nghiên cứu tái sinh invitro rong sụn kappaphycus alvarezii từ mô sẹo

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

PHẠM THỊ MÁT

NGHIÊN CỨU TÁI SINH INVITRO RONG SỤN
KAPPAPHYCUS ALVAREZII TỪ MÔ SẸO

Chuyên ngành:

Công nghệ sinh học

Mã số:

60.42.02.01

Người hướng dẫn khoa học:

TS. Nguyễn Văn Nguyên
PGS.TS. Nguyễn Thị Lý Anh

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên
cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo
vệ lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm
ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2016

Tác giả luận văn

Phạm Thị Mát

i


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được
sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè,
đồng nghiệp và gia đình.
Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết
ơn sâu sắc PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh, TS. Nguyễn Văn Nguyên, ThS. Đào Duy Thu
đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt
quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ
môn Công nghệ Sinh học thực vật, Khoa Công nghệ Sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt
Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức phòng Nghiên cứu
Công nghệ Sinh học Biển, Viện Nghiên cứu Hải sản đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi
trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn./.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2016

Tác giả luận văn

Phạm Thị Mát

ii


MỤC LỤC
Lời cam đoan ..................................................................................................................... i
Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii
Mục lục ........................................................................................................................... iii
Danh mục chữ viết tắt ....................................................................................................... v
Trích yếu luận văn ........................................................................................................... ix
Thesis abstract.................................................................................................................. xi
Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1
1.1.

Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1

1.2.

Mục tiêu và yêu cầu nghiên cứu ......................................................................... 3

1.3.

Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học, thực tiễn ............................................ 3

Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 5
2.1.

Tổng quan về rong sụn Kappaphycus alvarezii.................................................. 5

2.2.

Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô rong biển ..................................................... 9

Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ............................................................ 20
3.1.

Địa điểm nghiên cứu......................................................................................... 20

3.2.

Thời gian nghiên cứu ........................................................................................ 20

3.3.

Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................... 20

3.4.

Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 20

3.5.

Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 20

Phần 4. Kết quả và thảo luận ....................................................................................... 28
4.1.

Kết quả nghiên cứu ........................................................................................... 28

4.1.3.

Kết quả nghiên cứu phương pháp tái sinh chồi thích hợp ................................ 39

4.1.3.

Kết quả nghiên cứu so sánh hiệu quả tái sinh của các dạng mô sẹo khác nhau....... 42

4.1.4.

Kết quả nghiên cứu môi trường dinh dưỡng thích hợp cho sự sinh trưởng
của rong tái sinh ................................................................................................ 44

4.1.5.

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự sinh trưởng
của rong in vitro ................................................................................................ 48

4.2.

Thảo luận .......................................................................................................... 52

4.2.1.

Khử trùng tạo vật liệu sạch ............................................................................... 52

4.2.2.

Cảm ứng tạo mô sẹo ......................................................................................... 54

4.2.3.

Phương pháp tái sinh chồi từ mô sẹo ................................................................ 58

iii


Phần 5. Kết luận và kiến nghị ...................................................................................... 62
5.1.

Kết luận............................................................................................................. 62

5.2.

Kiến nghị .......................................................................................................... 62

Danh mục các công trình đã công bố .............................................................................. 63
Tài liệu tham khảo .......................................................................................................... 64
Phụ lục .......................................................................................................................... 70

iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt

Nghĩa tiếng Việt

BA

6 - benzylaminopurine

IAA

indole-3-acetic acid

NAA

1-naphtalene acetic axit

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Kết quả nghiên cứu nuôi cấy mô từ mô sẹo ở rong biển .............................. 11
Bảng 2.2. Môi trường, chất điều hòa sinh trưởng được thử nghiệm nuôi cấy từ mô
sẹo trên một số đối tượng rong biển .............................................................. 15
Bảng 4.1. Hiệu quả tái sinh của phương pháp phát sinh phôi ........................................ 39
Bảng 4.2. Các dạng mô sẹo được hình thành trong giai đoạn cảm ứng tạo phôi .......... 42
Bảng 4.3. Hiệu quả tái sinh chồi của các dạng mô sẹo ................................................... 43

vi

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Những khu vực trồng nhiều rong sụn ............................................................ 5
Hình 2.2. Các loài rong sụn thương mại Kappaphycus alvarezii .................................. 6
Hình 2.3. Vòng đời của rong sụn Kappaphycus alvarezii ............................................. 8
Hình 2.4. Quá trình tái sinh mô sẹo thành cây con ...................................................... 13
Hình 4.1. Hiệu quả của các chế độ khử trùng khác nhau ........................................... 29
Hình 4.2. Mẫu cấy của một số công thức thí nghiệm .................................................. 30
Hình 4.3. Mô sẹo phát sinh trong nuôi cấy mô rong sụn ........................................... 31
Hình 4.4. Các loại mô sẹo được hình thành (sau 60 ngày nuôi cấy) ........................... 32
Hình 4.5. Tỷ lệ sống và tỷ lệ cảm ứng mô sẹo ở các cường độ ánh sáng khác nhau......... 32
Hình 4.6. Tỷ lệ các loại mô sẹo ở cường độ ánh sáng khác nhau ................................ 33
Hình 4.7. Mẫu cấy ở cường độ ánh sáng khác nhau .................................................... 33
Hình 4.8. Tỷ lệ sống và tỷ lệ cảm ứng mô sẹo của mẫu cấy ở các nồng độ agar ........ 34
Hình 4.9. Tỷ lệ các loại mô sẹo của mẫu cấy ở nồng độ agar khác nhau. ................... 35
Hình 4.10. Mẫu cấy ở các nồng độ agar khác nhau ....................................................... 36
Hình 4.11. Tỷ lệ cảm ứng mô sẹo của mẫu cấy trên môi trường bổ sung các chất
điều tiết sinh trưởng khác nhau. .................................................................. 53
Hình 4.12. Tỷ lệ cảm ứng mô sẹo của mẫu cấy trên môi trường bổ sung các chất
điều tiết sinh trưởng khác nhau. ................................................................... 37
Hình 4.13. Khả năng cảm ứng mô sẹo của mẫu rong nuôi cấy trên môi trường
PES bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng khác nhau ................................ 38
Hình 4.14. Mô sẹo tái sinh bằng phương pháp nuôi lỏng trực tiếp và phương
pháp phát sinh phôi ...................................................................................... 39
Hình 4.15. Mô sẹo sau khi nuôi cấy tăng trưởng ........................................................... 40
Hình 4.16. Sự tái sinh chồi của mô sẹo......................................................................... 41
Hình 4.17. Các dạng mô sẹo hình thành trong giai đoạn cảm ứng tạo phôi trên thạch ........ 42
Hình 4.18. Kết quả tái sinh của các dạng mô sẹo .......................................................... 44
Hình 4.19. Tốc độ sinh trưởng của mẫu rong trong các môi trường khác nhau .................. 45
Hình 4.20. Số lượng chồi tăng lên của mẫu rong trong các môi trường khác nhau ...... 62
Hình 4.21. Sự tăng chiều dài của mẫu rong trong các môi trường khác nhau .............. 46

Hình 4.22. Động thái sinh trưởng của rong trong các môi trường khác nhau trong
30 ngày ......................................................................................................... 47

vii


Hình 4.23. Rong nuôi trong các môi trường khác nhau ................................................. 48
Hình 4.24. Tốc độ sinh trưởng của mẫu rong ở các cường độ ánh sáng khác nhau ..... 49
Hình 4.25. Số lượng chồi tăng lên của mẫu rong ở các cường độ ánh sáng khác nhau ....... 49
Hình 4.26. Sự tăng chiều dài của mẫu rong ở các cường độ ánh sáng khác nhau ............... 50
Hình 4.27. Động thái sinh trưởng của rong ở các điều kiện ánh sáng khác nhau .......... 51
Hình 4.28. Rong nuôi ở các cường độ ánh sáng khác nhau ........................................... 51

viii


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Tên tác giả: Phạm Thị Mát
Tên Luận văn: Nghiên cứu tái sinh in vitro rong sụn Kappaphycusalvarezii từ mô sẹo
Ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 60.42.02.01

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu
Kappaphycus alvarezii là loài rong biển nhiệt đới có giá trị kinh tế quan trọng,
đặc biệt đối với ngành công nghiệp carrageenan. Tuy nhiên, từ trước đến nay, giống
rong biển nói chung, giống rong sụn nói riêng chủ yếu được sản xuất bằng phương pháp
sinh sản sinh dưỡng truyền thống. Đây chính là nguyên nhân dẫn đến suy thoái nguồn
gen, giảm biến dị di truyền, đồng thời làm giảm tốc độ sinh trưởng, hàm lượng

carrageenan và làm tăng mức độ cảm nhiễm bệnh của rong kéo theo sự suy giảm về
năng suất thu hoạch. Những nhược điểm này sẽ được khắc phục bởi công nghệ nuôi cấy
mô tế bào thực vật. Mặc dù trên thế giới đã có những thành công nhất định, tuy nhiên,
nuôi cấy mô rong sụn ở Việt Nam còn là lĩnh vực mới mẻ. Chính vì vậy, chúng tôi đã
tiến hành thực hiện đề tài nhằm cảm ứng và tái sinh thành công mô sẹo rong sụn
K.alvarezii tạo ra cây con trong phòng thí nghiệm làm cơ sở xây dựng quy trình nhân
giống rong sụn in vitro để phục vụ nhu cầu rong giống thiết yếu hiện nay.
Phương pháp nghiên cứu
Mẫu rong sụn K. alvarezii được thu thập từ vịnh Cam Ranh, Khánh Hòa và
chuyển về phòng Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Biển - Viện Nghiên cứu Hải sản. Sau
đó, rong được nuôi thích nghi trong điều kiện nhà kính 4 tuần và trong phòng thí
nghiệm 1 tuần. Phương pháp nuôi cấy mô rong sụn có 4 bước cơ bản gồm (1) khử trùng
tạo vật liệu sạch, (2) cảm ứng tạo mô sẹo, (3) tái sinh mô sẹo thành chồi và (4) nuôi tạo
tản rong. Việc nghiên cứu lựa chọn phương pháp tạo vật liệu sạch trên cơ sở bố trí thí
nghiệm so sánh hiệu quả của ba phương pháp khử trùng bằng kháng sinh nguyên chất
hãng Sigma, kháng sinh có nguồn gốc dược phẩm và dung dịch Javen ở các nồng độ,
thời gian khác nhau. Để tối ưu cho việc cảm ứng mô sẹo, ảnh hưởng của một số yếu tố
môi trường đã được tiến hành nghiên cứu như nồng độ agar (0,4; 0,8; 1,5 và 2%), cường
độ ánh sáng (5, 35, 70 µmol photon.m-2.s-1) và chất điều tiết sinh trưởng (IAA, NAA,
BA). Sau đó, mô sẹo được nghiên cứu tái sinh bằng hai phương pháp là phương pháp
nuôi trực tiếp trong môi trường lỏng và phương pháp cảm ứng phát sinh phôi trên môi

ix


trường thạch. Hiệu quả của năm dạng mô sẹo tạo ra sau giai đoạn cảm ứng tạo phôi
được đánh giá so sánh trên các chỉ tiêu gồm tỷ lệ và thời gian tái sinh, số lượng chồi tạo
ra. Sau đó, tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng (PES, f/2,
NH4Cl - K2HPO4) và cường độ ánh sáng (10, 35, 70 µmol photon m-2.s-1) để tối ưu cho
sự sinh trưởng của rong nuôi cấy mô tạo ra trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Kết quả chính và kết luận
Phương pháp khử trùng tốt nhất là sử dụng dung dịch Javen 0,25% trong thời
gian 5 giây cho tỷ lệ mẫu sạch 86,67% và tỷ lệ mô sẹo đạt 96,67%. Môi trường PES bổ
sung 1 mg/l BA, nồng độ agar 1,5%, cường độ ánh sáng 5 µmol photon m-2.s-1có hiệu
quả tốt nhất cho sự cảm ứng mô sẹo với tỷ lệ sống đạt 100%, tỷ lệ mô sẹo cao (đạt
96,67%, thậm chí có thể đạt tối đa 100%), trong đó chủ yếu là loại mô sẹo chất lượng
tốt. Tái sinh thông qua sự phát sinh phôi trên môi trường thạch của mô sẹo là phương
pháp thích hợp để tạo chồi rong sụn K. alvarezii với tỷ lệ đạt 29,23% với số lượng chồi
dao động lớn từ 1 đến 238. Toàn bộ mô sẹo tái sinh theo phương pháp nuôi lỏng trực
tiếp đều không có khả năng hình thành chồi và chết. Đối với phương pháp tái sinh qua
môi trường thạch, mô sẹo chất lượng kém thường không có khả năng tái sinh và chết.
Mô sẹo loại tốt có tỷ lệ sống tới 90,44% và hình thành 5 dạng phát triển (dạng sợi có
phôi, dạng khối có phôi, dạng có chồi, dạng sợi và dạng khối không chồi). Trong đó,
dạng sợi có phôi cho hiệu quả tái sinh cao nhất, đạt tỷ lệ 100%, số lượng chồi trung bình
là 168. Cường độ ánh sáng 35µmol photon.m-2.s-1, môi trường PES và môi trường
NH4Cl - KH2PO4 thích hợp cho sự sinh trưởng của rong in vitro với tốc độ cao nhất (đạt
5%/ngày).

x


THESIS ABSTRACT
Master candidate: Pham Thi Mat
Thesis title: Research of regeneration of cottonii seaweed Kappaphycusalvarezii from
callus.
Major: Biotechnology

Code: 60.42.02.01

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

Research Objectives
Kappaphycus alvareziiis a major commercial source of k-carrageenan and is an
important economic species in aquaculture in the central part of Vietnam. However,
seaweed seedling is mainly produced by traditional vegetative reproduction method.
This is one of the main causes to the degradation of genetic resources, genetic variation
reduction, the low rate of growth and content of carrageenan and it also increases the
disease susceptibility level of plant leading to the decline in productivity. These
disadvantages are overcome by tissue culture technology. Though the world has made
certain achievements in recent years, however, seaweed tissue culture in Vietnam is still
a new subject. Therefore, the objective of this study was to obtain the optimal medium
for callus induction from thallus explants of K. alvareziiand to regenerate thallus from
induced callus as a basis for formulating the process of in vitro propagation to produce
more seaweed seedling.
Materials and Methods
K. alvarezii, cottonii seaweeds collected from the Cam Ranh Bay (Khanh Hoa
province) were acclimatized in greenhouse and in semisterile culture in the laboratory.
The procedure includes four steps: preparation of axenic material, callus induction,
micropropagules culture, and thallus formation. The paper presents how to select an
appropriate method in producing “clean materials” for tissue culture of the contoni
seaweed, Kappaphycus alvarezii based on a test of some disinfectiton methods using
sodium hypochlorite (Javen), Sigma antibiotics and pharmaceutical antibiotics. To
obtain optimal and consistent callus induction rates and growth in explants, some of the
culture media supplements such as agar, growth regulators, and photon flux densities
were standardized. All culture conditions and media used for this purpose were the same
as adopted for explant culture. To investigate the optimal photon flux densities, explants

xi


were cultured at 5, 35, and 70 µmol photon m-2.s-1, for agar at 0,4%, 0,8%, 1.5%, and

2,0 %, and for growth regulators (naphthaleneacetic acid [NAA] and 6benzylaminopurine [BAP] and indole-3-acetic acid [IAA]) at different concentration
each or in combination. The concentrations of BA were 0, 0.5, 1 mg/l, the
concentrations of IAA were 0, 2.5, 5 mg/l, whereas the concentration of NAA were 0,
0.5, 1 mg/l. Two documented methods were applied including: direct regeneration of
callus in liquid medium and regeneration through somatic embryogenesis. Finally,
micropropagules were transferred into aerated flasks with seawater and added PES
medium, or f/2 medium or NH4Cl 1 mg.L-1 and K2HPO4 1 mg.L-1 to research optimal
medium. To investigate the optimal photon flux densities, micropropagules were
cultured at 10, 35, and 70 µmol photon m-2.s-1.
Main findings and conclusions
The main results showed using Javen 0.25% in 5 seconds to prevent bacterial
contamination in K. alvarezii tissue culture is the best selection. The rate of clean
samples in the treatment with Javen was 86.67% and the callus induction rate for that
was highest (96.67%). The optimal medium for callus induction was 1.5% (w/v) bactoagar-solidified PES medium supplemented with BA 1 mg/l. The optimal photon flux
densities was 5 µmol photon m-2.s-1. The results showed that a effective method was
regeneration through somatic embryogenesis with high micropropagule production rate
(29.23%). After two months of explants culture, callus was excised from the explants
and subcutured separately on fresh medium. The excised callus developed into dark
reddish brown-pigmented microcolonies of globular or oval-shaped somatic embryos.
The embryos were then transferred into liquid PES medium and sharked at 100 rpm for
about 10 - 15 days to form micropropagules. In other method, the callus directly
regenerated in liquid medium were bleached and die after 10-12 days. Finally,
micropropagules were transferred into aerated flasks with seawater. The seawater
medium added 1 mg.L-1 NH4Cl and 1mg.L-1 K2HPO4 or PES medium at 35 µmol
photon.m-2.s-1 gave the highest growth rate in vivo (5%).

xii


PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Rong sụn Kappaphycus alvarezii là một trong những loài rong biển nhiệt
đới có giá trị kinh tế quan trọng, đặc biệt với ngành công nghiệp carrageenan. K.
alvarezii được biết là nguồn nguyên liệu chính sản xuất kappa carrageenan, một
dạng hydrocolloid đang được sử dụng nhiều trong công nghiệp keo và tác nhân
kết dính (Hayashi et al., 2010, 2011). Cùng với Eucheuma denticulatum (chiết
xuất iota carrageenan), K. alvarezii đã cung cấp nguyên liệu sản xuất đến 88%
carrageenan, năng suất khoảng 120.000 tấn khô/năm (McHugh, 2006). Thị
trường thế giới tiêu thụ carrageenan mỗi năm khoảng trên 200 triệu đôla Mỹ và
trong ba thập kỷ gần đây, sản lượng mỗi năm tăng thêm 5%, từ 5.500 tấn năm
1970 lên 20.000 tấn năm 1995. Hơn nữa, kappa carageenan chiết xuất từ K.
alvarezii có sức đông mạnh hơn iota carageenan từ E. denticulatum (Hayashi et
al., 2010) nên được thị trường ưa chuộng hơn, tiềm năng kinh tế từ loài rong sụn
này là rất lớn. Chiết xuất từ K. alvarezii cũng rất giàu dinh dưỡng, cung cấp
nhiều khoáng chất (iod, magie, kẽm, sắt, phospho, kali, …), giàu vitamin B, C, E,
K, β – carotene và các chất điều tiết sinh trưởng thực vật như IAA, kinetin,
zeatine, gibberellins (Zodape et al., 2009).
Tuy nhiên, từ trước đến nay, giống rong biển nói chung, giống rong sụn
nói riêng chủ yếu được sản xuất bằng phương pháp sinh sản sinh dưỡng truyền
thống. Đây chính là nguyên nhân dẫn đến suy thoái nguồn gen, giảm biến dị di
truyền, đồng thời làm giảm tốc độ sinh trưởng, hàm lượng carrageenan và làm
tăng mức độ cảm nhiễm bệnh tật của rong kéo theo sự suy giảm về năng suất thu
hoạch (Dawes et al., 1991; Hayashi et al., 2008). Sự suy giảm chất lượng rong
giống đã khiến cả hai nước có bề dày lịch sử trồng rong hơn 40 năm là Indonesia
và Philippines đều phải đối mặt với tình trạng suy giảm nghiêm trọng về sản
lượng rong trong nhiều năm qua. Chất lượng rong giống Việt Nam cũng đang
suy thoái rất nhanh sau gần hai thập kỷ du nhập và nhân sinh dưỡng liên tục. Tốc
độ sinh trưởng của rong suy giảm đến mức đáng lo ngại. Vào những năm 1994 –
1996, tốc độ sinh trưởng đạt được trung bình 7-9%/ngày hoặc có thể đạt tối đa
11%/ngày (Ohno et al., 1996), nhưng hiện nay chỉ còn 3-6%/ngày, thậm chí còn

thấp hơn 1% (Trần Mai Đức và cs., 2007; Đào Duy Thu và cs., 2014). Một trong
những nguyên nhân dẫn đến nghề trồng rong sụn kém phát triển là do không chủ

1


động được nguồn giống. Nguồn giống chủ yếu do người dân tự lưu giữ, một năm
có khoảng 6 tháng để sản xuất rong thương phẩm nhưng họ phải mất 3 tháng để
nhân giống.Việc lưu giữ này có chi phí lớn, hiệu quả không ổn định bởi ảnh
hưởng của mưa, nước ngọt từ vùng cửa sông và bị bệnh Ice-ice, bệnh sởn lông
cũng như các loài rong tạp bám (chủ yếu là rong lục Enteromorpha spp.) (Đào
Duy Thu và cs., 2014).
Những nhược điểm này sẽ được khắc phục bởi công nghệ nuôi cấy mô tế
bào thực vật. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, nuôi cấy mô là phương pháp hiệu
quả trong việc lưu giữ những nguồn gen quý, tăng cường chất lượng giống, tạo
giống sạch bệnh,…làm cơ sở để nhân giống sinh dưỡng phục vụ thương phẩm
(Hayashi et al., 2010; Reddy et al., 2010; Bindu et al., 2011). Chất lượng rong
giống tạo ra cũng đồng đều cả về kích thước và về tuổi. Một ưu điểm khác của
phương pháp này là cùng một lúc có thể tạo ra một lượng lớn giống phục vụ sản
xuất, việc sản xuất và lưu giữ giống không phụ thuộc vào thời tiết, mùa vụ. Việc
nhân giống cũng không cần diện tích quá lớn và quá trình vận chuyển dễ dàng
hơn. Chính vì vậy, việc áp dụng phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô có
ưu thế vượt trội, là hướng đi tất yếu, sớm hay muộn ở Việt Nam, nếu không
muốn ngành sản xuất rong sụn dần suy thoái và mất ổn định.
Đối với việc nuôi cấy mô rong sụn, đã có nhiều tác giả tiến hành nghiên
cứu và đạt được nhiều kết quả quan trọng (Dawes et al., 1991, 1993; Reddy et
al., 2003; Salvador and Serrano, 2005; Hayashi et al., 2008; Hurtado et al.,
2009). Một số nghiên cứu không những đã sản xuất thành công giống rong sụn từ
nuôi cấy mô mà còn khẳng định tính ưu việt của phương pháp này trong sàng lọc
và chọn giống. Hai nghiên cứu của Dawes et al. (1991,1993) đã thử nghiệm

thành công sản xuất mô sẹo rong sụn và nuôi cấy thành rong, đạt tỷ lệ 100%.
Rong giống sau đó đem trồng thử nghiệm cho tốc độ sinh trưởng đạt 5-5,5 %
trong suốt chu kỳ 85 ngày. Reddy et al. (2003) đã sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô
từ mô sẹo tạo ra phôi tế bào soma và nuôi cấy phôi đó thành rong giống. Kết quả
khảo nghiệm tốc độ tăng trưởng cho thấy tốc độ tăng trưởng của rong nuôi cấy
mô luôn lớn hơn rong tự nhiên từ 1,5 – 1,8 lần trong cả 7 thế hệ thử nghiệm.
Hàm lượng carageenan trong rong sụn nuôi cấy mô (67%) cũng cao hơn so với
rong giống thường (51%) (Yong et al., 2014). Mặc dù trên thế giới đã có những
thành công nhất định, tuy nhiên, nuôi cấy mô rong sụn ở Việt Nam còn là lĩnh
vực mới mẻ. Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu

2


tái sinh in vitro rong sụn Kappaphycusalvarezii từ mô sẹo” nhằm tạo ra rong
giống nuôi cấy mô phục vụ nhu cầu thiết yếu hiện nay.
1.2. MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU NGHIÊN CỨU
1.2.1. Mục tiêu nghiên cứu
Cảm ứng và tái sinh thành công mô sẹo rong sụn K.alvarezii tạo ra cây con
trong phòng thí nghiệm làm cơ sở xây dựng quy trình nhân giống rong sụn in vitro.
1.2.2. Yêu cầu nghiên cứu
- Xác định được chế độ khử trùng tối ưu cho việc tạo vật liệu sạch.
- Xác định được nồng độ agar, nồng độ các chất điều tiết sinh trưởng và
cường độ ánh sáng thích hợp cho sự cảm ứng tạo mô sẹo.
- Xác định được phương pháp tái sinh rong sụn thích hợp trong phòng thí
nghiệm từ mô sẹo.
- Xác định được hiệu quả tái sinh của các dạng mô sẹo khác nhau.
- Xác định được môi trường và cường độ ánh sáng thích hợp để nuôi tản
rong tái sinh trong phòng thí nghiệm.
1.3. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI, Ý NGHĨA KHOA HỌC, THỰC TIỄN

1.3.1. Những đóng góp mới
Nuôi cấy mô rong sụn ở Việt Nam còn là lĩnh vực mới mẻ.Nghiên cứu
này nằm trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu nhân giống rong sụn
Kappaphycusalvarezii bằng công nghệ nuôi cấy mô” thuộc “Đề án phát triển và
ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực thủy sản đến năm 2020” được Bộ
Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn phê chuẩn năm 2013 và giao cho Viện
Nghiên cứu Hải sản chủ trì thực hiện. Sau ba năm nghiên cứu, đề tài đã tạo ra
được bước đầu thành công và lần đầu tiên ở Việt Nam sản xuất được rong sụn
bằng phương pháp nuôi cấy mô.
1.3.2. Ý nghĩa khoa học
- Cung cấp những cơ sở khoa học về quy trình nhân giống rong sụn K.
alvarezii- loài rong biển đầu tiên được nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy
mô ở Việt Nam.
- Các kết quả đạt được sẽ giúp bổ sung thêm nguồn tài liệu khoa học
phục vụ cho công tác giảng dạy, nghiên cứu khoa học về kỹ thuật nhân giống
rong biển bằng phương pháp nuôi cấy mô sẹo.

3


1.3.3. Ý nghĩa thực tiễn
- Xây dựng được quy trình nhân giống rong sụn K. alvarezii bằng
phương pháp nuôi cấy mô sẹo.
- Góp phần đẩy mạnh việc sản xuất rong sụnK. alvareziinói riêng và rong
biển nói chung, phục vụ nhu cầu nguồn giống thiết yếu hiện nay.

4


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. TỔNG QUAN VỀ RONG SỤN KAPPAPHYCUS ALVAREZII
2.1.1. Hệ thống phân loại
Theo cơ sở dữ liệu Algaebase (Guiry et al., 2016), rong sụn Kappaphycus
alvarezii (hoặc Eucheuma alvarezii) thuộc vào ngành rong đỏ. Hệ thống phân
loại của K. alvarezii như sau:
Ngành: Rhodophyta
Lớp: Florideophyceae
Phân lớp: Rhodymeniophycidae
Bộ: Gigartinales
Họ: Solieriaceae
Chi: Kappaphycus
Loài: Kappaphy alvarezii
2.1.2. Khu vực phân bố
K. alvarezii là loài rong nhiệt đới phân bố rộng theo chiều ngang từ các
quần đảo ở Thái Bình Dương đến các nước châu Phi, châu Á và châu Mỹ (Bindu
and Levine, 2011). Trong tự nhiên, rong sụn có thể bắt gặp ở các vùng nước ven
biển có độ sâu không quá 20m. Chúng thường bám lỏng lẻo trên bề mặt rạn san
hô hoặc đá ngầm (Huỳnh Quang Năng, 2007). Do có giá trị kinh tế, loài rong này
đã được di nhập sang các vùng biển khác từ những năm 1960 để trồng thương
phẩm (Bindu and Levine, 2011). Chúng đã xuất hiện ở trên 20 vùng nhiệt đới
trong khoảng vĩ độ ±10o (Hayashi et al., 2010). Trong đó, vùng biển Indosia Malaysia - Philippine được coi là trung tâm phân bố của rong sụn, chiếm khoảng
60% diện tích trên toàn cầu (Bindu and Levine, 2011).

Hình 2.1.Những khu vực trồng nhiều rong sụn (Hayashi et al., 2010)

5


2.1.3. Đặc điểm hình thái
Rong sụn có thân hình trụ đặc, cứng, dai và nhớt do chất keo (Trono and

Fortes, 1998). Rong thường có chiều dài tản 20-60 cm nhưng cũng có thể dài đến
2m, với trọng lượng tối đa đạt 56 kg. Tản rong thô, nặng, thân phân nhiều nhánh,
trên bề mặt các nhánh có các mấu hoặc u lồi nhỏ (Silva et al., 1996; Huỳnh
Quang Năng, 2007). Rong sụn có 2 dạng hình thái chính là dạng thân bò (phân
nhánh mạnh, dạng bụi lớn, nhiều nhánh nhỏ) và dạng thân thẳng (ít phân nhánh,
nhánh thẳng và mập). Màu sắc rong sụn rất đa dạng biến đổi từ xanh ngọc bích
đến vàng cam (Hayashi et al., 2008). Người ta đã tìm được ít nhất 10 loại rong
sụn khác nhau trên thế giới. Chúng không chỉ khác nhau về hình thái, màu sắc
mà còn khác nhau về tốc độ tăng trưởng, hàm lượng dinh dưỡng và carrageenan
(Dawes and Koch, 1991; Munoz et al., 2006).

Hình 2.2. Các loài rong sụn thương mạiKappaphycus alvarezii
Nguồn: Hurtado et al. (2008)

6


2.1.4. Đặc điểm sinh thái
Các điều kiện sinh thái ảnh hưởng khác nhau đến sinh trưởng và phát triển
của rong sụn. Ở vùng nước thường xuyên trao đổi và luân chuyển do dòng chảy,
dòng triều hay sóng bề mặt, rong phát triển rất tốt vì được tiếp xúc với ánh sáng
và chất dinh dưỡng liên tục cũng như hạn chế sự bám dính của chất bẩn. K.
alvarezii sinh trưởng tốt nhất trong điều kiện nhiệt độ từ 25-30oC. Vào những
tháng mùa nóng, nhiệt độ nước cao (>30oC) và cường độ ánh sáng cao (> 50000
lux), tốc độ tăng trưởng của rong sụn giảm mạnh (Nguyễn Xuân Lý và Phạm Thị
Nhàn, 2000). Theo Võ Duy Tiết và Cao Thị Trúc Duyên (2004), nhiệt độ thích
hợp nhất cho rong sụn sinh trưởng và phát triển là 25-28oC, nhiệt độ cao hơn
30oC rong sụn phát triển chậm, nhiệt độ nhỏ hơn 15oC rong sụn ngừng phát triển
và có thể chết. Rong sụn sinh trưởng ở độ mặn cao, thường từ 28-34‰ (Huỳnh
Quang Năng, 2007). Độ mặn nước dưới 20‰, rong sụn bị đứt gãy và chết trong

thời gian ngắn 7-10 ngày (Nguyễn Xuân Lý và Phạm Thị Nhàn, 2000; Võ Duy
Tiết và Cao Thị Trúc Duyên, 2004). Cường độ ánh sáng 30000-50000 lux phù
hợp cho sự sinh trưởng của rong sụn (Huỳnh Quang Năng, 2007). Hàm lượng
dinh dưỡng N, P phù hợp lần lượt là 1,1-1,4 mg/l và 0,08-0,1 mg/l (Nguyễn Xuân
Lý và Phạm Thị Nhàn, 2000).
2.1.5. Đặc điểm sinh sản
Sinh sản của rong sụn mang đặc điểm đặc trưng điển hình về sinh sản của
rong đỏ.
Trong tự nhiên, rong sụn tồn tại ở 3 dạng: cây giao tử đực (male gametophyte),
cây giao tử cái (female gametophyte) và cây bào tử bốn (tetrasporophyte) đồng
nhất về mặt hình thái và hình dạng (Luxton, 1999). Theo Azanza and Aliaza
(1999), trong tự nhiên rong sụn sinh sản theo các kiểu khác nhau bao gồm: sinh
sản sinh dưỡng (các đoạn của thân rong có thể phát triển thành cây rong rong
mới), sinh sản vô tính bằng bào tử (bào tử bốn phát triển thành các cây giao tử
đực, cái) và sinh sản hữu tính (sự kết hợp giữa giao tử đực và giao tử cái). Các
hình thức sinh sản này luôn luân phiên nhau trong tự nhiên và các dạng cây cùng
tồn tại và phát triển (Granbom et al., 2004). Vòng đời sinh sản của rong sụn bao
gồm 2 pha: pha lưỡng bội và pha đơn bội.

7


Hình 2.3. Vòng đời của rong sụn Kappaphycus alvarezii
Nguồn: Nguyễn Xuân Lý (1995)

2.1.6. Vai trò của rong sụn
Nuôi trồng rong biển nói chung và K. alvarezii nói riêng đã đóng góp
đáng kể cho nền kinh tế của các nước, mang lại nguồn thu nhập và cải thiện tình
hình kinh tế xã hội của người dân vùng ven biển (Hayashi et al., 2010). K.
alvarezii là một trong những loài rong biển nhiệt đới trồng phổ biến nhất và phát

triển nhanh nhất của chi rong Kappaphycus, đồng thời cho hàm lượng
carrageenan chất lượng tốt nhất. Vì vậy, nó được coi là nguồn chính sản xuất
kappa carrageenan, một dạng hydrocolloid đang được sử dụng trong nhiều ngành
công nghiệp như công nghệ thực phẩm, mỹ phẩm, công nghiệp nhẹ (giấy, da,
keo, sơn) và công nghệ sinh học (cố định enzyme và nấm men, nuôi cấy mô tế
bào thực vật, vi sinh) (Hayashi et al., 2008; Hayashi et al., 2010). Ngoài ra, chiết
xuất từ K. alvarezii cũng rất giàu dinh dưỡng, bao gồm cả những chất điều tiết
sinh trưởng thực vật như IAA, kinetin, zeatine, gibberellins (Zodape et al., 2009)
và lượng lớn các lectin có hoạt chất sinh học tốt (Kawakubo et al., 1997, 1999;
Sugawara et al., 2001; Liao et al., 2003; Hori et al., 2007).

8


2.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY MÔ RONG BIỂN
2.2.1. Nghiên cứu nuôi cấy mô rong biển trên thế giới
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một phạm trù khái niệm chung cho tất cả
các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi
trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng. Nuôi cấy mô tế bào thực
vật bao gồm: nuôi cấy cây con và cây trưởng thành; nuôi cấy cơ quan (rễ, thân,
lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh); nuôi cấy phôi; nuôi cấy mô sẹo; nuôi
cấy tế bào trần.
Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào chính là học thuyết về
tính toàn năng của tế bào của nhà sinh lý thực vật người Đức, Haberlandt (1902):
Mọi tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di
truyền (DNA) cần thiết và đầy đủ của sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp
mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Ngày nay, các nhà
khoa học đã chứng minh được khả năng tái sinh cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ
một tế bào riêng rẽ.
Quá trình từ nguồn vật liệu ban đầu là tế bào hoặc mô thực vật nuôi cấy

phân hóa thành cây hoàn chỉnh được gọi là sự biểu hiện về tính toàn năng của tế
bào thực vật. Sự biểu hiện tính toàn năng của tế bào trong nuôi cấy in vitro trải
qua ba giai đoạn sau: tế bào phản phân hóa với sự phát sinh tế bào khả biến; sự
định hướng phân hóa tế bào (hoặc tác dụng quyết định của tế bào); sự phát sinh
hình thái và phát triển cơ quan để hình thành cở thể hoàn chỉnh.
Dựa trên cơ sở khoa học nêu trên, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật
đã được ứng dụng thành công trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu và sản xuất khác
nhau. Trong đó, nhân giống cây trồng in vitro là một trong các lĩnh vực được
phát triển sớm, phổ biến và thu được nhiều thành công nhất.
Hiện nay, có hai phương pháp chính nuôi cấy mô rong biển là nuôi cấy
mô từ mô sẹo và nuôi cấy mô từ tế bào trần (Reddy et al., 2008a,b). Phương
pháp nuôi cấy từ tế bào trần đã được thực hiện trên 89 loài của 36 chi, thuộc
ngành rong đỏ (Phodophyta – có 41 loài thuộc 13 chi), rong lục (Chlorophyta
- có 24 loài thuộc 5 chi) và rong nâu (Phaeophyta - 24 loài thuộc 18 chi). Tuy
nhiên, phương pháp nuôi cấy mô bằng tế bào trần thường cho hiệu quả không
cao bằng phương pháp sử dụng mô sẹo vì quá trình phân lập tế bào trần phụ
thuộc vào nhiều yếu tố (Reddy et al., 2010). Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, số

9


lượng tế bào trần thu được trong mỗi lần xử lý đối khi chỉ đạt một hoặc vài tế
bào do chưa đúng trong việc áp dụng loại enzyme và nồng độ sử dụng, pH của
môi trường, điều kiện tinh sạch của môi trường cấy, nhiệt độ ủ phôi, vị trí thu
mẫu phôi,… (Reddy et al. 2008a). Việc phân lập tế bào trần đã hoàn toàn có
thể thực hiện được với nhiều hình thức phối hợp enzyme khác nhau ở tất cả
các loài trên, nhưng nuôi tế bào trần thành cây con hoặc xa hơn là tạo cây
giống chỉ thành công trên một số ít loài. Cho đến nay, nuôi cấy mô rong biển
từ mô sẹo được thực hiện nhiều hơn và cho kết quả ổn định hơn, với hiệu quả
tạo mô sẹo có thể lên tới 100% ở nhiều hình thức phối hợp môi trường nuôi

cấy với chất điều tiết sinh trưởng.
Phương pháp nuôi cấy mô sẹo đã được tiến hành thử nghiệm trên 85 loài
rong biển thuộc ba ngành rong đỏ, rong lục và rong nâu cho mức độ thành
công ở các mức độ khác nhau (bảng 2.1). Tùy từng loài mà mức độ thành
công khác nhau. Ở một số loài rong mới chỉ thành công ở mức tạo ra mô sẹo,
nhưng một số loài khác đã tạo được cây con trong phòng thí nghiệm, thậm chí
đã thuần dưỡng và chuyển ra trồng thử nghiệm ngoài môi trường tự nhiên, ví
dụ như Agardhiella subulata, Carpopeltis afinis, Gracilaria perplexa, G.
tenuistipitata, Grateloupia acuminate, G. doryphora, Kappaphycus alvarezii
(Dawes and Koch, 1991; Kumar et al., 2004, 2007; Reddy et al., 2003, 2010).
Riêng đối với rong sụn, đã có khá nhiều nghiên cứu được tiến hành và đạt
nhiều kết quả quan trọng (Dawes et al., 1991, 1993; Reddy et al., 2003;
Salvador and Serrano, 2005; Hayashi et al., 2008; Hurtado et al., 2009). Một
số nghiên cứu không những đã sản xuất thành công giống rong sụn từ nuôi cấy
mô mà còn khẳng định tính ưu việt của phương pháp này trong sàng lọc và
chọn giống. Hai nghiên cứu của Dawes et al. (1991,1993) đã thử nghiệm
thành công sản xuất mô sẹo rong sụn và nuôi cấy thành rong, đạt tỷ lệ 100%.
Rong giống sau đó đem trồng thử nghiệm cho tốc độ sinh trưởng đạt 5-5,5 %
trong suốt chu kỳ 85 ngày. Reddy et al. (2003) đã sử dụng kỹ thuật nuôi cấy
mô từ mô sẹo tạo ra phôi tế bào soma và nuôi cấy phôi đó thành rong giống.
Kết quả khảo nghiệm tốc độ tăng trưởng cho thấy tốc độ tăng trưởng của rong
nuôi cấy mô luôn lớn hơn rong tự nhiên từ 1,5 – 1,8 lần trong cả 7 thế hệ thử
nghiệm. Trong một nghiên cứu của Hayashi et al. (2008) đã tiến hành sản xuất
rong giống bằng công nghệ nuôi cấy mô sử dụng colchisin (0,01%) nhằm tạo
rong giống đa bội thể. Kết quả nghiên cứu cho thấy hơn 80% phôi cấy được

10


tiền xử lý bằng cochisin (0.01%) phát triển thành mô sẹo trong môi trường

Provasoni (PES). Mô sẹo sau đó phát triển nhanh chóng thành cây giống khi
nuôi trong môi trường Stosch có bổ sung glycerol 90 mM và rong giống khi
nuôi thương phẩm cũng cho tốc độ lớn nhanh hơn nhân giống tự nhiên từ 1,5
– 1,8 lần.
Bảng 2.1. Kết quả nghiên cứu nuôi cấy mô từ mô sẹo ở rong biển
(Reddy et al., 2008b)
Loài

Kết quả
đạt được

Chlorophyta
Enteromorpha sp.
Enteromorpha intestinalis
Ulva angusta
Ulva sp.

–
CI
CI
–

Rhodophyta
Agardhiella subulata
Ahnfeltiopsis flabelliformis
Ceramium kondoi
Chondrus crispus
Carpopeltis affinis
C. prolifera
Chondrcanthus tenellus

PR
PR
CI
CI
CI & PR
CI & PR
CI & PR

Eucheuma alvarezii
E. denticulatum
E. uncinatum
Furcellaria fastigata
Gelidiella acerosa
G. robustum
Gelidium sp.
G. vagum
Gigartina exasperate
Gloiopeltis tenax
Gracillaria acuminate
G. chilensis
G. corticata
G. papenfussii

PR, SE, CI
PR
PR
CI
PR
PR

PR
CI
PR
CI
CI
CI
CI & PR
PR

Loài
Pionitis crispate
Porphyra perforate
P. lenceolata
P. nereocystis
P. umbilicalis
P. yezoensis
Pterocladia capillacea
Ptilophora subcostata
Smithora naiadum
Soleria filiformis

Kết quả
đạt được
CI
PR
PR
PR
CI
PR
CI & BS

CI
PR
CI

Phaeophyta
Cystoseira expensa
C. osmundacea

SD
CI

C. retorta

SD

C. siliquosa
Dictyosiphon foeniculaceus
Ecklonia cava
E. radiate
E. stolonifera
Eisenia bicyclis
Egregia menziesis
Fucus sp.
Laminaria angustata
L. digitata
L. hyperborean
L. japonica
L. saccharina

SD

CI
PR
PR
PR
CI
PR
PR
PR
PR
PR
PR

11


Loài
G. perplexa
G. tenuistipitata
G. tenuifrons
G. textori
G. verrucosa
Grateloupia doryphora
G. dichotoma
G. filiformis
G. filicina
G. turutura
G. imbricate
Hypnea musciformis
Laurencia sp.
Meritotheca papulosa

Ochtodes secundriramea
Phyllophora nervosa

Kết quả
đạt được
CI
CI
PR
CI
CI & PR
BF
CI
CI & PR
CI
CI
CI
CI
PR, SD, CI
CI
PR
CI & PR

Loài
L. setchellii
L. sinclairii
Macrocystis pyrifera
Prionitis lanceolata
Pelvetia fastigiat
Sargassum confusm
S. flutians

S. heterophyllum
S. muticum
S. polycystum
Sargassum sp.
S. tenerrimum
Stylopodium sp.
Turbinaria conoides
Undaria pinnatifida
U. undarioides

Kết quả
đạt được
CI
CI
CI
CI
CI
PR
PR
PR
PR
PR
AE
CI
CI
CI
PR
PR

Ghi chú: BF – nảy chồi chưa hoàn toàn, CI – tạo ra mô sẹo, PR – tạo cây con, SE – tạo phôi hoàn chỉnh,

AE – tạo phôi chưa hoàn chỉnh, SD – nảy chồi hoàn toàn.

Quy trình nuôi cấy mô rong biển về cơ bản cũng giống như quy trình nuôi
cấy mô ở thực vật bậc cao. Tuy nhiên, do sự khác biệt về cấu trúc vỏ tế bào nên
phương pháp nuôi cấy mô (cả nuôi cấy bằng mô sẹo hay tế bào trần) đều cần có
sự chỉnh lý thích hợp với từng nhóm rong biển (Reddy et al., 2008b). Nhiều tác
giả trên thế giới đã thử nghiệm các phương pháp tái sinh chồi từ mô sẹo để tạo
cây con hoàn chỉnh. Sự thành công của việc tái sinh chồi từ mô sẹo trên môi
trường rắn đã được báo cáo trên một vài loài rong đỏ (Liu and Gordon, 1987;
PolneFuller and Gibor, 1987; Huang and Fujita, 1997; Reddy et al., 2003).
Reddy et al. (2003) đã tái sinh K. alvarezii bằng cách cắt những mô sẹo phát triển
mạnh sau 2 tháng nuôi cấy cảm ứng và cấy trên môi trường PES nồng độ agar
1,5%. Điều kiện nuôi tương tự như điều kiện cảm ứng mô sẹo, ngoại trừ ánh sáng
tăng lên 35 µmol photon m-2.s-1. Sau 60 ngày, mô sẹo được cắt thành những khối
nhỏ và cấy trong môi trường PES, 0,4% bactoagar hoặc 0,6% agarose, bổ sung
0,1–1,0 mg/l NAA hoặc hỗn hợp NAA và BAP 0,1 mg/l. Mẫu được cấy chuyển
sang môi trường mới sau 40-45 ngày. Phôi tạo thành được nuôi lắc một tháng

12