Nghiên cứu ứng dụng nấm mốc từ bánh men để thu nhận enzyme amylase

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG NẤM MỐC TỪ BÁNH MEN
ĐỂ THU NHẬN ENZYME AMYLASE

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS. NGUYỄN THỊ HOÀI HƯƠNG
Sinh viên thực hiện: ĐỒNG THỊ MINH THANH
Lớp: 11HSH02

MSSV: 1191111040

TP. Hồ Chí Minh, 2013


Nghiên cứu ứng dụng nấm mốc từ bánh men để thu nhận enzym amylase

LỜI CAM ĐOAN
Người thực hiện đề tài xin cam đoan Đồ án tốt nghiệp “Nghiên cứu tìm hiểu về
enzym amylase, amylase nấm mốc và vi khuẩn” là công trình nghiên cứu thực sự của
cá nhân, được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và thực nghiệm, dưới sự
hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Thị Hoài Hương.
Người thực hiện đề tài xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này.
TP.HCM, ngày

tháng 9 năm 2013

Người thực hiện đề tài

Đồng Thị Minh Thanh


LỜI CẢM ƠN
Để thực hiện đề tài này, người thực hiện đề tài xin dành lời cảm ơn chân thành
nhất gởi đến TS. Nguyễn Thị Hoài Hương, đã tận tình hướng dẫn trong suốt quá trình
học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Người thực hiện đề tài xin chân thành cảm ơn:
- Ban Giám hiệu, Ban Chủ nhiệm Khoa KhoaCông Nghệ Sinh Học – Môi
Trường Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh cùng các quý Thầy
Cô đã tận tình giảng dạy người thực hiện đề tài trong suốt khóa học.
- Lãnh đạo Trung tâm Khuyến nông – Khuyến ngư đã tạo điều kiện giúp đỡ
người thực hiện đề tài hoàn thành tốt trong suốt chương trình học và quá trình thực
hiện đề tài tốt nghiệp.
Cuối cùng, người thực hiện đề tài xin cảm ơn đến gia đình, các anh chị em
trong bộ phận xét nghiệm Trung tâm Khuyến Nông Khuyến Ngư đã động viên và giúp
đỡ người thực hiện đề tài trong suốt quá trình học tập và làm đề tài tốt nghiệp.
Người thực hiện đề tài xin chân thành cảm ơn Hội đồng chấm luận án đã phản
biện, đánh giá, góp ý, giúp đỡ người thực hiện đề tài hoàn thiện luận văn tốt nghiệp
này.
Chân thành cảm ơn!

ii

Nghiên cứu ứng dụng nấm mốc từ bánh men để thu nhận enzym amylase

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................
MỤC LỤC .......................................................................................................................i
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ...................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................................iv
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH....................................................................................v
PHẦN MỞ ĐẦU ............................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .........................................................................................4
1.1. Giới thiệu về enzym amylase nấm mốc ................................................................4
1.1.1. Khái niệm về enzyme amylase .......................................................................4
1.1.2. Phân loại ........................................................................................................5
1.2. enzyme amylase từ nấm mốc và từ vi khuẩn .....................................................5
1.3. Điều kiện sinh trưởng của nấm mốc: ....................................................................9
1.3.1. Nhu cầu dinh dưỡng .......................................................................................9
1.3.2. Độ ẩm ...........................................................................................................12
1.3.3. Nhiệt độ ........................................................................................................12
1.3.4. pH .................................................................................................................13
1.4. Các phương pháp thu nhận enzyme amylase......................................................13
1.4.1. Nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase bằng phương pháp bề mặt ................13
1.4.2. Nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase bằng phương pháp nuôi cấy chìm. ...15
1.5. Ứng dụng của enzyme amylase ..........................................................................16
1.5.1. Amylase trong công nghiệp rượu – bia ........................................................16
1.5.2. Trong sản xuất bánh mì ...............................................................................17
1.5.3. Trong sản xuất mật, tinh bột, malto, gluco ..................................................17
1.5.4. Trong một số ngành công nghiệp thực phẩm khác ......................................18
1.5.5. Trong các ngành công nghiệp dệt, giấy .......................................................18
1.5.6. Trong chăn nuôi ...........................................................................................19

1.5.7. Trong y học ..................................................................................................19
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .......................................................20
i


2.1. Vật liệu ................................................................................................................20
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................20
2.1.2. Vật liệu và hóa chất......................................................................................20
2.2. Phương pháp .......................................................................................................22
2.2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................................22
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................22
2.3. Qui trình lên men bề mặt tạo Enzym Amylase ..................................................28
2.3.1. Qui trình công nghệ lên men bề mặt ............................................................28
2.3.2. Xác định hoạt tính enzyme amylase theo Wohlgemuth ...............................29
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ...............................................................31
3.1. Kết quả phân lập các chủng nấm mốc có trong bánh men cơm rượu.................31
3.2. Kết quả quan sát hình thái nấm mốc ...................................................................32
3.3. Kết quả xác định khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc và chọn
lọc chủng sản xuất enzyme amylase ..........................................................................34
3.4 Kết quả thu nhận enzyme amylase từ nấm mốc bằng phương pháp nuôi cấy chìm
....................................................................................................................................36
3.4.1. Điều kiện nuôi cấy........................................................................................36
3.4.2. Xác định hoạt tính của enzyme Amylase ......................................................37
3.4.3. Kết quả xác định hoạt tính của enzyme Amylase .........................................37
3.5. Kết quả lên men bề mặt thu enzyme amylase.....................................................38
3.6. Kết quả xác định hoạt tính enzyme amylase sau kết tủa ....................................42
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................47
4.1. Kết luận ...............................................................................................................47
4.2. Kiến nghị.............................................................................................................47

ii


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Kí hiệu

Tên

MT

Môi trường

PGA

Môi trường PGA (Potato Glucose Agar)

Ghi chú

CĐ

Chợ Động – Phan Rang– Ninh Thuận

Nơi lấy mẫu

CL

Chợ Lớn – Đường Thống Nhất – TP. Phan Rang

Nơi lấy mẫu

NS

Chợ Ninh Sơn– Ninh Thuận

Nơi lấy mẫu

KB

Chợ Kim Biên – Ninh Thuận

Nơi lấy mẫu

LB

Chợ Long Bình – Ninh Thuận

Nơi lấy mẫu

NH

Chợ Ninh Hải

– Ninh Thuận

Nơi lấy mẫu

TN

Chợ Thuận Nam – Ninh Thuận

Nơi lấy mẫu

NP

Chợ Ninh Phước – Ninh Thuận

Nơi lấy mẫu

M1

Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Động

M2

Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Động

M3

Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Lớn

M4

Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Lớn

M5

Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Ninh Sơn

M6

Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Ninh Sơn

M7

Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Kim Biên

M8

Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Long Bình

M9

Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Ninh Hải

M10

Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Thuận Nam

M11

Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Ninh Phước

Dd

Dung dịch

iii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Các mẫu bánh men cơm rượu……………………………………………..20
Bảng 2.2: Thuốc thử Lugolc…………………………………………………………21
Bảng 2.3: Dung dịch đệm axetat pH 4,7……………………………………………..21
Bảng 2.4: Dung dịch tinh bột 1% ……………………………………………………21
Bảng 2.5: Môi trường PGA (Potato Glucose Agar) …………………………………21
Bảng 2.6: Môi trường thạch – tinh bột……………………………………….………22
Bảng 3.1: Các chủng nấm mốc phân lập từ bánh men cơm rượu……………………31
Bảng 3.2: Hình thái khuẩn lạc của các chủng nấm mốc đã phân lập từ bánh men cơm
rượu……………………………………………………………………………..…….32
Bảng 3.3: Khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc phân lập từ bánh men
cơm rượu…………………………………………………………………...…………34
Bảng 3.4: Bảng kết quả thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme……………...………38
Bảng 3.5: Xác định hoạt tính enzyme amylase thu được trong thời gian 2, 3, 4 ngày
lên men thể rắn…………………………………………………………………..……43
Bảng 3.6: Thí nghiệm thủy phân tinh bột…………………………………….……....44

iv


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 2.1: Môi trường PGA sau khi hấp……………………………………………...23
Hình 2.2: Đổ đĩa peptri……………………………………………………………….24
Hình 2.3: Môi trường nuôi cấy sau 48h………………………………………………24
Hình 2.4:Môi trường sau làm thuần…………………………………………………..24
Hinh 2.5. Cấy giữ giống………………………………………………………………25
Hình 2.6: Quy trình thu nhận enzyme amylase từ nấm mốc…………………………27
Hình 2.7 : Quy trình công nghệ lên men bề mặt……………………………………...28
Hình 3.1: Khuẩn lạc của các chủng nấm mốc M2, M4, M7, M10…………………...32
Hình 3.2: Khả năng phân giải tinh bột của các chủng M3, M4, M9, M11…………..35

Hình 3.3: Khả năng phân giải tinh bột của các chủng M6, M7……………………...36
Hình 3.4: Thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme…………………………………….38
Hình 3.5: Môi trường nuôi cấy sau khi hấp…………………………………..………39
Hình 3.6: Cấy giống vào môi trường nuôi cấy………………………………………39
Hình 3.8: Thu dịch nuôi cấy………………………………………………………….40
Hình 3.9: Lọc dịch chiết……………………………………………………………...41
Hình 3.10: Chế phẩm enzyme amylase được tủa bằng cồn 960 lạnh………………....41
Hình 3.11: Thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme sau 2 ngày nuôi cấy……………..42
Hình 3.12: Thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme sau 3 ngày nuôi cấy……………..42
Hình 3.13: Thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme sau 4 ngày nuôi cấy……………..43
Hình 3.14: Kết thúc thủy phân tinh bột gạo hồ hóa………………………………….45

v


PHẦN MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết và lý do hình thành đề tài.
Ngày nay, Amylase là một trong những enzyme được ứng dụng rộng rãi
trong các ngành công nghiệp, đem lại những lợi ích kinh tế, đặc biệt là ngành công
nghiệp thực phẩm như công nghiệp sản xuất rượu bia, nước ép trái cây, bánh kẹo,
bánh mì...
Sản xuất enzyme Amylase từ bánh mem (cơm rượu) là một trong những đề
tài mang tính cấp thiết, bởi vì bánh men có chứa rất nhiều chủng có khả năng tạo ra
enzyme amylase như nấm men, nấm mốc ...đây là nguồn nguyên liệu dễ tìm và rẻ
tiền, là nguyên liệu truyền thống sản xuất rượu trắng đảm bảo sự an toàn cho người
tiêu dùng và enzyme amylase thu được từ nấm mốc có trong bánh men có những ưu
điểm ưu việt, vì vậy trong nội dung đồ án tốt nghiệp người thực hiện đề tài đã chọn
đề “Nghiên cứu ứng dụng nấm mốc từ bánh men để thu nhận enzym amylase”
2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Vi sinh vật có thể tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác nhau. Đặc

điểm này có liên quan đến cơ thể đơn bào. Cơ thể đơn bào phải thực hiện tất cả
chức năng của sự sống, do đó chúng phải tạo ra nhiều loại enzyme khác nhau để
đảm bảo sự sống phát triển tốt. Nhiều vi sinh vật có khả năng tạo ra enzyme
amylase như: nấm mốc, vi khuẩn, nấm men, xạ khuẩn…Trong đó nấm mốc có khả
năng tạo ra enzym amylase nhiều hơn cả.
Nấm mốc còn được gọi là nấm sợi, tức là tất cả các mốc mọc trên thực phẩm,
trên chiếu, trên quần áo, trên sách vở … Chúng phát triển rất nhanh trên nhiều
nguồn cơ chất hữu cơ khi gặp khí hậu nóng ẩm.
Nấm mốc là vi sinh vật thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp vì
quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật không
phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài, nguồn nguyên liệu làm môi trường nuôi cấy nấm
mốc rẻ tiền và dễ kiếm, tốc độ sinh sản của nấm mốc phát triển vật rất nhanh,
Enzyme thu nhận từ nấm mốc có hoạt tính rất cao, đồng thời trong một khoảng thời
gian ngắn, không những ta thu được lượng sinh khối lớn về enzyme nội bào mà còn
1


thu được một lượng đáng kể enzyme ngoại bào do nấm mốc tiết ra môi trường. Vì
thế, giá thành sản phẩm sẽ giảm và có thể sản xuất ở mọi nơi trên thế giới, mang lại
hiệu suất kinh tế cao.
3. Mục tiêu nghiên cứu, đối tượng:
Phân lập vi nấm enzyme amylase từ bánh men rượu và thử nghiệm các quy
trình lên men thu enzyme amylase, cụ thể:
+ Thu thập nguồn bánh men từ các vùng khác nhau, sau đó phân lập các
chủng nấm mốc từ các mẫu bánh men cơm rượu, tuyển chọn các chủng nấm mốc có
khả năng phân giải tinh bột, lấy chủng đó lên men thu enzym bằng phương pháp lên
men chìm, lên men bán rắn, lên men công nghiệp và ứng dụng chúng để thu nhận
enzyme amylase.
+ Xác định hoạt tính của enzyme amylase thu được và thử nghiệm khả năng
phân giải tinh bột của enzyme amylase nhằm góp phần tạo ra nguồn enzyme có giá

trị từ vi sinh vật.
+ Phạm vi và giới hạn của đề tài
Trong giới hạn của đề tài, người thực hiện đề tài chỉ tập chung tìm hiểu về
nguồn nấm mốc có trong bánh men để thu nhận enzyme trong quy mô phòng thí
nghiệm.
Do trang thiết bị máy móc tại phòng thí nghiệm không đầy đủ, chưa hiện đại
nên đồ án còn nhiều hạn chế, chỉ dừng lại ở bước thu sản phẩm bán tinh khiết.
4. Kết quả đạt được:
Đã Phân lập được 11 chủng nấm mốc từ bánh men cơm rượu ở 8 địa điểm
khác nhau, trong đó có 9 chủng nấm mốc đều có khả năng phân giải tinh bột bao
gồm các chủng: M1, M3, M4, M5, M7, M8, M9, M10, M11 và 2 chủng không có
khả năng phân giải tinh bột là chủng M2, M6. Như vậy, 9 chủng nấm mốc có khả
năng tạo enzyme amylase, 2 chủng nấm mốc không có khả năng tạo enzyme
amylase.
- Đã tiến hành nuôi cấy chủng M4 để thu nhận được enzyme amylase bán
tinh khiết theo phương pháp nuôi cấy chìm.

2


- Từ 1 lít môi trường nuôi chủng M4 thu được 1,23 g chế phẩm enzyme
amylase bán tinh khiết.
- Đã tiến hành nuôi cấy chủng M4 để thu nhận được enzyme amylase bán
tinh khiết theo phương pháp lên men công nghiệp.
- Xác định enzym amylase có hoạt tính cao nhất thu được trong thời gian
nuôi cấy ở 3 ngày. Xác định khả năng phân giải tinh bột gạo của enzyme amylase
từ đó tính được nồng độ enzyme amylase cần để thủy phân hết 1g tinh bột gạo.
5. Cấu trúc đồ án:
Đồ án gồm các chương sau đây:
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Tìm hiểu về enzym amylase nấm mốc, enzyme amylase từ nấm mốc và từ vi
khuẩn, các phương pháp thu nhận enzyme amylase và ứng dụng của enzyme
amylase...
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Các vật dụng và hóa chất để tiến hành thí nghiệm. Xác định đối tượng nghiên
cứu, địa điểm và thời gian nghiên cứu. Mô tả phương pháp và qui trình lên men ,
xác định hoạt tính enzym amylase ...
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
Các kết quả sau khi thực nghiệm như: kết quả quả phân lập các chủng nấm
mốc có trong bánh men cơm rượu, kết quả quan sát hình thái nấm mốc, kết quả xác
định khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc và chọn lọc chủng sản
xuất enzyme amylase, kết quả thu nhận enzyme amylase từ nấm mốc bằng phương
pháp nuôi cấy chìm, kết quả lên men bề mặt thu enzyme amylase, kết quả xác định
hoạt tính enzym amylase sau kết tủa...
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Các kết luận và kiến nghị của đồ án.

3


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về enzyme amylase nấm mốc
1.1.1. Khái niệm về enzyme amylase
Enzyme amylase là một trong số các enzyme được sử dụng rộng rãi nhất
trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực khác. Những nghiên cứu thực nghiệm
đầu tiên về enzyme nói chung và về enzyme amylase nói riêng được bắt đầu vào
những năm 1811 – 1814. Những nghiên cứu này gắn liền với tên tuổi của nhà bác
học người Nga,Viện sĩ K.S Kirhof. Ông nghiên cứu quá trình phân giải tinh bột
dưới tác dụng của dịch chiết đại mạch nảy mầm và nhận thấy rằng trong malt có
chứa các chất phân giải tinh bột thành đường. Năm 1833, hai nhà khoa học người

Pháp là Payen và Persor đã tách được chất phân giải tinh bột đó là từ đại mạch nảy
mầm. Các tác giả đã dùng rượu để kết tủa nó trong dung dịch chiết malt và thu được
enzyme ở dạng bột, đồng thời đặc tên là diaslase. Sau này theo đề nghị của Duclo,
enzyme phân giải tinh bột gọi là amylase.
Các enzyme amylase có trong nấm mốc, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn,
nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm. Bây giờ, người
ta thu chúng chủ yếu từ canh trường nấm mốc, vi khuẩn và một số loài nấm men.
Amylase là một hệ Enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật . Các Enzyme
này thuộc nhóm Enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong
nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước.
Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và
dextrin hạn chế. Các Enzyme Amylase có trong nước bọt (còn được gọi là ptyalin),
trong dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, xạ khuẩn,
nấm men và vi khuẩn. Đối với enzyme amylase có trong nấm mốc, khi nuôi nấm
mốc tạo enzyme amylase có hai quá trình liên quan mật thiết với nhau: quá trình
tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tạo ra enzyme amylase trong tế bào hay
ngoài môi trường. Ở một số vi sinh vật, quá trình sinh tổng hợp enzyme amylase
xảy ra song song với quá trình sinh trưởng, sự tạo ra enzyme amylase phụ thuộc

4


tuyến tính vào sự tăng sinh khối. Sự tạo thành enzyme amylase cực đại xảy ra sau
khi quần thể tế bào vi sinh vật đạt điểm sinh trưởng.
1.1.2. Phân loại
Amylase có thể thủy phân hạt tinh bột chưa hồ hóa cũng như hạt tinh bột đã
hồ hóa. Theo tính chất và cơ chế tác dụng lên tinh bột của amylase người ta phân
biệt amylase ra các loại sau: α-amylase, β-amylase, Glucoamylase…
Tốc độ phản ứng của Enzyme Amylase phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, mức độ
polyme hóa của cơ chất. Các Enzyme Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có tính

chất, cơ chế tác dụng và sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân khác nhau.
1.2. Enzyme amylase từ nấm mốc và từ vi khuẩn
Trong thiên nhiên, enzyme amylase có ở hầu hết mọi vi sinh vật, thực vật và
động vật. Song chỉ có một số loài vi sinh vật và một số hạt thực vật mới là đối
tượng dùng làm nguồn thu các chế phẩm enzyme amylase, do chúng có khả năng
tích lũy một lượng lớn các enzyme này trong những điều kiện xác định.
Ngày nay do có ưu thế về nhiều mặt, vi sinh vật trở thành nguồn thu enzyme
chủ đạo. Người ta đã biết nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp các enzyme
amylase. Những chủng vi sinh vật tạo nhiều enzyme amylase thường được phân lập
từ các nguồn tự nhiên, bởi các loài khác nhau và các chủng vi sinh vật khác nhau
cũng thường sản sinh ra nhiều enzyme khác nhau. Vi sinh vật tạo enzyme amylase
được dùng nhiền hơn cả là nấm mốc, giả nấm men và vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít
hơn.
- Để thu enzyme amylase người ta thường dùng các giống nấm mốc
Aspergillus, Rhizopus và một số loài của giống Mucor sinh tổng hợp rất mạnh mẽ αamylase và glucoamylase. Nấm men và giả nấm men thuộc các giống Candida,
Saccharomyces, Endomycopis, Endomyces cũng tạo enzyme amylase.
- Nhiều vi khuẩn có khả năng tạo lượng lớn enzyme amylase như Bacillus
subtilis,

Bacillus

polymyxa,

Clostridium

saccharophila, Bacillus circulans…

5

acetobutylicum,

Pseudomonas


- Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loài tạo enzyme amylase rất mạnh mẽ,
tuy nhiên cũng có một số tạo enzyme như xạ khuẩn ưa nhiệt.
Các enzyme amylase có trong nấm mốc, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn,
nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm. Bây giờ, người
ta thu chúng chủ yếu từ canh trường nấm mốc, vi khuẩn và một số loài nấm men.
Amylase có thể thủy phân hạt tinh bột chưa hồ hóa cũng như hạt tinh bột đã
hồ hóa. Theo tính chất và cơ chế tác dụng lên tinh bột của amylase người ta phân
biệt amylase ra các loại sau: α-amylase, β-amylase, glucoamylase… Các enzyme
amylase từ các nguồn khác nhau thường khác nhau về tính chất, cơ chế tác dụng
cũng như sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân.
α-amylase có khả năng phân cách các liên kết α-1,4 glucoside nằm ở phía
bên trong phân tử cơ chất: tinh bột, glycogen và polyose đồng loại một cách ngẫu
nhiên, không theo một trật tự nào cả. Vì thế người ta gọi nó là enzyme amylase nội
phân. α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột
nguyên lành, song với tốc độ rất chậm.
Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình đa giai đoạn. Ở giai
đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa) chỉ 1 số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một
lượng lớn dextrin phân tử thấp độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh sang giai đoạn
thứ hai (giai đoạn đường hóa) các dextrin phân tử thấp vừa được tạo thành bị thủy
phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine. Các chất này bị
thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới di và monosaccharide. Dưới tác dụng của
α-amylase, amylase bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc
glucose. Sau đó các polyglucose này lại bị phân cách tiếp tục nên các mạch
polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose và
maltotriose, và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của
amylase chứa 13% glucose và 87% maltose.

Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành
maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α-

6


amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp không cho
màu với iodine và một ít maltose.
α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng.
Protein của các α-amylase có tính chất acid yếu và tính chất của globulin. Điểm
đẳng điện nằm trong vùng pH 4,2-5,7. Khi tách hoàn toàn Ca ra khỏi enzyme thì
α-amylase mất hết khả năng thủy phân cơ chất. Vì Ca tham gia vào sự hình thành và
ổn định cấu trúc bậc Bacilus subtilis của enzyme, duy trì cấu hình hoạt động của
enzyme. Canxi còn có tác dụng bảo đảm cho α-amylase có độ bền cực lớn đối với
các tác động gây biến tính và sự phân hủy bởi các enzyme phân giải protein.αamylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác. α-amylase bị kìm hãm bởi kim loại
nặng.
α-amylase của nấm mốc chỉ tấn công những hạt tinh bột bị thương tích, còn
α-amylase vi khuẩn lại có khả năng phân hủy cả các hạt tinh bột nguyên vẹn lẫn hồ
tinh bột. Ở giai đoạn thủy phân cuối, tác dụng của α-amylase từ nấm mốc khác tác
dụng của α-amylase từ vi khuẩn. Dextrin do amylase vi khuẩn tạo ra có mạch dài
hơn dextrin do α-amylase của malt và nấm mốc tạo ra một số lần.
Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không
giống nhau. pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm mốc là 4,5-4,8, của
đại mạch nảy mầm và thóc mầm là 5,3 và của vi khuẩn là 5,8-6,0. Độ bền đối với
tác dụng của axit cũng khác nhau.α-amylase của nấm mốc Aspergillus oryzae bền
vững đối với axit tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn Bacilus subtilis.
Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúa tác của α-amylase từ các nguồn khác
nhau cũng không đồng nhất, α-amylase của nấm mốc rất nhạy đối với tác động của
nhiệt.Nhiệt độ tối thích của nó là 500C.Amylase của thóc mầm và của malt bền
nhiệt hơn và hoạt động tối thích ở 58-600C. Amylase của vi khuẩn có độ bền nhiệt

cao hơn cả. Nhiệt độ tối thích của nó là 70-750C . Amylase của nấm mốc bị vô hoạt
ở 700C, trong khi đó amylase vi khuẩn có thể chịu được nhiệt độ 920C. Những khác
biệt về nhiệt độ và pH tối thích, mức độ thủy phân và đặc tính thủy phân của αamylase từ các nguồn khác nhau đang mở ra nhiều khả năng to lớn trong việc ứng

7


dụng chúng một cách thích hợp và đầy hiệu quả ở các giai đoạn khác nhau của quá
trình sản xuất.
β-amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4 glucan trong tinh bột,
glucogen và polysaccharide đồng loại, phân cắt tuần tự từng gốc maltose một từ đầu
không khử của mạch. Maltose tạo thành có cấu hình β, vì thế amylase này được gọi
là β-amylase.
Theo đặc tính tác dụng lên tinh bột, β-amylase không thủy phân hạt tinh bột
nguyên lành mà thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột.β-amylase phân giải 100% amylose
thành maltose và phân giải 54-58% amylopectin thành maltose. Quá trình thủy phân
amylopectin được tiến hành từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng. Khi gặp
liên kết α-1,4 glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6 glucoside thì β-amylase ngừng
tác dụng. Phần saccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết α1,6 glucoside và được gọi là β-dextrin, α-dextrin cho màu tím đỏ của iodine. Độ
nhớt của dung dịch giảm chậm.
Glucoamylase thủy phân liên kết α-1,4 glucan trong polysaccharide, tách
tuần tự từng gốc glucose một khỏi đầu không khử của mạch. Glucoamylase có khả
năng xúc tác thủy phân đã liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucan. Glucoamylase là enzym
ngoại phân, nó thủy phân polysaccharide từ đầu không khử để tạo ra glucose.Khi
thủy phân tinh bột cùng với glucose còn có thể tạo thành các α-oligosaccharide.
Ngoài các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside, glucoamylase còn có khả năng thủy
phân liên kết α-1,2 và α-1,3 glucoside.
Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen,
amylopectin dextrin cuối, panose, isomatose và maltose tới glucose. Đa số
glucoamylase đã biết đều thuộc loại enzyme “axit” . Thể hiện hoạt lực tối đa ở vùng

pH 3,5-5,5. So với α-amylase, glucoamylase bền đối với axit hơn, nhưng lại kém
bền hơn dưới tác dụng của rượu etylic, aceton không được bảo vệ bằng Ca2+.
Điểm đẳng điện của glucoamylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng
nhất. Đa số các chế phẩm glucoamylase của nấm mốc, vi khuẩn, nấm men và của
mô động vật đều có pH hoạt động tối thích ở vùng axit trừ glucoamylase của

8


Saccharomyces italicus và một số mô động vật có pH hoạt động tối thích ở vùng
trung tính. Glucoamylase axit có pH hoạt động tối thích là 4,0-5,0; glucoamylase
trung tính pH tối thích là 6,0-7,5.
Những nghiên cứu về amylase vi sinh vật đã đặt nền móng cho việc sản xuất
các chế phẩm enzyme amylase để sử dụng trong sản xuất và đời sống. Những
nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của enzyme amylase ngày càng được phát triển
mạnh mẽ hơn và đang mở ra những phương hướng mới, triển vọng mới to lớn hơn
đối với việc ứng dụng enzyme amylase rộng rãi trong các ngành công nghiệp.
1.3. Điều kiện sinh trưởng của nấm mốc:
1.3.1. Nhu cầu dinh dưỡng
Nấm mốc là sinh vật dinh dưỡng hóa năng hữu cơ. Chúng chỉ có khả năng
thu nhận năng lượng từ môi trường bên ngoài nhờ quá trình oxy hóa hiếu khí hoặc
quá trình lên men kỵ khí các chất hữu cơ ngoại bào. Kiểu dinh dưỡng carbon hữu cơ
này được gọi là kiểu dinh dưỡng carbon dị dưỡng. mốc là những loài nấm có kiểu
carbon dị dưỡng thuộc loại hoại sinh, sử dụng các hợp chất hữu cơ để làm chất dinh
dưỡng.
a. Nguồn carbon:
Nấm mốc có thể sử dụng nguồn carbon rất khác nhau. Các loại thức ăn
carbon có thể dùng làm nguồn năng lượng và nguồn vật liệu xây dựng tế bào đối
với nấm mốc có thể kể đến các loại hydradecarbon (monosaccharide,
oligosaccharide, polysaccharide), các dẫn xuất của hydradecarbon, các loại rượu,

các loại axit hữu cơ, các loại axit amin, protein, lipid....Trong nhiều trường hợp nếu
có mặt trong môi trường vài nguồn carbon khác nhau, nấm mốc sẽ phát triển mạnh
mẽ hơn so với khi chỉ có riêng biệt từng loại một. Đối với các nguồn carbon phức
tạp (tinh bột, cenlulose,...) trước hết nấm mốc phải sinh ra các enzyme để phân hủy
các hợp chất này thành các hợp chất đơn phân tử sau đó mới đồng hóa được chúng.
b. Nguồn Nitơ:
Các loại nấm mốc khác nhau có thể có nhu cầu khác nhau đối với các nguồn
nitơ.Nấm mốc thường có khả năng sử dụng cả các nguồn nitơ hữu cơ lẫn các nguồn

9


nitơ vô cơ. Nhiều loại nấm mốc có khả năng đồng hóa cả muối amon lẫn nitrat. Đôi
khi có những loại nấm mốc không phát triển được trên các môi trường chứa nguồn
nitơ là muối amon nhưng nguyên nhân không phải ở bản thân gốc NH4+ mà ở độ
chua sinh lý do các muối amon tạo ra. Sau khi nấm mốc đồng hóa gốc NH4+ trong
môi trường sẽ tích lũy các anion vô cơ ( SO42- , HPO42- , Cl- ...) và làm hạ độ pH của
môi trường xuống. Ngược lại với các muối amon, nitrat là những muối có tính kiềm
sinh lý. Sau khi nấm đồng hóa gốc NO3- trong môi trường sẽ tích lũy lại các cation
(Na+ , K+...) và làm tăng rõ rệt độ pH của môi trường.
Khả năng đồng hóa amon sunfat của nấm mốc sẽ tăng cường rõ rệt khi bổ
sung vào môi trường một ít axit hữu cơ ( acid lactic, acid malic...). Ngoài các nguồn
nitơ vô cơ, nhiều loài nấm mốc có thể sử dụng nguồn nitơ hữu cơ (protein, peptid,
acid amin, ...).
c. Các nguyên tố khoáng:
Nấm mốc cần các nguyên tố đa lượng như: S, P, K, Ca, Mg và Fe. Các
nguyên tố được nấm mốc đòi hỏi với những số lượng rất nhỏ được gọi là các
nguyên tố vi lượng như: Mn, Zn, Cu, Co, Ni, ...
Lượng chứa từng nguyên tố khoáng trong tế bào nấm mốc không những thay
đổi tùy thuộc vào từng loài nấm mốc mà còn phụ thuộc cả vào điều kiện nuôi cấy

chúng. Sau đây là vai trò các chất khoáng trong tế bào nấm mốc:
- Phospho: thường chiếm tỷ lệ cao nhất trong thành phần khoáng của nấm
mốc. Phospho tham gia vào cấu tạo của nhiều chất hữu cơ rất quan trọng trong tế
bào nấm mốc như: nucleoprotein, nucleotid, phosphoprotein, phosphatid... ).
- Lưu huỳnh: tham gia vào thành phần của một số acid amin: cystin, cystein,
metionin. Lưu huỳnh cũng có mặt trong nhiều coenzyme quan trọng như acid lipoic,
biotin, coenzyme A ...
- Kali: có lượng khá lớn trong các tế bào nấm mốc, chúng tham gia vào quá
trình trao đổi glucid và có ảnh hưởng đến nhiều quá trình trao đổi chất khác của các
tế bào này.

10


- Magnesium: tham gia vào quá trình hoạt hóa khoảng 80 enzyme trong tế
bào. Có nghiên cứu cho biết việc thiếu Mg2+ dẫn đến việc ức chế quá trình hình
thành bào tử ở một số loài nấm mốc.
- Canxi: không tham gia các thành phần các chất hữu cơ trong tế bào nhưng
chúng rất cần thiết vì đóng vai trò cầu nối trung gian giữa nhiều thành phần quan
trọng trong tế bào (giữa các nucleotid, giữa protein và acid nucleic). Canxi còn có
ảnh hưởng đến sự hình thành các cấu trúc không gian ổn định của ribosome, nhân ...
- Sắt: tham gia vào kết cấu porphirin sắt của các hệ thống enzyme chuyển
vận electron. Sắt còn tham gia vào cấu trúc của các enzyme catalase, peroxidase.
d. Các chất sinh trưởng:
Cũng giống như đối với các loại vi sinh vật khác, nấm mốc có những quan hệ
rất khác nhau đối với các loại vitamin và các chất sinh trưởng khác. Việc một loài
nấm mốc không đòi hỏi một loại chất sinh trưởng nào đấy có thể do hoặc là chúng
tự tổng hợp ra được chất sinh trưởng này hoặc là trong quá trình trao đổi chất chúng
không cần tới loại coenzyme có chứa chất sinh trường này.
Người ta chia nấm mốc thành hai nhóm căn cứ vào mối quan hệ của chúng

đối với các chất sinh trưởng :
- Nhóm tự dưỡng chất sinh trưởng: có thể tự tổng hợp tất cả các chất sinh
trưởng cần thiết đối với hoạt động sống của chúng.
- Nhóm dị dưỡng chất sinh trưởng: cần phải được cung cấp một vài hoặc
nhiều chất sinh trưởng ở dạng có sẵn..
Nhu cầu về chất sinh trưởng của một loài nấm mốc có thể thay đổi tùy theo
điều kiện nuôi cấy, tùy theo tuổi giống. Phần lớn các vitamin nhóm B được các loài
nấm mốc sử dụng để tạo ra các enzyme cần thiết đối với hoạt động sống của chúng.
Nhiều loại vitamin tan trong lipid (A, D, E, K) được tìm thấy trong các lớp màng
sinh học, sự tồn tại và số lượng của các loại vitamin này trong môi trường có ảnh
hưởng rõ rệt đối với cấu trúc và đối với sự hoạt động của các lớp màng này.

11


1.3.2. Độ ẩm
Ngoài các chất dinh dưỡng nấm mốc cũng như tất cả sinh vật khác còn có
nhu cầu về nước cho các hoạt động sinh lý, sinh hóa của tế bào. Liên quan đến
lượng nước này là độ ẩm, bao gồm : hàm lượng nước của sản phẩm, độ ẩm tương
đối của không khí. Giữa hàm lượng nước của sản phẩm và độ ẩm của không khí ở
môi trường ngoài có mối liên quan (trao đổi qua lại).Chính mối liên quan dinh
dưỡng này không những ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm, mà còn ảnh
hưởng đến khả năng sử dụng nước của tế bào nấm mốc cho các quá trình sinh
trưởng, phát triển của chúng.
a. Hàm lượng nước của sản phẩm:
Nước trong các sản phẩm như: lương thực, thực phẩm, thuốc men, dược
liệu… gồm phần nước liên kết và phần nước không liên kết. Nấm mốc cũng như
các vi sinh vật khác chỉ sử dụng được phần nước tự do có trong sản phẩm, và cũng
chỉ phần nước này thực hiện sự trao đổi qua lại với nước có trong không khí.
b. Độ ẩm tương đối của không khí:

Mỗi loại nấm mốc thích ứng với một khoảng giá trị độ ẩm tương đối.Việc
giảm độ ẩm tương đối sẽ làm ngừng hoặc kéo dài thời gian nảy chồi của bào tử nấm
mốc.Nấm mốc sống trong môi trường có độ ẩm tương đối thấp, chúng có khả năng
thích nghi dần để có thể tiếp tục sinh trưởng, phát triển bình thường hoặc ở trạng
thái sống nghỉ. Ở độ ẩm tương đối thấp cùng với hàm lượng nước thấp trong sản
phẩm, tế bào nấm mốc đầu tiên mất nước tự do, sau mất nước liên kết. Tùy theo
lượng nước mất đi, nấm mốc chuyển sang trạng thái sống nghỉ hoặc bị chết. Phần
lớn nấm mốc không sinh trưởng, phát triển trong điều kiện độ ẩm tương đối của
không khí môi trường dưới 60%.
1.3.3. Nhiệt độ
Mỗi loài nấm mốc cũng có nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển, sinh
trưởng.Phần lớn nấm mốc sinh trưởng, phát triển ở nhiệt độ 15-300C và cũng
thường có nhiệt độ tăng trưởng tối ưu trong khoảng 20-250C tùy từng loài.Một số
rất nhỏ các loài nấm mốc có thể tăng trưởng ở các kho lạnh ở nhiệt độ -60C, thậm

12


chí ở -200C và một số ít loài khác có nhiệt độ tăng trưởng đến 500C. Căn cứ vào
nhiệt độ tăng trưởng, các loài nấm mốc được chia thành 5 nhóm: nhóm ưa nóng,
nhóm chịu nóng, nhóm ưa nhiệt trung bình, nhóm chịu lạnh, nhóm ưa lạnh.
1.3.4. pH
Một trong những yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của nấm
mốc đó là pH. Nấm mốc nảy mầm và sau đó tăng trưởng bình thường ở pH 7. Ở
môi trường kiềm hoặc axít, nấm mốc không hoặc tăng trưởng rất yếu.
1.4. Các phương pháp thu nhận enzyme amylase
1.4.1. Nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase bằng phương pháp bề mặt
Trong quá trình phát triển của vi sinh vật, enzyme luôn được tổng hợp để
tham gia vào quá trình đồng hóa và quá trình dị hóa. Trong thí nghiệm này chủ yếu
là thu nhận các chế phẩm enzyme thủy phân. Phần lớn các enzyme thủy phân là

enzyme cảm ứng. Do hoạt tính enzyme không chỉ biểu hiện ở khả năng thủy phân
của enzyme mà còn biểu hiện ở khả năng mà vi sinh vật tổng hợp ra nó trong những
điều kiện nuôi cấy nhất định.
Trong quá trình phát triển, vi sinh vật sẽ tạo ra nhiều loại enzyme khác nhau.
Các enzyme được tạo ra trong tế bào vi sinh vật và thoát ra khỏi tế bào để thực hiện
các phản ứng thủy phân ngoài tế bào được gọi là enzyme ngoại bào. Các enzyme
được tổng hợp trong tế bào vi sinh vật và thực hiện các phản ứng trong tế bào được
gọi là enzyme nội bào.
Thành phần chính của môi trường vi sinh vật tạo enzyme amylase bằng
phương pháp bề mặt là cám mì, cám gạo. Đó là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là
thành phần duy nhất của môi trường để nuôi vi sinh vật mà không cần phải bổ sung
thêm các chất khác nữa.
Chất lượng của cám gạo, cám mì có ảnh hưởng lớn tới hoạt lực của các
enzyme amylase.Cám không được chứa tinh bột dưới 20 – 30%, nên dùng cám tốt,
cám mới không hôi mùi mốc. Độ ẩm của cám không quá 15%, tạp chất độ không
quá 0,05%... Thành phần bổ sung được đưa vào môi trường có thể là chất làm xốp
môi trường hoặc làm giàu thêm chất dinh dưỡng và chất sinh trưởng mà ở cám

13


không có đủ. Thành phần này thường là mầm mạch, trấu, mùn cưa… Cám và các
chất phụ gia chứa nhiều vi sinh vật khác cần phải thanh trùng để đảm bảo môi
trường không có vi sinh vật ngoại lai, cần thanh trùng dưới áp suất hơi 1 – 1,5 atm
trong vòng 4 - 6 giờ.
Độ ẩm tối thích của môi trường: trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối
thích của môi trường đối với Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus
oryzae là 58 – 60% và phải giữ cho môi trường có độ ẩm đó trong suốt quá trình
nuôi. Độ ẩm mà quá 55 – 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 50 – 55%
thì kìm hãm sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng như tạo enzyme amylase.

Chế độ thông khí có thể liên tục, gián đoạn tùy thuộc vào chiều dày của lớp
môi trường nuôi, vào khoảng cách giữa các tầng khay và dãy khay. Ở giai đoạn sinh
trưởng thứ nhất phải thông khí vào phòng nuôi khoảng 4 – 5 lần thể tích không khí
trên một thể tích phòng trong một giờ, ở giai đoạn thứ hai là 30 – 60 thể tích không
khí trên thể tích phòng nuôi trong 1 giờ, giai đoạn ba giảm đi chỉ còn 10 – 12 thể
tích không khí.
Nhiệt độ nuôi: Toàn bộ chu kỳ sinh trưởng của nấm mốc trên cám chia làm
ba thời kỳ:
- Thời kỳ trương và nảy mầm của đính bào tử (đối với nấm mốc 10 – 11 giờ
đầu tiên, vi khuẩn 3 – 4 giờ). Trong thời kỳ này phải đốt nóng không khí phòng
nuôi và giữ cho nhiệt độ phòng nuôi không thấp hơn 23 – 300C đối với nấm mốc.Độ
ẩm tương đối của không khí là 96 – 100%.
- Thời kỳ sinh trưởng nhanh của hệ sợi kéo dài trong 4 – 18 giờ. Ở giai đoạn
này nấm mốc hô hấp rất mạnh và tạo ra một lượng nhiệt sinh lý lớn.Vì vậy cần phải
hạ nhiệt độ phòng nuôi khoảng 28 – 290C.
- Thời kỳ tạo enzyme amylase mạnh mẽ kéo dài từ 10 – 20 giờ. Trong thời
kỳ này các quá trình trao đổi chất dần dần yếu đi, sự tỏa nhiệt giảm mạnh.Các
enzyme amylase được tổng hợp mạnh mẽ. Đối với đa số vi sinh vật ở giai đoạn này
nên hạ nhiệt độ xuống 3 – 40C so với giai đoạn đầu. Nhiệt độ tối thích cho sinh
trưởng của đa số nấm mốc trên môi trường rắn là 28 – 300C.

14


Thời gian nuôi để có lượng enzyme amylase cực lớn: Tùy thuộc vào tính
chất sinh lý của chủng vi sinh vật và sự ngừng tổng hợp enzyme amylase mà có thể
ngừng sinh trưởng của nấm mốc vào bất kỳ lúc nào thấy cần thiết. Sự tạo bào tử là
hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt lực enzyme.Đa số nấm mốc
Aspergillus, sự tạo enzym amylase cực đại thường kết thúc khi nấm mốc bắt đầu
sinh đính bào tử.

1.4.2. Nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase bằng phương pháp nuôi cấy
chìm.
Phương pháp nuôi cấy chìm là phương pháp vi sinh vật phát triển, sinh sản
và trao đổi chất trong lòng môi trường. Môi trường dùng trong nuôi cấy chìm là môi
trường lỏng.
Trong quá trình phát triển, sinh sản và trao đổi chất trong lòng môi trường
lỏng, vi sinh vật sẽ tổng hợp ra các enzyme thủy phân. Các enzyme thủy phân là các
enzyme hòa tan trong nước. Do đó việc thu nhận enzyme trong trường hợp này là
thu nhận dịch nuôi cấy. ( sau khi đã tách sinh khối và những thành phần không hòa
tan của môi trường).
Chế phẩm enzyme thô trong nuôi cấy chìm ở đây bao gồm enzyme đã hòa
tan trong nước, nước và các sản phẩm trao đổi chất hòa tan khác.
Môi trường dinh dưỡng: môi trường nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase là
có chất cảm ứng là tinh bột, dextrin hay maltose. Để tạo điều kiện cho vi sinh vật
phát triển tốt và sinh nhiều enzyme amylase người ta cho thêm vào môi trường các
loại nước chiết như nước chiết mầm mạch, nước chiết ngô, nước chiết đậu nành…
Độ axit của môi trường được xác định bởi thành phần và tính chất của các
muối vô cơ thêm vào môi trường cũng như sự tiêu thụ các muối này bởi vi sinh vật,
pH của môi trường phụ thuộc vào tính chất của nguồn nitơ vô cơ . Nếu thêm vào
môi trường các muối ammonium thì khi vi sinh vật tiêu thụ ion ammonium, các
anion được giải phóng ra sẽ axit hóa môi trường. Vì thế cần phải thêm CaCO3 vào
để trung hòa hoặc duy trì giá trị pH thích hợp cho việc tổng hợp enzyme amylase.

15


Nhiệt độ nuôi: là một yếu tố quan trọng đối với sinh trưởng của vi sinh vật và
sự tạo thành enzyme amylase. Nhiệt độ nuôi tối thích đối với nấm mốc thuộc giống
Aspergillus là 30 – 320C, Bacillus subtilis là 370C.
Sục khí và khuấy trộn. Phần lớn vi sinh vật tạo enzyme amylase là những vi

sinh vật hiếu khí. Vì vậy sinh trưởng của chúng phụ thuộc vào lượng oxy phân tử
hòa tan trong dịch nuôi cấy. Trong quá trình sinh trưởng, vi sinh vật sử dụng oxy
phân tử cho hoạt động sống nên lượng oxy hòa tan trong môi trường lỏng phải luôn
luôn được bổ sung. Vì thế việc sục khí và khuấy đảo môi trường có tác dụng tốt tới
sinh trưởng và tích lũy sinh khối cũng như sinh tổng hợp enzyme amylase của vi
sinh vật. Chế độ sục khí đối với nấm mốc là 10 – 12m3 không khí vô trùng trên 1 m3
môi trường trong 1 giờ với thời gian nuôi khoảng 68 – 72 giờ.
1.5. Ứng dụng của enzyme amylase
Chế phẩm enzyme amylase được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp - đặc
biệt là trong công nghiệp thực phẩm, sau đây là một số ứng dụng quan trọng của
enzyme amylase:
1.5.1. Amylase trong công nghiệp rượu – bia
Chế phẩm enzyme amylase từ nấm mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus
awamori, Aspergillus usamii, Aspergillus niger, Rhizopus delemar hoặc từ
Endomycopsis bispora, từ vi khuẩn Bacillus subtilis, Bacillus diastaticus được thay
thế malt làm tác nhân đường hóa tinh bột trong sản xuất rượu,bia từ nguyên liệu có
bột. Việc sử dụng chế phẩm amylase vi sinh vật thay malt đã tiết kiệm được hàng
vạn tấn đại mạch loại tốt, giảm giá thành, rút ngắn quy trình sản xuất.
Trong giai đoạn đường hóa, glucoamylase chiếm vị trí hàng đầu và đóng vai
trò quyết định trong việc chuyển hóa tinh bột thành đường lên men, do vậy cần
chọn chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh nhiều glucoamylase. Trong sản xuất
rượu người ta thường dùng hỗn hợp canh trường bề mặt hay bề sâu của các nấm
mốc. Ở Việt Nam chúng ta dùng canh trường bề mặt của nấm mốc Aspergillus
oryzae, Aspergillus usamii, Aspergillus awamori và Rhizopus delemar để đường

16


hóa. Ở một số nước, ngoài enzyme amylase nấm mốc người ta còn sử dụng enzyme
amylase từ vi khuẩn, nấm men cũng cho kết quả đường hóa khá cao.

Chế phẩm enzyme amylase từ vi khuẩn Bacillus subtilis, Bacillus diastaticus
chịu nhiệt độ cao, dùng trong giai đoạn dịch hóa tinh bột lúc đầu, trước khi đường
hóa rất tốt. Ở nhiệt độ 80-900C trong 10-15 phút α-amylase của vi khuẩn bị vô hoạt
một phần rất nhỏ.
Trong sản xuất bia, thường dùng Aspergillus oryzae và Bacillus subtilis để
đường hóa thay malt, là nguyên liệu khá đắt tiền và cần thiết trong sản xuất bia.
Dùng chế phẩm enzyme này người ta có thể thay từ 50 - 100% malt bằng đại mạch
không nảy mầm, thay thế 50 - 60% malt thì chất lượng bia tốt hơn. Khi dùng chế
phẩm enzyme vi sinh vật thay malt, cần bổ sung nguồn nguyên liệu có bột như các
loại ngũ cốc như: bắp, khôi, sắn, gạo, đại mạch không nảy mầm, tiểu mạch. Biện
pháp thay thế malt bằng chế phẩm enzyme như trên có ý nghĩa đặc biệt quan trọng
trong việc giảm giá đáng kể giá thành của sản phẩm, mà chất lượng bia vẫn bảo
đảm.
1.5.2. Trong sản xuất bánh mì
Trong sản xuất bánh mì người ta thường sử dụng chế phẩm enzyme amylase
của nấm mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, hay của vi khuẩn, nhưng
chế phẩm từ nấm mốc áp dụng có hiệu quả và rộng rãi hơn.
Dùng với lượng 0,002 - 0,05% chế phẩm enzyme amylase so với bột nhão sẽ
tăng cường quá trình lên men bột, rút ngắn thời gian lên men xuống 20 - 30%, tăng
độ xốp 5 - 8%, tăng thể tích bánh lên men 15 - 25% màu sắc vỏ bánh đẹp hơn, ruột
bánh xốp và sáng màu hơn tăng hương vị thơm ngon của bánh. Khi làm bánh mì
ngọt, nếu thêm chế phẩm enzyme amylase vào bột, sẽ xảy ra quá trình thủy phân
bột thành đường, do đó giảm lượng đường tiêu tốn cho sản xuất.
1.5.3. Trong sản xuất mật, tinh bột, malto, gluco
Từ lâu các sản phẩm mật tinh bột như: mật gluco, mật malto… được sản xuất
bằng phương pháp thủy phân tinh bột bằng axit hay bằng malt. Ngày nay người ta

17