Nghiên cứu quá trình tách chết và tinh sạch protein từ rong cladophora SP

tên đề tài.txt
Nghiên cứu quá trình tách chết và tinh sạch protein từ rong Cladophora SP
(Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng; Cn. Đỗ Thị Tuyến)
SV: Hoàng Thị Huyền
MSSV: 0851110099
Lớp: 08DSH5

Page 1


Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG I: MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề

Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về rong biển đã được thực hiện trên
các khía cạnh khác nhau như: đa dạng sinh học, nguồn lợi, nuôi trồng và tạo
giống làm nguyên liệu trong sản xuất nhiên liệu sinh học.
Việc nuôi trồng rong biển tăng lợi nhuận do rong biển phát triển nhanh,
pham vi thích nghi rộng, có khả năng chịu được độ mặn rộng và phát triển được
ở vùng nước lợ, có thể tận dụng tài nguyên mặt nướcvà giúp cải thiện và duy trì
chất lượng nước. Hàm lượng protein cao và có giá trị có thể bổ sung vào thực
phẩm, sử dụng trong y dược hoặc làm thức ăn gia súc. Công nghiệp thức ăn gia
súc đang khó khăn để tìm cách đưa protein vào thành phần thức ăn với giá thành
hợp lý. Các loài thực vật thủy sinh chứa khoảng 20% protein trong thành phần
có các loại acid amin thiết yếu phù hợp với nhu cầu của tôm. Việc sản xuất
thành công sản phẩm protein từ rong nhằm sử dụng trong thức ăn gia súc sẽ góp
phần giảm thiểu chi phí chăn nuôi cho nông dân, đa dạng hóa các sản phẩm
nông nghiệp.

Đề tài nằm trong một phần của dự án chuyển hóa sinh khối rong thành đường
để lên men tạo ethanol và butanol.
1.2.

Mục đích nghiên cứu

Quá trình chuyển hóa sinh khối rong thành đường để lên men tạo ethanol và
butanol, đồng thời còn ly trích được protein từ sinh khối có khả năng sử dụng
làm thức ăn cho con người, nguyên liệu cho công nghiệp (như: agar,
carrageenan, alginate…), bổ sung vào thức ăn gia súc hay phân bón.
1.3.

Mục tiêu nghiên cứu

-

Xác định chỉ tiêu sinh hóa của rong Cladophora sp.

-

Tách chiết protein từ rong Cladophora sp.

1


Đồ án tốt nghiệp

-

Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký lọc gel

-

Xác định trọng lượng phân tử bằng phương pháp điện di SDS – PAGE

1.4.

Phƣơng pháp nghiên cứu

-

Thu thập tài liệu trong và ngoài nước có liên quan đến nội dung nghiên cứu

-

Tổng hợp, phân tích, so sánh và lựa chọn hướng nghiên cứu phù hợp.

-

Phân tích đánh giá điều kiện thực tế về kỹ thuật, kinh tế để xác định giới hạn
nghiên cứu và phương pháp thực hiện.

-

Lập kế hoạch, sơ đồ thực hiện thí nghiệm

-

Xử lý kết quả bằng excel, phần mềm Modde 5.0

1.5.

Giới hạn đề tài
Vì lý do giới hạn về thời gian, đề tài chỉ thực hiện việc nghiên cứu quá

trình tách chiết, tinh sạch protein trên gel Sephadex G50 và điện di SDS –
PAGE.

2


Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, có nhiều loại nền đáy khác
nhau như cát, sỏi, đá tảng, san hô chết… Vì thế mà rong biển phát triển rất đa
dạng và phong phú. Theo nhiều công trình nghiên cứu hiện nay có khoảng 800
loài rong biển thuộc 3 ngành: Chlorophyta, Heterokontophyta, Rhodophyta.
Nhiều loài có giá trị kinh tế cao, khoảng 121 loài đang được người dân ven biển
khai thác. Trong đó 65 loài dùng làm thực phẩm và 56 loài dùng trong công
nghiệp chế biến hoặc sản xuất các chất như: agar, carrageenan, alginate…
-

Rong dùng làm thực phẩm cho con người: Porphyra crispate, Dermonema
frappierii, Gelidiella acerosa, Gracilaria salicornia, Ulva kylinii,…

-

Rong làm nguyên liệu trong công nghiệp chế biến: Agar (Gelidiella acerosa,
Hypnea sp. …); Alginate (Hydroclathrus clathratus, Colpomenia sinuosa,

Sargassum binderi,…); Carrageenan (Hypnea boergesenii, Hypnea
japonica,…).

-

Rong dùng làm dược liệu: Porphyra crispate, Gelidiella, Sargassum
binderi,…
Ngành rong Lục (Chlorophyta) được xem là một ngành lớn, có nhiều loài,

đến nay trên toàn thế giới biết khoảng 500 chi và 8000 loài. Phần lớn chúng
sống trong nước ngọt gần 90%, còn lại ở biển và đại dương hơn 10%. Chúng
phân bố chủ yếu ở nền đáy mềm trong các đầm, phá, vịnh và trong các ao nuôi
tôm bỏ hoang. Chịu được độ mặn từ 5-50 %.
2. 1

Tổng quan về rong Cladophora sp.
Chi

Cladophora

Họ

Cladophoraceae

Bộ

Cladophorales

Ngành

Chlorophyta

3


Đồ án tốt nghiệp

2.1.1

Đặc điểm hình thái

Cladophora được xếp trong lớp Cladophorophyceae (Chlorophyta). Do đó
Cladophora cũng sẽ mang những đặc điểm hình thái của loài rong lục trên.
-

Hình dạng: Các loài rong Lục sống ở biển thường có dạng sợi (Cladophora,

Ulvothrix), dạng ống (Codium, Enteromorpha), dạng phiến lá (Ulva,
Monostroma), hình mạng, dạng chuỗi hạt, hình cầu hoặc bán cầu.
-

Cấu tạo tế bào: Vỏ tế bào do nguyên sinh chất phân hóa tạo ra, gồm có

cellulose ở phía trong và pectin ở phía ngoài. Chất nguyên sinh tạo thành 1 lớp
mỏng ở sát thành vỏ tế bào, ở giữa tế bào là một không bào lớn chứa đầy dịch tế
bào. Sắc tố chủ yếu là chlorophyll a, chlorophyll b làm cho rong có màu xanh.

2.1.2

Sinh sản

Rong Lục có 3 kiểu sinh sản chủ yếu là sinh dưỡng, vô tính, hữu tính
2.1.3
-

Dạng sống

Bám cố định: Rong bám trên đá sỏi, rạn san hô, gốc mục hay các động vật

thân mềm. Điển hình như rong Tóc đốt (Chaetomorpha), rong Cải biển
(Ulva),…
-

Sống tự do: Chúng nảy mầm từ những bào tử và bám vào vật bám, đến một

giai đoạn nào đó chúng sẽ rời vật bám sống tự do thành bè mảng. Điển hình như
rong Bún (Enteromorpha), một số loài rong Lông cứng (Cladophora).
-

Sống bì sinh: một số loài rong nhỏ thường sống bám trên các loài sinh vật

khác hay bám trên các rong khác như Chaetomorpha aerea, rong lông cứng
chùm Cladophora fascicularis,…

2.1.4

Hệ thống phân loại

Cho đến nay ở trên thế giới cũng như trong nước chưa có một hệ thống phân
loại nào được xem là thống nhất và hợp lý cho ngành rong lục Chlorophyta.

4


Đồ án tốt nghiệp

Theo Phạm Hoàng Hộ (1969), Taylor (1960), tác giả xếp rong Lục vào 1 lớp
Chlorophyceae
Bảng 2.1: Hệ thống phân loại các bộ của ngành rong Lục chỉ gồm 1 lớp
Chlorophyceae
Taylor (1960)

Phạm Hoàng Hộ (1969)

Chlorococcales

Ulothrichales

Tetrasorales

Cladophorales

Ulothrichales

Siphonocladales

Prasiolaes

Derbesiales

Cladophorales

Caulerpales

Siphonocladales

Codiales

Siphonales

-

Các loài thuộc chi Cladophora sp.:


Cladophora aegagrophila



Cladophora albida



Cladophora brasiliana



Cladophora catenata



Cladophora coelothrix



Cladophora columbiana



Cladophora dalmatica



Cladophora fracta



Cladophora glomerata



Cladophora graminea



Cladophora montagneana



Cladophora ordinata

5


Đồ án tốt nghiệp



Cladophora prolifera



Cladophora rupestris



Cladophora scopaeformis



Cladophora sericea



Cladophora vagabunda

Theo thống kê số liệu đo đạt khảo sát thực tế về diện tích phân bố rong và
sản lượng hiện tại (2009) ở Việt Nam cho thấy khả năng khai thác tự nhiên và
nuôi trồng có thể đạt diện tích 79126,32 ha và sản lượng thu hoạch được là
69703,26 tấn khô.

6


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 2.2: Diện tích và sản lượng tại thời điểm (2009) và dự kiến đến năm 2015
của một số tỉnh ở Việt Nam
Chlorophyta
Tiềm năng

Hiện trạng
Diện tích

Sản lượng

Diện tích

Sản lượng

(ha)

(Tấn khô)

(ha)

(Tấn khô)

Quảng Ninh

334

160

4388

5276

Hải Phòng

399

139

3146

3495

Thái Bình

702

88

4067

4176

Nam Định

481

160

4331

4853

Ninh Bình

308

38

2175

2308

Thừa Thiên Huế

90

89

1938

2370

Quảng Nam

96

74

1526

1887

Vũng Tàu

197

207

5249

6229

Bến Tre

9671

5503

107400

65880

Trà Vinh

7470

7444

249650

149970

Sóc Trăng

8455

8956

72250

43650

Bạc Liêu

11198

7300

107400

65880

Cà Mau

18570

9674

249650

149970

Kiên Giang

1534

745

72319

43786

7


Đồ án tốt nghiệp

2. 2

Tổng quan tình hình nghiên cứu rong biển

2.2.1

Tình hình nghiên cứu rong biển ở nước ngoài

-

Có một số xu hướng quản lý nuôi trồng thủy sản các loài như tôm, cá với các

loài hấp thụ dinh dưỡng hữu cơ và vô cơ như rong biển… giúp tái sử dụng
nguồn dinh dưỡng, giảm ô nhiễm môi trường, có lợi cho các đối tượng nuôi
trồng, đa dạng hóa nguồn thu nhập, nâng cao lợi nhuận.
-

Theo nghiên cứu của Amir Neori (2007), một số loài rong xanh làm lọc sinh

học cho các hệ thống nuôi trồng thủy sản như Ulva lactuca, Undaria pinnatifida,
giúp cải thiện chất lượng nước và giảm ô nhiễm môi trường.
-

Một số loài rong bún Enteromorpha sp. Khi nuôi trong ao tôm làm tăng năng

suất và chất lượng của tôm nuôi. Theo nghiên cứu của Moll & Deikman (1995)
xác nhận việc nuôi rong Enteromorpha clathrata trong ao tôm có tốc độ sinh
trưởng lên đến 28g khô/m2/ngày, nếu duy trì liên tục trong 1 năm có thể đạt 100
tấn/ ha/ năm.
-

Đã có nhiều nghiên cứu chiết xuất các chất trong rong biển làm thực phẩm,

dược liệu có giá trị sinh học cao như β-caroten, các chất chống oxy hóa, hay
nghiên cứu sản xuất nhiên liệu sinh học từ rong biển.

2.2.2

-

Tình hình nghiên cứu rong biển ở trong nước

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa và đường bờ biển dài, đa dạng

các kiểu đầm, sông … Vì vậy rong biển phát triển rất đa dạng và phong phú. Các
loài rong biển chủ yếu thuộc 3 ngành Chlorophyta, Heterokontophyta,
Rhodophyta. Trong đó ngành rong lục Chlorophyta được xem là một ngành lớn,
có nhiều loài. Phần lớn chúng sống trong nước ngọt gần 90%, còn lại ở biển và
đại dương.
-

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về việc nuôi trồng rong cũng được thực hiện

nhiều, tập trung chủ yếu trên các giống rong như Gracillariace, Kappaphycus.

8


Đồ án tốt nghiệp

-

Một số nghiên cứu về nuôi trồng kết hợp rong với các loài thủy sản khác

cũng đã được thử nghiệm. Ví dụ như trồng rong sụn (Kappaphycus alvarezii)
luân canh trong ao nuôi tôm, kết quả thu được rất khả thi.
-

Người nuôi tôm rất thích sự hiện diện của các loài rong Enteromorpha hay

Chaetomorpha trong ao nuôi tôm, vì chúng giúp cải thiện môi trường ao nuôi,
làm thức ăn cho tôm và cải thiện năng suất tôm nuôi.

2. 3
-

Giới thiệu về protein trong rong biển

Hàm lượng protein của rong biển khác nhau tùy theo loài. Thấp nhất là ở

rong nâu (3 –15 % trọng lượng khô), trong rong lục có hàm lượng trung bình (9
– 26 % trọng lượng khô) và cao nhất là ở rong đỏ (tối đa 47% trọng lượng khô).
Ngoại trừ loài Undaria pinnatifida có hàm lượng protein khoảng 11 – 24% trọng
lượng khô. Hầu hết các loài rong Nâu được sử dụng như các loại rau biển hoặc
để khai thác keo (colloid) có chứa ít hơn 15% protein (tính theo trọng lượng
khô).

9


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 2.3. Hàm lượng protein trong một số loài rong được tiêu dùng như thực phẩm
của con người
Phaeophyta
Lamina

Loài

ria
digitata

Chlorophyta

Ascoph

Undari

yllum

a

Ulva

nodosu

pinnatif

lactuca

m

ida

Ulva
lactu
ca

Rhodophyta
Palma
ria
palmat
a

Porph
yra
tenera

Chon
drus
crisp
us

%protei
n (tính
theo

8.0-

trọng

15.0

3.0-15.0

11.0-

8.7-

17.5-

8.0-

33.0-

24.0

32.7

26.0

35.0

47.0

21.4

lượng
khô)

Các loài rong Lục có thể ăn được thuộc chi Ulva vì nồng độ protein của
chúng có thể đại diện cho 9 – 33% khối lượng thực vật khô. Ulva pertusa
thường được người dân Nhật Bản sử dụng dưới tên “aonori” cho thấy mức độ
protein cao (26% trọng lượng khô)(bảng 1). Một số công trình nghiên cứu đã
cho thấy hàm lượng protein của Ulva lactuca khá cao (32%), nhưng giá trị này
dường như cao theo mùa.
Tuy nhiên, hàm lượng protein cao hơn cả là ở rong Đỏ. Ví dụ, Porphyra
yezoensis có thể chứa đến 47% protein theo trọng lượng khô. Mức này cao hơn

so với hàm lượng protein cao ở đậu như đậu nành. Ở rong Palmaria palmate có
thể chứa 35% hàm lượng protein (tính theo khối lượng khô). Loài này được tiêu
thụ nhiều ở Bắc Âu.
Hàm lượng protein của loài rong biển cũng thay đổi theo chu kỳ mùa. Ví dụ,
hàm lượng protein của Palmaria palmate thu thập trên bờ biển Đại Tây Dương

10


Đồ án tốt nghiệp

của Pháp cho thấy sự thay đổi lớn (9 – 25% protein) (hình 1) với giá trị cao nhất
xảy ra trong vài tháng mùa đông và mùa xuân.
Việc biến đổi theo mùa hàm lượng protein của tảo cũng ở rong Lục và rong
Nâu. Ví dụ rong Lục Ulva lactuca có hàm lượng protein đạt tối đa trong tháng
tám (32.7% theo trọng lượng khô) và tối thiểu trong tháng tư (8.7%). Sự thay
đổi hàm lượng protein theo mùa cũng đã được quan sát ở rong Nâu ăn được như
Laminaria digitata (6.5 – 14.5% theo trọng lượng khô.
Các thành phần acid amin của rong đã được nghiên cứu thường xuyên hơn so
với protein của thực phẩm khác như đậu hoặc trứng. Đối với hầu hết các loài
rong biển, một phần lớn các acid amin bao gồm acid aspartic và glutamic (bảng
3) đặc biệt nhiều trong rong Nâu. Ví dụ trong Fucus sp., những acid amin có mặt
khoảng 22 – 44% tổng số các acid amin .

2. 4
-

Giới thiệu về phƣơng pháp sắc ký lọc gel

Protein được tinh sạch dựa trên những đặc tính căn bản như độ hòa tan, kích

thước, điện tích hay liên kết ái lực. Các kỹ thuật tinh sạch thường dùng như tủa
bằng muối, thẩm tách hay sắc ký. Trong đó, sắc ký được sử dụng nhiều nhất vì
nó thích hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể sử dụng ngay
cho việc định lượng và định danh. Tùy loại mẫu cần phân tách mà ta có thể lựa
chọn loại sắc ký để sử dụng. Có bốn phương pháp sắc ký được ứng dụng nhiều
trong tinh sạch protein: sắc ký lọc gel dựa vào kích thước phân tử, sắc ký trao
đổi ion dựa vào điện tích của phân tử, sắc ký ái lực dựa vào ái lực của phân tử
với một loại phân tử khác và sắc ký lỏng cao áp dựa vào kích thước phân tử nhờ
vào áp suất.
-

Tuy nhiên, sắc ký lọc gel tốt hơn các phương pháp khác. Mẫu sẽ được nạp

vào đầu một cột chứa nhiều hạt gel có lỗ làm từ polymer không tan nhưng có
tính hydrate hóa cao như dextran, agarose hay polyacrylamide, Sepharose hay

11


Đồ án tốt nghiệp

Bio-gel là những loại gel phổ biến có sẵn những hạt lỗ với đường kính chuẩn là
100µm (0.1mm). Những phân tử nhỏ thì ở bên trong các hạt, những phân tử lớn
thì chỉ bên ngoài các hạt. Vì vậy, những phân tử có kích thước lớn sẽ chảy ra
nhanh hơn và ra ngoài trước, còn những phân tử nhỏ đi quanh co nên ra sau
cùng.

Hình 2.1: Nguyên tắc sắc ký lọc gel

-

Sắc ký lọc gel khá phù hợp cho các phân tử sinh học mẫn cảm với sự thay

đổi của pH, nồng độ ion kim loại hoặc các co-factor và các điều kiện môi trường
khắc nghiệt. Sự phân tách có thể thực hiện khi có sự hiện diện của các ion, các
chất tẩy, urea, guanidine hydrochloride, ở cường độ ion cao hoặc thấp tùy theo
những yêu cầu thí nghiệm.

2.4.1
-

Bản chất của phương pháp

Sự tách riêng biệt các phân tử protein dựa trên sự khác biệt về hình dạng và

trọng lượng phân tử, khi hỗn hợp protein di chuyển dọc theo chất mang có kích
thước lỗ quy định theo cơ chế thẩm thấu và có sự khuyếch tán chọn lọc.

12


Đồ án tốt nghiệp

-

Để phân tách, môi trường lọc gel được nhồi trong cột để tạo nền nhồi. Môi

trường này là một chất nền có lỗ ở dạng hạt hình cầu, loại hạt này phải có tính
trơ. Nền nhồi được cân bằng bởi dung dịch đệm, dung dịch này làm đầy các lỗ

của hạt và khoảng không của chất nền. Chất lỏng bên trong các lỗ hạt đôi khi
cũng được xem như là phase tĩnh và chất lỏng bên ngoài các hạt được xem như
phase động. Mẫu được giải hấp một cách đồng nhất nghĩa là không cần sử dụng
các loại đệm khác nhau trong quá trình phân tách. Việc rửa giải cũng sử dụng
loại đệm của quá trình phân tách, làm cho việc loại bỏ các phân tử còn sót lại dễ
dàng hơn và để chuẩn bị cột cho lần chạy kế tiếp.

2.4.2

Quá trình lọc gel

Bước 1. Các hạt gel được nhồi trong cột.
Bước 2. Mẫu được nạp vào cột.
Bước 3. Dung dịch đệm (phase động) và mẫu di chuyển qua cột. Các phân tử
khuếch tán trong và ngoài các lỗ của chất nền. Các phân tử nhỏ hơn sẽ di chuyển
vào sâu trong chất nền và do đó lưu lại trong cột lâu hơn.
Bước 4. Khi dung dịch đệm di chuyển liên tục qua cột, các phân tử lớn hơn
kích thước lỗ gel không thể khuếch tán vào trong lỗ và do đó di chuyển qua cột
ra ngoài trước. Các phân tử nhỏ hơn khuếch tán vào trong các lỗ gel và bị trì
hoãn trong quá trình di chuyển.
Bước 5. Các phân tử lớn rời cột trước nhất, sau đó đến các phân tử nhỏ hơn
theo trình tự kích thước của chúng. Quá trình phân tách xảy ra hoàn toàn khi một
lượng dung môi bằng tổng thể tích cột di chuyển qua môi trường lọc gel.

13


Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.2: Quá trình lọc gel

 Một số thông số vật lý của phương pháp:
Phạm vi tách (Fructionation range) : Các phân tử nằm trong khoảng trọng
lượng phân tử (MW) giới hạn của mỗi loại gel được phân tách dễ dàng. Ví dụ,
gel Sephadex G50 có FR từ 5000 – 30000 Da.
Độ ngậm nước (water regain): Là trọng lượng nước mà 1 gam bột gel khô
hút nước. Ví dụ G50 có WR là 5.0±0.3 gam. Giá trị này chưa tính đến lượng
nước bao quanh hạt.
Thể tích nền (bed volume): Là thể tích cuối cùng mà 1 gam gel khô hấp thu
khi trương nở trong nước. Ví dụ, G50 có thể tích nền là 9 – 11 ml/g gel khô.

2.4.3

Phase tĩnh của sắc ký lọc gel

Việc tinh sạch trong sắc kí lọc gel tùy vào đặc điểm của lỗ rỗng trong hệ
mạng không gian ba chiều của hạt gel. Hạt gel phải có kích cỡ giống nhau, có
tính trơ về mặt hóa học, bền về mặt cơ học, các lỗ rỗng trong hạt gel phải có
hình dạng đồng nhất.

14


Đồ án tốt nghiệp

Mỗi loại gel có khả năng tách một loại trọng lượng phân tử, tùy vào kích
thước của lỗ rỗng trong hạt gel. Vì thế, nếu muốn tách một hỗn hợp chứa nhiều
loại hợp chất có nhiều trọng lượng phân tử khác nhau thì phải sử dụng một loạt
những gel khác nhau, để mỗi loại sẽ tách riêng một nhóm hợp chất cỏ khoảng
trọng lương phân tử xác định.
Các nhà sản xuất có những loại gel thương mại rất tốt, tuy nhiên các loại gel

đó không chịu được những điều kiện acid hoặc base quá mạnh. Các nhà sản xuất
cũng ít có loại gel với lỗ rỗng lớn vì các hạt gel này kém bền cơ học: trong quá
trình giải ly nếu sử dụng một áp lực nhỏ, hạt gel này dễ bị bóp méo, biến dạng,
làm ảnh hưởng đến vận tốc dòng chảy của pha động.
Giống như các loại gel trong các kĩ thuật sắc ký khác, hạt gel trong sắc ký
gel có dạng hình cầu. Hạt gel được lựa chọn có kích thước lỗ tương đồng với
trọng lượng phân tử của mẫu cần tách.
Có hai nguyên liệu chính để chế tạo gel là xerogel và aerogel. Xerogel là loại
gel cổ điển, khi cho tiếp xúc với dung môi, gel sẽ trương nở để tạo thành mạng
gel với các lỗ rỗng tương đối mềm. Trong hệ gel này các lỗ rỗng là khoảng trống
giữa những chuỗi dây trong hệ thống mạng gel. Nếu dung môi được loại khỏi hệ
thống mạng, cấu trúc gel bị sụp đổ, nếu cho dung môi trở lại, đôi khi có thể khôi
phục lại hệ mạng đó.
Ngược lại, aerogel là nguyên liệu rắn chắc và không phải là gel như thủy tinh
có lỗ rỗng hoặc silica có lỗ rỗng mà dung môi có thể chui qua các lỗ này. Khi
dung môi có thể chui vào các lỗ rỗng này và được loai khỏi hệ thống mạng, cấu
trúc gel không bị xụp đổ.
Các nhà sản xuất có nguyên liệu lai trộn giữa xerogel và aerogel, ví dụ như
polystyrene. Loại nguyên liệu này có cấu trúc khá rắn chắc, nhưng trương nở có
mức độ khi tiếp xúc với dung môi.

15


Đồ án tốt nghiệp

 Gel dextran ( tên thương mại sephadex)
Là loại gel được điều chế đầu tiên và vẫn còn thông dụng hiện nay. Gel
dextran là polysacarid thiên nhiên, mạch thẳng, nghĩa là chuỗi dây polyglucose
nối với nhau bởi nối α-1,6.

Mỗi chuỗi polysacarid của dextran được tạo mạng ngang, bởi nối glyceryl,
giữa các nhóm (–OH) khi cho phản ứng với hợp chất epiclorohydrin trong dung
môi hữu cơ ở điều kiện kiềm. Sản phẩm tạo thành là chất rắn dạng hình cầu
không tan trong nước, nhưng có tính ái nước cao vì có mang nhiều nhóm
hydroxyl. Vì tính ái nước cao nên hạt gel sẽ trương nở trong dung dịch có nước,
một gam gel khô có thể ngậm được 1-20ml nước.
Gel sephadex không tan trong nước, bền trong các dung dịch nước muối,
dung dịch kiềm, cả trong dung môi hữu cơ. Chỉ khi tiếp xúc mạnh với acid vô cơ
mạnh, mới có thể thủy giải được nối glycosic, còn nếu tiếp xúc trong 2 giờ với
dung dịch acid như HCl 0,1 N vẫn không bị ảnh hưởng. Thực nghiệm sắc ký cột
với acid formic 88% với gel G – 50 vẫn không bị hư hại. Gel ổn định an toàn
trong khoảng pH 2-12.
Một số loại gel Sephadex và khả năng tách các hợp chất theo trọng lượng
phân tử khác nhau (bảng 2.4)

16


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 2.4: Một số gel Sephadex G và tính chất của chúng

Loại gel
Sephadex G

Kích thước
hạt gel khô
(μ)

G – 50, thô

100 – 300

G – 50, trung

50 – 150

Lương
nước gel có
thể
hút(ml/g)

Thể tích

Khả năng tách các hợp chất

gel nở

theo trong lượng phân tử

trong
nước
(ml/g)

Peptide,
prein hình
cầu

Các phân
đoạn dextran

5.0 ± 0.3

9 – 11

1 – 30000

500 – 10000

bình
G – 50, mịn

20 – 80

G – 75

40 – 120

7.5 ± 0.5

12 – 15

3 – 700000

1 – 50000

G – 100

40 – 120

10.0 ± 1.0

15 – 20

4 – 150000

1 – 100000

G – 150

40 – 120

15.0 ± 1.5

20 – 30

5 – 400000

1 – 150000

G – 200

40 - 120

20.0 ± 2.0

30-40

5-800000

1-200000

 Thu hồi và tái sử dụng gel Sephadex
Sau quá trình thực nghiệm với các loại gel sephadex, có thể thu hồi gel để tái
sử dụng cho những lần sau. Khi không sử dụng nữa, tồn trữ gel bằng cách giữ
nguyên gel trong cột, bị chặt đầu cột và nhớ luôn có một lớp dung môi trên bề
mặt lớp gel. Tuy nhiên để như thế, gel có thể bị hư hại bởi các loại vi sinh vật,
có thể tránh bằng cách thêm dung dịch 0.02% natri acid vào dung môi giải ly cột
lần cuối cùng. Tốt nhất là làm gel trở lại dạng hạt khô như ban đầu, bằng cách
thao tác như sau:

17


Đồ án tốt nghiệp

Cho gel vào phễu lọc xốp và rửa với thật nhiều nước để loại muối, tiếp theo
rửa với etanol 50% để làm giảm thể tích hạt gel còn phân nửa. Để đuổi hết phần
nước còn lại, cho hạt gel này vào etanol 99% với tỉ lệ thể tích gel : thể tích
etanol là 1:2. Cho tiếp xúc 30 phút, thỉnh thoảng khuấy trộn nhẹ. Lọc rồi thu hồi
gel. Ngâm vào etanol. Thực hiện như thế nhiểu lần. Lọc, sấy gel ở 60 – 80 oC,
cho hạt gel khô, rời từng hạt.Nếu hạt gel không khô rời từng hạt là do etanol
chưa loại được hết phần nước trong hạt, cần tiếp tục quá trình vừa rồi. Chú ý nếu
nhiệt độ lên 120oC, hạt gel sẽ biến thành màu nâu (thay vì là màu trắng). Tuy
nhiên, ở trạng thái trương nở, hạt gel có thể được tiệt trùng trong nồi hấp ở
110oC trong 40 phút, chất lượng hạt gel không thay đổi.
 Gel polyacrylamide
Nhà sản xuất Bio – Rad có bán loại gel polyacrylamide đặt tên BioGel - P,
một loại polymer tổng hợp dưới dạng hạt hình cầu, chế tạo từ polyacrylamide (
CH2=CH-CONH2 ) với N,N- metylenbisacrylamid. Thay đổi tỉ lệ của hai cấu

phần monomer nêu trên sẽ làm thay đổi kích thước của lỗ rỗng . Hạt gel có kích
thước trung bình 45-180μm.

18


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 2.5: Một số loại gel polyacrylamide
Lượng nước hấp thu

Thể tích hạt gel

Khả năng tách các hạt chất theo

(ml/g gel khô)

(ml/g)

trọng lượng phân tử (M)

P–2

1.6

3.8

200 – 2000

P–4

2.6

6.1

500 – 4000

P–6

3.2

7.4

1000 – 5000

P – 10

5.1

12

5000 – 17000

P – 30

6.2

14

20000 – 50000

P – 60

6.8

18

30000 – 70000

P – 100

7.5

22

40000 – 100000

P – 150

9.0

47

50000 – 150000

P – 200

13.5

47

80000 – 300000

P – 300

22.0

70

100000 – 400000

Loại gel

Biogel tương đối trơ, nhưng kém bền hơn Sephadex, gel ổn định bền ở môi
trường pH 2 – 11. Trong môi trường kiềm mạnh, nghĩa là có nồng độ OH- cao,
các nối amide bị thủy giải thành acid carboxylic (–COOH), điều này khiến cho
gel có cấu trúc phần nào giống như nhựa trao đổi ion, vì thế không nên sử dụng
Biogel cho trường hợp sắc kí thực hiện thời gian dài, trong điều kiện pH < 9.
Biogel là nguyên liệu plastic nên khi tồn trữ lâu dài không bị các loại vi sinh
vật làm hư hại như loại Sephadex.

19


Đồ án tốt nghiệp

Có tính ái nước cực mạnh nhờ các nhóm (–NH2). Hạt gel trương nở tốt trong
nước khi tiếp xúc với nước trong một khoảng thời gian: gel - P – 2 cần khoảng
30 phút, gel - P – 300 cần 24 giờ.
 Gel kết hợp giữa polyacrylamide và agarose có tên thương mại là ultra – gel,

nó cho độ phân tách cao, với cấu trúc khá vững của agarose cho phép sử
dụng áp suất để tách.

2.4.4
-

Ưu và nhược điểm của phương pháp

Ưu điểm:
Phương pháp đơn giản, rẻ, đồng nhất.
Dung dịch đệm và hạt gel không tương tác gì với protein nên không ảnh

hưởng hay biến tính protein.
Tách được protein có kích thước khác nhau ra khỏi hỗn hợp.
-

Nhược điểm:
Tốc độ chậm.
Độ chính xác chưa được cao, chỉ có thể tách các protein có kích thước khác

nhau, còn các loại protein có kích thước giống nhau thì chưa tách được.

2. 5

Xác định trọng lƣợng phân tử bằng điện di SDS PAGE

Điện di là phương pháp tách các phân tử sinh học (protein, DNA, RNA) trên
gel trong một điện trường.
Các phân tử protein có thể chạy điện di trên một khuôn đỡ như giấy,
cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc polyacrylamide gel. Trong đó, gel

agarose và polyacrylamide được sử dụng phổ biến nhất. Gel là một khuôn đúc
dạng phiến mỏng có các giếng để nạp mẫu. Gel được ngâm trong đệm điện di
cung cấp các ion để dẫn truyền dòng điện, duy trì ở một giá trị pH không đổi.

20


Đồ án tốt nghiệp

SDS PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamid Gel Eloctrophoresis) là
một kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamid khi có sự hiện diện của SDS.
SDS là một tác nhân sẽ làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein, tác
nhân khử cầu nối disulfide là mercaptoethanol (2-thioethanol) hay dithiothreitol.
Với tác nhân này, protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 được biến đổi thành bậc 1 và tất
cả các protein đều được tích điện âm. Vì thế, sự di chuyển trong gel chỉ phụ
thuộc vào kích thước. Khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định, những phân
tử có kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn những phân tử có kích thước lớn.
Dưới tác dụng của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực
dương và các phân tử tích điện dương sẽ di chuyển về cực âm của điện trường.
Để xác định phân tử lượng của một protein, người ta thường so sánh với một
thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tử
khác nhau đã biết.
Để đưa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự
phân tách tốt hơn, người ta thường sử dụng phương pháp điện di trên gel không
liên tục. Trong phương pháp này gel gồm 2 lớp:
-

Lớp gel gom (stacking gel): Các protein trong mẫu được dồn lại và tạo một
lớp băng mỏng.

-

Lớp gel phân tách (separating gel): Tạo ra các băng protein có trọng lượng
phân tử, kích thước khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu.
Kỹ thuật SDS PAGE có độ phân tách cao, cho kết quả nhanh và độ nhạy cao.

Có thể xác định được những phân tử protein có trọng lượng phân tử từ 10000 –
200000 Da. Những phân tử protein có trọng lượng phân tử lớn hơn 200000 Da
thường được xác định trên gel có nồng độ acrylamide ít hơn 2.5%.

21


Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1
-

Vật liệu
Rong Cladophora sp. đã được sấy khô và nghiền thành bột

Hình 3.1: Bột rong Cladophora sp.

3.2

Phƣơng pháp nghiên cứu

3.2.1

Phương pháp phân tích chỉ tiêu sinh hóa của rong Cladophora sp.

3.2.1.1

Phương pháp xác định độ ẩm

a) Nguyên tắc
Xác định độ ẩm ban đầu của mẫu bằng cách sấy trong tủ sấy cho đến trọng
lượng khô không đổi và xác định mức tiêu hao khối lượng trong quá trình đó.
b) Cách tiến hành thí nghiệm
-

Cân bì (giấy bạc)

-

Cân 2 g mẫu (3 mẫu)

-

Sấy 100 – 105oC / 4 giờ

-

Để nguội trong bình hút ẩm

-

Cân lại

-

Sấy tiếp 1 – 2 giờ

-

Cân và lặp lại đến khi khối lượng không đổi

c) Tính kết quả
Độ ẩm mẫu tính bằng phần trăm theo công thức:
Độ ẩm (%)

22

X1
X1

X2
* 100
Xo


Đồ án tốt nghiệp

Trong đó:
Xo là trọng lượng bì
X1 là trọng lượng bì + mẫu trước khi sấy
X2 là trọng lượng bì + mẫu sau khi sấy

3.2.1.2

Phương pháp xác định khoáng tổng số

a) Nguyên tắc
Tro thô là phần vật chất còn lại của mẫu sau khi nung ( vô cơ hóa) ở nhiệt độ
550oC – 700oC trong 4 giờ. Để nguội trong bình hút ẩm. Cân tính sự chênh lệch
trước và sau khi nung, ta có được hàm lượng tro trong mẫu.
b) Các bước tiến hành
-

Cân 2g ± 0.001g vào chén nung đã biết trọng lượng Po (trọng lượng bì).

-

Đặt chén có mẫu vào lò nung để mẫu cháy hết khói đen, đóng cửa lò nung

điều chỉnh nhiệt độ 600oC trong 4 giờ.
-

Nếu mẫu chưa cháy hết, tiếp tục nung thêm 1 giờ.

-

Làm nguội tro.

-

Thấm ướt tro bằng nước cất và thêm vào 10 – 15 giọt HNO3 đậm đặc.

-

Sấy lại.

-

Làm nguội trong bình hút ẩm và đem cân.

-

Quá trình lặp lại cho đến khi khối lượng không đổi
 Phương pháp xác định hàm lượng tro không tan trong HCl

-

Hóa chất:
HCl 4N
HNO3 đậm đặc
AgNO3 0,1N

-

Cách tiến hành:
Hòa tan tro vào 25 ml HCl 4N. Để nóng ở nồi cách thủy sôi từ 10 – 15 phút.

23


Đồ án tốt nghiệp

Lọc tro, rửa bã bằng nước cất sôi khi lọc không còn chứa Cl- ( thử bằng cách

HNO3 2 giọt + AgNO3 0,1N không thấy tủa).
Cho toàn bộ vào chén sứ đem sấy khô 100 – 105oC, rồi cho toàn bộ vào lò
nung 550oC thời gian 30 phút, để nguội trong bình hút ẩm rồi cân.
 Phương pháp xác định hàm lượng tro không tan trong nước
-

Tiến hành:
Sau khi hòa tan tro trong nước cất sôi, rửa, lọc
Lấy toàn bộ đi sấy ở nhiệt độ 105oC cho đến trọng lượng không đổi.

c) Tính kết quả
% chất mất khi nung

% khoáng tổng số

P1

P2
m

P2

Po
m

* 100

* 100

Trong đó:

Po : khối lượng chén trước khi nung (g)
P1 : khối lượng mẫu và chén trước khi nung (g)
P2 : khối lượng mẫu và chén sau khi nung (g)
m : khối lượng mẫu (g)
Hàm lượng tro không tan trong HCl
X (%)

G1 G
* 100
P

Trong đó:
G: trọng lượng của chén (g).
G1: Trọng lượng của chén và mẫu tro không tan (g).
24