Phân lập và tuyển chọn và xác định môi trường nhân sinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Phân lập và tuyển chọn và xác định môi trường nhân sinh
khối của các chủng Azotobacter spp trong đất trồng phục vụ
sản xuất phân bón vi sinh

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN THỊ HAI
Sinh viên thực hiện
MSSV: 0851110255

:MAI THỊ QUỲNH TRÂN
Lớp: 08DSH1

TP. Hồ Chí Minh, <2011>


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Song song với sự phát triển không ngừng của các ngành công nghiệp thì
nông nghiệp ở nước ta cũng đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể nhờ tiến bộ của

khoa học kĩ thuật, làm cho năng suất và chất lượng cây trồng tăng lên gấp nhiều lần.
Trong nông nghiệp, đạm được xem là nguồn dinh dưỡng rất quan trọng đối với cây
trồng. Việc cung cấp đạm cho cây trồng từ phân bón là vô cùng quan trọng nhằm
đáp ứng nhu cầu sinh trưởng, phát triển của cây và phần nào bù đắp lại lượng đạm
mà cây trồng đã lấy đi từ đất qua các vụ mùa.
Khi bón phân đạm vào đất, cây trồng chỉ hấp thu khoảng 40 - 50% lượng phân bón,
lượng còn lại bị nước mưa, nước tưới rửa trôi, hoặc bị chuyển hóa và bốc hơi ở
dạng NH3, NOx, N2. Bên cạnh đó, sự lạm dụng quá nhiều phân bón hóa học để gia
tăng năng suất đã làm cho đất đai ngày càng bạc màu, độ phì nhiêu kém dần, tình
trạng ô nhiễm nguồn nước mặt gây nên hiện tượng nước nở hoa, ảnh hưởng trực
tiếp đến sức khỏe và môi trường sống của con người cũng như các sinh vật khác
trong tự nhiên (Shenoy và ctv, 2001; Huỳnh Thu Hòa, 2006). Vì vậy, việc gia tăng
bón phân đạm hóa học chỉ là giải pháp tạm thời, không thể áp dụng lâu dài bởi
chúng phát sinh nhiều mối lo ngại.
Hiện nay, phân vi sinh có nhiều ưu điểm hơn hẳn so với phân hóa học nhờ
tác dụng nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng, giảm chi phí sản suất thì phân
vi sinh còn góp phần quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và phát triển nông
nghiệp bền vững. Tuy nhiên tình hình sản xuất phân vi sinh ở nước ta vẫn chưa đáp
ứng đủ nhu cầu thực tiễn sản xuất của nền nông nghiệp, do quy mô sản xuất nhỏ,
chất lượng sản phẩm chưa hoàn thiện và ổn định. Do đó, nghiên cứu để hoàn thiện
và nâng cao chất lượng phân vi sinh là việc làm hết sức cần thiết. Trong đó, việc
phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật là khâu đầu tiên và quan trọng trong
quy trình tạo ra chế phẩm [7].
Thời gian gần đây việc nghiên cứu và sử dụng phân sinh học có nguồn gốc
từ vi sinh vật, đã được nhiều nước trên thế giới quan tâm nhằm tạo ra một sản phẩm
sạch, giảm bớt chi phí đầu tư sản xuất trong nông nghiệp và bảo vệ môi trường

1

Đồ án tốt nghiệp

hướng tới xây dựng một nền nông nghiệp bền vững. Và một trong những hướng
nghiên cứu đang được chú ý nhiều nhất hiện nay là sản xuất phân sinh bón vi sinh
cố định đạm có nguồn gốc từ vi sinh vật với chủng Azotobacter spp là chủng được
quan tâm nhiều nhất vì nhiều đặc điểm thuận lợi như khả năng cố định đạm tự do
trong không khí, tổng hợp nhiều chất kích thích sinh trưởng thực vật IAA, GA3…
làm hệ thống rễ phát triển vững chắc, hấp thu nước và chất dinh dưỡng tốt (Okon,
1985) góp phần nâng cao độ phì nhiêu của đất, kích thích tăng trưởng, tăng năng
suất cây trồng, hạn chế bón phân hóa học và phát triển nền nông nghiệp sinh thái
bền vững [11]
Xuất phát từ thực tế đó, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tuyển
chọn và xác định môi trường nhân sinh khối của các chủng Azotobacter spp
trong đất trồng phục vụ sản xuất phân bón vi sinh”.
2. Mục tiêu của đề tài
Phân lập và tuyển chọn được một số chủng Azotobacter cố định đạm cao
trong đất trồng.
Xây dựng quy trình nhân sinh khối một số chủng Azotobacter có hoạt tính cố
định đạm làm phân sinh học chuyên dụng cho cây trồng.
3. Ý nghĩa của đề tài
Ý nghĩa khoa học
-

Xác định được một số chủng Azotobater spp có khả năng cố định đạm ứng
dụng trong sản xuất phân bón vi sinh

-

Thiết lập quy trình nhân giống, nhân sinh khối

Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài là cơ sở cho việc lựa chọn các chủng Azotobacter spp có
hoạt tính cố định đạm để sản xuất phân vi sinh có hiệu quả, nâng cao độ phì nhiêu
của đất, hạn chế bón phân hóa học, tăng năng suất cây trồng và góp phần phát triển
một nền nông nghiệp sinh thái bền vững.

2


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Tổng quan về vi sinh vật cố định Nitơ (N)

1.1.1. Chu trình Nitơ trong tự nhiên
Nitơ là nguồn dinh dưỡng quan trọng không thể thiếu đối với động vật, thực vật
và ngay cả đối với các loài vi sinh vật. Dự trữ nitơ trong tự nhiên rất lớn trong
không khí, nitơ chiếm 78,16% thể tích. Người ta ước tính rằng, trong bầu không khí
bao trùm lên một hecta đất đai chứa tới 8 triệu tấn nitơ. Lượng nitơ này có thể cung
cấp cho cây trồng tới hàng chục triệu năm (nếu như cây trồng có khả năng đồng hóa
nó). Trong cơ thể các loại sinh vật trên trái đất cũng có khoảng 0,4 x 109 tấn nitơ.
Trong các vật trầm tích chứa khoảng 4 x 1015 tỷ tấn nitơ.
Cây trồng không đồng hóa trực tiếp nitơ hữu cơ, mà phải nhờ các loại vi sinh vật
phân hủy và chuyển hóa nguồn nitơ bền vững thành ra nitơ dạng dễ tiêu (NH3 hoặc
NH4+), cung cấp nguồn dinh dưỡng nitơ cho cây trồng, quá trình này được gọi là
quá trình amôn hóa.
Tiếp nối quá trình amôn hóa, các loài vi sinh vật lại chuyển hóa tiếp từ NH3
thành NO3- được gọi là quá trình nitrat hóa.

Tiếp theo của quá trình nitrat hóa, các loại vi sinh vật lại chuyển hóa từ NO3thành N2 để bù trả nitơ cho không khí được gọi là quá trình phản nitrat hóa.
Dưới tác dụng của các loại vi sinh vật, nitơ không khí được chuyển vào các hợp
chất hữu cơ chứa nitơ được gọi là quá trình cố định nitơ phân tử.
Tất cả các quá trình: cố định – phân hủy - chuyển hóa và phản nitrat hóa luôn xảy ra
dưới tác dụng của các loài vi sinh vật và tạo được thế cân bằng nitơ. Nhờ đó mà đã
khép kín được vòng tuần hoàn nitơ trong tự nhiên.

3


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.1 Vòng tuần hoàn nitơ trong tự nhiên

Hợp chất Nitơ
(protein, urea…)
Vi sinh vật thủy phân
Ammoniac

Tạo sinh
khối

Tế bào Nitơ hữu cơ

Tế bào thực vật

Phân hủy nội bào
NO2Khử
nitrat

Khí Nitơ

NO-3
Chất hữu cơ Carbon
Hình 1.2 Tóm tắt qúa trình chuyển hóa nitơ của vi sinh vật (theo
climategis.com)


Đồ án tốt nghiệp

1.1.2. Các vi sinh vật cố định Nitơ phân tử
Vi sinh vật cố định N có một vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoàn N2 và
cung cấp một lượng N đáng kể cho cây trồng. Theo tính toán của các nhà khoa học,
các nhóm vi sinh vật cố định N BNF (Biological nitrogen fixation) có thể cung cấp
tới 240 x 106 tấn N/năm trên cả hành tinh, gấp 6 lần lượng N mà cả thế giới sản
xuất bằng con đường hóa học.
Vi sinh vật cố định N là các nhóm vi sinh vật có khả năng chuyển hóa khí N2 dồi
dào trong khí quyển (79%) thành dạng NH4+ cung cấp cho cây. Có 2 nhóm vi sinh
vật cố định nitơ :1) nhóm vi sinh vật sống tự do và hội sinh; 2) nhóm vi sinh sống
cộng sinh
1)Nhóm vi sinh vật sống tự do và hội sinh co một số loài điển hình sau:
Vi khuẩn Azotobacter
Vi khuẩn Beijerinskii
Vi khuẩn Clostridium
2)Nhóm vi sinh vật sống cộng sinh có một số loài điển hình sau:
Rhizobium
Azospirillum
Một số vi sinh vật cố định đạm khác
Ngoài những giống vsv cố định nitơ phân tử nói trên, còn vô số những giống khác
đều có khả năng cố định nitơ phân tử, chúng có nhiều ý nghĩa trong sản xuất nông

lâm, ngư nghiệp.
 Vi

khuẩn:

Pseudomonas

Azotomonas

insolita,

Azotomonas

fluorescens,

azotogenis,Klebsiella

pneumonia,;

Aerobacter

aerogene, Rhodospirillum rubrum,Chromatium sp,Chlorobium sp,
Rhodomicribium spp,Desulfovibrio desulfuricans; Methanobacterium
spp…
 Xạ khuẩn : Một số loài thuộc giống: Actinomyces, Frankia, Nocardia,
 Actinopolyspora,…
 Tảo – Vi khuẩn lam: Plectonema, Anabaena azolla,; Anabaena
 Ambigua, Anabaena cylindrica, Calothrix elenkii...

5

Đồ án tốt nghiệp

1.1.3. Quá trình cố định Nitơ phân tử
Trong suốt một thời gian dài, cơ chế của quá trình cố định nitơ vẫn là một bí
ẩn của tự nhiên. Trong khi con người đang sử dụng những điều kiện kỹ thuật rất cao
và tốn kém (400- 5000 C, 200-1000atm) để phá vỡ mối liên kết ba của phân tử nitơ.
Phân tử N2 (có năng lượng 9,4.105J/mol) thì các vi sinh vật cố định đạm lại
có thể đồng hóa ngay trong các điều kiện bình thường về áp suất và nhiệt độ. Những
nghiên cứu trong những năm gần đây đã cho thấy rõ được một phần cơ chế của quá
trình cố định nitơ là nhờ enzyme.
Quá trình cố định nitơ là quá trình khử N2 thành NH3 nhờ enzyme
nitrogenase với sự có mặt của ATP (andenozintriphotphat
N2+ AH2 + ATP -> NH3 + A + ADP + P (AH2 là chất cho e)
ADP: adenozin photphat.
ATP cấu tạo thành 3 nhóm base nitro adenine, đường ribose và 3 nhóm phosphate.
Bằng phương pháp sắc ký trên ICC ”120” BIP (Pháp) với cột sắc ký
poropak, ta nhận được và xác định được cường độ cố định nito phân tử theo hoạt
tính của nitrogenase.
Sau một thời gian nghiên cứu các nhà khoa học dần hoàn thiện cơ chế cố
định nito phân tử. Theo cơ chế mới nhất (1992) thì quá trình cố định nitơ phân tử
được chia theo hai hướng cơ bản: con đường khử và con đường oxi hóa.
Quá trình cố định nitơ được thể hiện bằng phương trình sau:
N2 → HN=NH → H2N - NH2 → NH3→ NH4OH
N2 + 8e- +16Mg.ATP + 8H + 16O

nitrogenase,

2NH3 + 16Mg.ADP +16P + H 2O.

Cơ chế của quá trình cố định nitơ này khá phức tạp và được làm sáng tỏ nhờ các
công trình nghiên cứu nhiều năm gần đây (Hardy, Bun, 1968; Mortenson, 1966,
1968; Hardetal, 1970; Bulen, Lecomte, 1966; Begersen, 1969; Silop, 1971…)
Nitrogenase là một phức gồm 2 protein chủ yếu: một protein MoFe (nitrogense,
MW 220000) liêm kết với 1-2 protein Fe (nitrogenase reductase, MW 64000)
Fe phân tử có khối lượng phân tử khoảng 6.104
Mo-Fe protein có khối lượng phân tử khoảng 2,2.105

6


Đồ án tốt nghiệp

Mo-Fe protein chứa hai nguyên tử Mo (molipden) và 28-32 nguyên tử Fe và 25-30
nguyên tử sắt không bề với axit.
Fe và Mo của protein Mo-Fe được chứa bên trong cột cofactor gọi là FeMo-co và
sự khử N2 diễn ra cofactor này.
Quá trình khử:
Trước hết protein Fe được khử bởi ferredoxin sau đó liên kết với ATP làm thay đổi
hình thể của protein Fe và hạ thấp thế khử của protein này ( từ 100mV- 400mV) tạo
điều kiện cho protein Fe khử protein MoFe. ATP bị thủy phân khi diễn ra sự chuyển
đổi electron này. Cuối cùng protein Mo-Fe khử chuyển các electron tới nitrogen
nguyên tử.
Electron của các chất khử (ferredoxin, ditionit) đi vào trung tâm chứa Fe của thành
phần II ( protein Fe) và tiếp tục chuyển thành phần enzyme (protein Mo-Fe).
Electron đã hoạt hóa sẽ đi theo mạch nguyên tử Fe để đến Mo, ở bên trong “hạt”,
Mo sẽ bị khử, nhờ đó có khả năng phản úng nhanh với N2.Phân tử N2 đi qua khe có
kích thước khoảng 4-5 0A, tức tương đương với chiều dài phân tử N2 vào bên trong
enzyme và được hoạt hóa ở đây.

Kết quả của quá trình nitrogenase hoạt hóa và hấp thụ hóa học nitơ sẽ làm đứt hai
dây nối trong số dây nối cực phân tử N2 năng lượng tiêu phí là 7,8.105j/mol. Dây
nối thứ basex bị cắt đứt khi tiếp xúc với hydro đã được hoạt hóa nhờ các enzyme
dihydrogenase và hệ thống hydrogenase. Sau đó NH3 hoặc sản phẩm khử sinh ra sẽ
liên kết axit để tạo thành axit amin.
Con đường oxi hóa:
N2 → N2O → (HNO)2 → NH4OH
Qua hai hướng đó người ta thu được kết quả sau:
Nếu nồng độ nitơ nhiều sẽ ức chế quá trình tạo nito phân tử. Hiệu suất cố định nitơ
phân tử của những vi sinh vật kỵ khí thường cao hơn vi sinh vật hiếu khí.tìm thấy
hợp chất loại khử khi nuôi các vi sinh vật cố định nitơ phân tử. Qua đó cho ta thấy
con đường khử có nhiều khả năng hơn.

7


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.3 Sơ đồ chuyển điện tử trong quá trình khử và oxi hóa N
1.2.

Vi khuẩn Azotobacter

1.2.1. Phân loại
Theo Fribram (1938) phân loại khoa học của Azotobacter được ghi nhận như sau:
Giới:

Vi khuẩn

Ngành :

Proteobacteria

Lớp:

Gammaproteobacteria

Bộ:

Pseudomonadales

Họ:

Azotobacteraceae

Chi :

Azotobacter

Azotobacter là vi khuẩn cố định nitơ sống tự do trong đất được nhà vi sinh vật Hà
Lan Beijerinckphân lập và nuôi cấy thuần khiết năm 1901.
Theo Becking (1974), Azotobacter spp có 4 loài đặc trưng sau A.chroococcum
 Beijerinckii
 A.vinelandii
 A.agilis

8


Đồ án tốt nghiệp

Theo FAO (1982) Azotobacter sppcó các loài phổ biến sau :
 A.chroococcum
 A.beijerinekii
 A.vinellandii
 A.insignis
 A.agilis
 A.macrocytogenes
 A.paspali
1.2.2. Đặc điểm hình thái
Azotobacter spp là vi khuẩn hiếu khí nhưng có thể phát triển trong điều kiện
vi hiếu khí, Gram âm không sinh bào tử.
Vi khuẩn Azotobacter khi nuôi cấy trong các môi trường nhân tạo thường
biểu hiện đặc tính đa hình. Hình dạng tế bào và chu kì biến đổi của chúng phụ thuộc
vào tuổi của ống giống và điều kiện phát triển.
Khi còn non tế bào có dạng que đầu tròn đứng riêng lẻ hay xếp thành từng
đôi chồng chất, chất tế bào nhuộm màu đồng đều, sinh sản bằng cách phân cắt có
khả năng di động nhờ tiên mao. Kích thước: 2,0-7,0 × 10-25 µm.
Khi già tế bào Azotobacter mất khả năng di động, kích thước thu nhỏ lại biến
thành dạng hình cầu. Khi già, tế bào thường được bao bọc lớp vỏ dày và tạo thàng
nang xác. Khi môi trường sống không thuận lợi như thay đổi nồng độ các chất dinh
dưỡng hoặc bổ sung một số chất hữu cơ như ethanol, butanol-n hoặc βhydroxybutyrate. Khi gặp điều kiện thuận lợi, nang xác sẽ nứt ra và tạo thành các tế
bào mới. Azotobacter spp ít hình thành nang trong môi trường lỏng
Trên môi trường đặc, khuẩn lạc của Azotobacter có dạng nhày, đàn hồi, khá
lồi, có khi ở dạng nhăn nheo. Khi già, khuẩn lạc có màu vàng lục, màu hồng hoặc
màu nâu đen. Màu sắc khuẩn lạc là một trong những tiêu chuẩn để phân loại các
loài Azotobacter.
Trong đất, Azotobacter spp thường phổ biến các loài sau:
Azotobacter chrococcum (đồng danh: Az.acidum, Az.araxii, Az.nigricans,
Az.galophilum, Az.unicapsulare, Az.woodswnii): Kích thước tế bào 2,0 x 3,1µm, có

9


Đồ án tốt nghiệp

khả năng tạo nang xác, có khả năng di động được, có tiêm mao. Khuẩn lạc khi già
có màu nâu đen, sắc tố không khuếch tán vào môi trường, có khả năng đồng hóa
mannit, ramnose, tinh bột.
 Azotobacter beijerinskii : Kích thước tế bào 2,4 x 5,0µm, có khả năng tạo
nang xác, không có tiêm mao, không di động được. Khi già có màu vàng
hoặc màu nâu sáng. Sắc tố không khuếch tán vào môi trường, có khả năng
đồng hóa mannit, ramnose, không đồng hóa tinh bột nhưng đồng hóa được
benzoat natri.
 Azotobacter vinelandii (đồng danh: Az.smyrnii, Az.hilgardii, Az.vitreum,
Az.fluorescens): Kích thước 1,5 x 3,4µm, có khả năng tạo nang xác, có tiên
mao, có khả năng di động. Sinh sắc tố màu vàng lục huỳnh quang, sắc tố
khuếch tán vào môi trường, có khả năng đồng hóa mannit, ramnose, benzoat
natri.
 Azotobacter agilis( đồng danh Az.agile- Azotobacter agile) : tế bào có kích
thước 2,8-3,3 µm, không tạo nang xác, có tiên mao có khả năng di động
được. Khi già khuẩn lạc có màu vàng lục huỳnh quang, sắc tố khuếch tán vào
môi trường, không có khả năng đồng hóa benzoate natri, mannit, ramnose.
1.2.3. Sự phân bố Azotobacter spp trong tự nhiên
Azotobacter spp chủ yếu phân bố ở trong đất và bao gồm 6 loài phổ biến
nhưng phân bố giữa các loài trong tự nhiên rất khác nhau chịu ảnh hưởng của nhiều
yếu tố. Phổ biến nhất là Az. Chroococum-đặc trưng trên đất đồng cỏ, một số loài
phân bố trong nước ao hồ đặc trưng có Az. Agilis và Az. Vinelandii còn Az. paspali
có thể được tìm thấy chỉ trong vùng rễ của cỏ.
Ở trong đất, số lượng Azotobacter spp thường là 102- 10 3/ gam đất.

(FAO,2007) Số lượng Azotobacter spp phân bố trong các loại đất khác nhau cũng
có sự khác nhau (Islam M. Z., Sharif D. I. and Hossain M. A, 2008). Azotobacter
spp thường có ở đất trung tính hoặc kiềm, ở đất có pH <6,0 ít xuất hiện Azotobacter.
Đồng thời Azotobacter spp cũng rất mẫn cảm với pH, chúng có thể phát triển được
ở pH 4,5-9,0 nhưng thích hợp nhất đối với Azotobacter là 7,2-8,2. Môi trường acid
rất bất lợi đối với sự phát triển và các hoạt động sống của Azotobacter và ảnh

10


Đồ án tốt nghiệp

hưởng xấu đến quá trình cố định nitơ của Azotobacter. Vì vậy sự phân bố của
Azotobacter spp cũng phụ thuộc vào pH.
Năm 1961, 148 mẫu đất được kiểm tra bởi Becking cho thấy tất cả các mẫu
đất có pH >7,5 đều có Azotobacter spp và trong khoảng pH 7-7,4; 6,5-6,9; 6,0-6,4
đều xuất hiện Azotobacter spp với tỷ lệ 89%, 57%, 32%. pH thấp giới hạn sự phát
triển của Azotobacter spp. Jensen (1965) cho thấy Azotobacter spp được tìm thấy ở
PH >6,0.
Nguyễn Thu Hà, Nguyễn Ngọc Quyên, Vũ Minh Đức, Ngô Tự Thành
(2003), đã phân lập được 18 chủng Azotobacter từ 50 mẫu đất trồng , phần lớn ở
các mẫu có pH 5,15- 7,75. Các chủng thu nhận từ đất khô tồn tại tốt trong điều kiện
nuôi cấy nhân tạo. Các chủng phân lập từ đất ẩm dễ bị chết sau một thời gian dài
bảo quản trong ống nghiệm và dễ bị nhầm lẫn với Azomonas.(một loại vi khuẩn cố
định nitơ giống Azotobacter spp nhưng không hình thành bào nang)
Phần lớn các loài Azotobacter chỉ phát triển được ở pH lớn hơn 6, vì vậy hầu
như không gặp chúng ở đất chua. Đối với đất chua, đặc trưng là loài Az. Indicum có
thể phát triển trong môi trường với pH 3. Azotobacter cần độ ẩm cao hơn so với
nhiều vi khuẩn khác nên cũng ít gặp chúng ở các vùng đất khô hạn[8].
Islam M. Z., Sharif D. I. and Hossain M. A.(2008) đã tiến hành phân lập

Azotobacter spp ở 7 loại đất khác nhau bao gồm đất trồng lúa, đất bỏ hoang, đồng
cỏ, đất rừng, đất mùn ở sông, đất trồng cây họ đậu, đất không trồng cây họ đậu cho
thấy số lượng Azotobacter spp ở các loại đất này là khác nhau. Ngoài ra trong
nghiên cứu này cũng cho thấy số lượng Azotobacter spp cũng phụ thuộc vào pH và
độ ẩm của đất ở những loại đất có độ ẩm cao không thích hợp cho sự phát triển của
Azotobacter spp.

11


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.1 Sự khác nhau của loại đất phân lập về pH, độ ẩm và số lượng Azotobacter
spp
Số

Số thứ tự

Loại đất phân lập

pH

Độ ẩm (%)

1

Đất trồng cây họ đậu

4,5

21,65

11

4,2

30,89

4

2

Đất không trồng cây
họ đậu

lượng

Azotobacter

spp CFU (.10 5)

3

Đất trồng lúa

4,4

81,15

3

4

Đồng cỏ

4,5

18,76

9

5

Đất rừng

4,3

44,92

7

6

Đất bỏ hoang

4,7

17,09

7

7

Đất mùn ở song

5,6

87,31

0

Nguồn (Islam M. Z., Sharif D. I. and Hossain M. A, 2008)
1.2.4. Hiệu quả sử dụng chế phẩm phân bón chứa Azotobacter
Azotobacter spp có tác dụng tăng cường nguồn thức ăn N cho cây trồng,
trung bình khi tiêu thụ 1g các chất sinh năng lượng Azotobacter có khả năng đồng
hóa được khoảng 10-15g N phân tử. Bón rơm rạ hay phân xanh vào ruộng là cung
cấp nguồn năng lượng cho Azotobacter và hoạt động của Azotobacter sẽ làm giàu N
cho đất. Các biện pháp kỹ thuật như bón vôi để trung hòa đất, bón lân tưới nước làm
tươi xốp đất, phơi đất… đều làm tăng cường rõ rệt sự phát triển và cố định N của
Azotobacter trong đất.
Malik et al., (1994) đã sử dụng các vi khuẩn Azotobacter, Azospirilium,
Acetobacter, Bacillus và Pseudomonas để giúp cây lúa nước phát triển tốt và gia
tăng năng suất so với đối chứng và sự tổng hợp IAA của những vi khuẩn này giúp
rễ lúa phát triển nhiều hơn để hấp thu nhiều nước và dưỡng chất hơn.
Ngoài được sử dụng làm phân bón hữu cơ vi sinh thì mới đây có nghiên cứu
của Markus Ribbe, một nhà nghiên cứu của Đại học California tại Mỹ (2010), cho
thấy Azotobacter vinelandii có khả năng sinh ra một loại enzyme vanadium
nitrogenase. Enzyme này có thể tự động tạo ra những chuỗi phân tử carbon ngắn

12

Đồ án tốt nghiệp

gồm hai hoặc ba nguyên tử. Vì thế ông khẳng định các nhà khoa học có thể tác động
vào vanadium nitrogenase để enzyme này tạo ra dầu mỏ. Và có thế sử dụng vi
khuẩn này để chế tạo ra nhiên liệu dành cho động cơ.
Ở Việt Nam, việc sản xuất và sử dụng chế phẩm Azotobacterin chỉ đặt ra
trong những điều kiện thâm canh có khả năng dồi dào về phân bón, cần bón vôi và
bón phân lân để làm tăng số lượng Azotobacter trong đất. Phần lớn các nghiên cứu
chỉ dừng lại ở mức độ khảo sát chưa được áp dụng rộng rãi trong nông nghiệp.
Sau nhiều năm nghiên cứu, thử nghiệm và áp dụng trong sản xuất rau màu ở
nhiều địa phương cho kết quả tốt, Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu
hoạch cho biết phân bón có chứa Azotobacter spp khi bón làm giảm từ 30 đến 50%
lượng đạm urê, làm cho đất tơi xốp. Qua các mô hình thử nghiệm và thực tế sản
xuất ở nhiều địa phương cho thấy phân có tác dụng làm tăng năng suất lúa, ngô và
các loại rau màu, cây ăn quả từ 18 đến 35%. Loại phân vi sinh này có khả năng
phòng chống một số bệnh cho cây trồng như bệnh héo xanh khoai tây và các loại
rau xanh; bệnh khô vằn trên ngô, lúa; giảm các loại sâu hại như sâu cuốn lá, sâu đục
thân trên lúa và sâu tơ, sâu xanh trên các loại rau xanh [10].
Sản xuất ở quy mô công nghiệp hoặc thủ công nghiệp những chế phẩm
Azotobacter và gọi là Azotobacterin. Đó là những dịch nuôi cấy Azotobacter được
hấp thụ vào than bùn hoặc các loại đất giàu chất hữu cơ đã trung hoà và bổ sung
thêm một ít phospho, kali…
1.3.

Các nghiên cứu trong và ngoài nước về phân lập, tuyển chọn, nhân
giống và nhân sinh khối vi khuẩn Azotobacter

1.3.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Islam M. Z., Sharif D. I. and Hossain M. A.(2008) đã phân lập các chủng
Azotobacter spp từ các mẫu đất khác nhau. Trong đó mẫu đất trồng cây họ đậu mật
độ tế bào (CFU) Azotobacter spp xuất hiện nhiều nhất 11.105/g đất và đất trồng lúa
xuất hiện ít Azotobacter spp nhất 3.105/g đất.
Ridvan Kizilkaya (2008) đã đánh giá khả năng cố định nitơ của Azotobacter
spp trong môi trường nuôi cấy Ashby và trong các môi trường đất khác như đất
mùn, đất khô hạn, đất sét trong đó khả năng cố định của Azotobacter spp trên môi

13


Đồ án tốt nghiệp

trường Ashby trong 3 ngày nuôi cấy là từ 3,50- 29,35microgam N/ml trung bình là
10.24 cao hơn các môi trường đất khác.
Đánh giá hiệu quả của việc nhiễm chế phẩm Azotobacter spp cho đất và hạt
giống, cây con đã được chứng minh trên các thí nghiệm đồng ruộng qua các nghiên
cứu như:
 Puneet (1998) cho thấy việc nhiễm Azotobacter sp kích thích nẩy mầm của
hạt, kích thích ra rễ và sinh trưởng, năng suất lúa mì, ngô tăng 10-15% so với
đối chứng [29].
 Các kết quả nghiên cứu của Nhật Bản, Hoa Kỳ, Trung Quốc, Ấn Độ cho thấy
sử dụng chế phẩm Azotobacter có thể cung cấp cho cây trồng từ 30-60 kg
N/ha/năm và tổng lượng N do vi sinh vật tổng hợp trên hành tinh có thể đạt
đến 240 triệu tấn/năm. Vi khuẩn cố định N tự do Azotobacter còn có khả
năng tổng hợp B1, giberellin, cytokinin kích thích tăng trưởng cây trồng
[30].
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Một số đề tài công trình nghiên cứu trong nước có liên quan đến đề tài :
 Đỗ Thu Hà (2008), đã phân lập được 8 chủng Azotobacter có khả năng cố

định đạm và 2 chủng có khả năng sinh IAA từ 30 mẫu đất trồng lúa, rau và
bỏ hoang ở thôn Bình Kỳ- Hòa Qúy-Ngũ Hành Sơn-TP.Đà Nẵng. Trong đó
tuyển chọn 2 chủng có hoạt tính mạnh nhất có thể ứng dụng sản xuất phân
bón vi sinh [3]
 Nguyễn Thu Hà, Vũ Minh Đức, Nguyễn Ngọc Quyên, Ngô Tự Thành
(2003), đã phân lập được 18 chủng Azotobacter từ 50 mẫu đất trồng. Trong
đó tuyển chọn được 3 chủng Azotobacter spp có hoạt tính ARA và tổng hợp
IAA, kích thích sự nảy mầm của hạt ngô lai DK.888 và ngô tẻ P.11[4].
 Nguyễn Thị Luyện (2011), đã phân lập được 10 chủng Azotobacter spp từ
30 mẫu đất trồng bắp, đậu xanh và lúa tại huyện Long Khánh - Đồng Nai.
Trong đó tuyển chọn được 4 chủng Azotobacter spp có hoạt tính có định Nito
mạnh và 2 chủng có khả năng kích thích nảy mầm tốt [8].

14


Đồ án tốt nghiệp

 Châu Ngọc Anh (2012), đã phân lập được 16 chủng Azotobacter spp từ 36
mẫu đất trồng bắp, lúa và cây ăn quả tại huyện Trảng Bom – Đồng Nai,
huyện Tam Nông – Đồng Tháp và huyện Bình Minh – Vĩnh Long. Trong đó
tuyển chọn được 2 chủng Azotobacter spp có hoạt tính cố định Nitơ mạnh và
có khả năng sinh IAA kích thích nảy mầm tốt [2].
 Phạm Bích Hiên và cộng sự ( 2003) đã nghiên cứu 10 chủng Azotobacter của
Việt Nam và nhận thấy rằng ngoài khả năng cố định N chúng còn có khả
năng sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng IAA. Nhiệt độ thích hợp của
các chủng này là 25-300C, pH thích nghi rộng từ 5,5- 8,0 [5].
 Phạm Ngọc Lan (1999) đã phân lập được 37 chủng Azotobacter trên đất gò
đồi vùng Thừa Thiên - Huế. Nhóm nghiên cứu cũng tuyển chọn được hai
chủng có khả năng kháng kháng sinh, tồn tại được ở pH kiềm ( pH = 8). Kết

quả thử nghiệm gây nhiễm cây giống keo tai tượng trong vườn ươm đã làm
tăng tỷ lệ sống, sinh khối, chiều cao cây và hàm lượng N trong lá cũng cao
hơn so với đối chứng [11].
 Thái Sơn Nam (2010) đã khái quát quy trình sản xuất các vi sinh vật có khả
năng cố định đạm trong tự nhiên như vi khuẩn cộng sinh Rhizobium, vi
khuẩn Azotobacter, vi khuẩn Azospirillum [13]

15


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu của đề tài chúng tôi tiến hành nghiên cứu các nội dung sau:
- Phân lập và mô tả đặc điểm sinh học một số chủng Azotobacter spp.
- Tuyển chọn các chủng Azotobacter spp có khả năng cố định đạm mạnh
- Đánh giá khả năng kích thích của các chủng vi khuẩn Azotobacter spp lên sự nẩy
mầm của hạt đậu đen
- Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các chủng Azotobacter spp
được tuyển chọn.
2.2.

Vật liệu và địa điểm nghiên cứu

2.2.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu
* Vật liệu: mẫu đất lấy từ đất trồng bắp và đậu xanh và mẫu Azotobacter nhập nội

*Hoá chất:


Cồn 96 0, cồn 700.

 Crystal violet , Glucol, Fucshin, dầu xem kính.
 Thuốc thử Nessler.
 Thuốc thử Tashiro.
 H2SO4 đậm đặc .
 H2SO4 0,1N chuẩn.
 NaOH 0,1N chuẩn
 NaOH 40ất pha môi trường dinh dưỡng
 Agar .
 Xúc tác ( K2SO4: CuSO4 tỉ lệ 3:1).
Môi trường nuôi cấy Ashby (g/l):
Manitol

20g

K2HPO4

0,2g

MgSO4.7H2O

0,2g

K2SO4

0,2g

CaCO3

5g

16


Đồ án tốt nghiệp

NaCl

0,2g

Agar

20g

Nước cất

1000ml

Môi trường Burk (g/l)
K 2HPO4

0,8g

KH2PHO4

0,2g

MgSO4.7H2O

0,2g

NaCl

0,2g

CaSO4

0,1g

Hỗn hợp Fe- Mo

1ml

Sucrose

20g

H3BO3

100mcg

ZnSO4 .7H2 O

100mcg

MnSO4.4H2O

10mcg

CuSO4.5H 2O

3mcg

KI

1mcg

Nước cất

1000ml

Agar

20g

Hỗn hợp Fe- Mo
FeCl3.6H2O

1,45g

NaMoO4.2H 2O

0,253g

Nước cất

100ml

* Dụng cụ và thiết bị:
Dụng cụ:
 Dao, bịch nilon 0,5kg, giấy dán, bút
 Ống nghiệm có nắp, ống nghiệm không nắp.
 Đĩa pertri
 Cốc 50ml, 100ml, 250ml, 1000ml
 Erlen 100ml, 250ml, 500ml,1000ml
 Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 25ml

17


Đồ án tốt nghiệp

 Pipetman 10µl-100 µl
 Đầu típ 100 µl
 Đũa thủy tinh
 Giấy lọc
 Que cấy trang, que cấy, que gắp
 Đèn cồn
 Bông thấm nước, bông không thấm nước
 Bao nilon hấp, dây thun, báo, bút lông dầu
Thiết bị
 Tủ cấy vi sinh (Brlad France)
 Tủ ủ (Memmert Germany)
 Tủ lạnh Toshiba
 Autolave (Huxky Đài Loan)
 Máy đo PH (Hach-Germany)

 Cân phân tích (Orbital Germany)
 Bếp từ (Billy – England)
 Máy nước cất (Branstead USA)
 Máy lắc
 Bếp đun
 Bình đốt mẫu
 Bộ chưng cất Kjeldahl
2.2.2. Địa điểm nghiên cứu
Địa điểm thí nghiệm: Đồ án được thực hiện tại hệ thống phòng thí nghiệm
Khoa Môi Trường Và Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ
TP. Hồ Chí Minh.
Hệ thống phòng thí nghiệm gồm:
 Phòng thí nghiệm vi sinh.
 Phòng thí nghiệm thực vật.
 Phòng thí nghiệm hóa sinh.

18


Đồ án tốt nghiệp

2.2.3. Thời gian nghiên cứu
Đề tài thực hiện từ tháng 05/2012 tới tháng 07/2012.
2.3.

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phân lập các chủng Azotobacter spp ở các loại đất trồng (theo FAO,
2007)
Sau khi mẫu đất đem về phòng thí nghiệm được tách riêng ra cho vào từng

đĩa nhỏ có đánh số thứ tự, tên mẫu, quan sát và ghi nhận màu sắc của các mẫu đất.
Sau đó đo pH các mẫu đất, ở từng loại đất trồng mỗi mẫu đất lấy 25g đất cho vào
cốc thêm 50ml nước cất vào khuấy đều sau đó để lắng và dùng máy đó pH đo giá trị
pH cho từng mẫu đất (theo Islam M. Z., Sharif D. I. and Hossain M. A. 2008). Vì
thời gian thực hiện đề tài có hạn nên sinh viên tiến hành gộp các mẫu đất có giá trị
pH gần bằng nhau trong cùng một loại đất trồng.
Tiếp đó cho các mẫu đất ra đĩa để hong khô trong điều kiện nhiệt độ phòng
rồi nghiền mịn. Việc hong khô mẫu đất giúp cho việc phân lập chính xác hơn. Ở
từng mẫu đất đất trồng, cân 1g đất cho vào erlen chứa 50ml môi trường Ashby lỏng
đã hấp khử trùng ở 1210c, 1atm (không có agar), đem ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng
3 ngày trong điều kiện lắc liên tục.
Sau đó tiến hành pha loãng bằng nước muối sinh lí 0,85%(hệ số pha loãng
10-6). Lấy 0,1ml dịch pha loãng ở lần pha loãng cuối, cấy trên môi trường phân lập
là môi trường Ashby. Cấy bằng phương pháp trải đĩa trang cho đến khi khô mặt
thạch hoàn toàn và đặt các đĩa cấy ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 đến 2 ngày. Mỗi
mẫu cấy lặp lại 3 lần trên 3 đĩa pertri.
Từ đĩa cấy ban đầu tiến hành chọn lọc các khuẩn lạc rời rạc có hình dạng,
màu sắc khác nhau, sau đó cấy sang đĩa pertri khác chứa môi trường Ashby bằng
phương pháp cấy ria để phân lập từng chủng vi khuẩn. Tiến hành phân lập cho đến
khi các khuẩn lạc tạo ra có dạng đồng nhất, khi quan sát dưới kính hiển vi chỉ có
một dạng vi khuẩn thì lấy các khuẩn lạc rời rạc đó để trữ trong ống thạch nghiêng
chứa môi trường trên. Các chủng vi khuẩn thu được và trữ trong từng ống nghiệm
tạm xem như một dòng, được trữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 50c để bảo quản.

19


Đồ án tốt nghiệp

Sau đó theo dõi các chỉ tiêu sau:

 Tỷ lệ số mẫu đất có xuất hiện khuẩn lạc của Azotobacter spp
 Số chủng Azotobacter spp phân lập được.
2.3.2. Phương pháp mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học của các
chủng Azotobacter spp
Sau khi phân lập thuần khiết các chủng ta tiến hành quan sát:
Hình thái khuẩn lạc: quan sát hình thái khuẩn lạc riêng rẽ ngay sau khi mọc và sau
khi già đi tiến hành quan sát các khuẩn lạc này từ các phía (từ trên xuống, từ bên
cạnh), chú ý về hình dạng khuẩn lạc, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, độ lồi lõm, độ
trong, diễn biến màu sắc (trên, dưới, có khuếch tán ra môi trường hay không , lúc
non cho đến lúc già )
Phương pháp nhuộm Gram: ( Lê Thị Vu Lan, Phạm Minh Nhựt, 2008):
Dùng que cấy tròn chấm một ít nước cất lên lame rồi dùng que cấy tròn chấm vào
khuẩn lạc làm vết bôi, hơ lame trên ngọn lửa đèn cồn để cố định tiêu bản trên lame.
 Bước 1 –Nhuộm tím crysal violet để ổn định 1 phút, rửa bằng
nướccất(dùng bình tia phun ở mép vết bôi đã nhuộm không phun trực
tiếp vào giữa vết có thể làm trôi mẫu ), thấm khô bằng giấy thấm.
 Bước 2: Nhuộm bằng Glucol , ổn định sau 1 phút, tương tự rửa bằng
nước cất.
 Bước 3: Dùng etanol 960 rửa tẩy màu 30 giây, dùng giấy thấm lau khô
 Bước 4: Nhuộm bổ sung fucshin 2-3 phút, rửa lại bằng nước cất, để
khô
 Bước 5: Soi kính hiển vi ở X100. Quan sát dưới kính hiển vi ghi nhận
Gram của vi khuẩn. Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của crytal
violet là mẫu Gram dương, có màu hồng đỏ của fushin là mẫu Gram
âm.
Khả năng di động trên thạch mềm: chuẩn bị các ống thạch bán lỏng môi trường
Ashby chứa 0,5% agar, dùng que cấy thẳng cấy xuyên qua thạch, đem ủ ở nhiệt độ
phòng trong vòng 3 đến 4 ngày rồi quan sát xung quanh vết cấy.

20

Đồ án tốt nghiệp

2.3.3. Phương pháp tuyển chọn các chủng Azotobacter spp có khả năng cố
định đạm mạnh
Sau khi phân lập chọn ra các chủng Azotobacter spp có khả năng cố định nitơ sinh
viên tiến hành:
Định tính hàm lượng NH4+ trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp so màu
với thuốc thử Nessler [8]
Chuẩn bị thuốc thử Nessler: cân 15g HgI2 và 10g KI cho vào 15ml H2O cho vào tủ
hút khuấy tan cho 80ml dung dịch NaOH 50% sau đó thêm H2O đến 500ml khuấy
đều đem lọc cặn. Bảo quản trong lọ tối.
Chuẩn bị các ống nghiệm chứa môi trường Ashby đã hấp khử trùng (ở 1210c, 1atm)
mỗi ống nghiệm chứa 10ml môi trường. Cấy các chủng Azotobacter.spp đã phân lập
được vào các ống nghiệm, mẫu đối chứng không cấy vi khuẩn chỉ chứa môi trường
Ashby. Và đem ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 5 ngày. Sau đó đem dịch nuôi cấy
lọc bằng giấy lọc rồi cho thuốc thử Nessler (lượng thuốc thử bằng nhau ở các mẫu)
vào dịch lọc. Quan sát sự thay đổi màu của dịch lọc và so màu với mẫu đối chứng.
Mỗi mẫu lặp lại 2 lần.
Định lượng N tổng trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp Kjeldahl:
Chuẩn bị các erlen chứa 50ml môi trường Ashby đã hấp khử trùng( ở 1210c, 1atm),
sau đó cấy các chủng Azotobacter spp đã phân lập được vào erlen, mẫu đối chứng là
erlen không cấy vi khuẩn. Sau đó lắc liên tục trong 5 ngày ở nhiệt độ phòng.
Sau khi lắc xong tiến hành định lượng hàm lượng NH4+ bằng phương pháp
Kjeldahl: dùng pipet hút 2ml dịch nuôi cấy cho vào bình Kjeldahl thêm 0,2g xúc tác
( K2SO4: CuSO4 tỉ lệ 3:1) lắc nhẹ, đậy kín trong 3 phút . Đặt bình Kjeldahl lên bếp
đun, đậy miệng bình bằng một phễu thủy tinh cho 5ml dung dịch H 2SO4 đậm đặc
98%. Giai đoạn này thực hiện trong tủ hote đặt bình hơi nghiêng trên bếp tránh
trường hợp khi sô mạnh hóa chất bắn ra ngoài và không bị bay mất ammoniac.

Trong khi đun, theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun, khi thấy
dung dịch gần như trong suốt thì lắc nhẹ bình để kéo hết các phân tử ở trên thành
bình còn chưa bị oxy hóa vào trong dung dịch. Tiếp tục đun cho đến khi dung dịch
trong hoàn toàn. Để nguội bình rồi chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức

21


Đồ án tốt nghiệp

50ml, dùng nước cất vô đạm tráng lại bình Kjeldahl và định mức tới vạch. Sau đó
cất đạm, chuyển 50ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm có
sẵn 50ml nước cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro lúc này trong bình có màu tím hồng,
tiếp tục cho vào bình cất 15ml NaOH 40% cho đến khi toàn bộ dung dịch chuyển
sang màu xanh lá mạ (thêm 5ml NaOH 40% nếu dung dịch trong bình chưa chuyển
hết sang màu xanh lá mạ).
Tiến hành lắp hệ thống cất đạm, cho vào bình hứng 20ml H2SO4 0,1 N và 3 giọt
thuốc thử Tashiro (dung dịch có màu tím hồng) đặt bình hứng sao cho ngập đầu ống
sinh hàn. Bật công tắc cất đạm.
Sau khi cất 10- 12 phút để kiểm tra xem NH4OH còn được tạo ra không, dùng giấy
quỳ thử ở đầu ống sinh hàn. Nếu giấy quỳ không đổi sang màu xanh là được. Sau
đó đem chuẩn độ H2SO4 dư trong bình hứng bằng NaOH 0,1N cho đến khi mất màu
tím hồng và chuyển sang màu xanh lá mạ. Ghi nhận thể tích NaOH 0,1N sử dụng.
Tính kết quả hàm lượng nitơ tổng được tính theo công thức (dựa theo Nguyễn Hoài
Hương, 2008):

N (mg) = (1,42 * (V1- V2)/a)

Với:

V1- số ml H2SO4 cho vào bình hứng
V2- số ml NaOH 0,1 N đã chuẩn độ
a- số ml nguyên liệu sử dụng
1,42 hệ số; cứ 1ml H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH thì tương đương
với 1,42 mg N.

2.3.4. Phương pháp xác định khả năng tạo IAA của các chủng Azotobacter
spp
Đánh giá khả năng tạo IAA của các chủng Azotobacter dựa trên nồng độ IAA có
trong dich chiết từ dịch nuôi cấy vi khuẩn. Nồng độ IAA có trong dịch chiết càng
cao chứng tỏ khả năng tạo IAA của chủng vi khuẩn càng mạnh. Nồng độ IAA được
xác định bằng phương pháp so màu Salkowski ở bước sóng 530 nm [5]

22


Đồ án tốt nghiệp

* Phương pháp xác định phương trình đường chuẩn của mối tương quan giữa chỉ số
OD530nm và nồng độ IAA.
- Chuẩn bị dung dịch đệm phosphat (200ml)
A: KH2PO4 0,136g/100ml nước cất;
B: K2HPO4 0,174g/100ml nước cất;
Lấy 39ml A + 61ml B cho thêm nước cất vừa đủ 200ml, điều chỉnh pH 7.
- Chuẩn bị thuốc thử Salkowski
Lấy 553 ml H2SO4 (98%) cho vào nước cất đủ 1 lít, để nguội sau 12 giờ được dung
dịch H2SO4 đậm đặc 10,8M.
Cân 4,5g FeCl3 cho vào 1 lít H2SO4 10,8M đã pha ở trên để được thuốc thử
Salkowski.
- Chuẩn bị đường chuẩn IAA

Cân 1,6 mg IAA tổng hợp hòa tan với 10 ml dung dịch đệm phosphat được nồng độ
là 160mg/l. Sau đó tiến hành pha loãng ra các nồng độ 0, 5, 10, 16, 20, 40, 80 mg/l.
Lấy 4 ml thuốc thử cho vào các ống nghiệm có nồng độ IAA khác nhau có thể tích
2 ml, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần.
Để 10 phút trong tối ở nhiệt độ phòng để phản ứng xảy ra hoàn toàn, sau đó tiến
hành đo OD ở bước sóng 530 nm.
Từ kết quả trên, chúng tôi xác định được phương trình đường chuẩn của dung dịch
IAA thông qua chỉ số OD530nm. Dựa vào phương trình đường chuẩn để xác định
nồng độ IAA (mg/ml) do các vi khuẩn tạo ra có trong môi trường nuôi cấy.
Bảng 2.1 Nồng độ IAA thành lập đồ thị đường chuẩn
Ống nghiệm số

0

1

2

3

4

5

6

Thể tích IAA 160 mg/ml

0

1,0

0,50

0,25

0,20

0,125

0,0625

Dung dich đệm (ml)

2,0

1,0

1,50

1,75

1,80

1,875

1,9375

Tổng thể tích (ml)

2,0

2,0

2,0

2,0

2,0

2,0

2,0

0

80

40

20

16

10

5

4

4

4

4

4

4

4

Nồng độ IAA (mg/ml )
Thuốc
(ml)

thử

Salkowski

23


Đồ án tốt nghiệp

Biểu đồ 2.1 Phương trình đường chuẩn về mối tương quan tuyến tính giữa chỉ số
OD530nm và nồng độ IAA (mg/ml)
Chỉ số OD 530nm
y = 0,0207x + 0,0368
R2 = 0,995

1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0

OD
Linear (OD)

0

50

100

Nồng độ(mg/ml)

Thực hiện nuôi cấy các chủng Azotobacter phân lập được trên môi trường Ashby.
Chuẩn bị môi trường lỏng trong các bình tam giác, mỗi bình chứa 50ml dịch môi
trường, hấp khử trùng, để nguội. Tiến hành cấy các chủng Azotobacter vào các bình
tam giác chứa môi trường đã khử trùng. Nuôi ở nhiệt độ phòng, trên máy lắc xoay
vòng 150 vòng/phút. Sau 5 ngày thu dịch nuôi cấy và li tâm 8000 vòng/phút, li tâm
15 phút, lấy dịch trong để đo lượng IAA được vi khuẩn tổng hợp và tiết ra môi
trường bằng phương pháp so màu Salkowski ở bước sóng 530 nm, thí nghiệm được

lặp lại 3 lần.
2.3.5. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Azotobacter spp
lên sự nảy mầm của hạt đậu đen [8]
Chuẩn bị các erlen chứa 50ml môi trường Burk hấp khử trùng (ở 1210c,1atm), sau
đó cấy các chủng Azotobacter vào erlen rồi lắc liên tục trong 5 ngày ở nhiệt độ
phòng. Sau 5 ngày tiến hành dùng giấy lọc lọc dịch nuôi cấy.
Đậu đen tiến hành chọn những hạt khô, trơn bóng, đen đều các hạt đồng nhất,
không bị sâu mọt, không bị vỡ, bị lép. Đem đậu rửa sạch và đem ngâm với nước cất
trong vòng 1giờ.

24