Thực nghiệm công nghệ tổng hợp double stranded RNA vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tôm càng xanh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

THỰC NGHIỆM CÔNG NGHỆ TỔNG HỢP DOUBLE
STRANDED RNA VÀO NGHIÊN CỨU CHUYỂN ĐỔI
GIỚI TÍNH TÔM CÀNG XANH
Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1879)

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn : Th.S BÙI THỊ LIÊN HÀ
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ KIM HOÀNG
MSSV: 0851110091

Lớp: 08DSH4

TP. Hồ Chí Minh, 2012


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
Tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) (De Man, 1879) là một trong
những loài giáp xác thương mại rất quan trọng, được đánh bắt và nuôi trồng rộng rãi
và phân bố tự nhiên trong các ruộng lúa (New, 2005). Năm 1987, sản lượng M.

rosenbergii toàn cầu ước tính đạt khoảng 27000 tấn mỗi năm (New, 1990). Một số
lượng lớn được sản xuất ở Trung Quốc và mở rộng nhanh chóng ra Ấn Độ và
Bangladesh (New, 2005). Ngày nay, nó được nuôi rộng rãi ở các nước trên thế giới.
Trong thập kỷ qua, sản lượng trung bình mỗi năm của M. rosenbergii tăng 9-35,5%
về giá trị. Năm 1993, tổng sản lượng là 17,164 tấn, trị giá 116,799,000 USD và năm
2005 đạt 205,033 tấn với trị giá 896,263,000 USD. Việc nuôi trồng tôm càng xanh
đóng góp lớn vào ngành nuôi trồng thủy sản toàn cầu, cả về số lượng và giá trị. M.
rosenbergii được nuôi nhiều ở Châu Á và một số khu vực khác như Châu Phi,
Israel, Trung và Nam Mỹ (Nhan, 2009).
Tại Việt Nam, tôm càng xanh là đối tượng nuôi bản địa được nông dân ưa
thích, được nhiều địa phương xác định là đối tượng nuôi có giá trị kinh tế cao, đặc
biệt là những khu vực nuôi tôm thương mại ở lưu vực sông Mê Kông. Do đó nhu
cầu về con giống cho việc nuôi đại trà là rất lớn.
Tuy nhiên, trong quá trình tăng trưởng, con đực thường lớn nhanh hơn con
cái. Khi chiều dài cơ thể đạt trung bình 8-14 cm và trọng lượng 10-20 g, tốc độ phát
triển của con đực và con cái tương đương nhau. Nhưng khi chiều dài cơ thể vượt
quá 14 cm, con đực thường lớn nhanh hơn con cái (Lê Quang Khôi, 2009). Do ở
giai đoạn này con cái ngưng phát triển và tập trung dưỡng chất cho việc sinh sản
(Ra`anan và Cohen, 1984). Tôm đực lớn nhất có thể đạt 110 g, trong khi tôm cái lớn
nhất chỉ đạt 50 g sau 7 tháng nuôi (Lê Quang Khôi, 2009). Đây là một vấn đề gây
trở ngại lớn cho nghề nuôi tôm càng xanh thương phẩm vì con có kích thước càng
lớn thì giá thành càng cao và sản lượng thu hoạch cũng sẽ tăng cao.
Nghiên cứu của Sagi và Ra`anan trong năm 1988 đã chứng minh rằng việc
nuôi tôm càng xanh toàn đực đạt sản lượng cao hơn việc nuôi toàn cái hay đực và
cái trong cùng quần thể. Khối lượng trung bình của mỗi quần thể lần lượt là 473

1


Đồ án tốt nghiệp

g/m2, 248 g/m2 và 260 g/m2. Những nhà khoa học Ả Rập Xê Út cũng đã báo cáo
những kết quả tương tự khi tiến hành thí nghiệm nuôi tôm toàn đực, toàn cái và hỗn
hợp cả đực và cái (Siddiqui, 1997). Điều này thể hiện rằng việc nuôi tôm càng xanh
toàn đực đã làm tăng sản lượng một cách đáng kể và mang lại lợi nhuận cao hơn
việc nuôi toàn cái hay hỗn hợp đực và cái. Do đó, sự phát triển những kỹ thuật cho
việc sản xuất quần thể toàn đực là nhu cầu cần thiết cho việc nuôi tôm càng xanh.
Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh chức năng làm bất hoạt gene của
iRNA trong tế bào tôm (Estrada và ctv, 2007). Và đây là một trong những công cụ
có tiềm năng đáp ứng cho việc sản xuất ra tôm càng xanh toàn đực. Kỹ thuật bất
hoạt RNA (Guo và Kempheus, 1995) đã được sử dụng như một công cụ hiệu quả để
làm bất hoạt các sản phẩm gene bằng cách tiêm RNA mạch đôi vào trong cơ thể của
nhiều loài giáp xác (Tiu, 2007; Hiu, 2008). Ý tưởng tạo ra con cái giả bằng cách
làm bất hoạt RNA thông tin mã hóa gene tuyến đực insuline-like của tôm càng xanh
(Macrobrachium rosenbergii insuline-like androgenic gland, Mr-IAG) bằng RNA
mạch đôi (dsRNA) đã được thực hiện thành công tại quy mô phòng thí nghiệm
(Ventura và ctv, 2009). Kể từ đó, kỹ thuật bất hoạt RNA hứa hẹn như là một hướng
tiếp cận mới để tạo ra quần thể tôm toàn đực cho việc nuôi tôm càng xanh thương
mại.
Xuất phát từ những nhu cầu con giống tôm càng xanh đực từ thị trường thì
đề tài “Thực nghiệm công nghệ tổng hợp double stranded RNA vào nghiên cứu
chuyển đổi giới tính tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii (De Man,
1879)” là cần thiết và đang được nhiều mong đợi.
Mục tiêu đề tài là ứng dụng dsRNA để tạo ra tôm càng xanh cái giả, từ con
cái giả này sẽ sản xuất ra tôm càng xanh toàn đực để đáp ứng nhu cầu cho việc nuôi
tôm càng xanh thương phẩm.
Những nội dung cần thực hiện là:
+ Tổng hợp Mr-IAG RNA mạch đôi cho kỹ thuật bất hoạt RNA.
+ Kiểm tra hiệu quả của Mr-IAG RNA mạch đôi đối với việc chuyển
đổi giới tính của tôm càng xanh với các nồng độ và tần suất tiêm khác nhau.

2


Đồ án tốt nghiệp

+ Kiểm tra ảnh hưởng của thời gian tiêm Mr-IAG RNA mạch đôi lên
sự tạo thành tôm càng xanh cái giả.
Phương pháp nghiên cứu của đề tài là thu thập thông tin từ các bài báo khoa
học đã công bố, các nghiên cứu trong và ngoài nước, thu thập các số liệu thực
nghiệm và xử lý bằng phần mềm excel.
Các kết quả đạt được của đề tài:
+ Tổng hợp thành công dsRNA bằng bộ kit Promega.
+ Khảo sát được nồng độ tiêm dsRNA 1,25 µg/g, tần suất tiêm 1
lần/tuần là có thể làm bất hoạt gene mã hóa cho hormone tuyến đực ở tôm PL25 để
tạo ra tôm càng xanh cái giả.
+ Thời gian tiêm dsRNA phải kéo dài đến khi con cái giả thành thục
sinh sản.
Kết cấu của đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương:
+ Chương 1. Tổng quan: giới thiệu sơ lược về tôm càng xanh
Macrobrachium rosenbergii, tổng quan về tuyến đực, cơ chế làm bất hoạt gene của
iRNA.
+ Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu: vật liệu sinh học là
tôm PL25, phương pháp tổng hợp dsRNA theo bộ kit Promega, thí nghiệm tiêm
được thực hiện với 3 nồng độ tiêm là 5 µg/g; 2,5 µg/g và 1,25 µg/g và các tần suất
tiêm là 3 lần/ tuần, 2 lần/tuần và 1 lần/tuần. Thí nghiệm thời gian tiêm được thực
hiện trong vào 4 tháng với nồng độ tiêm là 1,25 µg/g và tần suất tiêm là 1 lần/tuần.
+ Chương 3. Kết quả và thảo luận: nêu lên các kết quả đạt được là
tổng hợp được dsRNA, nồng độ và tần suất tiêm dsRNA tốt nhất, tạo được con cái
giả đến tháng thứ 4 của thí nghiệm.

+ Chương 4. Kết luận và đề nghị: một số kết quả mà đề tài đã đạt
được và đưa ra một số kiến nghị để làm hướng nghiên cứu trong tương lai.

3


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Phân loại (New, 2002)
Tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1897), là loài đầu tiên
được biết đến trong giống Macrobrachium và được công nhận lần đầu tiên vào năm
1705. Quá trình đặt tên cho tôm càng xanh cả giống và loài đã gặp khá nhiều khó
khăn trong lịch sử. Trong quá khứ tên của giống bao gồm cả Cancer (Astacus) và
Palaemon. Trước kia, tên M. rosenbergii bao gồm Palaemon carcinus, P. dacqueti,
và P. rosenbergii và đến năm 1959 tên khoa học Macrobracchium rosenbergii xuất
hiện và được chấp nhận phổ biến ở hầu hết các nước.
Giới: Animalia
Ngành: Arthropoda
Ngành phụ: Crustacea
Lớp: Malacostraca
Bộ: Decapoda
Bộ phụ: Pleocyemata
Phân bộ: Caridea
Họ: Palaemonidae
Họ phụ: Palaemoninae
Giống: Macrobrachium
Loài: M. rosenbergii (De Man, 1879)
Tên tiếng anh: Giant freshwater prawn.
1.2. Đặc điểm sinh học của tôm càng xanh

1.2.1. Phân bố
Tôm càng xanh M. rosenbergii phân bố tự nhiên ở Đông Nam Á, các nước ở
Nam Thái Bình Dương, phía Bắc châu Đại Dương và phía Tây của các đảo Thái
Bình Dương (New và Singholka, 1982; New, 2002).
Tôm càng xanh phân bố ở tất cả các thủy vực nước ngọt và các thủy vực
nước lợ của nhiều vùng trên thế giới (Nguyễn Việt Thắng, 2003). Môi trường sống

4


Đồ án tốt nghiệp

của tôm càng xanh đa dạng trong thủy vực nước trong cũng như nước đục. Ở Việt
Nam, tôm càng xanh phân bố chủ yếu ở các tỉnh Nam Bộ đặc biệt ở vùng đồng bằng
sông Cửu Long (Nguyễn Thị Thanh Thủy, 2002).
1.2.2. Vòng đời và tập tính sống
Vòng đời của tôm càng xanh được chia làm 4 giai đoạn: trứng, ấu trùng, hậu
ấu trùng và tôm trưởng thành. Khi tôm đã trưởng thành, chúng thường sống trong
môi trường nước ngọt như: sông, rạch, ao, hồ.…Cũng chính nơi đây xảy ra quá
trình thành thục, phát dục và giao vĩ đẻ trứng. Nhưng khi ôm trứng chúng có xu thế
bơi ra vùng nước lợ từ 6-18 0/00, ở đó ấu trùng được nở ra và sống trôi nổi theo kiểu
phù du. Sau 11 lần lột xác với 12 giai đoạn biến thái ấu trùng (Nauplii) biến thành
hậu ấu trùng (Postlarvae-PL) lúc này tôm con di cư về vùng nước ngọt, sống và lớn
lên ở đây (Ling và Omerica, 1962; Nguyễn Thanh Phương, 2003).
Ấu trùng có tính hướng quang mạnh, vận động trôi nổi trong nước. Sang thời
kỳ hậu ấu trùng và giai đoạn trưởng thành, tôm có tập tính sống ở đáy, bám vào cây
cỏ; giá thể…Tôm trưởng thành ít hoạt động và thường ẩn náo vào ban ngày và tích
cực hoạt động vào ban đêm. Tôm càng xanh có tập tính ăn thịt lẫn nhau, vì vậy việc
dùng giá thể tăng chổ ẩn nắp, hạn chế hiện tượng ăn thịt lẫn nhau để nâng cao tỷ lệ
sống của tôm (Nguyễn Thị Hồng Hạnh, 2008).

1.2.3. Hình thái và tăng trưởng
Dựa vào hình dạng và màu sắc để phân biệt giữa tôm càng và các nhóm tôm
khác. Tôm càng xanh có cơ thể thon dài, đối xứng 2 bên. Con trưởng thành thường
có màu xanh dễ nhận, đôi khi có màu nâu nhạt (Nguyễn Thị Hồng Hạnh, 2008).
Tôm càng xanh ở nước ta có trọng lượng cá thể khá lớn, con đực đạt tới 450
g/cá thể, thân tương đối tròn, cá thể trưởng thành có màu xanh dương đậm. Chủy
phát triển nhọn và cong lên ½ bề dài tận cùng của chủy, phía trên mắt chủy có 1115 răng và 3-4 răng sau hốc mắt. Mặt dưới thường có 12-15 răng. Chiều dài chủy
của con cái khi trưởng thành thường bằng hoặc ngắn hơn vỏ đầu ngực, còn chủy của
con đực dài hơn chiều dài ở đầu ngực (Lê Quang Khôi, 2009).

5


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.1. Tôm càng xanh M. rosenbergii
Chân thứ 2 luôn phát triển hơn các chân khác, nhất là con đực trưởng thành,
đôi chân bò thứ 2 có hình dạng và kích thước giống nhau ở 2 phía (trái và phải); (Lê
Quang Khôi, 2009).
Đặc điểm về kích cỡ, hình dạng, màu sắc và các gai trên đôi càng sẽ thay đổi
theo giai đoạn thành thục của tôm, nhất là ở tôm đực. Khi tôm còn nhỏ, đôi càng có
màu trong, sau chuyển thành vàng cam (còn gọi là càng lửa), chưa có gai hay có gai
rất mịn trên càng, chưa có hay rất ít lông tơ. Khi tôm lớn, đôi càng có màu xanh
đậm, xuất hiện nhiều gai nhọn và lông tơ trên càng. Quá trình thay đổi trên được thể
hiện qua các giai đoạn như: tôm nhỏ, tôm càng lửa nhạt, tôm càng lửa đậm, tôm
càng lửa đậm chuyển tiếp càng xanh, tôm càng xanh nhạt, tôm càng xanh đậm và
tôm già (Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 2009).
Trong quá trình tăng trưởng, con đực thường lớn nhanh hơn con cái. Khi
chiều dài cơ thể đạt trung bình 8-14 cm và trọng lượng 10-20 g, tốc độ phát triển

6


Đồ án tốt nghiệp

của con đực và con cái tương đương nhau. Nhưng khi chiều dài cơ thể vượt quá 14
cm, con đực thường lớn nhanh hơn con cái (Lê Quang Khôi, 2009).
1.3. Đặc điểm sinh sản của tôm càng xanh
1.3.1. Phân biệt tôm đực và tôm cái
Tôm càng xanh trưởng thành không những dễ dàng phân biệt đực và cái qua
đôi chân bò thứ 2 (càng) mà còn qua cơ quan sinh dục như lỗ sinh dục đực nằm ở
gốc chân bò thứ 5, lỗ sinh dục cái nằm ở gốc chân bò thứ 3 (Nguyễn Việt Thắng,
1993).
Tôm đực có kích cỡ lớn hơn tôm cái cùng tuổi. Đầu ngực tôm đực to hơn và
khoang bụng hẹp hơn tôm cái. Đôi càng thứ 2 to, dài và thô. Cơ quan sinh dục trong
của con đực gồm một đôi tinh sào, một đôi ống dẫn tinh và đầu mút. Đôi tinh sào
ngoằn ngèo nằm giữa mặt lưng của giáp đầu ngực nối với ống dẫn tinh chạy từ
trước tim dọc sang 2 bên viềng sau của giáp đầu ngực và đổ vào đầu mút nằm ở đốt
gốc của chân ngực thứ năm. Túi tinh hình thành trong quá trình phóng tinh. Túi tinh
chứa khối tinh trùng không di động.
Ở con cái, buồng trứng nằm trên mặt lưng của phần đầu ngực, giữa dạ dày và
gan tụy. Khi buồng trứng thành thục sẽ có màu vàng có thể nhìn thấy qua giáp đầu
ngực, trải dài từ sau mắt đến đốt đầu của phần bụng. Ống dẫn trứng nối từ buồng
trứng ở trước tim chạy dọc 2 bên về phía bụng đổ về túi chứa tinh ở đốt gốc của
chân ngực thứ ba (Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 2009).

7


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.1. Tóm tắt đặc điểm của tôm đực và tôm cái
Đặc điểm

Tôm đực

Tôm cái

Kích cỡ

Lớn hơn và đầu ngực to

Nhỏ hơn và đầu ngực nhỏ

hơn tôm cái

hơn tôm đực

Đôi càng thứ 2 rất to, ghồ

Nhỏ hơn và nhẵn hơn

ghề, nhiều gai

càng của tôm đực

Hiện diện dưới gốc của

Hiện diện dưới gốc của

chân ngực thứ năm và có

chân ngực thứ ba, có

nắp đậy

màng mỏng bao phủ.

Mặt bụng có đốt thứ nhất

Tôm cái thành thục có

có điểm cứng ở giữa

tấm bụng thứ nhất, thứ 2,

Càng
Lỗ sinh dục

Bụng

thứ ba dài và nở rộng,
hình thành buồng ấp
trứng.
Lông tơ sinh dục

Không có

Xuất hiện nhiều trên chân
ngực và chân bụng của

tôm trưởng thành

Tuyến androgenic

Dãy tế bào dính vào vùng

Không có

cuối của ống dẫn tinh
Chiều dài và kích cỡ thành Chiều dài 17,5 cm, trọng

Chiều dài 15 cm, trọng

thục

lượng trung bình 35 g

lượng trung bình 25 g.

Phụ bộ giao vĩ

Xuất hiện những nhánh

Không có

trong và nhánh phụ trong
của chân bụng thứ 2
(Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 2009).
1.3.2. Thành thục, giao vĩ, đẻ trứng và ấp trứng của tôm càng xanh
Trong tự nhiên cũng như trong điều kiện nhân tạo, tôm thành thục và giao vĩ

xảy ra hầu như quanh năm. Mùa đẻ rộ của tôm càng xanh ở đồng bằng Nam Bộ tập
trung từ tháng 4-6 và từ tháng 8-10 (Nguyễn Việt Thắng, 1993; Nguyễn Thị Thanh
8


Đồ án tốt nghiệp

Thủy, 2005). Tôm cái thành thục lần đầu tiên ở khoảng 3-3,5 tháng kể từ hậu ấu
trùng 10-15 ngày (PL10-15). Kích cở tôm nhỏ nhất đạt thành thục từ 10-13 cm và 7,5
g (Nguyễn Việt Thắng, 1993).
Quá trình lột xác tiền giao vĩ của tôm cái sẽ tiết ra chất dẫn dụ có tác dụng
kích thích tôm đực tìm đến. Sau khi tôm lột xác 1-22 giờ, thường 3-6 giờ, tôm bắt
đầu giao vĩ. Toàn bộ quá trình tiếp xúc và giao vĩ xảy ra trong vòng 20-35 phút. Sau
khi giao vĩ 2-5 giờ, có khi 6-24 giờ, tôm cái bắt đầu đẻ trứng (Nguyễn Thanh
Phương, 2003). Tôm thường đẻ trứng vào ban đêm. Tôm cái thường di chuyển từ
tầng đáy lên tầng giữa hay tầng mặt để đẻ. Trong quá trình đẻ trứng, trứng được thụ
tinh khi đi ngang túi chứa tinh. Trứng sẽ lần lượt dính từng chùm vào các lông tơ
của các đôi chân bụng thứ tư, thứ ba, thứ hai, thứ nhất. Thời gian đẻ trứng khoảng
10-60 phút và thông thường từ 15-25 phút. Những tôm cái thành thục chín muồi
nhưng không được giao vĩ vẫn đẻ trứng trong vòng 24 giờ sau khi lột xác. Những
trứng này do không được thụ tinh nên sẽ rụng sau 1-2 ngày (Nguyễn Thị Thanh
Thủy, 2002).
Trong quá trình ấp trứng, tôm cái thường dùng chân bụng quạt nước, tạo
dòng nước, cung cấp dưỡng khí cho trứng. Thời gian ấp trứng đến trứng nở có thể
từ 15-23 ngày phụ thuộc vào nhiệt độ nước (Nguyễn Thị Hồng Hạnh, 2008).
1.4. Tổng quan về tuyến đực
Hệ thống nội tiết của nhóm giáp xác gồm một phần của tuyến sinus và
cơ quan X nằm trong cuống mắt. Cơ quan X sản xuất gonal-inhibiting
hormone (GIH) và molt-inhibiting hormone được giữ trong tuyến sinus trước
khi được lưu thông trong cơ thể. Ở giáp xác cơ quan Y nằm trong trung tâm

phần đầu ngực và sản xuất ra gonal-stimulating hormone (GSH) và ecdysone.
GIH và GSH tác động trực tiếp vào buồng trứng và gián tiếp vào tinh hoàn
thông qua sự tiết hormone từ tuyến androgenic (AGH). Giáp xác có các cơ
quan thuộc hàm dưới, các cơ quan neurohemal, đây là những vị trí tổng hợp và
tiết ra methyl farnosoate, một loại hormone có vai trò quan trọng trong sự
trưởng thành sinh dục ở con đực và con cái, phát triển hệ thống sinh sản rõ

9


Đồ án tốt nghiệp

ràng, tạo noãn hoàn, khác biệt hình thái và hành vi giao phối (Ohs và ctv, 2006).
1.4.1. Phụ bộ đực
Phụ bộ đực là cơ quan giao cấu ở tôm càng xanh đực nó xuất hiện ở chân bơi
thứ 2. Chồi của phụ bộ đực bắt đầu xuất hiện vào giai đoạn khoảng 70 ngày tuổi sau
giai đoạn postlarve (trọng lượng 0,38 g, tổng chiều dài 3,7 cm) đến giai đoạn 94
ngày tuổi thì phụ bộ đực phát triển đầy đủ (Chung Quang Trí, 2006).

Hình 1.2. Chân bơi thứ 2 của tôm càng xanh đực (Chung Quang Trí, 2006)
1.4.2. Tuyến đực
Những tế bào thuộc tuyến đực được quan sát đầu tiên bởi Faxon (1884) trong
tôm nước ngọt Cambarus montanus. Tuyến hormone đã được xác định sau đó ở
giáp xác Orchestia gammarellus vào 1953, và mô đó được gọi là tuyến đực
(Charniaux - Cotton, 1953). Những nghiên cứu sau này đã cho thấy rõ hơn về tuyến
đực, nó là một lớp mô mỏng gắn ở phần cuối ống dẫn tinh của tôm nước ngọt
Procambarus blandingii, P. viae - viridis, Camb. bartonni và Camb. diogenees, có
chiều dài vài milimet. Những cấu trúc tương tự cũng đã được quan sát ở cua
Callinectes sapidus (King, 1964).
Theo Sagi (2001) “Ở giáp xác, tinh sào là nơi tạo tinh trùng còn cơ quan tạo

hormone là tuyến đực. Nếu ở con đực động vật có xương sống, tuyến sinh dục đực
(tinh sào) có 2 chức năng căn bản là tạo tinh trùng và nội tiết như testosterone thì ở

10


Đồ án tốt nghiệp

tôm càng xanh 2 chức năng này thực hiện bởi 2 cơ quan riêng lẻ. Tinh sào ở tôm
càng xanh chuyên tạo tinh, còn tuyến đực (androgenic gland) - một cơ quan biệt lập
khác có chức năng tiết ra hormone, tham gia vào sự biệt hóa giới tính và phát triển
những đặc điểm sinh dục thứ cấp, ảnh hưởng lên kích thước và sự tăng trưởng”.
Ở những tôm lớn người ta có thể thấy được tuyến đực tương đối rõ. Đó là
một khối tế bào có hình kim tự tháp, dính với phần sau ống phóng tinh (Chung
Quang Trí, 2006).
1.4.3. Hormone tuyến đực
Hormone tuyến đực đã được tìm ra trên nhóm giáp xác chân đều
Armadilidium vulgare là một protein gồm có 3 chuổi peptide A (chứa 29 aa), B (44
aa), và C (45 aa), ngoài ra trên chuổi A ở aa thứ 18 còn có thêm một nhóm carboxyl
(Martin và ctv, 1999).
1.5. Hoạt động của tuyến AG (Androgenic gland)
Tuyến androgenic có nhiều nhất là ở tôm đực càng xanh, chứa trong mạng
lưới nội chất sần sùi của tế bào chất. Hoạt động của tuyến androgenic đóng vai trò
kiểm soát hoạt động phát dục của M. rosenbergii (Okumura và Hara, 2004).
Tuyến androgenic là hormone tuyến đực được xác định đầu tiên ở cua
Callinectes sapidus bởi Cronin (1947). Ở giáp xác 10 chân tuyến androgenic nằm ở
tận cùng của ống dẫn tinh. Các tế bào được sắp xếp thành các lớp mỏng, song song
và nối nhau hay ở cấu trúc dạng thùy. Ở M. rosenbergii tuyến androgenic là sự kết
hợp của 2 cấu trúc trên (Sagi, 1995). Tuyến androgenic có vai trò trong điều khiển
giới tính của giáp xác bộ mười chân. Nó làm xuất hiện những đặc điểm hình thể bên

ngoài của con đực (Taketomi và ctv, 1990).
Tuyến androgenic cũng là hormone chịu trách nhiệm biệt hóa giới tính đực ở
giáp xác (Charniaux-Cotton và Payen, 1985; Katakura, 1989). Gần đây hormone
tuyến androgenic đã được xác định là hormone peptide và trình tự cDNA của nó đã
được phát hiện ở Armadillidium vulgare (Martin và ctv, 1999; Okuno và ctv, 1999).
Tuyến androgenic có chức năng điều khiển giới tính đực khác nhau, tuyến
sinh dục khác nhau và sự phát triển của các phần phụ sinh dục ở tôm càng xanh M.

11


Đồ án tốt nghiệp

rosenbergii (Nagamine và ctv, 1980). Sự phát triển của mạng lưới nội chất sần sùi
trong tế bào chất của tuyến androgenic có liên quan đến hoạt động sinh sản của con
đực ở một vài loài giáp xác mười chân (King, 1964; Taketomi và ctv, 1990).
Ở tôm đực M. rosenbergii, phân biệt 3 kiểu hình thái nhờ vào màu sắc và
chiều dài càng và hoạt động sinh sản: con đực nhỏ, con đực càng vàng và con đực
càng xanh (Ra’anan và Sagi, 1985; Kuris và ctv, 1987). Mỗi kiểu hình thái được mô
tả để phân biệt hoạt động sinh sản khác nhau. Con đực nhỏ có đôi càng ngắn, chưa
có hoạt động giao phối và phát triển thành con đực càng cam. Con đực càng cam cơ
thể phát triển nhanh chóng và không giao phối. Con đực càng cam phát triển thành
con đực càng xanh, con đực càng xanh có hoạt động giao phối với con cái trưởng
thành. Hoạt động sinh tinh thay đổi theo hình thái khác nhau; cao ở con đực nhỏ và
con đực càng cam, nhưng thấp ở con đực càng xanh, tinh hoàn tôm đực càng xanh
thì đầy tinh trùng chín và được sử dụng để dự trữ (Sagi và ctv, 1988). Sự khác biệt
của các kiểu hình thái này chịu tác động kiểm soát của tuyến androgenic, đây là nền
tảng cho thí nghiệm cắt bỏ tuyến androgenic (Sagi và ctv, 1990).
Theo Fingerman (1997), AGH là hormone điều khiển biệt hóa giới tính thành
con đực và phát triển các đặc điểm sinh dục đực thứ cấp. Sự tiết GSH và GIH được

cho là do quy định của một số chất dẫn truyền thần kinh và tác động trực tiếp vào
buồng trứng của con cái. Ở con đực, GIH tác động lên tinh hoàn gián tiếp bởi sự
điều khiển AG và sau đó giảm tiết AGH. Hormone kích thích tuyến sinh dục là cần
thiết để có sự sinh tinh xảy ra trong tinh hoàn.
AG tham gia vào quá trình biệt hóa giới tính ở con đực thông qua việc tiết
hormone. AGH là tín hiệu ban đầu của tất cả các bước cần thiết trong quá trình biệt
hóa giới tính và phát triển đặc điểm của con đực (Ohs và ctv, 2006). Nếu không có
AG hoặc sự tiết AGH không đủ thì tuyến sinh dục sẽ biệt hóa thành tuyến sinh dục
cái (Sagi và ctv, 1995). Việc loại bỏ tuyến androgenic trong giai đoạn sớm của sự
phát triển dẫn đến sự phát triển ngược thành con cái (Malecha và ctv, 1992).
1.6. Bất hoạt gene bằng iRNA (RNA interference)
1.6.1. Sơ lược về iRNA

12


Đồ án tốt nghiệp

iRNA là hiện tượng sợi kép RNA (dsRNA) có khả năng bắt cặp đặc hiệu với
trình tự gene đích, thúc đẩy sự phân hủy gene đích và ngăn chặn sự biểu hiện của
nó. dsRNA can thiệp gián tiếp vào quá trình phiên mã gene làm bất hoạt gene
(PTGS-bất hoạt gene hậu phiên mã), kéo dài trong suốt quá trình tiến hóa. Nó cũng
được mô tả ở mức độ phiên mã và dịch mã, từ đó có thể can thiệp vào suốt quá trình
hoặc dịch mã tạo ra gene nội sinh; và ở mức độ chất nhiễm sắc, bằng cách hình
thành nhiễm sắc thể ở nhân (Estrada và ctv, 2007; Đỗ NăngVịnh, 2007).
iRNA là một hệ thống bên trong các tế bào sống, giúp kiểm soát được các
gene đang hoạt động. Đó là những đoạn RNA ngắn có thể ức chế sự biểu hiện của
các gene có trình tự tương đồng với nó. Các phân tử iRNA này có thể gây nên các
hiệu ứng: ức chế quá trình dịch mã của mRNA, ức chế sự phiên mã của gene ở
trong nhân, phân giải mRNA.

Quá trình iRNA xảy ra ở mức độ sau phiên mã và được kích hoạt bởi các
đoạn dsRNA-còn được gọi là siRNA, đây là những đoạn được tạo ra từ các dsRNA
dài nhờ sự phân cắt của enzyme RNase III Dicer hoặc được đưa vào từ bên ngoài.
Sau khi được đưa vào phức hợp RNA-inducing silencing (RISC) trong tế bào chất,
siRNA sẽ làm mất các trình tự đặc hiệu tương đồng với trình tự mRNA của nó.
iRNA được khám phá đầu tiên bởi Andrew Fire và Craig Mello ở tuyến trùng
Caenorhabditis elegans và sau đó được tìm thấy trong các loài sinh vật khác, bao
gồm cả động vật có vú (Fire và ctv, 1998).
1.6.2. Lịch sử nghiên cứu iRNA.
Đến những năm đầu thập niên 1990 một số nhà khoa học công bố kết quả
nghiên cứu iRNA trên các tạp chí quốc tế (Napoli và ctv, 1990).
Năm 1992, Romano và Macino đã phát hiện ra hiện tượng bất hoạt gene hậu
phiên mã (PTGS) ở nấm men Neurospora crassa (Romano và Macino, 1992).
Năm 1995 trên tạp chí Cell số 81, nhóm nghiên cứu của Guo và Kemphues
đã đưa ra bằng chứng đầu tiên trên tuyến trùng Caenorhabditis elegans rằng: Phân
tử sense RNA cũng gây ra sự ức chế gene (Guo và Kemphues, 1995).

13


Đồ án tốt nghiệp

Đến năm 1998, nhóm nghiên cứu Fire đã giải thích được điều nghịch lý này
bằng những thí nghiệm trên tuyến trùng C. elegans (Fire và Mello, 1998).
Năm 2000, Zamore PD và ctv đã công bố việc phát hiện hiện tượng dsRNA
dài bị phân cắt thành các đoạn ngắn khoảng 21-23 nucleotide bởi Rnase III (Dicer)
trên ruồi giấm Drosophila (Zamore PD và ctv, 2000).
Năm 2001, lần đầu tiên iRNA được mô tả trong các tế bào động vật có vú
(Tuschl và ctv, 2001).
Năm 2006 giải thưởng Nobel sinh lý và y học cho việc phát hiện cơ chế

iRNA của 2 nhà bác học Mỹ là Andrew Fire (Đại học Stanford) và Craig Mello
(Đại học Massachusetts) (Won Noble Prize, 2006).
Năm 2010, lần đầu tiên chứng minh được rằng siRNA có thể sản xuất các
gene ức chế đặc hiệu (giảm mRNA và protein) ở người hoạt động theo cơ chế iRNA
(Davis ME và ctv, 2010).
1.6.3. Vai trò của iRNA trong điều khiển hoạt hóa gene, (Fire và Mello, 1998).
Chỉ có RNA sợi kép (dsRNA) có khả năng bất hoạt gene một cách hiệu quả,
RNA sợi đơn (sense hoặc antisense) chỉ có khả năng gây bất hoạt yếu hoặc không
có khả năng gây bất hoạt gene.
dsRNA gây bất hoạt một cách rất đặc thù, nó chỉ phân hủy một phân tử
mRNA có các trình tự tương đồng với nó, các phân tử mRNA khác không bị ảnh
hưởng.
Các sợi dsRNA chỉ có khả năng gây bất hoạt gene khi có trình tự tương đồng
với mRNA đã trưởng thành (mature RNA) (tức là mRNA đã ở ngoài tế bào chất và
không còn mang các trình tự intron); Các trình tự tương đồng với intron hoặc
promoter đều không có tác dụng. Điều này cho thấy dsRNA gây bất hoạt gene ở
giai đoạn sau phiên mã (post transcriptional gene silencing - PTGS) và xảy ra ở tế
bào chất.
Chỉ cần vài phân tử dsRNA trong một tế bào là đủ để hoàn thành quá trình
phân hủy mRNA. Điều này chứng tỏ dsRNA đã được nhân bản và tác dụng như một
tác nhân xúc tác.

14


Đồ án tốt nghiệp

Tác động của dsRNA có thể được lan rộng từ mô này sang mô khác và di
chuyển giữa các tế bào.
1.6.4. Cơ chế hoạt động của iRNA

Nghiên cứu hóa sinh iRNA ở ruồi giấm cho thấy RNA sợi kép (dsRNA) đã
được phân cắt thành các đoạn dsRNA ngắn gồm 21-23 nucleotide (Tuschl và ctv,
1999). Họ cho rằng các phân tử dsRNA ngắn (siRNA-small interference RNA)
đóng vai trò phân hủy mRNA. Sau đó nhóm Fire và Mello đã xác định rằng dsRNA
dài đã được cắt thành đoạn RNA ngắn (khoảng 25 nucleotide) và tiếp theo siRNA
gây ra sự phân hủy mRNA thông qua việc bắt cặp với mRNA (Parrish và ctv,
2000).

15


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.3. Cơ chế hoạt động của iRNA
( />
16


Đồ án tốt nghiệp

A. Sao chép nội sinh hoặc đưa các sợi ngoại sinh vào tế bào, dsRNA kích
hoạt quá trình iRNA.
B. Quá trình đầu tiên được thực hiện bởi RNase III enzyme Dicer, phản ứng
phụ thuộc vào năng lượng ATP.
C. Quá trình Dicer các dsRNA dài thành các siRNA 21-23 nucleotide.
siRNA cũng có thể được tổng hợp ở bên ngoài tế bào và sau đó được đưa vào tế bào
thông qua quá trình truyền nhiễm hoặc xung điện.
D. Các siRNA được kết hợp vào các phức hợp RISC, bao gồm protein
Argonaute (Ago) như là thành phần chính. Ago tách ra và loại bỏ các thành phần
không có tác dụng (sense) của siRNA có ảnh hưởng đến hoạt động của RISC.

E và F. Các sợi antisense của siRNA vẫn tồn tại và đóng vai trò như là sợi
dẫn đường để các RISC tác động vào các mRNA tương đồng với nó, dẫn đến sự
phân cắt các endonucleotide của mRNA đích (Fire và ctv, 1998).
1.6.5. Ứng dụng của iRNA trên động vật thủy sản
Cơ chế của iRNA là làm bất hoạt gene sau phiên mã, chức năng này của nó
trong tự nhiên chịu trách nhiệm chống lại sự nhiễm trùng virut ở đa số loài. Kết quả
là làm bất hoạt gene của Dicer-1 của virut trong tôm sú (Penaeus mondon) làm tăng
tỷ lệ chết của virut, cơ chế iRNA hoạt động mạnh mẽ và có chức năng miễn dịch tốt
trên tôm. Mức cao hơn là các Dicer ở tế bào bạch cầu nó đóng vai trò làm miễn dịch
tự nhiên ở trong tôm (Kitagishi, 2012).
Ở tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) Dicer-2 bao gồm các miễn
dịch không đặc hiệu chống lại virut. Dicer-2 góp phần vào chức năng miễn dịch
không đặc hiệu ở tôm bằng cách nâng cao hiệu lực của iRNA (Kitagishi, 2012).
Làm bất hoạt gene đích và có hiệu lực cao, miễn dịch đặc hiệu chống lại
virut đốm trắng (WSSV) hoặc virut Taura ở tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương
(Penaeus vannamei) bằng cách tiêm dsRNAs sợi dài có trình tự mã hóa cấu trúc
protein của virut. Sử dụng dsRNA tác động vào gene mục tiêu của virut đầu vàng
(YHV) sẽ thu được hiệu quả miễn dịch đặc hiệu giống như ở virut trên tôm sú
Penaeus monodon (Sarathi, 2010).

17


Đồ án tốt nghiệp

dsRNA can thiệp gián tiếp vào hầu hết các quá trình phiên mã gene, làm bất
hoạt gene. Chức năng của gene có thể được nghiên cứu trong các sinh vật dưới
nước bằng cách sử dụng iRNA. Kỹ thuật iRNA đã được ứng dụng trong 2 sinh vật ở
dưới nước: cá ngựa vằn (Danio rerio) và tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus schimitti)
Đại Tây Dương. Kết quả đã chứng minh iRNA được sử dụng như là công cụ để

nghiên cứu chức năng sinh học của các gene có liên quan đến sự phát triển của cá
ngựa vằn. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh tính hữu ích của dsRNA trong cơ
thể tôm trưởng thành. Hơn nữa, khả năng dsRNA ức chế chức năng của hormone
hyperglycemic (CHH) trong tôm Đại Tây Dương cũng đã được nghiên cứu (Estrada
và ctv, 2007).
Ảnh hưởng iRNA trong tôm được giải thích bằng các thí nghiệm in vivo
bằng cách tiêm dsRNA có trình tự tương đồng với gene mã hóa gonal inhibiting
hormone (GIH) trong tôm cát Metapenaeus ensis. dsRNA làm giảm sự biểu hiện
của GIH (Guan và ctv, 2004).
Công nghệ iRNA đã được nghiên cứu trên động vật thân mềm 2 mảnh, nó
quyết định chức năng của gene ở sò Crassostrea gigas. Việc tiêm dsRNA tương
ứng với gene Oyster vasa-like gene (Oyvlg) vào trong tuyến sinh dục sẽ làm ức chế
quá trình giảm phân và làm bất hoạt sự sản sinh các tế bào phôi ở sò Crassostrea
gigas (Fabioux và ctv, 2009).
iRNA có ảnh hưởng đến các yếu tố tạo cơ ở các tua khác nhau trên loài bạch
tuộc Sepia oficinalis (Grimaldi và ctv, 2004).
1.7. Các phương pháp chuyển đổi giới tính tôm càng xanh
1.7.1. Cơ sở lý thuyết
Cặp nhiễm sắc thể giới tính ở tôm càng xanh đực là đồng giao tử (ZZ) và con
cái là dị giao tử (WZ). Để tạo dòng đơn tính toàn đực (100% tôm đực ZZ) thì cần có
tôm bố và tôm mẹ có cùng NST ZZ. Sơ đồ tạo dòng đơn tính đực:

18


Đồ án tốt nghiệp

♂ (ZZ)

X ♀ (ZZ)

100% ♂ (ZZ)
Để tạo dòng toàn đực việc cần thiết là phải tạo tôm cái giả mang NST ZZ
(Ra’anan và Cohen, 1984).
1.7.2. Kỹ thuật chuyển giới tính
Sử dụng hormone đực hóa trộn vào thức ăn cho tôm ăn, hoặc hòa tan thành
dịch để ngâm, tắm tôm trong những khoảng thời gian nhất định. Đàn tôm toàn đực
được tạo ra gồm các cá thể tôm đực có kiểu di truyền ZZ và tôm đực có kiểu di
truyền WZ chuyển giới tính. Kết quả sử dụng hormone chuyển giới tính tôm phụ
thuộc vào một số yếu tố như loại hormone, thời gian, liều lượng sử dụng, giai đoạn
phát triển của tôm khi đưa vào xử lý (Phạm Anh Tuấn, 2002).
1.7.3. Tạo tôm cái giả ZZ bằng hormone
Hiện nay, steroid được sử dụng để thay đổi kiểu hình giới tính cá khi ngâm
hoặc tiêm hoặc qua chế độ ăn trước khi biệt hóa giới tính. Điều này mang lại hy
vọng trong việc sử dụng hormone để điều khiển giới tính ở động vật giáp xác. Điều
khiển chế độ ăn chứa hormone được xem là phương pháp thiết thực nhất trong quy
mô thương mại. Tuy nhiên, phương pháp này mang lại những thách thức do khả
năng mất các hormone do sự rò rỉ từ các viên thức ăn hoặc từ sự cố tiêu hóa, đặc
biệt là mất do sự thay đổi của thức ăn chế biến trước khi tiêu thụ (Ohs và ctv, 2006).
Năm 2006, Dewi và ctv đã dùng hormone 17β-estradiol bổ sung vào thức ăn
để điều khiển giới tính tôm càng xanh. Kết quả thu được là 17β-estradiol không ảnh
hưởng đến tỷ lệ đực cái ở tôm càng xanh (Dewi và ctv, 2006).
Năm 2004, Baghel và ctv đã nghiên cứu ảnh hưởng chuyển đổi giới tính khi
cho ấu trùng tôm càng xanh ăn artemia đã làm giàu với 17α-methyltestosterone,
dạng steroid của động vật có xương sống, kết quả cho thấy 17α-methyltestosterone
có tác dụng chuyển đổi giới tính của tôm càng xanh từ cái thành đực. Nhưng năm
2006, Ohs và ctv dùng 17α-methyltestosterone bổ sung vào thức ăn để chuyển giới
tính tôm càng xanh, tuy nhiên kết quả lại cho thấy 17α-methyltestosterone không có

19

Đồ án tốt nghiệp

tác dụng trong việc chuyển đổi giới tính tôm càng xanh (Ohs và ctv, 2006). Như
vậy, 17α-methyltestosterone có tác dụng chuyển đổi giới tính ở tôm càng xanh là
chưa xác định.
Năm 2006, Ohs và ctv cho hậu ấu trùng của tôm càng xanh thường (50 %
đực, 50 % cái) ăn thức ăn có bổ sung dopamine với 3 nồng độ 0,15; 1,5; và 15 ppm
trong vòng 60 ngày. Kết quả ở nhóm đối chứng có tỷ lệ tôm cái là 62,6 %, trong khi
đó 3 nghiệm thức cho tôm ăn thức ăn bổ sung dopamine với nồng độ 0,15; 1,5 và 15
mg/kg có tỷ lệ tôm cái lần lượt là: 80,9 %; 88 %; và 71 %. Kết quả cho thấy có sự
chênh lệch đáng kể giữa nhóm không và có cho ăn thức ăn có bổ sung dopamine.
Thử nghiệm đã tạo ra một tiềm năng sử dụng dopamine để tạo ra tôm càng xanh
toàn đực phục vụ cho sản xuất.
1.7.4. Kỹ thuật cắt tuyến androgenic tạo tôm cái giả ZZ
Việc cắt bỏ tuyến hormone androgenic trong tôm M. rosenbergii (nằm ở
phần sau của ống phóng tinh) sẽ ảnh hưởng lên các đặc điểm giới tính chính và phụ
của con đực tạo nên sự chuyển giới để sản xuất ra “con cái giả”, dẫn đến sự tạo
trứng, sự phát triển của vòi trứng và lỗ sinh sản của con cái trong con đực đã chuyển
giới trong giai đoạn phát triển còn non nhất. Sự tạo trứng chỉ bắt đầu khi trong con
đực đã được chuyển giới trong thời kỳ phát triển rất non, nếu tác động vào các con
đực trong giai đoạn phát triển muộn hơn thì nó chỉ chuyển giới không hoàn toàn
hoặc không hề chuyển giới (Nagamine và ctv, 1980) .
Việc loại bỏ AG ở con đực, làm mất AGH gây nên hiện tượng: con đực
thành con cái mang NST ZZ. Kỹ thuật vi phẫu loại bỏ tuyến androgenic được thực
hiện lần đầu tiên bởi Sagi và ctv năm 1990. Ở Việt Nam kỹ thuật vi phẫu đã được
thực hiện và thành công năm 2004 (Nguyễn Văn Hảo và ctv, 2004).
Sagi và Cohen vào năm 1990 đã cho biết “Khi cho những con cái chuyển
giới khoẻ mạnh lai với con đực thông thường sẽ cho ra một dòng con toàn đực.

Điều này mở ra tiềm năng của công nghệ tạo con cái để có thể sản xuất ra quần thể
hoàn toàn đơn tính đực đối với tôm càng xanh M. rosenbergii. Hiện nay, Israel và

20


Đồ án tốt nghiệp

Thái Lan đang nghiên cứu sâu công nghệ tạo con cái mới để sản xuất dòng con toàn
đực và đã áp dụng thực địa thành công ở Ấn Độ và Việt Nam”.
Kỹ thuật vi phẫu là kỹ thuật tạo ra tôm cái giả để sản xuất tôm toàn đực phổ
biến hiện nay. Tuy nhiên kỹ thuật này cần có kỹ thuật viên có tay nghề cao, cần
nhiều người để sản xuất một số lượng tôm cái giả lớn, chi phí sản xuất lớn, tỷ lệ tôm
vi phẫu thành tôm cái giả có thể sinh sản được thì không ổn định. Vì vậy, cần tìm ra
các phương pháp mới để cải thiện các hạn chế của kỹ thuật vi phẫu nhằm tạo nguồn
tôm toàn đực để tăng sản lượng cho người nuôi.
1.7.5. Cấy tuyến đực vào tôm cái
Trong một thí nghiệm người ta đã cấy mô tuyến đực từ tôm càng xanh đực
trưởng thành cho những tôm giả định là cái còn non. Những con cái với kích thước
vỏ đầu ngực 6,5-7,5 mm đã chuyển đổi giới tính thành đực gần như 100 %. Người
ta đã phối giống những con đực chuyển giới từ cái với những con cái bình thường.
Kết quả thu được 1 đực/3,2 cái, phù hợp với giả thuyết cơ chế NST định đoạt giới
tính ở tôm càng xanh là ZW (Malecha và ctv, 1992) .

21


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Thời gian và địa điểm
Thí nghiệm được thực hiện từ ngày 01 tháng 02 năm 2012 đến ngày 21 tháng
07 năm 2012 tại phòng Sinh Học Thực Nghiệm, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng
Thủy Sản 2 (116 Nguyễn Đình Chiểu, phường Đakao, quận 01, Thành Phố Hồ Chí
Minh).
2.2. Vật liệu thí nghiệm
2.2.1. Vật liệu sinh học
Tôm PL25: dùng cho các thí nghiệm thực nghiệm tiêm dsRNA.
2.2.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
2.2.2.1. Hóa chất thí nghiệm
- pGEM-Mr-IAG.
- Mr-IAG sense-(T7P)F.
- Mr-IAG antisense-(T7P)R.
- Colorless Buffer 5X.
- dNTPs 10 mM.
- MgCl2 25 mM.
- Flexi Taq 5 U/µl.
- H2O-DEPC.
- Agarose.
- RiboMAXTM Express T7 2X Buffer.
- Nuclease-free water.
- Enzyme Mix T7 Express.
- TURBO DNase.
- Enzyme RNase A.
- Enzyme RNase III.
- TBE 0,5X.
- Gel red.
- 6X DNA Loading Dye (Promega).

22

Đồ án tốt nghiệp

- Thang DNA ladder.
2.2.2.2. Dụng cụ thí nghiệm
- Eppendorf 0,2 ml; 0,5 ml; 1,5 ml.
- Máy hút và tủ cấy vô trùng (Astec Microflow).
- Micropipet các loại (Bio - rad).
- Đầu tip các loại.
- Máy luân nhiệt iCycle (Bio - rad).
- Máy điện di (Bio - rad).
- Máy chụp ảnh điện di GeldocX (Bio - rad).
- Bồn ủ nhiệt.
- Block nhiệt.
- Lò viba (Electrolux - Thụy Điển).
- Tủ mát, tủ âm (Sanyo - Nhật).
- Kính hiển vi CH40:OLYMPUS (Japan).
- Kim tiêm Exmire Microsyringe (Fuji, Japan).
- Hệ thống tuần hoàn nước.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Quy trình tổng hợp Mr-IAG dsRNA ở phòng thí nghiệm
Mr-IAG dsRNA được tổng hợp bằng bộ kit Promega.
Vector tái tổ hợp pGEM-Mr-IAG được sử dụng từ phần nghiên cứu “Phát
triển phương pháp tạo tôm càng xanh cái giả Macrobrachium rosenbergii (De
Man, 1897) bằng phương pháp bất hoạt gene” của nghiên cứu viên tập sự Lê
Chính, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 2.
Trong phương pháp tổng hợp này cDNA mạch khuôn sẽ mang T7 promoter
ở 2 đầu mạch bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu có T7 promoter ở đầu
5’ (Ongvarrasopone và ctv, 2007). dsRNA sẽ được tổng hợp trực tiếp từ cDNA

mạch khuôn mang T7 promoter ở 2 đầu sau phản ứng PCR khuếch đại DNA.
Thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại đoạn mạch khuôn mang T7 ở 2 đầu,
chuẩn bị 2 hỗn hợp phản ứng PCR dùng để tổng hợp và một hỗn hợp dùng để làm

23


Đồ án tốt nghiệp

chứng âm. Mẫu chứng âm thì không cho pGEM-Mr-IAG, còn mẫu tổng hợp thì cho
2 µl pGEM-Mr-IAG.
Trình tự mồi của hỗn hợp phản ứng:
Mr-IAG sense-(T7P)F: 5’- T7PATGGGATACTGGAATGCCGAG-3'
Mr-IAG antisense-(T7P)R: 5'-T7PCTGGAACTGCAGGTGTTAACG-3'
Bảng 2.1. Thành phần mix của phản ứng PCR để tổng hợp cDNA mạch khuôn
mang T7 promoter ở 2 đầu
Thành phần

V (µl) /50 µl

Colorless Buffer 5X

10

dNTPs 10 mM

1

10 mM

MgCl2 25 mM

3

25 mM

Flexi Taq 5 U/µl

0,25

5 U/µl

H2O-DEPC

32,75

Mr-IAG sense-(T7P)F

0,5

Mr-IAG antisense-(T7)R

0,5

pGEM-Mr-IAG

2 µl

Total

50

24

Nồng độ