phân tử. .................................... 14

1.6. Xây dựng cây phát sinh loài chủng loài......................................................... 19
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..................................................20
2.1.

Địa điểm nghiên cứu.................................................................................... 20

2.2.

Vật liệu thí nghiệm ...................................................................................... 20

2.3.

Thiết bị và dụng cụ ...................................................................................... 22

2.4.

Quy trình kiểm tra độ tinh sạch của đoạn gene 16S rDNA của từng

chủng vi khuẩn. ...................................................................................................... 23
2.4.1.

Quy trình ly trích và thu nhận DNA genomic bằng nhiệt. ....................... 24

2.4.2.

Quy trình kiểm tra sự xuất hiện DNA genomic trong mẫu sau khi ly

trích.

.................................................................................................................................. 26

2.4.3.

Khuếch đại đoạn gene 16S rDNA của nhóm vi khuẩn bằng phương

pháp PCR. ............................................................................................................................. 27
2.4.4.

Tinh sạch sản phẩm PCR bằng QIAGEN Kit.............................................. 28

2.4.5.

Quy trình Applied Biosystems.......................................................................... 30

2.4.6.

Xác định thành phần của mỗi chủng vi khuẩn bằng phương pháp

DGGE. ................................................................................................................................... 32
2.5. Sử dụng phần mềm tin sinh học .................................................................... 36
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN ............................................................37
3.1. Kết quả tăng sinh và kiểm tra hình thái tế bào của 9 chủng vi khuẩn. .......... 37
3.2. Kết quả ly trích DNA genomic bằng nhiệt của 9 chủng vi khuẩn. ................. 42
3.3. Kết quả khuếch đại đoạn gene 16S rDNA bằng phương pháp PCR. ............. 42
3.4. Kết quả tinh sạch đoạn gene 16S rDNA bằng QIAGEN Kit.......................... 43
3.5. Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA của 9 chủng vi khuẩn. ................ 44

ii


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

3.6. Kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loài ................................................... 54
3.7. Kết quả khuếch đại vùng V3 cho phương pháp DGGE ................................. 56
3.8. Kết quả kiểm tra nồng độ DNA bằng máy BEKMAN .................................. 57
3.9. Kết quả vùng V3 trên gel polyacrylamide của 9 chủng vi khuẩn bằng
phương pháp DGGE. ............................................................................................. 58
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ ............................................................59
4.1. Kết luận ........................................................................................................... 59
4.2. Kiến nghị......................................................................................................... 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................61
PHỤ LỤC ...................................................................................................................1

iii

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
CTAB

Cetyl – trimetyl – ammomiumbromide

DNA

Deoxyribonucleic acid

DGGE

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

dNTPs

Deoxyribonucleotide triphosphates

EDTA

Ethylene – Diamine – Tetraacetic – Acid

EtBr

Ethidium bromide

PCR

Polymerase chain reaction

SDS

Sodium dodecyl sulfate

RNA

Ribonucleic acid

TAE

Tris – Acetic – EDTA

Taq

Thermus aquaticus

TE

Tris – EDTA

UV

Ultra Violet

iv


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Các chủng vi khuẩn ................................................................................ 20
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR với tổng thể tích 50 µl ................................ 27
Bảng 2.3: Thành phần Big – Dye Reaction mồi xuôi 27F ...................................... 30
Bảng 2.4: Thành phần Big – Dye Reaction mồi ngược 1492R .............................. 30
Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR vùng V3 thuộc đoạn gene 16S rDNA
của DGGE ............................................................................................... 32
Bảng 2.6: Nồng độ pha gel polyacrylamide ........................................................... 34
Bảng 2.7: Tỷ lệ phối trộn gel polyacrylamide vào hai xilanh ................................. 34
Bảng 3.1: Kết quả quan sát hình thái học của 9 chủng vi khuẩn. ........................... 37
Bảng 3.2: Kết quả soi dưới kính hiển vi 100X của 9 chủng vi khuẩn .................... 39

v


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1: Quy trình kiểm tra độ tinh sạch của đoạn gene 16S rDNA của mỗi chủng
vi khuẩn. .................................................................................................. 23
Sơ đồ 2.2: Quy trình ly trích và thu nhận DNA genomic bằng nhiệt ...................... 25
Sơ đồ 3.3: Kiểm tra DNA genomics sau khi ly trích ................................................ 26
Sơ đồ 3.4: Quy trình tinh sạch DNA sau khi chạy PCR ........................................... 29
Sơ đồ 3.5: Quy trình Applied Biosystems ................................................................ 31

vi


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1: Hệ thống thiết bị chạy DGGE. ................................................................. 36
Hình 3.1: Kết quả tăng sinh của 9 chủng vi khuẩn. Đó là các chủng A, B, C,
D, E, F, G, H và K. ................................................................................. 41
Hình 3.2: Kết quả thu nhận DNA genomic của 9 chủng vi khuẩn trên gel
agarose 1%.. ............................................................................................. 42
Hình 3.3: Kết quả thu nhận đoạn gene 16S rDNA khi chạy PCR trên gel
agarose 1% ............................................................................................... 43
Hình 3.4: Kết quả tinh sạch đoạn gene 16S rDNA bằng QIAGEN Kit trên gel
agarose 1%. .............................................................................................. 44
Hình 3.5a: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) của
chủng A .................................................................................................... 45
Hình 3.5b: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Reverse) của
chủng A. ................................................................................................... 45
Hình 3.6a: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) của
chủng B .................................................................................................... 46
Hình 3.6b: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Reverse) của
chủng B .................................................................................................... 46
Hình 3.7a: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) của
chủng C .................................................................................................... 47
Hình 3.7b: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Reverse) của
chủng C .................................................................................................... 47

vii


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.8a: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) của

chủng D .................................................................................................... 48
Hình 3.8b: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Reverse) của
chủng D .................................................................................................... 48
Hình 3.9a: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) của
chủng E .................................................................................................... 49
Hình 3.9b: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Reverse) của
chủng E. ................................................................................................... 49
Hình 3.10a: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) của
chủng F. ................................................................................................... 50
Hình 3.10b: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Reverse) của
chủng F. ................................................................................................... 50
Hình 3.11a: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) của
chủng G. ................................................................................................... 51
Hình 3.11b: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Reverse) của
chủng G. ................................................................................................... 51
Hình 3.12a: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) của
chủng H. ................................................................................................... 52
Hình 3.12b: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) của
chủng H .................................................................................................... 52
Hình 3.13a : Kết quả giải trình tự đoạn 16S rDNA ( đoạn Forward) của
chủng K .................................................................................................... 53
Hình 3.13b : Kết quả giải trình tự đoạn 16S rDNA ( đoạn Reverse) của
chủng K ................................................................................................... 53

viii


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.14: Kết quả xây dựng cây phát sinh loài của 8 chủng khảo sát

(chủng E, F, G, H, K) so với dữ liệu của ngân hàng gene. ...................... 55
Hình 3.15: Kết quả khuếch đại vùng V3 của đoạn gene 16S rDNA của 9
chủng vi khuẩn trên gel agarose 1% ....................................................... 56
Hình 3.16: Kết quả chạy DGGE vùng V3 trên gel acrylamide biến tính .................. 57

ix


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

LỜI MỞ ĐẦU
1.

Tính cấp thiết của đề tài
Việc phân lập và định danh vi khuẩn có tầm quan trọng rất lớn trong các

nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật như: môi trường, công nghiệp, y tế, nông nghiệp
và sinh thái vi sinh vật. Trước đây công tác phân loại vi sinh vật cơ bản dựa vào các
đặc tính hình thái, sinh lý và hóa sinh của vi sinh vật: nhuộm, hình thái tế bào, bào
tử, khuẩn lạc, khả năng di động, nhu cầu dinh dưỡng, khả năng lên men, sinh acid
trong môi trường nuôi cấy cũng như các sắc tố được tạo thành v.v…Các đặc trưng
này phần lớn đã định danh sơ bộ các họ và chi của vi sinh vật. Tuy nhiên, để định
danh cụ thể và đạt độ chính xác cao về từng loài vi sinh vật thì cần phải kết hợp với
phương pháp sinh học phân tử - một phương pháp định danh nhanh chóng và có độ
tin cậy. Mỗi phương pháp có thể cho phép khẳng định tới một mức độ nhất định nào
đó của hệ thống phân loại như: đến loài, dưới loài và một vài phương pháp có thể
khẳng định đến cấp độ giống hay dòng. Các phương pháp định danh dựa trên nền
tảng là DNA đang được sử dụng rộng rãi do độ tin cậy cao, đơn giản và rẻ tiền để
xác định và phân loại vi khuẩn. Trong thực tế, sự phân biệt giữa giống và loài được
thực hiện theo phương pháp lai DNA-DNA (Wayne and al., 1987). Hiện nay, dựa

trên kỹ thuật phân tích trình tự đoạn gen16S rDNA ngày càng phát hiện ra loài mới
(Woese.,1987; Stackebrandt và Goebel.,1994). Và một trong các phương pháp
thường được dùng để định danh vi khuẩn gọi là kỹ thuật dấu vân tay di truyền RepPCR, hay Rep-PCR genomic fingerprinting, kỹ thuật này dựa trên nền tảng của sự
khuếch đại DNA. Với kỹ thuật này cho kết quả nhanh chóng, hiệu quả và đạt độ tin
cậy cao (Versalovicand et al., 1994; Louws et al., 1996).
2. Tình hình nghiên cứu
2.1. Thế giới
Qui trình Rep-PCR genomic fingerprinting do nhóm nghiên cứu của tiến sĩ JR
Lupski trường Baylor College of Medicine (Houston, Texas) phát triển và đã được

1


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ứng dụng trong nghiên cứu sự đa dạng sinh học, xác định và phân loại vi khuẩn, các
nghiên cứu dịch tễ học phân tử của con người và bệnh cây. Và một trong những
thành tựu lớn trong lĩnh vực sinh học phân tử là công trình giải mã trình tự bộ gene
người được công bố bản phát thảo vào năm 2000 và hoàn thiện vào năm 2003.
Ứng dụng thành công của PCR là đã xác định tính đa dạng tập đoàn vi khuẩn
trong quá trình xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ dioxin ở quy mô nhỏ hiện trường của
Cộng hòa Liên bang Đức tại trung tâm nghiên cứu bệnh truyền nhiễm Helmholtz
(GBF).
2.2.

Trong nước

Hiện nay, việc ứng dụng công nghệ sinh học phân tử được quan tâm rất nhiều
ở nước ta, thành tựu tiêu biểu nhất là kỹ thuật sinh học phân tử trong chuẩn đoán bất
thường phôi thai. Đây được xem là thành tựu mang tính tiên phong trong việc hạn

chế trẻ sơ sinh bất thường, góp phần nâng cao chất lượng dân số. Ứng dụng này sử
dụng kỹ thuật QF-PCR trong việc chẩn đoán hội chứng Down và các bất thường về
số lượng nhiễm sắc thể,triển khai các chuẩn đoán di truyền cho các bệnh phổ biến
khác như bệnh Hemophilia, giải trình tự DNA, chuẩn đoán đột biến gen AZF gây
hiếm muộn, chuẩn đoán nhiễm CMV và Rubella thai kỳ.
Một số thành công gần đây của kỹ thuật sinh hoc phân tử là ứng dụng PCR với
giải trình tự trong chẩn đoán định danh nguyên nhân viêm mũ nội nhãn nội sinh do
vi khuẩn, xác định một số loài sâm thuộc chi PANAX, trong xét nghiệm vi sinh lâm
sàng định danh vi khuẩn kị khí, phát hiện chất lượng các sản phẩm probiotic cho
người và cho thủy sản. Và ứng dụng trong xây dựng lý lịch 16S rDNA của các
chủng vi khuẩn dung trong kiểm chuẩn, làm xét nghiệm dịch vụ định danh vi
khuẩn…
3. Mục đích nghiên cứu
 Ly trích và thu nhận DNA genomic từ mẫu vi khuẩn đã phân lập trong quá
trình trồng ủ rơm.

2


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

 Xác định nhóm vi khuẩn bằng phương pháp PCR của đoạn gene 16S rNDA
dựa trên cặp mồi 27F và 1492R. Trình tự cặp mồi 27F 5‘-GA GTT TGA
TCM TGG CTC AG-3‘, 1492R 5'-GG CTA CCT TGT TAC GAC TT-3'
 Tiến hành tinh sạch đoạn gene 16S rDNA và giải mã trình tự đoạn gene này.
 Kiểm tra độ tinh sạch của đoan gene 16s rDNA bằng phương pháp DGGE
trong xác định loài.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
 Ly trích và thu nhận DNA genomic trực tiếp từ chủng vi khuẩn đã phân lập
trong quá trình ủ rơm.

 Xác định nhóm vi khuẩn bằng phương pháp khuếch đại đoạn gene 16S
rDNA, điện di và kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose.
 Tinh sạch sản phẩm PCR và giải mã trình tự đoạn gene 16S rDNA của mỗi
chủng vi khuẩn xem chúng có thuần hay không.
 Nếu mẫu không thuần thì khuếch đại vùng V3 thuộc đoạn gene 16S rDNA
bằng phương pháp DGGE, điện di và kiểm tra sản phẩm PCR trên gel
acrylamide biến tính.
 Kiểm tra nồng độ DNA và tiến hành chạy DGGE để cho kết quả tinh sạch
đoạn gene 16S rDNA được chính xác.
5. Phương pháp nghiên cứu
 Ly trích và thu nhận DNA genomic bằng quy trình nhiệt.
 Khuếch đại đoạn gene 16S rDNA của mỗi chủng vi khuẩn bằng phương
pháp PCR.
 Tinh sạch đoạn gene 16S rDNA bằng QIAGEN Kit.
 Giải mã trình tự đoạn gene 16S rDNA bằng quy trình Applied Biosystems
 Khuếch đại vùng V3 của đoạn gene 16S rDNA bằng phương pháp DGGE để
kiểm tra độ nhiễm DNA.
6. Kết quả nghiên cứu
 Ly trích và thu nhận DNA genomic của chủng vi khuẩn

3


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

 Xác định được mỗi chủng vi khuẩn dựa vào sự khuếch đại đoạn gene 16S
rDNA bằng phương pháp PCR.
 Giải mã trình tự được đoạn gene 16S rDNA của mỗi chủng vi khuẩn.
 Xác định được chủng vi khuẩn của vùng V3 thuộc đoạn gene 16S rDNA
bằng phương pháp DGGE.

 Kiểm tra được nồng độ DNA và độ tinh sạch của đoạn gene 16S rDNA trong
quá trình xác định loài.
7. Kết cấu của Đồ án tốt nghiệp
Đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương:
 Chương 1: Tổng quan.
 Chương 2: Vật liệu và phương pháp.
 Chương 3: Kết quả và thảo luận.
 Chương 4: Kết luận và kiến nghị.

4


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về nhóm vi sinh vật
Vi sinh vật (microorganisms) là tên gọi chung để chỉ tất cả các sinh vật có
hình thái nhỏ bé nuốn thấy được mà phải dùng dưới kính hiển vi.
Vi sinh vật không phải là một nhóm riêng biệt trong sinh giới. Chúng thậm chí
thuộc nhiều giới (kingdom) sinh vật khác nhau. Giữa các nhóm có thể không có
quan hệ mật thiết với nhau. Chúng có thể có chung những đặc điểm vể kích thước,
sinh lí, sinh hóa..
Khoa học phát triển thì vai trò của vi sinh vật được ứng dụng càng nhiều
trong sản xuất và đời sống, nó mang lại hiệu quả lớn. Ví dụ như việc chế vaccine
phòng bệnh, sản xuất chất kháng sinh và các dược phẩm quan trọng khác…Đặc biệt
trong bảo vệ môi trường, người ta đã sử dụng vi sinh vật làm sạch môi trường, xử lý
các chất thải độc hại. Sử dụng vi sinh vật trong việc tạo chế phẩm sinh học, phân
bón sinh học và thuốc trừ sâu bảo vệ thực vật không gây độc hại cho môi trường
bảo vệ sự cân bằng sinh thái.
Trong thiên nhiên ngoài những nhóm vi sinh vật có ích như trên, còn có

những nhóm vi sinh vật gây hại. Ví dụ như các nhóm vi sinh vật gây bệnh cho
người, động vật và thực vật, các nhóm vi sinh vật gây ô nhiễm thực phẩm, ô nhiễm
các nguồn nước, đất, không khí…Nếu nắm vững cơ sở sinh học của tất cả các quá
trình có lợi hay có hại trên thì sẽ có những biện pháp khoa học để phát huy những
mặt có lợi và hạn chế những mặt gây hại của vi sinh vật, đặc biệt trong bảo vệ môi
trường xung quanh ta sống.
1.2.

Các phương pháp ly trích và thu nhận DNA genomic
1.2.1.

Phương pháp ly trích và thu nhận DNA tổng số vi sinh vật trong

môi trường tự nhiên
Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng, mức độ đa dạng của vi sinh vật thay đổi
theo môi trường. Những vi sinh vật tìm thấy thường là những tế bào đơn hoặc tập
đoàn vi sinh vật. Sự phức tạp tính di truyền của cộng đồng vi sinh vật được đánh giá

5


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

thông qua việc xác định bởi tổ hợp DNA, chưa kể sự có mặt của những bộ gene
hiếm và những vi sinh vật chưa được khám phá. [14]
Sự ra đời kỹ thuật dựa trên phân tử nucleic acid đã dẫn đến sự thay đổi lớn
trong phát hiện vi sinh vật trong môi trường tự nhiên. Với những kỹ thuật này đã
phát hiện một số thay đổi lớn về việc tìm hiểu cấu trúc và sự vận động của các vi
sinh vật cộng đồng trong tự nhiên. Mặc dù các phương pháp trong kỹ thuật dựa trên
phân tử acid nucleic này đã phá vỡ những hạn chế trong việc chọn lọc và tính chất

đặc trưng trong việc ly trích DNA. Sự phục hồi tính đa dạng của vi khuẩn chịu ảnh
hưởng của việc ly trích DNA từ đất (Laurent et al. 2001). Độ tinh khiết của DNA từ
đất và compost thường không đạt yêu cầu, đặc biệt trong trường hợp đất giàu hợp
chất humic (Courtois et al. 2001). Sự hiện diện của hợp chất humic trong môi
trường tự nhiên sẽ cản trở sự phát hiện DNA, đo lường và tinh sạch (Chu et al.
1996). Vì vậy lựa chọn các phương pháp ly trích và tinh sạch là rất quan trọng cho
DNA của vi sinh vật từ môi trường tự nhiên. [16]


Một số phương pháp trích ly DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự
nhiên:

 Phương pháp SDS (Sodium docetyl sulfate): đây được xem là phương pháp
thích hợp nhất cho việc ly trích DNA của vi sinh vật. Đặc biệt là ly trích DNA từ
đất vùng rễ nơi mà tập trung nhiều cộng đồng vi sinh vật. Sử dụng phương pháp
SDS có thể loại bỏ các hợp chất Humic có trong đất, 1 hợp chất gây cản trở phát
hiện DNA. [16]
 Phương pháp CTAB (Cety- trimetyl- anmoniumbromide): Đây là phương
pháp trong chiết suất acid nucleic có hiệu quả cao và đang được sử dụng phổ biến
hiện nay. CTAB là dung môi có khả năng hòa tan cao acid nucleic, vì vậy mà
CTAB được dùng với vai trò là chất chính trong tách chiết acid nucleic. [16]
 Phương pháp PVP (polyvinylpolypyrrolidone): Đây là phương pháp tách
chiết acid nucleic hiệu quả. Trong thành phần dung dịch đệm ly trích có sử dụng
chất PVP, nó đóng vai trò ràng buộc các tạp chất có trong đất và loại bỏ chúng giúp
ly trích DNA dễ dàng hơn. [16]

6


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

 Phương pháp đóng băng và tan băng: Đây là phương pháp dùng kỹ thuật
đóng băng và tan băng ở nhiệt độ -650C trong 3 chu trình nhằm phá vỡ vách tế bào,
giải phóng các thành phần bên trong tế bào, tạo điều kiện thuận lợi cho việc ly trích
DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên. [16]
1.2.2.

Phương pháp ly trích và thu nhận DNA tổng số vi sinh vật từ dịch

nuôi cấy
Để ly trích DNA tổng số từ dịch nuôi cấy vi sinh vật, có thể áp dụng nhiều quy
trình khác nhau, nhưng trong bài báo cáo này sử dụng quy trình ly trích DNA
genomic bằng nhiệt. Sau khi ly trích, DNA tổng số được điện di trên gel agarose
1% ở điện thế 110V trong 45 phút và đo Nanodrop để xác định nồng độ và độ tinh
sạch. Phương pháp này sử dụng nhiệt để làm biến tính DNA. Do ở nhiệt độ cao (94950C) thì DNA mạch đôi được phân tách thành hai DNA mạch đơn. Điều này này
giúp cho việc ly trích DNA đạt hiệu quả cao nhất.
1.3. Các ứng dụng của phương pháp PCR
1.3.1.

Ứng dụng phương pháp PCR trong xác định trình tự nucleic acid

Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên sự phối hợp giữa phương pháp
PCR và phương pháp sử dụng các dideoxynucleotide. Phương pháp này chỉ sử dụng
được khi vùng cần xác định trình tự đã được biết trước và ứng dụng chủ yếu là
nhẳm phát hiện nhanh một đột biến điểm.
Trước hết đoạn DNA cần xác định trình tự được khuếch đại bằng phương
pháp PCR. Sau đó, hai mạch của phân tử được tách rời nhau. Mỗi mạch được bắt
cặp với một mồi. Phản ứng tổng hợp xảy ra tương tự trong các phương pháp
enzyme hay sử dụng dideoxynucleotide.
1.3.2.

Ứng dụng phương pháp PCR trong quá trình xác định loài vi sinh

vật
Ngày nay phương pháp PCR ngày càng có nhiều ứng dụng rộng rãi trong công
nghệ sinh học phân tử và kỹ thuật gene. Hiện nay trong nghiên cứu để xác định loài
vi sinh vật thì phương pháp PCR đóng vai trò vô cùng quan trọng vì có độ nhạy rất
cao, thao tác cũng rất đơn giản. Phương pháp PCR được xem là bước khởi đầu của

7


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

các nghiên cứu tiếp theo. Chính vì vậy phương pháp này càng được các nhà khoa
học sử dụng nhiều trong các nghiên cứu khoa học.
Để xác định loài vi sinh vật thì điều đầu tiên là phải chọn được đại phân tử
phù hợp để nghiên cứu trình tự của DNA. Để có thể giải trình tự các đoạn gene
mong thi muốn, thì phải khuếch đại chúng bằng phương pháp PCR. Từ đó người ta
nghiên cứu về các trình tự DNA để thiết lập cây phát sinh chủng loại từ các phân tử
này.
Tiến hành PCR khuếch đại những đoạn gene đặc trưng của các loài vi sinh vật
nghiên cứu dựa trên những cặp mồi đặc trưng của từng loài vi sinh vật. Mỗi vi sinh
vật đều có những cặp mồi chuyên biệt để có thể dựa vào đó chúng ta có thể dễ dàng
xác định được chúng.
Sử dụng phương pháp PCR để xác định giống Lactobacillus được thực hiện
thông qua việc sử dụng cặp mồi chuyên biệt cho giống Lactobacillus gồm: Lac 1 và
Lac 2, trình tự các cặp mồi này như sau:
 Lac 1: 5’ – AGC AGT AGG GAA TCT TCC A – 3’
 Lac 2: 5’ – ATT CCA CCG CTA CAC ATG – 3’

Phản ứng khuếch đại đoạn gene 16S rDNA được thực hiện với hai mổi chuyên
biệt cho giống Lactobacillus gồm Lac 3 và Lac 4, trình tự các mồi như sau:
 Lac 3: 5’ – GGA AAC AGA TGC TAA TAC CG – 3’
 Lac 4: 5’ – CAC CGC TAC ACA TGG AG – 3’
Sử dụng phản ứng PCR khuếch đại đoạn gene D1/D2 26S rDNA và đoạn gene
ITS 5,8S rDNA đặc trưng cho nấm men.
Các cặp mồi được sử dụng khuếch đại đoạn gene D1/D2 26S rDNA, ITS 5,8S
rDNA đặc trưng cho nấm men.
Trình tự cặp mồi NL và ITS
 Cặp NL: NL 4 5’ – GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG – 3’
NL 4 5’ – GGT CCG TGT TTC AAG ACG G – 3’
 Cặp ITS: ITS1 5’ – TCC GTA GGT GAA CCT GCG G – 3’
ITS4 5’ – TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC – 3’

8


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Phương pháp PCR là một phương pháp được ứng dụng rộng rãi trong việc xác
định loài vi sinh vật. Đối với loài vi sinh vật cũng vậy, người ta sử dụng phương
pháp PCR để khuếch đại những đoạn gene của vi khuẩn. Kết quả thu được từ những
phản ứng PCR là thu nhận những đoạn gene với kích thước như mong muốn.
Mỗi loài vi khuẩn đều có những cặp mồi chuyên biệt. Dựa trên những cặp mồi
chuyên biệt này kết hợp với những yếu tố cần thiết trong phản ứng PCR thì việc xác
định loài vi khuẩn trở nên đơn giản hơn.
Trên thực tế người ta muốn xác định loại vi khuẩn thì không thường thì người
ta sử dụng phương pháp PCR để khuếch đại đoạn gene 16S rDNA của vi khuẩn với
những cặp mồi chuyên biệt.
1.3.3.

Ứng dụng phương pháp PCR trong phát hiện các tác nhân vi sinh

vật gây bệnh nhiễm trùng
Nguyên tắc của PCR là khuếch đại đoạn DNA đích trong ống nghiệm phản
ứng để sau đó phát hiện chúng, do vậy PCR nay đang trở thành một công cụ chẩn
đoán nhạy cảm nhất, cho đến nay chưa có thử nghiệm nào sánh kịp, để phát hiện
các tác nhân vi sinh vật gây bệnh (ngay cả các vi sinh vật không thể phát hiện được
bằng các xét nghiệm khác) trong các bệnh phẩm khác nhau.
1.3.4.

Ứng dụng phương pháp PCR trong quá trình thúc đẩy nhanh

công nghệ giải trình tự
Nhờ có công cụ PCR trong kỹ thuật giải trình tự gene mà các nhà khoa học có
thể hoàn tất được công trình giải mã bộ gene người sớm hơn dự định trên 10 năm và
từ kết quả của công trình trình này, nhiều cánh cửa mới của y sinh học đã được mở
với vô vàn các ứng dụng đầy triển vọng trong công nghệ dược phẩm protein, trong
sinh-tin học (bio-informatic), trong chẩn đoán bệnh bằng các gen-chip. Lý do để nói
PCR là đòn bẩy để thúc đẩy nhanh công nghệ giải trình tự là vì nhờ có PCR mà các
nhà khoa học đã thay đổi được phản ứng giải trình tự trong phương pháp giải trình
tự với hiệu quả phản ứng tốt hơn rất nhiều và nhạy hơn rất nhiều. Ngoài ra, cũng
nhờ có PCR mà các sản phẩm giải trình tự sẽ được nhân bản thành nhiều bản sao

9


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

đồng nhất về chiều dài và trình tự, do vậy mà sẽ có được kết quả giải trình tự chính

xác hơn. Với PCR kết hợp giải trình tự, nhà nghiên cứu có thể giải trình tự trọn vẹn
DNA hay RNA bộ gene của virus gây bệnh có trong mẫu thử mà không cần phải
nuôi cấy được virus này vào tế bào bằng cách thiết kế các mồi đặc hiệu cho từng
đoạn trên bộ gene mà các đoạn này có trình tự ở hai đầu trùng lắp nhau, rồi dung
PCR để khuếch đại các đoạn DNA này lên. Giải trình tự các sản phẩm PCR này,
cuối cùng so chuỗi để tìm những trình tự trùng lắp làm cơ sở để lắp ghép nối các
đoạn trình tự đã giải được với nhau thành trình tự DNA bộ gene hoàn chỉnh.
1.3.5.

Ứng dụng phương pháp PCR trong chẩn đoán và sàng lọc bệnh di

truyền
Có thể nói PCR là một công cụ duy nhất hữu hiệu trong phát hiện và sàng lọc
bệnh di truyền do sự biến gen ở mức độ phân tử mà các phương tiện di truyền tế
bào không thể phát hiện được. Không chỉ vậy, PCR còn là một công cụ hữu hiệu để
sàng lọc trước sanh các bệnh di truyền qua sự phát hiện các biến đổi gene ở mức độ
phân tử về mặt cấu trúc, ví dụ Thalassemia, Duchene… hay về số lượng như bệnh
lý tam thể 13, 18, 21…trên các mẫu tế bào lấy từ gai nhau, từ dịch ối của sản phụ
ngay trong những thời kỳ còn rất sớm của thai kỳ để giúp các nhà điều trị có biện
pháp can thiệp như chấm dứt thai kỳ sớm nhờ vậy mà gia đình không phải chịu
gánh nặng vì phải sanh những đứa con bị bệnh lý di truyền. Ngoài ra, PCR còn
được dung để phát hiện các cá nhân khỏe mạnh nhưng mang gene tiềm ẩn bệnh di
truyền, ví dụ bệnh Thalassemia, Duchene…để có thể có tham vấn tiền hôn nhân hay
trước sanh, nhờ vậy mà sẽ có thể làm giảm đi hay loại trừ một bệnh lý di truyền
trong quần thể, giảm được gánh nặng xã hội vì phải đối phó với bệnh lý di truyền
này.
1.4. Phương pháp DGGE và các ứng dụng
1.4.1.

Phương pháp DGGE

10


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DGGE là một kỹ thuật thường được sử dụng trong sinh học phân tử và đã trở
thành một yếu tố phân tích quan trọng trong cộng đồng vi sinh.
Phương pháp DGGE là một trong những phương pháp có độ nhạy cao, có thể
nhanh chóng cung cấp đầy đủ những đặc tính đặc trưng của sự đa dạng về thành
phần của cộng đồng vi sinh. Đồng thời sự thay đổi của cộng đồng vi sinh vật cũng
có thể dễ dàng được chứng minh.
Để có thể thực hiện được phân tích DGGE, thì nó đòi hỏi một số lượng đáng
kể DNA để có thể phát hiện, kèm theo là một chuỗi phản ứng dây chuyền
polymerase (PCR) phải được thực hiện trước khi phân tích.
Phân tích DGGE được sử dụng cho việc tách các mảnh DNA sợi đôi giống hệt
nhau về chiều dài, nhưng khác nhau về trình tự. Trong thực tế, điều này đề cập đến
việc tách các đoạn DNA thông qua việc khuếch đại một đoạn gene mong muốn
bằng phương pháp PCR, kỹ thuật khai thác (trong số những yếu tố khác) sự khác
biệt trong kết nối ổn định GC (3 liên kết hydro cho mỗi kết nối) trái ngược với kết
nối AT (2 liên kết hydro). Một hỗn hợp gồm các đoạn DNA khác nhau của trình tự
khác nhau được điện di trong một môi trường acrylamide gel có nồng độ từ thấp tới
cao. Đồng thời, trong gel acrylamide các sợi đôi đoạn DNA di chuyển tốt hơn, trong
khi các phân tử DNA biến tính lại trở nên ít hiệu quả hơn hoặc không di chuyển
trong gel. Nói chung, các đoạn DNA GC sẽ ổn định hơn và vẫn còn sợi đôi cho đến
khi đạt đến nồng độ cao hơn nồng độ ban đầu. Như vậy, các đoạn DNA của chuỗi
khác nhau có thể được tách trong gel polyacrylamide.
1.4.2.

Ứng dụng của phương pháp DGGE trong việc tìm hiểu những đột

biến sinh học của quần thể vi sinh vật
Để phân tích cấu trúc của tập đoàn vi khuẩn nguyên thủy hay là mẫu môi
trường thì kỹ thuật DGGE thường được sử dụng nhằm phân tích đoạn DNA có cùng
kích thước nhưng khác nhau về trình tự nucleotide có thể phân tách riêng trong môi
trường điện di (Watanabe et al.,2001; Jackson et al., 2000; Heuer et al., 1997).

11


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Thêm vào đó phương pháp này còn cho phép phân tích cả những đoạn gene có
kích thước nhỏ hơn đoạn 16S rRNA thường được nhân bởi cặp mồi thông dụng
(universal primers) (Heuer et al., 1997; Muyzer et al.,1996; Watanabe et al., 2001).
Bên cạnh đó, người ta có thể xác định trình tự của cả những vi sinh vật nuôi cấy
được và không thể nuôi cấy được trong điều kiện invitro. [6]
Ứng dụng trong bài nghiên cứu này là kiểm tra độ tinh sạch của đoạn
gene 16S rDNA của vi khuẩn để đưa ra kết luận chính xác và đạt độ tin cậy cao
trong xác định chủng, loài.
1.5.

Định danh nhóm vi khuẩn
Việc phân loại định danh vi khuẩn cần phải khảo sát các đặc điểm hình thái và

các đặc tính sinh lí, sinh hóa của vi khuẩn. Đồng thời, phương pháp sinh học phân
tử giải trình đoạn gen đặc trưng của vi khuẩn cũng được tiến hành để cho kết quả
nhanh chóng và chính xác.
1.5.1.

Định danh bằng phương pháp truyền thống

1.5.1.1. Phân biệt bằng thực khuẩn thể
Các vi khuẩn có độ mẫn cảm với thực khuẩn thể khác nhau. Có thực khuẩn
thể xâm nhiễm làm tan tế bào ngay lập tức để sau đó thực khuẩn thể nhân lên thành
các hạt trong tế bào chủ, trong khi đó với một số vi khuẩn thì thực khuẩn thể xâm
nhiễm nhưng lại không làm tan tế bào vi khuẩn và chúng cùng tồn tại với tế bào vật
chủ. Dựa vào sự khác biệt này mà người ta dùng các thực khuẩn thể khác nhau để
phân biệt các đối tượng vi khuẩn nghiên cứu. [7]
Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm khó giải quyết
là các đặc tính mẫn cảm của vi khuẩn với thực khuẩn thể lại thay đổi do điều kiện
ngoại cảnh hoặc là vi khuẩn lại có mức độ mẫn cảm khác nhau đối với các thực
khuẩn thể khác nhau. Mặt khác nữa, thực khuẩn thể rất dễ thay đổi các đặc tính do
đó cũng làm thay đổi cơ chế xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ. [7]
1.5.1.2. Phân biệt theo Typ huyết thanh

12


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Đây là phương pháp được dùng khá lâu nhưng rất hiệu quả và hiện vẫn đang
được sử dụng (ví dụ nhóm vi khuẩn Bt). Nguyên tắc là dựa vào nhóm quyết định
kháng nguyên trên tế bào vi sinh vật (bề mặt tế bào tiên mao hoặc protein vỏ). Ưu
thế của phương pháp này là các kháng huyết thanh được dùng để biệt hóa nhiều chi
khác nhau, trong nhiều trường hợp đặc trưng cho loài. Nói chung đây là phương
pháp khá ổn định nhưng hạn chế chủ yếu của phương pháp này ở chỗ: yêu cầu kỹ
thuật sản xuất kháng huyết thanh và tiêu chuẩn hóa phản ứng kháng huyết thanh
không đồng nhất tại các phòng thí nghiệm và tính ổn định giữa các lần lặp lại. [7]
1.5.1.3. Phân biệt bằng loại hoạt chất kháng khuẩn (Bacteriocin)

Bacteriocin bản chất là peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại
vi khuẩn khác. Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng
kháng lại chính bacteriocin đó. Bởi vậy có nhiều loại vi khuẩn đã được phân loại
dựa vào kiểu bacteriocin. [7]
1.5.1.4. Phân biệt bằng các định tính sinh lí, sinh hóa
Là những chủng vi sinh vật có khả năng sống và phát triển tốt ở nhiệt độ khá
cao từ 550C đến 800C. Các chủng vi sinh vật thường thấy có khả năng chịu nhiệt là
những chủng có khả năng sinh bào tử, xạ khuẩn... Các enzyme và các chất mang
của nhóm vi khuẩn này đều được cân bằng ở nhiệt độ khá cao. Hầu hết chúng đều
cần nguyên tố lưu huỳnh để phát triển. Vì vậy thường gặp ở những nơi có hàm
lượng lưu huỳnh cao và nhiệt độ thích hợp như trong các suối nước nóng, các khu
vực gần núi lửa hoạt động hoặc phân ủ, rơm ủ trồng nấm rơm.
Tùy thuộc vào cấu trúc màng khác nhau mà vi khuẩn có thể chịu được áp suất
thẩm thấu cao hay thấp. Điều này giải thích vì sao có loài sống được trên môi
trường có nồng độ đường hay muối cao nhưng có loài thì không tồn tại được trên
môi trường đó.
Khả năng biến dưỡng của vi khuẩn cũng được dùng để định danh vi khuẩn vì
các loài vi khuẩn có khả năng đồng hóa các nguồn carbon, nitơ, khả năng lên men
đường, khả năng chuyển hóa sinh citrate, phân giải ure, sinh H2S…không giống
nhau.

13


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Mỗi loài vi khuẩn đều có nhiều loại enzyme khác nhau. Chủng loại của các
enzyme này quyết định các đặc điểm kiểu hình, các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn.
Định danh nhóm vi khuẩn bằng sinh học phân tử

1.5.2.

Ngày nay những tiến bộ trong sinh học phân tử đã mở ra khả năng ứng dụng
hữu hiệu trong phân loại học và nghiên cứu đa dạng vi sinh vật. Nếu như các
phương phap truyền thống chỉ tập trung trên một số đối tượng vi sinh vật thì
phương pháp sinh học phân tử có thể áp dụng trên mọi đối tượng
1.5.2.1. Thước đo tiến hóa
Thước đo tiến hóa dùng để đo sự thay đổi về mặt tiến hóa trên các đại phân tử
của tế bào. Sự khác nhau vể trình tự các nuleotide haya cid amin của các đại phân tử
được tách chiết sẽ cho biết khoảng cách tiến hóa giữa hai sinh vật đó. Số lượng thay
đổi này tỷ lệ với số lượng thay đổi do đột biến bền vững trên phân tử DNA. Khi có
các đột biến khác nhau trên các quẩn thể khác nhau thì xảy ra hiện tượng tiến hóa
sinh học và kết quả dẫn đến là sự đa dạng sinh học. [9]
1.5.2.2. Xác định thước đo tiến hóa thích hợp
Muốn xác định mức tiến hóa chính xác giữa các sinh vật thì cần phải chọn một
đại phân tử phù hợp để nghiên cứu trình tự của DNA. Đại phân tử này đảm bảo các
yêu cầu sau :
 Tồn tại ở tất cả các sinh vật.
 Có cùng chức năng trong các sinh vật.
 Sắp xếp một cách thích hợp trình tự của 2 phân tử để xác định được
các vùng trình tự tương đồng và các vùng trình tự không tương đồng.
 Trình tự của phân tử được chọn nên thay đổi một cách tỷ lệ với
khoảng cách tiến hóa được đo. Trên thực tế khoảng cách phát sinh rộng nhưng tốc
độ thay đổi của các trình tự chậm hơn. Một phân tử đã trải qua rất nhiều sự biến đổi
về trình tự thì không thể sử dụng làm công cụ xác định quan hệ tiến hóa vì các vùng
tương đồng của trình tự có thể biến mất.
Có rất nhiều phân tử được đề xuất làm thước đo tiến hóa và cũng có nhều
nghiên cứu về trình tự để thiết lập cây phát sinh chủng loài từ các phân tử này. Các

14

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

phân tử được đề xuất bao gồm : Cytochrome, hemoglobin, ferredoxin, gen mã hóa
cho một số protein và RNA ribosome. Trong các phân tử này thì pahn6 tử phù hợp
nhất là các gen mã hóa cho RNA ribosome – một thành phần quan trọng trong hệ
thống dịch mã. [9]
1.5.2.3. RNA ribosome – phân tử dùng làm thước đo tiến hóa
RNA ribosome (rRNA) có ở mọi sinh vật và có trình tự bảo tồn. Mức độ
tương đồng ở các trình tự rRNA giữa hai cá thể cho biết mối liên hệ về mặt tiến hóa
của chúng. Từ các phân tích này có thể xây dựng được cây phát sinh loài và chỉ ra
vị trí tiến hóa của các sinh vật với nhau.
RNA ribosome chiếm đến 80% tổng số RNA của tế bào. Tùy vào hệ số lắng
rRNA được chia thành nhiều loại: ở sinh vật Eukaryote có rRNA 26S, 18S, 5.8S và
5S, còn ở Prokaryote là 23S, 16S và 5S.
Ribosome của mọi tế bào bao gồm một tiểu đơn vị nhỏ và tiểu đơn vị lớn.
Mỗi tiểu đơn vị có mang protein và rRNA có kích thước khác nhau, chứa một số
vùng có trình tự bảo tồn và trình tự biến đổi.
RNA ribosome 16S ở Prokaryote và 18S ở Eukaryote được chọn làm thước đo
tiến hóa. Riêng đối với nấm men thì trình tự đoạn D1/D2 26S rRNA và vùng ITS
5.8S rRNA được sử dụng phổ biến để xây dựng cây phát sinh chủng loài.
Đoạn mồi được sử dụng để khuếch đại đoạn D1/D2 26S rRNA là cặp mồi
NL1 và NL4, còn đoạn ITS 5.8S rRNA thì sử dụng cặp mồi ITS1 và ITS4.
1.5.2.4. Giải trình tự đoạn gene đặc trưng
Trước khi giải trình tự đoạn gene mong muốn, ta cần phải khuếch đại chúng
bằng phương pháp PCR.
 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Phương pháp PCR do Karl Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985, là một
cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử. Đây là một kỹ thuật sinh hóa và sinh

học phân tử hiện đại cho sự khuếch đại nhanh đoạn DNA thông qua con đường sao
chép của enzyme bên ngoài sinh vật sống. Hiện nay, PCR đã trở thành kỹ thuật
thông dụng được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm sinh học và y dược

15