Nghiên cứu tạo kháng nguyên VP6 tái tổ hợp và kháng thể đặc hiệu để ứng dụng phát triển que thử phát hiện nhanh virus rota

BỘ GIÁO DỤ C VÀ ĐÀO TẠ O
TRƯ Ờ NG ĐẠ I HỌ C BÁCH KHOA HÀ NỘ I
-----------------------

ĐỖ

THỊ THU HÀ

NGHIÊN CỨ U TẠ O KHÁNG NGUYÊN VP6 TÁI TỔ HỢ P VÀ
KHÁNG THỂ ĐẶ C HIỆ U ĐỂ Ứ NG DỤ NG PHÁT TRIỂ N QUE
THỬ PHÁT HIỆ N NHANH VIRUS ROTA

LUẬ N ÁN TIẾ N SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌ C

HÀ NỘ I – 2017


BỘ GIÁO DỤ C VÀ ĐÀO TẠ O
TRƯ Ờ NG ĐẠ I HỌ C BÁCH KHOA HÀ NỘ I
-----------------------

ĐỖ

THỊ THU HÀ

NGHIÊN CỨ U TẠ O KHÁNG NGUYÊN VP6 TÁI TỔ HỢ P VÀ
KHÁNG THỂ ĐẶ C HIỆ U ĐỂ Ứ NG DỤ NG PHÁT TRIỂ N QUE
THỬ PHÁT HIỆ N NHANH VIRUS ROTA

Chuyên ngành: Công nghệ sinh họ c
Mã số

: 62420201

LUẬ N ÁN TIẾ N SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌ C

NGƯ Ờ I HƯ Ớ NG DẪ N KHOA HỌ C
1. PGS. TS TRƯ Ơ NG QUỐ C PHONG
2. GS. TS NGUYỄ N ĐĂNG HIỀ N

HÀ NỘ I – 2017


LỜ I CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứ u củ a tôi và mộ t số kế t quả cùng cộ ng tác vớ i các cộ ng sự
khác.
Các số liệ u và kế t quả trình bày trong luậ n án là trung thự c, mộ t phầ n đã đư ợ c công bố
trên các tạ p chí khoa họ c chuyên ngành vớ i sự đồ ng ý và cho phép củ a các đồ ng tác giả . Phầ n
còn lạ i chư a đư ợ c tác giả nào công bố trong bấ t kỳ công trình nghiên cứ u nào khác.

GVHD 1

GVHD 2

Nghiên cứ u sinh

PGS. TS Trư ơ ng Quố c Phong

GS. TS Nguyễ n Đăng Hiề n

Đỗ Thị Thu Hà


LỜ I CẢ M Ơ N

Tôi xin bày tỏ lòng biế t ơ n chân thành và sâu sắ c tớ i PGS. TS Trư ơ ng Quố c Phong –
giám đố c Trung tâm nghiên cứ u và phát triể n CNSH, Việ n CN Sinh họ c - CN Thự c phẩ m,
trư ờ ng Đạ i họ c Bách khoa Hà Nộ i và GS. TS Nguyễ n Đăng Hiề n – giám đố c Trung tâm
nghiên cứ u, sả n xuấ t vắ c xin và sinh phẩ m y tế (Bộ Y tế ) đã tậ n tình hư ớ ng dẫ n, quan tâm và
tạ o điề u kiệ n cho tôi hoàn thành luậ n án này;
Để hoàn thành luậ n án, tôi đã nhậ n đư ợ c nhiề u sự giúp đỡ và độ ng viên từ PSG. TS Tô
Kim Anh, PGS. TS Khuấ t Hữ u Thanh – Nguyên ban lãnh đạ o Trung tâm nghiên cứ u - phát triể n
CNSH cùng toàn thể bạ n bè và đồ ng nghiệ p. Tôi xin chân thành cả m sự giúp đỡ quý báu đó;
Tôi chân thành cả m ơ n tậ p thể cán bộ mộ t số phòng nghiên cứ u thuộ c Trung tâm nghiên
cứ u, sả n xuấ t vắ c xin và sinh phẩ m y tế đã tạ o điề u kiệ n giúp đỡ để tôi hoàn thành nghiên cứ u
củ a mình;
Vớ i tấ t cả lòng kính yêu và biế t ơ n chân thành nhấ t, tôi xin dành cho gia đình: bố , mẹ ,
chồ ng và các con, nhữ ng ngư ờ i thân yêu đã thông cả m, độ ng viên, tạ o điề u kiệ n và chia sẻ khó
khăn cùng tôi trong suố t thờ i gian qua!
Hà Nộ i, ngày 30 tháng 08 năm 2017

Đỗ Thị Thu Hà


DANH MỤ C CHỮ

VIẾ T TẮ T ......................................................................................................VI

DANH MỤ C CÁC HÌNH Ả NH .....................................................................................................IX

DANH MỤ C CÁC BẢ NG ............................................................................................................... X
ĐẶ T VẤ N ĐỀ .................................................................................................................................... 1
CHƯ Ơ NG I. TỔ NG QUAN TÀI LIỆ U........................................................................................... 3
1.1

TÌNH HÌNH BỆ NH TIÊU CHẢ Y DO VIRUS ROTA TRÊN THẾ

GIỚ I VÀ VIỆ T

NAM .................................................................................................................................... 3
1.1.1

Tình hình nhiễ m virus rota trên thế giớ i ........................................................................... 3

1.1.2

Tình hình nhiễ m virus rota ở Việ t Nam............................................................................. 3

1.2

ĐẶ C ĐIỂ M CỦ A VIRUS ROTA ........................................................................................ 4

1.2.1

Phân loạ i virus rota.............................................................................................................. 4

1.2.2

Đặ c điể m cấ u trúc củ a virus rota........................................................................................ 5

1.2.3

Cơ chế xâm nhiễ m và nhân lên củ a virus rota.................................................................. 8

1.3

CÁC PHƯ Ơ NG PHÁP PHÁT HIỆ N VIRUS ROTA ........................................................ 9

1.3.1

Quan sát bằ ng kính hiể n vi điệ n tử .................................................................................. 10

1.3.2

Phư ơ ng pháp điệ n di.......................................................................................................... 10

1.3.3

Phư ơ ng pháp Real time -PCR........................................................................................... 11

1.3.4

Phư ơ ng pháp giả i trình tự gen.......................................................................................... 11

1.3.5

Phư ơ ng pháp ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) .................................. 11

1.3.6

Phư ơ ng pháp ngư ng kế t hạ t nhự a (latex agglutination) ................................................ 12

1.3.7

Kỹ thuậ t sắ c ký miễ n dị ch ( immunochromatographic)................................................. 12

1.4

ĐẶ C ĐIỂ M PROTEIN VP6 VIRUS ROTA..................................................................... 12

1.4.1

Gen tổ ng hợ p VP6 .............................................................................................................. 12

1.4.2

Đặ c điể m protein VP6........................................................................................................ 13

1.4.2.1 Cấ u trúc protein.............................................................................................................................................13
1.4.2.2 Đặ c tính củ a VP6 ..........................................................................................................................................15
1.5

PROTEIN VP6 TÁI TỔ HỢ P VÀ Ứ NG DỤ NG .............................................................. 18

1.5.1

Protein VP6 tái tổ hợ p ....................................................................................................... 18

1.5.2

Sả n xuấ t protein tái tổ hợ p trong hệ biể u hiệ n E. coli .................................................... 20

1.5.2.1 Hệ biể u hiệ n E. coli .......................................................................................................................................20
1.5.2.2 Các mã hiế m khi biể u hiệ n protein trên E. coli..........................................................................................21
1.5.3

Ứ ng dụ ng kháng thể kháng VP6 trong tạ o kit thử chẩ n đoán....................................... 22

1.6

MỘ T SỐ YẾ U TỐ Ả NH HƯ Ở NG ĐẾ N SINH TỔ NG HỢ P PROTEIN TÁI TỔ HỢ P 23

1.6.1

Ả nh hư ở ng củ a chấ t cả m ứ ng ........................................................................................... 24

1.6.2

Ả nh hư ở ng củ a nhiệ t độ .................................................................................................... 24
I


1.6.3

Ả nh hư ở ng củ a thờ i gian cả m ứ ng ................................................................................... 25

1.6.4

Ả nh hư ở ng củ a tố i ư u hóa các codons.............................................................................. 25

1.7

TINH SẠ CH PROTEIN VP6 TÁI TỔ HỢ P .................................................................... 26

1.7.1

Thu nhậ n và làm tan thể vùi ............................................................................................. 26

1.7.2

Tái cuộ n gấ p VP6 tái tổ hợ p.............................................................................................. 27

1.8

SẢ N XUẤ T KHÁNG THỂ ĐA DÒNG Ở ĐỘ NG VẬ T ................................................... 27

1.8.1

Quy trình gây miễ n dị ch và giám sát độ ng vậ t................................................................ 28

1.8.1.1 Chuẩ n bị kháng nguyên................................................................................................................................28
1.8.1.2 Lự a chọ n tá dư ợ c...........................................................................................................................................29
1.8.1.3 Đư ờ ng tiêm.....................................................................................................................................................29
1.8.1.4 Liề u lư ợ ng kháng nguyên, thể tích và số mũi ti êm.....................................................................................29
1.8.1.5 Giám sát độ ng vậ t..........................................................................................................................................29
1.8.1.6 Lấ y máu..........................................................................................................................................................30
1.8.1.7 Tinh sạ ch kháng thể .......................................................................................................................................30
1.9

KỸ THUẬ T SẮ C KÝ MIỄ N DỊ CH .................................................................................. 30

1.9.1

Nguyên lý que thử .............................................................................................................. 30

1.9.2

Ðặ c tính các thành phầ n que thử ...................................................................................... 31

1.9.2.1 Hạ t nano vàng (AuNPs)................................................................................................................................31
1.9.2.2 Cộ ng hợ p kháng thể VP6 - hạ t nano vàng..................................................................................................32
1.9.2.3 Miế ng cộ ng hợ p.............................................................................................................................................33
1.9.2.4 Miế ng thấ m mẫ u............................................................................................................................................33
1.9.2.5 Màng nitrocellulose.......................................................................................................................................34
1.9.2.6 Miế ng thấ m hút (absorbent pad) .................................................................................................................34
1.10

CÁC KIT THƯ Ơ NG MẠ I CHO CHẨ N ĐOÁN VIRUS ROTA .................................... 34

CHƯ Ơ NG 2. ĐỐ I TƯ Ợ NG VÀ PHƯ Ơ NG NGHIÊN CỨ U ....................................................... 36
2.1

ĐỐ I TƯ Ợ NG, VẬ T LIỆ U, HÓA CHẤ T VÀ THẾ T BỊ ................................................... 36

2.1.1

Sơ đồ tổ ng thể nghiên cứ u ................................................................................................. 36

2.1.2

Đố i tư ợ ng nghiên cứ u......................................................................................................... 36

2.1.3

Vậ t liệ u ................................................................................................................................ 36

2.1.4

Các cặ p mồ i sử dụ ng .......................................................................................................... 37

2.1.5

Các kháng thể sử dụ ng ...................................................................................................... 38

2.1.5.1 Kháng thể cho tạ o que thử ............................................................................................................................38
2.1.5.2 Kháng thể cho Western Blot và ELISA.......................................................................................................38
2.1.6

Hóa chấ t và thiế t bị máy móc............................................................................................ 39

2.1.6.1 Vậ t liệ u, hóa chấ t...........................................................................................................................................39
II


2.1.6.2 Thiế t bị máy móc cơ bả n...............................................................................................................................40
2.2

PHƯ Ơ NG PHÁP NGHIÊN CỨ U ..................................................................................... 40

2.2.1

Các phư ơ ng pháp vi sinh................................................................................................... 40

2.2.1.1 Phư ơ ng pháp nuôi cấ y vi sinh vậ t................................................................................................................40
2.2.1.2 Phư ơ ng pháp giữ giố ng vi sinh vậ t..............................................................................................................40
2.2.2

Các phư ơ ng pháp sinh họ c phân tử .................................................................................. 41

2.2.2.1 Phư ơ ng pháp tách chiế t RNA tổ ng số (QIAgen RNA extract Kit)..........................................................41
2.2.2.2 Phư ơ ng pháp RT – PCR...............................................................................................................................41
2.2.2.3 Phư ơ ng pháp tách chiế t plasmid [17].........................................................................................................42
2.2.2.4 Phư ơ ng pháp ghép nố i gen vào vector tách dòng [182] ..........................................................................42
2.2.2.5 Biế n nạ p vào tế bào E.coli............................................................................................................................43
2.2.2.6 Phư ơ ng pháp tạ o tế bào khả biế n................................................................................................................43
2.2.2.7 Phư ơ ng pháp cắ t DNA plasmid bằ ng enzyme giớ i hạ n............................................................................43
2.2.2.8 Thiế t kế vecter biể u hiệ n pET 22b(+) mang gen vp6 ................................................................................43
2.2.2.9 Phư ơ ng pháp tinh sạ ch DNA từ gel agarose bằ ng QIAquick Gel Extraction kit...................................44
2.2.2.10 Phư ơ ng pháp biể u hiệ n gen .........................................................................................................................44
2.2.3

Phư ơ ng pháp hóa sinh ....................................................................................................... 45

2.2.3.1 Điệ n di DNA trên gel agarose [110]...........................................................................................................45
2.2.3.2 Phư ơ ng pháp điệ n di biế n tính trên gel polyacrylamide – SDS...............................................................45
2.2.3.3 Phư ơ ng pháp tách chiế t protein tổ ng số [120] ..........................................................................................45
2.2.3.4 Phư ơ ng pháp tách chiế t protein thể tan [169]..........................................................................................45
2.2.3.5 Thu nhậ n và làm tan thể vùi [48, 145]........................................................................................................46
2.2.3.6 Phư ơ ng pháp tinh sạ ch protein trên cộ t His-tag kế t hợ p tái cuộ n gấ p [32]...........................................46
2.2.3.7 Phư ơ ng pháp lọ c tách hạ t virus rota và các tiể u thể thành phầ n.............................................................46

2.2.3.8 Đị nh lư ợ ng protein bằ ng phư ơ ng pháp Bradford [24].............................................................................47
2.2.4

Phư ơ ng pháp miễ n dị ch họ c.............................................................................................. 47

2.2.4.1 Phư ơ ng pháp sả n xuấ t kháng thể ................................................................................................................47
2.2.4.2 Phư ơ ng pháp Western Blotting [158].........................................................................................................48
2.2.4.3 Phư ơ ng pháp ELISA [162] ..........................................................................................................................49
2.2.4.4 Phư ơ ng pháp tinh sạ ch IgG bằ ng cộ t sắ c ký ái lự c gắ n protein A-Sepharose.......................................50
2.2.4.5 Phư ơ ng pháp soi hiể n vi miễ n [112]...........................................................................................................50
2.2.5

Phư ơ ng pháp tạ o que thử sắ c ký miễ n dị ch [93, 171, 174] ............................................. 51

2.2.5.1 Tìm pH tố i ư u cho phả n ứ ng gắ n kháng thể và nano vàng.......................................................................51
2.2.5.2 Phư ơ ng pháp tạ o cộ ng hợ p kháng thể - hạ t nano vàng............................................................................51
2.2.5.3 Phư ơ ng pháp cố đị nh kháng thể lên màng.................................................................................................51
III


2.2.5.4 Phư ơ ng thứ c hoạ t độ ng que thử nhanh ......................................................................................................52
2.2.5.5 Phư ơ ng pháp phân tích mẫ u bằ ng que thử ................................................................................................52
2.2.5.6 Phư ơ ng pháp tính độ nhạ y và độ đặ c hiệ u củ a que thử ............................................................................52
2.2.6

Các phư ơ ng pháp tin sinh ................................................................................................. 53

2.2.6.1 Kiể m tra mồ i bằ ng phầ n mề m FastPCR.....................................................................................................53
2.2.6.2 Kiể m tra vị trí củ a các enzyme hạ n chế trên gen đích bằ ng phầ n mề m Nebcutter................................53
2.2.6.3 Phân tích trình tự gen bằ ng phầ n mề m NCBI (Blast,…)..........................................................................53

2.2.6.4 Chuyể n mã trình tự DNA sang trình tự axit amin bằ ng ExPASy.............................................................53
2.2.6.5 Dự đoán cấ u trúc VP6 bằ ng phầ n mề m RaptorX [124]...........................................................................53
2.2.6.6 Dự đoán trình tự epitope trên chuỗ i axit amin bằ ng phầ n mề m SNMTriP ............................................53
2.2.6.7 Xác đị nh độ sạ ch củ a protein VP6 sau khi tinh sạ ch bằ ng phầ n mề m Quanty-One 4.6.9 (Bio-rad) .53
CHƯ Ơ NG 3. KẾ T QUẢ VÀ THẢ O LUẬ N ................................................................................. 54
3.1

TÁCH DÒNG VÀ BIỂ U HIỆ N GEN MÃ HÓA PROTEIN VP6 TRONG E. COLI ... 54

3.1.1

Tách dòng gen vp6 kiể u dạ i............................................................................................... 54

3.1.1.1 Khuế ch đạ i gen vp6.......................................................................................................................................54
3.1.1.2 Tách dòng gen vp6 trong vector pJET1.2..................................................................................................55
3.1.2

Biể u hiệ n gen vp6 mã hóa protein VP6 ............................................................................ 59

3.1.2.1 Tạ o cấ u trúc biể u hiệ n tái tổ hợ p mang gen kiể u dạ i mã hóa protein VP6 (VP6nat)............................59
3.1.2.2 Nghiên cứ u biể u hiệ n gen vp6nat trong E. coli BL21(DE3).....................................................................61
3.1.2.3 Tạ o cấ u trúc biể u hiệ n tái tổ hợ p mang gen tố i ư u mã hóa protein VP6 (VP6opt) ...............................66
3.1.2.4 Nghiên cứ u biể u hiệ n gen vp6 tố i ư u trong E. coli BL21(DE3)..............................................................72
3.1.3

Đánh giá so sánh biể u hiệ n gen vp6nat và vp6opt........................................................... 77

3.2

THU NHẬ N PROTEIN VP6 TÁI TỔ HỢ P TINH SẠ CH .............................................. 78

3.2.1

Tách chiế t protein VP6 ...................................................................................................... 78

3.2.2

Tinh sạ ch protein VP6 tái tổ hợ p và tái cuộ n gấ p........................................................... 80

3.2.2.1 Tinh sạ ch protein VP6 tái tổ hợ p bằ ng sắ c ký ái lự c gắ n Ni2+ .................................................................80
3.2.2.2 Đánh giá khả năng tái cuộ n gấ p củ a protein VP6 tái tổ hợ p sau tinh sạ ch ...........................................81
3.2.3

Đánh giá đặ c tính protein VP6 tái tổ hợ p sau tinh sạ ch................................................. 82

3.3

TẠ O KHÁNG THỂ KHÁNG PROTEIN VP6 VIRUS ROTA TÁI TỔ HỢ P .............. 84

3.3.1

Quy trình gây miễ n dị ch trên thỏ ..................................................................................... 84

3.3.2

Xác đị nh hiệ u giá kháng thể bằ ng phư ơ ng pháp ELISA ............................................... 84

3.3.3

Thu nhậ n và tinh sạ ch kháng thể kháng protein VP6 bằ ng sắ c ký ái lự c cộ t protein ASepharose .......................................................................................................................... 85

3.3.4

Xác đị nh đặ c tính kháng thể ............................................................................................. 87

3.4

TẠ O QUE THỬ

CHẨ N ĐOÁN VIRUS ROTA ............................................................... 90
IV


3.4.1

Nghiên cứ u điề u kiệ n cộ ng hợ p anti-VP6IgG vớ i phứ c PEG-AuPNs .......................... 91

3.4.2

Nghiên cứ u cố đị nh kháng thể trên màng nitrocellulose ................................................ 95

3.4.3

Tố i ư u dị ch ly giả i mẫ u ...................................................................................................... 96

3.4.4

Khả o sát đánh giá que thử ................................................................................................ 97

3.4.4.1 Khả o sát phả n ứ ng chéo...............................................................................................................................99

3.4.4.2 Khả o sát ngư ỡ ng phát hiệ n ........................................................................................................................100
3.4.4.3 Khả o sát khả năng củ a que thử vớ i các nhóm virus rota khác type ......................................................101
3.4.4.4 Khả o sát độ nhạ y và độ đặ c hiệ u trên mẫ u bệ nh phẩ m..........................................................................103
3.4.4.5 Khả o sát thờ i gian bả o quả n que thử ........................................................................................................103
CHƯ Ơ NG 4. KẾ T LUẬ N – KIẾ N NGHỊ ................................................................................... 105
4.1.

KẾ T LUẬ N ....................................................................................................................... 105

4.2.

KIẾ N NGHỊ ...................................................................................................................... 106

DANH MỤ C CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

CỦ A LUẬ N ÁN....................................... 107

TÀI LIỆ U THAM KHẢ O ............................................................................................................ 108
PHỤ LỤ C ....................................................................................................................................... 117
Phụ lụ c 1: Môi trư ờ ng và hóa chấ t .............................................................................................. 117
Phụ lụ c 2: Trình tự gen vp6 trên ngân hàng dữ liệ u NCBI ....................................................... 119
Phụ

lụ c 3: Trình tự

gen vp6

trên vector tách dòng pJET1.2 so sánh vớ i trình tự

gen

(GenBank: HQ392338.1)................................................................................................ 120
Phụ lụ c 4: Cây phân loạ i theo trình tự gen vp6 củ a virus rota................................................. 122
Phụ lụ c 5: Cây phân loạ i theo trình tự axit amin VP6 củ a virus rota. .................................... 123
Phụ lụ c 6: Thông tin trình tự gen vp6 từ virus rota nhóm A G1P(8) phân lậ p ở Việ t Nam... 124
Phụ lụ c 7: Kế t quả giả i trình tự gen vp6nat trên vector pET22b+ ........................................... 126
Phụ lụ c 8: Kế t quả giả i trình tự gen vp6opt trên vector pET22b+ ........................................... 129
Phụ lụ c 9: Trình tự gen VP6opt trên pET22b(+) so sánh vớ i trình từ gen VP6 tổ ng hợ p
(Genscript) ...................................................................................................................... 133
Phụ lụ c 10: Kế t quả tín hiệ u ELISA OD450nm ............................................................................. 135
Phụ lụ c 11: Tóm tắ t quy trình xét nghiệ m .................................................................................. 136
Phụ lụ c 12: Kế t quả khả o sát thử nghiệ m kit trên mẫ u bệ nh phẩ m ........................................ 138
Phụ lụ c 13: Nguồ n gố c mẫ u sử dụ ng trong nghiên cứ u ............................................................. 142

V


DANH MỤ C CHỮ

Từ viế t tắ t

VIẾ T TẮ T

Tiế ng Anh

Tiế ng Việ t

Amp

Ampicillin

Kháng sinh Ampicilline

AP

Alkaline phosphatase

Enzyme Alkaline phosphatase

Anti-VP6IgG

Anti VP6 protein-IgG

Kháng thể kháng protein VP6 tái tổ hợ p

AuNPs

Gold nanoparticle

Hạ t nano vàng

5-Bromo-4-chloro-3-indolyl

Muố i 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl

phosphate disodium salt

phosphate disodium

bp

Base pair

Cặ p base

BSA

Bovine Albumine Serum

Albumine huyế t thanh bò

CBB

Coomassie Brilliant Blue

Coomassie Brilliant Blue

Complementary

Chuỗ i Axit Deoxyribonucleic acid bổ

Deoxyribonucleic acid

sung

CFU

Colony forming unit

Đơ n vị hình thành huẩ n lạ c

dATP

Deoxyadenosine triphosphate

Nucleotid Adenosine -A

dCTP

Deoxycytidine triphosphate

Nucleotid Cytidine - C

dGTP

Deoxyguanosine triphosphate

Nucleotid Guanosine -G

dTTP

Deoxythymidine triphosphate

Nucleotid Thymidine - T

dNTPs

Deoxyribonucleoic Triphosphates

Chứ a 4 nucleotid A,T,C và G

BCIP

cDNA

dsRNA
DTT

Double stranded Ribonucleic
Acid
1,4-Dithiothreitol
1-Ethyl-3-(3-

EDC

dimethylaminopropyl)
carbodiimide

EDTA

RNA sợ i đôi
1,4-Dithiothreitol
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)
carbodiimide

Ethylene diamine tetraacetic acid

Ethylene diamine tetraacetic acid

Enzyme-Linked ImmunoSorbent

Thử nghiệ m hấ p phụ miễ n dị ch liên kế t

Assay

enzyme

EtBr

Ethidium bromide

Ethidium bromide

FCA

Freund’ s Complete Adjuvant

Tá dư ợ c toàn phầ n

FIA

Freund’ s Incomplete Adjuvant

Tá dư ợ c không toàn phầ n

ELISA

FPLC

Fast protein liquid

chromatography

Sắ c ký lỏ ng nhanh
VI


HPLC

High-performance liquid
chromatography

Sắ c ký lỏ ng hiệ u năng cao

HRP

Horseradish Peroxidase

Enzyme Horseradish Peroxidase

ID

Intradermal

Tiêm trong da

IM

Intramuscular

Tiêm bắ p

IP

Intraperitoneal

Tiêm trong phúc mạ c bụ ng

IV

Intravenous

Tiêm tĩnh mạ ch

Ig

Immunoglobulin/ globulin

Kháng thể

Isopropyl β -D – 1 –

Isopropyl β -D – 1 –

thiogalactopyranoside

thiogalactopyranoside

Kb

Kilo base

Kilo base

kDa

Kilo Dalton

Kilo Dalton

LB

Luria Bertani

Môi trư ờ ng Luria Bertani

mAb

Monoclonal Antibody

Kháng thể đơ n dòng

mRNA

Messenger Ribonucleic Acid

RNA thông tin

NBT

Nitro blue tetrazolium

Nitro blue tetrazolium

NHS

N-Hydroxysuccinimide

N-Hydroxysuccinimide

NSP

Non-Structural Protein

Protein phi cấ u trúc

OD

Optical Density

Mậ t độ quang

pAb

Polyclonal Antibody

Kháng thể da dòng

IPTG

PAGE

Polyacrylamide Gel
Electrophoresis

Điệ n di trên gel polyacrylamide

PBS

Phosphate Buffered Saline

Dung dị ch đệ m muố i phố t phát

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phả n ứ ng chuỗ i trùng hợ p

PEG

Polyethylene Glycol

Polyethylene Glycol

pET22(b)::vp6

pET22(b)::vp6

Vector pET22(b) mang gen vp6

Center for research and
Polyvac

production of vaccines and
biologicals

Trung tâm nghiên cứ u sả n xuấ t vắ c xin
và sinh phẩ m y tế

Primer F

Primer Forward

Mồ i xuôi

Primer R

Primer Reverese

Mồ i ngư ợ c

VLPs

Virus-like particles

Tiể u thể giố ng virus

RNase

Ribonuclease

Enzyme Ribonuclease

RV

Rotavirus

Virus rota
VII


RT-PCR

Reverse Transcription PCR

PCR dùng enzyme phiêm mã ngư ợ c

SC

Subcutaneous

Tiêm dư ớ i da

SD

Standard Deviation

Độ lệ ch chuẩ n

SDS

Sodium dodecyl sulphase

Sodium dodecyl sulphase

SG

Subgroup

Dư ớ i nhóm

Sol

Solution

Dung dị ch

TAE

Tris – Acid Acetic – EDTA

Tris – Acid Acetic – EDTA

TMB

Tetramethylbenzidine

Tetramethylbenzidine

TTH

Recombinant

Tái tổ hợ p

UV

Ultraviolet

Tia cự c tím

v/v

Volume/Volume

Thể tích/Thể tích

v/w

Volume/Weight

Thể tích/Khố i lư ợ ng

VP

Virus Protein

Protein cấ u trúc virus

VP6nat

VP6nat - native

VP6 kiể u dạ i

VP6opt

VP6opt - optimum

VP6 tố i ư u

WB

Western Blot

Western Blot

WHO

World Health Organization

Tổ chứ c Y tế Thế giớ i

VIII


DANH MỤ C CÁC HÌNH Ả NH
Hình 1. 1: Cấ u trúc virus rota (vwww.reoviridae.or)...................................................................................................... 5
Hình 1. 2: Mẫ u bệ nh phẩ m chứ a virus rota quan sát dư ớ i kính hiể n vi điệ n tử ......................................................... 9
Hình 1. 3: Sự phân bố khác nhau củ a dsRNA củ a các chủ ng virus rota nhóm A, B và C trên gel 10%

polycrylamide [128]............................................................................................................................................................10
Hình 1. 4: Vị trí và hình thái củ a lớ p protein VP6 trong hạ t virus rota [72]............................................................13
Hình 1. 5: Cấ u tạ o tiể u đơ n vị VP6..................................................................................................................................14
Hình 1. 6: Xác đị nh khu vự c epitope dự đoán củ a VP6 bằ ng phư ơ ng pháp trao đổ i H/D kế t hợ p khố i phổ
(Hydrogen–deuterium exchange mass spectroscopy) [15].........................................................................................15
Hình 1. 7: Chuộ t đư ợ c gẫ y nhiễ m VP6, VP4 và VP7 tái tổ hợ p vớ i các đư ờ ng nhiễ m và tá dư ợ c khác nhau
[35]..........................................................................................................................................................................................17
Hình 1. 8: Đáp ứ ng miễ n dị ch củ a chuộ t vớ i L. lactis NZ9000/pCWA:VP6, NZ9000 [55]...............................18
Hình 1. 9: Cấ u tạ o que thử phát hiệ n nhanh virus rota.................................................................................................31
Hình 1. 10: Mộ t kháng thể đư ợ c cộ ng hợ p vớ i hạ t nano vàng đã gắ n sẵ n lớ p PEG [176]...................................32
Hình 1. 11: Bộ kit SD bioline rotavirus (Hàn Quố c)....................................................................................................35

Hình 2. 1: Sơ đồ vector tách dòng pJET1.2/blunt (Thermo scientific) [173]..........................................................37
Hình 2. 2: Vùng tách dòng và biể u hiệ n trên vector pET22b(+) [172].....................................................................37
Hình 2. 3: Sơ đồ tạ o cấ u trúc tái tổ hợ p mang gen vp6nat trên vector pET22b(+).................................................43
Hình 2. 4: Sơ đồ tạ o cấ u trúc tái tổ hợ p mang gen vp6opt trên vector pET22b(+)................................................44

Hình 3. 1: Điệ n di đồ sả n phẩ m khuế ch đạ i gen vp6 trên gel agarose 0,8%............................................................54
Hình 3. 2: Phổ điệ n di sả n phẩ m PCR thu đư ợ c từ 6 dòng vớ i cặ p mồ i VP6nat đặ c hiệ u. .................................56
Hình 3. 3: Kế t quả chọ n dòng bằ ng xử lý plasmid pJET::vp6 vớ i enzyme cắ t hạ n chế BamHI/SalI................56
Hình 3. 4: Trình tự nucleotide vớ i trình tự axit amin tư ơ ng ứ ng suy diễ n củ a gen tách dòng gen vp6 trên
pJET1.2/blunt.......................................................................................................................................................................58
Hình 3. 5: Kế t quả xử lý 2 plasmid pET22b(+) và pJET1.2::vp6nat bằ ng BamHI/SalI.......................................59
Hình 3. 6: Kế t quả chọ n dòng E. coli BL21(DE3) tái tổ hợ p bằ ng phư ơ ng pháp PCR và cắ t hạ n chế ............60
Hình 3. 7: Trình tự nucleotide và axit amin suy diễ n trên vector biể u hiệ n pET22b(+)........................................61
Hình 3. 8: Kế t quả kiể m tra sự biể u hiệ n gen vp6nat trong E. coli BL21(DE3) /pET22::vp6.............................62
Hình 3. 9: Kế t quả kiể m tra sự biể u hiệ n gen vp6nat bằ ng kháng thể đơ n dòng kháng VP6...............................63
Hình 3. 10: Ả nh hư ở ng củ a nồ ng độ cả m ứ ng tớ i biể u hiệ n gen vp6nat..................................................................63
Hình 3. 11: Ả nh hư ở ng củ a nhiệ t độ cả m ứ ng tớ i biể u hiệ n gen vp6nat..................................................................64
Hình 3. 12: Ả nh hư ở ng củ a thờ i gian cả m ứ ng tớ i biể u hiệ n gen vp6nat.................................................................65

IX


Hình 3. 13: Tố i ư u mã di truyề n gen vp6 củ a virus rota. ............................................................................................67
Hình 3. 14: So sánh trình tự gen vp6 trư ớ c và sau khi tố i ư u mã di truyề n tư ơ ng ứ ng trình tự axit amin suy
diễ n. ........................................................................................................................................................................................68
Hình 3. 15: Kế t quả chọ n dòng bằ ng xử lý enzyme cắ t hạ n chế BamHI/ SalI và PCR vớ i cặ p mồ i VP6opt . 69
Hình 3. 16: Khung đọ c mở dị ch mã tổ ng hợ p protein VP6 trong vector pET22b(+)..........................................70
Hình 3. 17: Cấ u trúc 3D củ a protein VP6 tái tổ hợ p đư ợ c dự đoán bằ ng phầ n mề m RaptorX...........................71
Hình 3. 18:Ví trí các epitope dự đoán trên VP6 protein bằ ng phầ n mề m SVMtriP ..............................................72
Hình 3. 19: Kế t quả kiể m tra sự biể u hiệ n củ a 6xHis-VP6opt ở chủ ng E. coli BL2(DE3)..................................73
Hình 3. 20: Kế t quả kiể m tra sự biể u hiệ n protein VP6 vớ i mAb kháng VP6 (Abcam).....................................74
Hình 3. 21: Ả nh hư ở ng củ a nồ ng độ cả m ứ ng tớ i biể u hiệ n gen vp6opt.................................................................75
Hình 3. 22: Ả nh hư ở ng củ a nhiệ t độ tớ i biể u hiệ n gen vp6opt...................................................................................76
Hình 3. 23: Ả nh hư ở ng củ a thờ i gian tớ i biể u hiệ n gen vp6opt.................................................................................77
Hình 3. 24: So sánh khả năng biể u hiệ n gen vp6 tự nhiên và tố i ư u trên cùng hệ biể u hiệ n................................77
Hình 3. 25: Kế t quả xử lý và hòa tan protein bằ ng 3 phư ơ ng pháp...........................................................................79
Hình 3. 26: Kế t quả tinh sạ ch protein VP6 TTH bằ ng sắ c ký ái lự c giữ a His-tag và Ni2+....................................80
Hình 3. 27: Kế t quả ELISA đánh giá khả năng tái cuộ n gấ p củ a protein VP6 TTH tinh sạ ch............................82
Hình 3. 28: Kế t quả kiể m tra sự đặ c hiệ u củ a protein VP6 bằ ng phư ơ ng pháp WB............................................83
Hình 3. 29: Kế t quả ELISA đánh giá trạ ng thái cấ u trúc VP6 TTH so vớ i VP6 tự nhiên...................................83
Hình 3. 30: Hiệ u giá kháng thể kháng VP6 protein virus rota tạ i các thờ i điể m lấ y máu....................................85
Hình 3. 31: Sắ c ký đồ tinh sạ ch IgG từ huyế t thanh thỏ sử dụ ng cộ t protein A-Sapharose..................................86
Hình 3. 32: Phổ điệ n di tinh sạ ch kháng thể thỏ kháng VP6 TTH virus rota.........................................................87
Hình 3. 33: Kế t quả Western Blot kiể m tra độ đặ c hiệ u củ a kháng thể kháng protein VP6 TTH so vớ i VP6 tự
nhiên.......................................................................................................................................................................................88
Hình 3. 34: Kế t quả ELISA đánh giá khả năng nhậ n biế t củ a anti-VP6IgG vớ i kháng nguyên VP6 TTH và
VP6 tự nhiên.........................................................................................................................................................................89
Hình 3. 35: Đánh giá khả năng nhậ n biế t củ a anti-VP6IgG vớ i các vùng bộ lộ epiope củ a VP6 protein trên hạ t
virus rota nguyên vẹ n..........................................................................................................................................................90

Hình 3. 36: Thử nghiệ m thiế t lậ p que thử vớ i điề u kiệ n ban đầ u...............................................................................91
Hình 3. 37: Ả nh hư ở ng nồ ng độ anti-VP6IgG vớ i phứ c PEG-AuNPs. .................................................................92
Hình 3. 38: Ả nh hư ở ng củ a nồ ng độ anti-VP6IgG vớ i phứ c PEG-AuNPs tớ i tín hiệ u vạ ch kiể m tra và kiể m
chứ ng trên que thử ...............................................................................................................................................................92
Hình 3. 39: Ả nh hư ở ng củ a pH cộ ng hợ p anti-VP6IgG vớ i phứ c PEG-AuNPs..................................................93
Hình 3. 40: Ả nh hư ở ng nồ ng độ EDC/NHS tớ i cộ ng hợ p anti-VP6IgG vớ i phứ c PEG-AuNPs.....................94
Hình 3. 41: Ả nh hư ở ng nhiệ t độ cộ ng hợ p anti-VP6IgG vớ i phứ c PEG-AuNPs.................................................94
Hình 3. 42: Ả nh hư ở ng thờ i gian cộ ng hợ p anti-VP6IgGt vớ i phứ c PEG-AuNPs..............................................95
X


Hình 3. 43: Kế t quả ả nh hư ở ng củ a nồ ng độ vạ ch kiể m chứ ng (control line) ả nh hư ở ng đế n tín hiệ u củ a que
thử ...........................................................................................................................................................................................96
Hình 3. 44: Ả nh hư ở ng củ a dị ch ly giả i mẫ u tớ i tín hiệ u củ a que thử .......................................................................96
Hình 3. 45: Ả nh chụ p TEM mẫ u virus rota trên màng lọ c 100kDa ........................................................................97
Hình 3. 46: Ả nh chụ p TEM các tiể u thể củ a virus rota dư ớ i màng lọ c 100kDa ....................................................98
Hình 3. 47: Ả nh chụ p TEM mẫ u bệ nh phẩ m................................................................................................................98
Hình 3. 48: Kế t quả đánh giá khả năng phát hiệ n củ a que thử ...................................................................................98
Hình 3. 49: Kiể m tra phả n ứ ng chéo củ a que thử vớ i 14 tác nhân gây bệ nh tiêu chả y..........................................99
Hình 3. 50: Kiể m tra ngư ỡ ng phát hiệ n củ a que thử ...................................................................................................100
Hình 3. 51: Kế t quả que thử vớ i các type virus rota....................................................................................................102
Hình 3. 52: Kế t quả bả o quả n que thử trong 7 tháng và 9 tháng bả o quả n ở 40C và nhiệ t độ phòng..............103
Hình 3. 53: Thử nghiệ m que thử trên mẫ u bệ nh phẩ m dư ơ ng tính vớ i virus rota................................................139
Hình 3. 54: Thử nghiệ m que thử trên mẫ u bệ nh phẩ m âm tính vớ i virus rota......................................................141

XI


DANH MỤ C CÁC BẢ NG
Bả ng 1. 1: Gen tổ ng hợ p protein củ a virus rota, vị trí và chứ c năng............................................................................ 6

Bả ng 2. 1: Cặ p mồ i sử dụ ng trong nghiên cứ u..............................................................................................................38
Bả ng 2. 2: Quy trình gây đáp ứ ng miễ n dị ch vớ i kháng nguyên VP6 tái tổ hợ p....................................................48

Bả ng 3. 1: Đánh giá so sánh biể u hiệ n VP6nat và VP6opt trên cùng 1 hệ biể u hiệ n...........................................78
Bả ng 3. 2: Các số liệ u thu hồ i và tinh sạ ch protein VP6..............................................................................................81
Bả ng 3. 3: Kế t quả hiệ u giá kháng thể kháng protein VP6 tái tổ hợ p ......................................................................84
Bả ng 3. 4: Điề u kiệ n tạ o kit thử nghiệ m .......................................................................................................................100
Bả ng 3. 5: Kế t quả tổ ng hợ p khả o sát thử nghiệ m kit trên mẫ u bệ nh phẩ m..........................................................103

X


ĐẶ T VẤ N ĐỀ

Virus rota là nguyên nhân gây tử vong do tiêu chả y cao nhấ t ở trẻ em dư ớ i 5 tuổ i.
Hàng năm virus này đã làm cho khoả ng 25 triệ u trẻ mắ c bệ nh trong đó có 2 triệ u trẻ phả i nhậ p
việ n và đã gây tử vong hơ n 600.000 trẻ , trong số này hơ n 80% là ở các nư ớ c đang phát triể n
[122]. Theo số liệ u thố ng kê tạ i Việ t Nam, hàng năm tỷ lệ mắ c tiêu chả y do virus rota chiế m
trên 50% trong tổ ng số trẻ em dư ớ i 5 tuổ i bị tiêu chả y [7]. Bệ nh tiêu chả y do virus rota gây
ả nh hư ở ng lớ n đế n sự tăng trư ở ng củ a trẻ và là gánh nặ ng kinh tế đố i vớ i toàn xã hộ i, mỗ i
năm chi phí để điề u trị tiêu chả y do loài virus này ở nư ớ c ta lên tớ i 5,3 triệ u đô la Mỹ , trong
đó 3,1 triệ u cho chi phí y tế trự c tiế p, khoả ng 685.000 cho chi phí không thuộ c lĩnh vự c y tế
và 1,5 triệ u khác cho chi phí gián tiế p [38, 46, 103].
Việ c sử dụ ng vắ c xin đã ngăn ngừ a đư ợ c 74% trẻ nhỏ không bị nhiễ m virus rota [115].
Như ng thự c tế , giá thành củ a vắ c xin rota là mộ t trở ngạ i đố i vớ i các nư ớ c đang phát triể n.
Do đó, hiệ n nay còn mộ t tỉ lệ lớ n trẻ dư ớ i 5 tuổ i chư a đư ợ c chủ ng ngừ a bằ ng vắ c xin nên tỉ lệ
trẻ nhiễ m virus rota là rấ t cao, chiế m 50% số trẻ tiêu chả y phả i nhậ p việ n [4]. Không giố ng
như nhiễ m khuẩ n, bệ nh tiêu chả y do virus rota không thể sử dụ ng kháng sinh. Vì vậ y, việ c
chẩ n đoán nhanh, xác đị nh chính xác đư ợ c căn nguyên gây bệ nh để có phư ơ ng án điề u trị hợ p

lý là rấ t cầ n thiế t. Các phư ơ ng pháp chẩ n đoán virus rota đư ợ c Tổ chứ c y tế thế giớ i (WHO)
khuyế n cáo bao gồ m: (1) nhậ n diệ n virus rota bằ ng kính hiể n vi điệ n tử ; (2) phát hiệ n vậ t liệ u
di truyề n củ a virus; (3) phát hiệ n kháng nguyên virus bằ ng mộ t số kỹ thuậ t miễ n dị ch. Mỗ i
phư ơ ng pháp đề u có nhữ ng ư u, như ợ c điể m điể m như điề u kiệ n thự c hiệ n, giá thành phép thử ,
thờ i gian thự c hiệ n. Phư ơ ng pháp chẩ n đoán dự a vào kháng nguyên (ELISA, ngư ng kế t hạ t
nhự a - latex agglutination và sắ c ký miễ n dị ch) đư ợ c đánh giá có ư u thế hơ n bở i mộ t số ư u
điể m như nhanh, đơ n giả n, chính xác, giá thành hợ p lý có thể áp dụ ng trên quy mô mẫ u bệ nh
lớ n. Các phư ơ ng pháp như quan sát hình thái hoặ c phát hiệ n vậ t liệ u di truyề n (PCR, Real
time-PCR) thư ờ ng chỉ phù hợ p dùng trong các phòng nghiên cứ u, trung tâm giám sát dị ch tễ .
Hiệ n nay, các bệ nh việ n và cơ sở y tế chủ yế u dùng kit nhanh dạ ng que thử để phát hiệ n virus
rota trong mẫ u phân bệ nh nhân. Tuy nhiên, các kit này đề u phả i nhậ p khẩ u, giá thành cao và
không chủ độ ng nguồ n sinh phẩ m.
Cấ u trúc virus rota gồ m có 3 lớ p capsit; lớ p ngoài là do protein VP7, VP4 tạ o thành,
lớ p trong do VP2 và protein capsit nằ m ở giữ a củ a virus rota là VP6 tạ o thành. Virus rota
đư ợ c chia thành 7 nhóm (A, B, C, D, E, F và G) phụ thuộ c vào kháng nguyên củ a các protein
capsit ngoài, chỉ có nhóm A, B và C gây bệ nh cho ngư ờ i và độ ng vậ t [107]. Protein VP6
chiế m hơ n 51% khố i lư ợ ng hạ t virus và có tính bả o thủ cao vớ i độ tư ơ ng đồ ng khoả ng 92%
về trình tự axit amin giữ a các chủ ng virus rota nhóm A [67, 132]. Protein VP6 đư ợ c coi là
1


kháng nguyên chung cho tấ t cả virus thuộ c nhóm A [74], nhóm đư ợ c coi là nguyên nhân
chính (chiế m 90%) gây tiêu chả y thể nặ ng ở ngư ờ i, đặ c biệ t là trẻ dư ớ i 5 tuổ i [18]. Do có tính
bả o thủ cho các chủ ng virus rota thuộ c nhóm A nên protein VP6 đư ợ c coi như là mộ t dấ u chỉ
sinh họ c xác đị nh virus rota [56, 109, 165]. Đã có mộ t số nghiên cứ u ứ ng dụ ng protein VP6
để phát triể n vắ c xin tiể u phầ n [133], sử dụ ng làm kháng nguyên tạ o kháng thể đặ c hiệ u cho
phụ c vụ cho chẩ n đoán virus rota bằ ng phư ơ ng pháp ELISA hoặ c sắ c ký miễ n dị ch [98, 178]
Xuấ t phát từ nhữ ng cơ sở lý luậ n và thự c tiễ n nêu trên chúng tôi tiế n hành nghiên cứ u
đề tài: " Nghiên cứ u tạ o kháng nguyên VP6 tái tổ hợ p và kháng thể đặ c hiệ u để ứ ng dụ ng
phát triể n que thử phát hiệ n nhanh virus rota"

- - -

Vớ i các mụ c tiêu:
Tạ o đư ợ c kháng nguyên VP6 tái tổ hợ p củ a virus rota
Tạ o đư ợ c kháng thể đặ c hiệ u kháng protein VP6 virus rota
Thử nghiệ m ứ ng dụ ng cho phát triể n que thử phát hiệ n nhanh virus rota dự a vào
nguyên lý sắ c ký miễ n dị ch
-

Nộ i dung nghiên cứ u:
Nghiên cứ u tách dòng và biể u hiệ n gen mã hóa protein VP6 tái tổ hợ p, tạ o chủ ng
E.coli BL21(DE3) mang pET22(b)::vp6 và nghiên cứ u điề u kiệ n biể u hiệ n VP6
-

tái tổ hợ p từ gen dạ ng dạ i và tố i ư u hóa gen tổ ng hợ p.
Nghiên cứ u điề u kiệ n thu hồ i và tinh sạ ch kháng nguyên VP6 tái tổ hợ p và đặ c

-

tính kháng nguyên VP6.
Nghiên cứ u gây miễ n dị ch thu kháng thể đặ c hiệ u kháng VP6 tái tổ hợ p, xác

-

đị nh tính đặ c hiệ u kháng thể .
Ứ ng dụ ng kháng thể kháng VP6 tái tổ hợ p tạ o que thử phát hiệ n nhanh rota vius.

-

Nhữ ng đóng góp mớ i củ a luậ n án :

Tách dòng và xác đị nh trình tự gen mã hóa protein VP6 củ a virus rota phân lậ p
tạ i Việ t Nam. Trên cơ sở đã tố i ư u hóa trình tự gen vp6 để tăng hiệ u suấ t biể u
-

hiệ n protein VP6 trong E. coli đạ t 0,24 mg/ ml dị ch nuôi
Tạ o đư ợ c đư ợ c nguồ n kháng nguyên VP6 tái tổ hợ p có đặ c tính tư ơ ng tự kháng

-

nguyên VP6 tự nhiên củ a virus rota và kháng thể đa dòng kháng VP6 tái tổ hợ p.
Bư ớ c đầ u thử nghiệ m ứ ng dụ ng kháng thể kháng protein VP6 tạ o que thử nhanh
dự a trên nguyên tắ c sắ c ký miễ n dị ch cho phát hiệ n nhanh virus rota đạ t đư ợ c
kế t quả tố t trong phạ m vi thử nghiệ m. Có ý nghĩa ứ ng dụ ng thự c tiễ n cao.

2


CHƯ Ơ NG I. TỔ NG QUAN TÀI LIỆ U

1.1

TÌNH HÌNH BỆ NH TIÊU CHẢ Y DO VIRUS ROTA TRÊN THẾ GIỚ I VÀ VIỆ T
NAM

1.1.1 Tình hình nhiễ m virus rota trên thế giớ i
Năm 1973, Bishop et al., quan sát dư ớ i kính hiể n vi điệ n tử mả nh sinh thiế t niêm mạ c
ruộ t củ a mộ t em bé chế t vì tiêu chả y cấ p đã phát hiệ n ra mộ t loạ i virus có đư ờ ng kính hơ n 70
nm, thuộ c giố ng Reovirus. Theo thố ng kê bệ nh tiêu chả y là mộ t trong nhữ ng nguyên nhân gây
bệ nh và tử vong cho trẻ em ở các nư ớ c đang phát triể n, ngư ờ i ta ư ớ c tính trên thế giớ i hàng
năm có 500 triệ u trẻ em dư ớ i năm tuổ i mắ c ít nhấ t mộ t đợ t tiêu chả y và 4 triệ u trẻ em dư ớ i 5

tuổ i hàng năm chế t vì bệ nh tiêu chả y. Tiêu chả y là nguyên nhân thứ hai gây tử vong cho trẻ
em sau nhiễ m khuẩ n hô hấ p cấ p tính, 80% tử vong do tiêu chả y xả y ra ở trẻ dư ớ i 2 tuổ i. Mộ t
phầ n ba số trẻ em tử vong dư ớ i 5 tuổ i có liên quan tớ i tiêu chả y cấ p, trong đó virus rota là căn
nguyên hàng đầ u. Virus rota có phạ m vi lư u hành trên khắ p các châu lụ c [161, 167]
Tỷ lệ phát hiệ n virus rota tuy khác nhau giữ a các nư ớ c như ng bệ nh vẫ n tậ p trung chủ
yế u ở trẻ em dư ớ i 5 tuổ i và thư ờ ng vào mùa khô lạ nh. Ư ớ c tính đế n tháng 4 năm 2016, tổ
chứ c Y tế Thế giớ i (WHO) ư ớ c tính trên toàn cầ u trung bình có 215.000 trẻ dư ớ i 5 tuổ i tử
vong do tiêu chả y bở i virus rota. Số lư ợ ng trẻ chế t nhiề u nhấ t là Ấ n Độ (47.100 trẻ em) chiế m
22 %, 4 quố c gia Ấ n Độ , Nigeria, Pakistan và Cộ ng hòa Fdân chủ Congo chiế m khoả ng mộ t
nử a (49 %) củ a tấ t cả các ư ớ c tính trư ờ ng hợ p tử vong do virus rota vào năm 2013 [185].

1.1.2 Tình hình nhiễ m virus rota ở Việ t Nam
Ở

Việ t Nam, năm 1980 mớ i nghiên cứ u và xác đị nh virus này là nguyên nhân chính

gây nên bệ nh tiêu chả y ở trẻ em, theo thố ng kê dị ch tễ tỷ lệ trẻ em mắ c bệ nh tiêu chả y cấ p do
virus rota chiế m trên 50% trong tổ ng số trẻ mắ c tiêu chả y cấ p phả i nhậ p việ n hàng năm, số
trẻ chế t do virus rota chiế m từ 4% - 8% trong tổ ng số trẻ dư ớ i 5 tuổ i bị chế t vì mọ i nguyên
nhân [5]. Bình quân ở nư ớ c ta, 1 trẻ dư ớ i 5 tuổ i mỗ i năm mắ c từ 0,8 - 2,2 đợ t tiêu chả y [7,
103]. Tiêu chả y là nguyên nhân hàng đầ u gây suy dinh dư ỡ ng, ả nh hư ở ng tớ i sự tăng trư ở ng
củ a trẻ . Bệ nh tiêu chả y ở trẻ em và ngư ờ i lớ n có nhữ ng căn nguyên cũng như biể u hiệ n tư ơ ng
đố i giố ng nhau. Tuy nhiên do chư a hoàn chỉ nh về hệ miễ n dị ch nên trẻ em là đố i tư ợ ng nhạ y
cả m hơ n vớ i nguồ n bệ nh, khố i lư ợ ng nư ớ c ở trẻ em (70 - 80%) cao hơ n so vớ i ngư ờ i lớ n (50
- 60%) dẫ n đế n nguy cơ mấ t nư ớ c lớ n gây nên việ c trẻ tiêu chả y dễ đố i mặ t vớ i nguy cơ tử
vong cao hơ n. Theo kế t quả giám sát bệ nh tiêu chả y do virus rota các năm tạ i các bệ nh việ n ở
Việ t Nam đã chỉ rõ kiể u gen G1P(8) chiế m 70% các chủ ng virus rota lư u hành, đây cũng l à
type gây bệ nh phổ biế n ở ngư ờ i trên toàn thế giớ i [1-2, 5, 7].
3

Hiệ n nay, ở Việ t Nam bằ ng kỹ thuậ t ELISA phát hiệ n tỷ lệ virus rota là nguyên nhân
gây tiêu chả y cấ p là tư ơ ng đố i cao. Các nghiên cứ u về virus rota ở Việ t Nam chủ yế u tậ p
trung vào các vấ n đề như giám sát dị ch tễ , nghiên cứ u đặ c điể m miễ n dị ch họ c củ a virus và
nghiên cứ u sả n xuấ t vắ c xin [4, 6, 8-9]. Việ c giám sát dị ch tễ đư ợ c WHO hỗ trợ để theo dõi
diễ n biế n củ a bệ nh dị ch, tỷ lệ mắ c bệ nh, sự phân bố cũng như lư u hành củ

a các type virus.

Vấ n đề này trong nhữ ng năm qua đã đư ợ c thự c hiệ n tạ i PTN củ a Trung tâm Nghiên cứ u sả n
xuấ t vắ c-xin và sinh phẩ m y tế , Việ n Pasteur Hồ Chí Minh và tạ i Việ n Vệ sinh dị ch tễ Trung
ư ơ ng.

1.2

ĐẶ C ĐIỂ M CỦ A VIRUS ROTA

1.2.1 Phân loạ i virus rota
Virus rota gây bệ nh ở ngư ờ i và độ ng vậ t đư ợ c chia thành 7 nhóm A, B, C, D, E, F và
G, chỉ có nhóm A, B, C gây bệ nh cho cả ngư ờ i và độ ng vậ t. Trong đó, nhóm A hay gặ p nhấ t,
gây ra hầ u hế t các ca dị ch tiêu chả y nặ ng ở trẻ em. Nhóm B là nhóm duy nhấ t gây tiêu chả y ở
ngư ờ i lớ n và chỉ đư ợ c phát hiệ n ở mộ t số nư ớ c Châu Á. Nhóm C cũng gây bệ nh ở trẻ em
như ng rấ t hiế m gặ p. Nhóm D, E, F, G chỉ thấ y ở độ ng vậ t [107, 135].
Virus rota đư ợ c phân loạ i nhóm dự a vào tính kháng nguyên củ a các protein capsit lớ p
ngoài. Capsit trong (VP6) mang kháng nguyên đặ c hiệ u nhóm, capsit ngoài (VP4, VP7) mang
kháng nguyên đặ c hiệ u type. Type huyế t thanh G đạ i diệ n cho VP7 và type P đạ i diệ n cho
VP4. Cho đế n nay có 23 type G đã đư ợ c xác đị nh bằ ng ELISA và 11 trong số đó đư ợ c phân
lậ p từ ngư ờ i, trong khi đó chỉ 12 trong 32 type P đã xác đị nh đư ợ c phân lậ p từ ngư ờ i [107],
[138]. Các type huyế t thanh phổ biế n gây bệ nh cho ngư ờ i là G1P(8), G2P(9), G3P(8), và
G4P(8) và mộ t tỷ lệ nhỏ G5, G8 và G9 [105, 138]. Trư ớ c năm 2006 chủ ng G1P(8) chiế m tỷ lệ

cao nhấ t, chủ ng G3 chỉ chiế m 3,3% các chủ ng phân lậ p đư ợ c trên thế giớ i cũng như ở

Việ t

nam. Từ năm 2006, chủ ng G3P(8) là chủ ng lư u hành rộ ng rãi ở phía Bắ c nư ớ c ta. Chủ ng này
có nguồ n gố c từ Trung Quố c và Nhậ t Bả n. Trên thế giớ i tầ n suấ t phát hiệ n chủ ng G3 tăng dầ n
vào nhữ ng năm 2004 [46]. Việ c xuấ t hiệ n độ t ngộ t và chiế m ư u thế củ a các chủ ng G3 cho
thấ y sự cầ n thiế t phả i liên tụ c giám sát các chủ ng virus lư u hành đặ c biệ t là sau khi vắ c xin
phòng virus rota đư ợ c sử dụ ng.
Virus rota gây nhiễ m độ ng vậ t đã vư ợ t qua hàng rào ngăn cả n loài để gây nhiễ m cho
ngư ờ i do chúng đã trả i qua quá trình tổ hợ p và sắ p xế p lạ i hệ gen giữ a các đồ ng chủ ng
(homologous) và dị chủ ng (heterologous) dự a vào hệ gen phân đoạ n củ a mình [13, 55, 96].
Bên cạ nh khả năng sắ p xế p và tái tổ hợ p lạ i hệ gen, nhữ ng độ t biế n điể m và sự tích lũy các
độ t biế n điể m cũng đư ợ

c nghiên cứ u [138]. Hiệ n tạ i đã có 3 cụ m kiể u gen P(8) (gọ i là P(8)-1,

P(8)-2, và P(8)-3) trong đó chủ ng vắ c xin Rotarix thuộ c nhóm P(8)-1 còn các chủ ng P(8) lư u
4


hành tạ i thờ i điể m 2006-2009 lạ i thuộ c nhóm P(8)-2, và P(8)-3. Như vậ y nguồ n gen virus rota
gây nhiễ m cho ngư ờ i ngày càng tăng do sự tái tổ hợ p khác nhau củ a các type huyế t thanh P và
G, củ a các đơ n type khác nhau trong cùng mộ t kiể u huyế t thanh. Do vậ y, việ c phát triể n mộ t
loạ i vắ c xin có hiệ u lự c đố i vớ i tấ t cả các dạ ng virus rota cầ n quan tâm đế n yế u tố này. Tuy
nhiên điề u may mắ n là mộ t type huyế t thanh virus rota cũng có thể

gây ra miễ n dị ch bả o vệ

đố i vớ i type khác [50, 96].

1.2.2 Đặ c điể m cấ u trúc củ a virus rota
Virus rota có dạ ng khố i cầ u 20 mặ t, đư ờ ng kính ~74nm. Chuỗ i nuleocapsit củ a virus
hình thành bở i 3 vòng gấ p đồ ng tâm do 11 đoạ n RNA kép tạ o thành. Capsit củ a virus đố i
xứ ng 20 mặ t, do 132 capsomer sắ p xế p đố i xứ ng gấ p.

Hình 1. 1: Cấ u trúc virus rota (vwww.reoviridae.or).
Virus rota có dạ ng khố i cầ u 20 mặ t, đư ợ c cấ u tạ o nên bở i 6 protein cấ u trúc (VP1-VP7)
và 6 protein phi cấ u trúc (NSP1-NSP6) do 11 mả nh gen mã hóa. Protein VP2 và VP6 tạ o nên
các hạ t hai lớ p đư ợ c phủ bở i lớ p protein VP7, VP4 dimer tạ o nên lớ p mạ ng nhệ n nhô ra phía
ngoài.
Vậ t liệ u di truyề n củ a virus rotalà RNA sợ i đôi. Hệ gen củ a virus rota phân mả nh, gồ m
11 đoạ n RNA có kích thư ớ c 660-3300 bp mã hóa cho 12 protein: 6 protein cấ u trúc VP1 (125
kDa), VP2( 94 kDa), VP3 (88 kDa), VP4 (88 kDa), VP6 (44 kDa), VP7 (38 kDa) và 6 protein
phi cấ u trúc NSP1(53 kDa), NSP2 (34 kDa), NSP3 (35 kDa), NSP4 (28 kDa), NSP5 (26
kDa), NSP6 (12 kDa). Đoạ n gen 11 mã hóa cho 2 protein NSP5, NSP6 [58].

5


•

Đặ c điể m gen tổ ng hợ p protein củ a virus rota
Bả ng 1. 1: Gen tổ ng hợ p protein củ a virus rota, vị trí và chứ c năng

R
N
A

Kích

thư ớ c
(bp)

1

3302

Sả n phẩ m
protein
Tên
(kDa)
b

VP1

125,0

Biế n đổ i sau dị ch
mã (protein trư ở ng
thành)
-

%
trọ ng
lư ợ ng
so vớ i
hạ t
2

Vị trí và chứ c nănga

Protein

lõi

trong;

RNA

polymerase, liên kế t RNA,
tư ơ ng tác vớ i VP2 và VP3
2

2687

VP2

102,4

Myristyl

hóa

(nhóm

axit

15

Protein lõi trong; gắ n vớ i

RNA; kẹ p leucine (axit amin

myristic liên kế t

536 tớ i 559 và 665 tớ i 686)

hóa trị vớ i amide,
kỵ nư ớ c và liên kế t
màng)
3

2591

VP3

98,1

0,5

Protein lõi trong; chuyể n hoá
guanylyl; mathalyse

4

2362

VP4

86,7

xen giữ a bở i 2 vị
trí
VP5*

trypsin
(529)

1,5

củ a

Protein bề mặ t (dimer)
Glycoprotein kháng nguyên

+

(hemagglutinin)

VP8*(247)

Trung

hòa

(serotype

kháng
đặ c

nguyên

hiệ u)

protein tổ ng hợ p màng tế bào
Có độ c lự c và có khả năng gây
bệ nh
5

1581

NSP1

58,6

Phi cấ u trúc

Liên kế t vớ i RNA, zinc fingers
- protein liên kế t vớ i các Zn2+
mụ c đích tạ o nế p gấ p ổ n đị nh

6

1356

VP6

44,8

Myristyl hóa

51

Protein lõi trong, trimer, kỵ
nư ớ c,

phân

nhóm

kháng

nguyên, cầ n thiế t cho quá trình
phiên mã
7

1104

NSP2

34,6

Phi cấ u trúc

Quan trọ ng đố i vớ i sự sao chép
củ a

hệ

gen

virus,

thành phầ n chính củ a thể vùi,
6


NTPase, liên kế t vớ i RNA,
tư ơ ng tác vớ i NSP5
8

1059

NSP3

36,6

Phi cấ u trúc

Quan trọ ng đố i vớ i sự sao chép
củ a

hệ

gen

virus

và

là thành phầ n củ a thể vùi
9

1062

VP7

34,3

Chứ a tín hiệ u cắ t.

30

glycoprotein màng vớ i ER

glycosyl hoá gắ n

(mạ ng lư ớ i nộ i chấ t), protein

nhóm

gắ n vớ i tế

mannose

mứ c cao

kháng

bào, trung hòa
nguyên,

hai

vùng NH2- đầ u cuố i kỵ nư ớ c,
vùng gắ n Ca2+ (axit amin 127
tớ i 157)
10

751

NSP4

20,2

Phi cấ u trúc

glycoprotein xuyên màng liên

Tín hiệ u dẫ n không

kế t vớ i ER, có vai trò trong

cắ t, glycosyl hoá

hình thái, chứ a độ c tố ruộ t

gắ n nhóm mannose
mứ c cao
11

a

667

NSP5

21,7

Phi cấ u trúc

Thành phầ n củ a thể vùi, tư ơ ng

Phosphoryl hoá, O-

tác vớ i NSP2, gắ n RNA,

glycosyl hóa

protein kinase

Mộ t số các chứ c năng đư ợ c biế t tham khả o củ a Estes., et al, 2001 [55] và Pesavento., et al,

2006 [125]
b

Trọ ng lư ợ ng phân tử xác đị nh bở i phư ơ ng pháp SDS-page
•

Các protein phi cấ u trúc:
Protein NSP1 đư ợ c mã hóa bở i đoạ n gen 5, là độ c tố củ a virus rota đố i vớ i chuộ t

như ng lạ i không độ c đố i vớ i lợ n hay thỏ . Mộ t nghiên cứ u gầ n đây cho rằ ng NSP1 phá vỡ đáp
ứ ng miễ n dị ch tự nhiên bằ ng cách phân hủ y yế u tố điề u hòa interferon 3 (IRF3) [21]. Protein
NSP2 đư ợ c mã hóa bở i đoạ n gen 7 là mộ t oligo NTPase có hoạ t tính phá vỡ sự bề n vữ ng củ a
cấ u trúc gấ p và có thể protein này cũng có vai tr ò trong quá trình đóng gói RNA và độ c tính
củ a virus. Protein NSP3 đư ợ c mã hóa bở i đoạ n gen 8, liên kế t vớ i eIF4G (protein liên quan
đế n quá trình phiên mã) và ứ c chế quá trình tổ ng hợ p protein củ a tế bào qua đó tăng cư ờ ng
quá trình dị ch mã trên mRNA củ a virus [160]. Chứ c năng cụ thể củ a 2 protein NSP5 và NSP6
vẫ n chư a đư ợ c rõ, tuy nhiên dự a vào khả năng liên kế t củ a chúng vớ i RNA cho thấ y có thể
chứ c năng củ a chúng là vậ n chuyể n các protein khác củ a virus từ nơ i tổ ng hợ p vào khu vự c
7


virus lắ p ráp trong tế bào chấ t, hoặ c tạ o điề u kiệ n thuậ n lợ i cho quá trình đóng gói RNA, hoặ c
tham gia vào quá trình di chuyể n các hạ t virus từ tế bào chấ t vào mạ ng lư ớ i nộ i chấ t [123].
Protein NSP4 đư ợ c mã hóa bở i đoạ n gen 10 có chứ c năng đị nh hình virus, mang hoạ t tính như
thụ thể đố i vớ i hạ t 2 lớ p nhờ đó các hạ t virus này đi vào trong khoang củ a mạ ng lư ớ i nộ i chấ t
nhờ hình thứ c nả y chồ i. NSP4 cũng l à mộ t độ c tố ruộ t quan trọ ng tham gia vào quá trình phát
sinh bệ nh [19].

1.2.3 Cơ chế xâm nhiễ m và nhân lên củ a virus rota
Sự xâm nhiễ m, nhân lên, đóng gói và giả i phóng virus gồ m các bư ớ c cơ bả n sau: (1)
Giai đoạ n hấ p phụ qua trung gian VP4 và VP7. (2) Thâm nhậ p vào tế bào và cở i vỏ . (3) Tổ ng
hợ p vậ t liệ u di truyề n và dị ch mã tổ ng hợ p protein virus và (4) Lắ p ráp và giả i phóng các hạ t
virus
• Giai đoạ n hấ p phụ
Virus rota thư ờ ng gây nhiễ m tế bào nhung mao trư ở ng thành ở ruộ t non, vớ i cấ u tạ o
có ba lớ p protein capsit giúp virus vư ợ t qua điề u kiệ n pH thấ p và các enzyme tiêu hóa trong
đư ờ ng ruộ t. Mộ t số chủ ng virus rota gây nhiễ m trên độ ng vậ t cầ n axit silic trên bề mặ t tế bào
để quá trình hấ p phụ thành công trong khi đó virus rota gây nhiễ m trên ngư ờ i thì không phụ
thuộ c axit silic [77-78, 131].

• Thâm nhậ p vào tế bào và cở i vỏ
Sau khi gây nhiễ m, protein VP4 đóng vai trò là thụ thể , cho phép virus thâm nhậ p vào
tế bào. VP4 đư ợ c cắ t bở i trypsin thành VP8 và VP5 giúp cho việ c thâm nhậ p tế bào dễ dàng
hơ n. Khi đã ở trong tế bào, transcriptase củ a virus đư ợ c hoạ t hóa để phiên mã vậ t liệ u di
truyề n. Quá trình này đư ợ c kích thích bở i giai đoạ n cở i áo virus và quá trình protein VP4 và
VP7 tách ra khỏ i cấ u trúc 3 lớ p củ a virus. Quá trình tách vỏ VP4 và VP7 có thể do ả nh hư ở ng
củ a nồ ng độ Ca2+ trong nộ i bào [45].
• Tổ ng hợ p vậ t liệ u di truyề n và dị ch mã tổ ng hợ p protein virus
Sau khi hoàn thành quá trình cở i vỏ , hoạ t tính RNA polymerase củ a phứ c hợ p VP1VP3 đư ợ c hoạ t hóa trong cấ u trúc 2 lớ p củ a virus dẫ n đế n quá trình phiên mã và nhô ra củ a 11
sợ i mRNA từ cấ u trúc 2 lớ p này. Sợ i RNA thông tin chị u trách nhiệ m cho cả quá trình giả i mã
và tổ ng hợ p sợ i RNA âm tính để tạ o sợ i RNA kép. Lõi trung gian đư ợ c hình thành, mRNAs
dị ch mã trong polysomes tạ o 12 protein virus. Cả sợ i RNA dư ơ ng và âm đề u có thể tìm thấ y
sau 3 giờ nhiễ m virus. Quá trình phiên mã đạ t đỉ nh cao trong khoả ng 9-12 giờ sau khi nhiễ m
[150].

8


• Lắ p ráp và giả i phóng các hạ t virus
Quá trình này xả y ở mạ ng lư ớ i nộ i chấ t củ a tế bào (ER), cấ u trúc không hoàn chỉ nh
củ a hạ t virus đư ợ c lắ p ráp trong tế bào chấ t sau đó qua lư ớ i nộ i chấ t cùng vớ i protein VP7 và
NSP4 tạ o nên hạ t virus có vỏ . NSP4 và có thể cả VP4 có hoạ t tính làm tan màng cùng vớ i
nồ ng độ Ca2+ cao trong dị ch củ a ER giúp cho việ c loạ i bỏ vỏ lipid tạ m thờ i. Nhiề u nghiên cứ u
đã chỉ rằ ng, việ c tích lũy cao nồ ng độ

Ca2+ trong mạ ng lư ớ i nộ i chấ t giúp cho việ c ổ n đị nh

việ c hình thành các hạ t virus hoàn chỉ nh [131]. Sự tăng cao nồ ng độ Ca2+ trong tế bào dẫ n đế n
việ c thay đổ i tính thấ m củ a màng plasma do việ c bù Ca2+ từ ngoạ i bào vào bên trong tế bào,
kế t quả là tế bào bị mấ t nư ớ c trong quá trình thả i virus qua phân ra ngoài môi trư ờ ng.

Quá trình này là đỉ nh điể m củ a việ c nhiễ m virus rota, bệ nh phẩ m có thể lên tớ i 109 1010 hạ t virus/ ml [73]. Trong bệ nh phẩ m ngoài có các hạ t virus nguyên vẹ n, còn chứ a các tiể u
thể , thành phầ n hạ t đóng gói chư a hoàn toàn và mộ t số hạ t đang ở giai đoạ n suy thoái (Hình
1.2) [129].
Hạ t nguyên vẹ n

Hạ t trong giai
đoạ n suy thoái

Hạ t đóng gói chư a
hoàn toàn

100nm

Hình 1. 2: Mẫ u bệ nh phẩ m chứ a virus rota quan sát dư ớ i kính hiể n vi điệ n tử
1.3

CÁC PHƯ Ơ NG PHÁP PHÁT HIỆ N VIRUS ROTA
Khi các tác nhân gây tiêu chả y xâm nhậ p vào đư ờ ng tiêu hóa sẽ sả n xuấ t ra các độ c tố

ruộ t (enterotoxin) kích thích bài tiế t các chấ t điệ n giả i, xâm lấ n trự c tiế p và phá hủ y tế bào
biể u mô niêm mạ c ruộ t gây tổ n thư ơ ng tạ i ruộ t và toàn thân. Các nguyên nhân tiêu chả y như
đã biế t có thể là do các nguyên nhân do vi sinh vậ t như vi khuẩ n, ký sinh trùng hoặ c virus. Do
vớ i mỗ i loạ i tác nhân gây tiêu chả y sẽ có mộ t cách điề u trị khác nhau, việ c xét nghiệ m phân
tìm nguyên nhân tiêu chả y là mộ t khâu rấ t quan trọ ng để bác sĩ đư a ra phác đồ điề u trị bệ nh
hợ p lý.
Vậ y việ c xác đị nh nguyên nhân gây bệ nh tiêu chả y có ý nghĩa quan trọ ng đế n việ c
điề u trị , giả i quyế t xử lý ngay tạ i các bệ nh việ n đị a phư ơ ng giả m tả i cho các bệ nh việ n tuyế n
trên.

9