khảo sát nguồn gen kháng bệnh đạo ôn trên một số giống lúa bằng chỉ thị phân tử

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

DƯƠNG THỊ THƯỞNG

KHẢO SÁT NGUỒN GEN KHÁNG BỆNH ĐẠO ÔN
TRÊN MỘT SỐ GIỐNG LÚA BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ

Chuyên ngành:

Công nghệ sinh học

Mã số:

60.42.02.01

Người hướng dẫn khoa học:

TS. Phạm Thiên Thành
TS. Nguyễn Văn Giang

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Kết quả nghiên
cứu trong luận văn là kết quả lao động của chính tác giả. Các số liệu và kết quả trình
bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình
nào khác.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được
cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2016

Tác giả luận văn

Dương Thị Thưởng

i


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp ngoài sự cố gắng của bản thân tôi đã nhận được
rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của thầy cô, bạn bè và người thân.
Trước tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm
Thiên Thành và thầy giáo TS. Nguyễn Văn Giang người đã định hướng nghiên cứu,
tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn tốt
nghiệp này.
Tôi xin được cám ơn chân thành các Anh, Chị trong bộ môn Công nghệ sinh học Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá
trình thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các Thầy, Cô trong Bộ môn Công
nghệ Vi sinh – Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam những
người đã trực tiếp giảng dạy, trang bị những kiến thức bổ ích trong suốt khoảng thời
gian tôi học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và biết ơn vô hạn, tôi xin gửi lời cảm ơn tới
ông, bà, bố, mẹ, anh chị em và bạn bè, những người luôn bên cạnh động viên giúp đỡ
tôi vượt qua những khó khăn trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2016

Tác giả luận văn

Dương Thị Thưởng

ii


MỤC LỤC
Lời cam đoan ..................................................................................................................... i
Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii
Mục lục ........................................................................................................................... iii
Danh mục chữ viết tắt ....................................................................................................... v
Danh mục bảng ................................................................................................................ vi
Danh mục hình ................................................................................................................ vii
Trích yếu luận văn ......................................................................................................... viii
Thesis abstract................................................................................................................... x
Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1
1.1.

Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 1

1.2.

Mục đích và yêu cầu ........................................................................................... 2

1.3.

Ý nghĩa của đề tài ............................................................................................... 2

Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 3
2.1.

Cây lúa và bệnh đạo ôn trên lúa ......................................................................... 3

2.1.1.

Nguồn gốc và phân loại ...................................................................................... 3

2.1.2.

Bệnh đạo ôn trên lúa ........................................................................................... 5

2.1.3.

Cơ sở di truyền tính kháng đạo ôn trên lúa......................................................... 9

2.2.

Chỉ thị ADN sử dụng trong chọn tạo giống lúa kháng đạo ôn ......................... 11

2.2.1.

Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) và SCAR
(Sequence Characterized Amplified Region) .................................................. 11

2.2.2.

Chỉ thị STS (Sequence Tagged Sites)............................................................... 12

2.2.3.

Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeates) ........................................................ 12

2.2.4.

Chỉ thị SNP (Single Nucleotide Polymorphism) .............................................. 13

2.2.5.

Chỉ thị CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) .......................... 14

2.3.

Các gen kháng đạo ôn và chỉ thị phân tử liên kết ............................................. 14

2.4.

Nghiên cứu lúa kháng đạo ôn trên thế giới ....................................................... 24

2.4.1.

Đa dạng di truyền nguồn gen kháng bệnh đạo ôn ............................................ 24

2.4.2.

Sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống lúa kháng bệnh đạo ôn ................... 25

2.4.3.

Chọn giống lúa kháng bệnh đạo ôn bằng QTL ................................................. 27

2.5.

Nghiên cứu lúa kháng đạo ôn ở Việt Nam ....................................................... 27

iii


2.5.1.

Đa dạng di truyền quần thể nấm đạo ôn ........................................................... 28

2.5.2.

Xác định gen kháng hiệu quả và quy tụ gen kháng vào các giống lúa ............. 29

2.5.3.

Nghiên cứu lai tạo trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn ..................... 30

Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ............................................................ 32
3.1.

Địa điểm nghiên cứu......................................................................................... 32

3.2.

Thời gian nghiên cứu ........................................................................................ 32

3.3.

Đối tượng/vật liệu nghiên cứu .......................................................................... 32

3.4.

Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 35

3.5.

Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 35

Phần 4. Kết quả và thảo luận ....................................................................................... 41
4.1.

Đánh giá đặc điểm nông sinh học ..................................................................... 41

4.1.1.

Thời gian sinh trưởng ....................................................................................... 41

4.1.2.

Khả năng đẻ nhánh, chiều cao cây ................................................................... 44

4.1.3.

Đặc điểm hình thái của các dòng/giống lúa thí nghiệm ................................... 46

4.1.4.

Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất ................................................... 49

4.2.

Kết quả lây nhiễm nhân tạo .............................................................................. 52

4.3.

Kết quả khảo sát nguồn gen kháng bệnh đạo ôn của các dong/giống lúa
nghiên cứu ........................................................................................................ 53

4.4.

So sánh kết quả PCR với kết quả lây nhiễm nhân tạo ...................................... 56

Phần 5. Kết luận và đề nghị ......................................................................................... 61
5.1.

Kết luận............................................................................................................. 61

5.2.

Đề nghị ............................................................................................................. 61

Tài liệu tham khảo .......................................................................................................... 62

Phụ lục .......................................................................................................................... 71

iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Nghĩa tiếng Việt

BC

Lai hồi giao

bp

basepair

BVTV

Bảo vệ Thực vật

CLT-CTP

Cây lương thực - Cây thực phẩm

cs

Cộng sự

ĐBSCL

Đồng bằng sông Cửu Long

ĐBSH

Đồng bằng sông Hồng

MAS

Chọn giống bằng ứng dụng chỉ thị phân tử

NN

Nông nghiệp

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Phân loại chi Oryza ........................................................................................ 4
Bảng 2.2. Gen kháng bệnh đạo ôn................................................................................ 15
Bảng 2.3. Chỉ thị ADN liên kết với gen kháng đạo ôn ................................................ 20
Bảng 3.1. Danh sách các dòng, giống lúa thí nghiệm .................................................. 33
Bảng 3.2. Trình tự mồi liên kết gen kháng bệnh đạo ôn .............................................. 35
Bảng 4.1. Thời gian sinh trưởng của các dòng/giống lúa nghiên cứu .......................... 42
Bảng 4.2. Khả năng đẻ nhánh, chiều cao cây các dòng/giống lúa thí nghiệm ............. 44
Bảng 4.3. Một số đặc điểm hình thái của các dòng/giống lúa thí nghiệm ................... 47
Bảng 4.4. Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất ............................................... 49
Bảng 4.5. So sánh kết quả xác định gen kháng bằng PCR và lây nhiễm nhân tạo ......... 56

Bảng 4.6. Các giống lúa có triển vọng ......................................................................... 60

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Đạo ôn gây hại trên lá, cổ lá, cỏ bông ........................................................... 6
Hình 2.2. Ruộng lúa bị bệnh đạo ôn hại nặng ............................................................... 6
Hình 2.3. Nấm sinh sản vô tính tạo cành bào tử ........................................................... 6
Hình 2.4. Bào tử nấm ..................................................................................................... 6
Hình 2.5. Quá trình xâm nhiễm gây bệnh của bào tử nấm đạo ôn................................. 7
Hình 4.2. Kết quả khảo sát chỉ thị RM527 liên kết gen kháng Piz5 trên 50
dòng/giống lúa nghiên cứu........................................................................... 53
Hình 4.3. Kết quả khảo sát chỉ thị RM7102 liên kết gen kháng Pita trên 50
dòng/giống lúa nghiên cứu........................................................................... 54
Hình 4.4. Kết quả khảo sát chỉ thị RM1233 liên kết gen kháng Pik-p trên 50
dòng/giống lúa nghiên cứu........................................................................... 55
Hình 4.5. Hình ảnh thể hiện tính kháng, nhiễm của một số giống lúa trong thí
nghiệm.......................................................................................................... 59

vii


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Tên tác giả: Dương Thị Thưởng
Tên Luận văn: “Khảo sát nguồn gen kháng bệnh đạo ôn trên một số giống lúa
bằng chỉ thị phân tử”.
Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01
Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực quan trọng trên thế giới, là nguồn cung

cấp lương thực cho hơn 50% dân số thế giới. Ở Việt Nam, lúa là cây trồng truyền thống
gắn bó lâu đời với người nông dân Việt Nam, vừa cung cấp nguồn lương thực chính,
vừa là nông sản xuất khẩu có kim ngạch lớn ở nước ta. Tuy nhiên, bệnh đạo ôn đã gây
tác hại nghiêm trọng ở một số nước như Nhật Bản, Ấn Độ, Philippin và Việt Nam. Mỗi
năm bệnh đạo ôn làm thế giới mất một lượng lúa đủ để nuôi sống hơn 60 triệu người. Ở
Việt Nam, bệnh đạo ôn xuất hiện ở cả ba miền Bắc, Trung và Nam. Năm 1992, trong
tổng số 5 triệu ha diện tích trồng lúa có tới 600.000 ha nhiễm bệnh đạo ôn, 1/4 trong số
diện tích này đã bị nhiễm bệnh trầm trọng. Năng suất lúa trên diện tích bị nhiễm đã
giảm từ 15-30%. Trong chiến lược phòng chống bệnh đạo ôn, việc tìm ra các gen kháng
nhằm tạo ra các giống lúa kháng bệnh đạo ôn vẫn được coi là biện pháp hiệu quả và bền
vững. Tuy nhiên chủng nấm đạo ôn rất đa dạng tại các vùng sinh thái khác nhau và dễ
phát sinh chủng mới, trong khi đó, mỗi gen kháng chỉ có khả năng chống được một số
chủng nhất định. Bởi vậy, luôn phải nỗ lực tìm ra gen kháng mới hoặc gen kháng trên
nguồn vật liệu mới để chống lại các chủng mới phát sinh.
Mục đích nghiên cứu
Dùng chỉ thị phân tử liên kết gen kháng đạo ôn để khảo sát sự có mặt của gen
kháng ở một số giống lúa vật liệu.
Phương pháp nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, thí nghiệm 1 được bố trí theo phương pháp quan sát vườn
dòng không nhắc lại của IRRI, diện tích ô 5m2. Đánh giá các chỉ tiêu nông sinh học. Thí
nghiệm 2: Đánh giá khả năng kháng nhiễm của các mẫu dòng/giống với nguồn nấm đạo
ôn. Thí nghiệm 3: tiến hành lấy mẫu, tách chiết ADN, chạy PCR với ba cặp mồi:
RM527, RM1233, RM7102 và điện di trên gel polyacrylamide để kiểm tra sự có mặt
của gen kháng trong các mẫu giống.

viii


Kết quả chính và kết luận
Kết quả đánh giá đặc điểm nông sinh học cho thấy: các mẫu giống có đặc điểm

nông sinh học rất đa dạng, một số mẫu giống có kiểu hình đẹp, năng suất khá, chất
lượng cao có thể sử dụng để làm vật liệu trong chọn tạo giống lúa chất lượng.
Trong 50 mẫu giống lúa lây nhiễm nhân tạo đạo ôn có 26 mẫu giống thể hiện tính
kháng tốt, 20 mẫu giống nhiễm nhẹ, 4 mẫu giống nhiễm nặng.
Kết quả kiểm tra gen kháng nhận thấy có 12 mẫu giống mang 2 gen kháng, 31
giống mang 1 gen kháng, 7 giống không có gen kháng nào.
Trong 13 mẫu giống có chứa 2 gen kháng có 5 mẫu giống thể hiện tính kháng
mạnh với chủng vi khuẩn nấm đạo ôn, 6 mẫu giống thể hiện tính kháng vừa (nhiễm
nhẹ), 2 mẫu giống nhiễm nặng.
Trong những mẫu giống thể hiện tính kháng tốt có những giống chứa 2 gen kháng,
có giống chứa 1 gen kháng hoặc không có gen kháng nào. Như vậy, có thể những giống
đó chứa gen kháng nào khác, cần xác định thêm những gen kháng khác để có kết luận
chính xác hơn về tính kháng.
Trong 13 mẫu giống có chứa 2 gen kháng có 11 mẫu giống thể hiện tính kháng
mạnh hoặc kháng vừa với chủng vi khuẩn nấm đạo ôn sử dụng lây nhiễm nhân tạo. Đây
là nguồn vật liệu tốt trong chọn tạo lúa kháng đạo ôn.

ix


THESIS ABSTRACT
Master candidate: Duong Thi Thuong
Thesis title: "Using molecular marker to screen blast resistance gene in rice germplasm".
Major: Biotechnology

Code: 60.42.02.01

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA).
Rice (Oryza sativa L.) is an important food crop in the world. It is also a source of
food for more than 50% of the world population. In Vietnam, the rice crop is a long

tradition of sticking with the farmers. Not only has it provided the main source of food
for Vietnamese, but it also can be exported with a large turnover for the country.
However, blast disease threats rice production. It caused serious damage in some
countries such as Japan, India, Philippines and Vietnam. Each year the yield loss by
blast in the world counted enough to feed more than 60 million people. In Vietnam, the
blast occurred in the whole country. In 1992, we planted a total of 5 million hectares of
rice. In which, 600,000 hectares had been infected by blast disease and 1/4 of this area
was severely infected. Rice yield in the infected area has decreased by 15-30%. One of
strategies to prevent effects of rice blast is finding resistance genes to create new rice
varieties. This is still considered to be effective method and sustainable. However, rice
blast fungus strains varied in different ecological zones and easy to generate new
strains. Moreover, a resistance gene has effective with only certain strain. Therefore,
breeders struggle to find new resistance genes or resistance genes from the new
resources to combat new arising strains.
Research Objectives:
Using molecular markers linked to blast resistance genes to survey the presence of
resistance genes in rice germplasm.
Methods
In this research, the first experiment was arranged in line based on IRRI without
replication with the area of 5 m2 for each line. Agronomic characteristics (growth
duration, plant high, number of tiller…) were evaluated. The second experiment: rice
varieties were inoculated with blast fungus and evaluated for resistance or susceptible.
The third experiment: three SSR markers RM527, RM1233 and RM7102 linked to
resistance genes Piz5, Pik-p, Pita, respectively, were applied to check the presence of
resistance genes by using DNA genome of rice varieties.

x


Main findings and conclusions

The results of assessment of agricultural characteristics showed that their
characteristics are very diverse. Some of them have good plant type, quite productive and
high quality. These can be used as material for breeding high quality rice.
In fifty varieties were inoculated with blast, twenty six varieties shown high
resistance, twenty varieties shown medium resistance and four varieties were susceptible.
The results of screening marker shown that there are twelve varieties bringing two
resistance genes, thirty one varieties carrying one resistance gene and seven varieties do
not have the resistance gene.
In thirteen varieties carrying two resistance genes, five varieties shown high
resistance with rice blast fungus strains, six varieties have medium resistance and two
varieties is infection.
The rice varieties gave highly resistance. In which, some varieties possess two
resistance genes, some varieties carry a single resistance gene and some do not have any
of checked genes. Thus, it is possible that these varieties may contain another resistant
gene. It is necessary to identify other resistance genes in order to have more accurate
conclusions for these varieties.
In thirteen varieties carrying two resistance genes, eleven varieties showed high or
medium resistance to rice blast fungus strain using in inoculation. This is a good resource
for breeding rice blast resistance variety.

xi


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực quan trọng trên thế giới, được trồng
phổ biến ở 112 nước trên thế giới. Lúa là nguồn cung cấp lương thực cho hơn
50% dân số thế giới và là lương thực chính cho phần lớn các quốc gia ở Châu Á,
một số nước ở Châu Phi và Mỹ Latinh (Chang, 2000). Ở Việt Nam, lúa là cây
trồng truyền thống gắn bó lâu đời với người nông dân Việt Nam, vừa cung cấp

nguồn lương thực chính, vừa là nông sản xuất khẩu có kim ngạch lớn ở nước ta
(Trần Văn Đạt, 2008). Năng suất và sản lượng lúa của nước ta không ngừng tăng
lên, năm 1990 năng suất lúa của nước ta đạt 31,8 tạ/ha; năm 2000: 42,4 tạ/ha;
năm 2010: 53 tạ/ha, năm 2014: 57,6 tạ/ha. Sản lượng lúa năm 1990 là 19,2 triệu
tấn; năm 2000: 32,5 triệu tấn; năm 2010: 39,9 triệu tấn và năm 2014: 44,9 triệu
tấn (Bui Ba Bong, 2010; Tổng cục Thống kê).
Tuy nhiên nhiều bệnh hại thường xuyên xuất hiện, gây tổn thất lớn về sản
lượng lúa như: bệnh đạo ôn (do nấm Pyricularia oryzae), bạc lá (do vi khuẩn
Xanthomonas oryzae pv. Oryzae), khô vằn (do nấm Zhizoctonia sonani). Trong
đó bệnh đạo ôn do nấm Pyricularia oryzae gây ra làm thiệt hại lớn về sản lượng
lúa gạo toàn cầu và là bệnh có ý nghĩa quan trọng nhất đối với nghề trồng lúa
trên toàn thế giới. Hiện nay, bệnh đạo ôn đã gây tác hại nghiêm trọng ở một số
nước như Nhật Bản, Ấn Độ, Philippines và Việt Nam (Valent and Chumley,
1991; Gheysen, 2004). Mỗi năm bệnh đạo ôn làm thế giới mất một lượng lúa đủ
để nuôi sống hơn 60 triệu người (Roxanne Khamsi, 2005). Ở Việt Nam, bệnh đạo
ôn xuất hiện ở cả ba miền Bắc, Trung và Nam. Tuy nhiên mức độ bệnh xảy ra ở
miền Bắc và miền Trung thường trầm trọng. Dịch bệnh xảy ra có thể gây thiệt hại
cho lúa vào khoảng 10-25%. Năm 1992, trong tổng số 5 triệu ha diện tích trồng
lúa có tới 600.000 ha nhiễm bệnh đạo ôn, 1/4 trong số diện tích này đã bị nhiễm
bệnh trầm trọng. Năng suất lúa trên diện tích bị nhiễm đã giảm từ 15-30% .
Trong chiến lược phòng chống bệnh đạo ôn, việc tìm ra các gen kháng
nhằm tạo ra các giống lúa kháng bệnh đạo ôn vẫn được coi là biện pháp hiệu quả
và bền vững. Khoảng hơn 100 Pi loci và 350 QTL liên quan đến tính kháng bệnh
đạo ôn ở cây lúa đã được phát hiện (Tanweer et al., 2015), tạo cơ sở cho việc
chọn tạo giống mang gen kháng bệnh. Tuy nhiên chủng nấm đạo ôn rất đa dạng

1


tại các vùng sinh thái khác nhau và dễ phát sinh chủng mới, trong khi đó, mỗi

gen kháng chỉ có khả năng chống được một số chủng nhất định. Bởi vậy, các nhà
khoa học luôn phải nỗ lực tìm ra gen kháng mới hoặc gen kháng trên nguồn vật
liệu mới để chống lại các chủng mới phát sinh.
Xuất phát từ những vấn đề thực tiễn nêu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện
đề tài: “Khảo sát nguồn gen kháng bệnh đạo ôn trên một số giống lúa bằng chỉ
thị phân tử”.
1.2. MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU
1.2.1. Mục đích
Khảo sát nguồn gen kháng trên một số giống lúa vật liệu nhằm phục vụ
công tác chọn giống lúa kháng bệnh đạo ôn.
1.2.2. Yêu cầu
- Đánh giá khả năng kháng đạo ôn của các dòng/giống lúa bằng lây nhiễm
nhân tạo.
- Xác định sự có mặt của các gen kháng đạo ôn bằng kỹ thuật nhân gen
(Polymerase Chain Reaction - PCR).
1.3. Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
 Kết quả đánh giá khả năng kháng bệnh đạo ôn của các dòng/giống lúa
bằng lây nhiễm nhân tạo cho phép xác định được các dòng/giống lúa có khả năng
kháng tốt dùng làm nguồn vật liệu khởi đầu cho chương trình chọn tạo giống lúa
kháng đạo ôn trong nước.
 Kết hợp chỉ thị phân tử trong đánh giá khả năng kháng bệnh đạo ôn ở lúa
giúp xác định chính xác hơn nguồn vật liệu khởi đầu trong chọn tạo lúa chất
lượng, năng suất cao có khả năng kháng đạo ôn.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
 Kết quả của đề tài đã góp phần bổ sung nguồn vật liệu khởi đầu là các
dòng/giống lúa có khả năng kháng đạo ôn, năng suất khá, chất lượng gạo tốt sử
dụng để lai cải tạo các giống lúa thuần đang trồng phổ biến ở Đồng bằng sông
Hồng, nhằm mục đích cải tạo chất lượng lúa gạo ở khu vực miền Bắc.
 Việc sử dụng chọn giống bằng chỉ thị phân tử (MAS) giúp tiết kiệm thời

gian, giảm chi phí chọn giống và đáng tin cậy hơn do không bị ảnh hưởng bởi
các yếu tố môi trường.
2


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. CÂY LÚA VÀ BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN LÚA
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại
Cây lúa trồng thuộc họ Poaceae, trước đây gọi là họ Hoà thảo (Gramineae),
họ phụ Pryzoideae, tộc Oryzae, chi Oryza, loài Oryza sativa và Oryza
glaberrima. Loài Oryza sativa là lúa trồng ở Châu Á và Oryza glaberrima là lúa
trồng ở Châu Phi. Năm 1753, Lineaeus là người đầu tiên đã mô tả và xếp loài lúa
sativa thuộc chi Oryza. Dựa vào mày hạt và dạng hạt tác giả đã phân chi Oryza thành
bốn nhóm là sativa, granulata, coarctala, rhynchoryza và chi Oryza gồm tất cả 19
loài (Trần Văn Đạt, 2005).
Morinaga là người đầu tiên đã sử dụng kỹ thuật phân tích genome để định
danh các loài lúa dại. Công trình nghiên cứu dựa trên cơ sở khoa học này đã giúp
phân tích các loài lúa được chính xác hơn (Trần Văn Đạt, 2005).
Hội nghị di truyền lúa Quốc tế tổ chức họp tại Viện nghiên cứu lúa Quốc tế,
Philippines năm 1967 đã khẳng định chi Oryza có 22 loài trong đó có 20 loài lúa
dại và hai loài lúa trồng (Chang and Vaughan, 1991).
Sau này, Vaughan phát hiện thêm một loài lúa dại mới ở Papua New Ginea
là loài Oryza rhizomatis, đưa số loài của chi Oryza lên 23 loài và chia thành bốn
nhóm genome. Danh sách các loài, số lượng nhiễm sắc thể, bộ gen của từng loài
được ghi ở Bảng 2.1 (Vaughan, 1994).
Ngày nay, các nhà phân loại học đều nhất trí là chi Oryza có 23 loài, trong
đó 21 loài hoang dại và hai loài lúa trồng là Oryza sativa và Oryza glaberrima
thuộc loại nhị bội 2n = 24 có bộ gen AA. Loài Oryza glaberrima phân bố chủ yếu
ở Tây và Trung Phi còn loài Oryza sativa được gieo trồng khắp thế giới và được
chia thành hai loài phụ là Indica và Japonica. Trong quá trình tiến hoá của cây

lúa, ngoài hai loài phụ Indica và Japonica còn có nhiều loại hình trung gian như
Javanica v.v... (Nguyễn Văn Hoan, 2006; Trần Văn Minh, 2004).
Tác giả Tang et al. (2004) so sánh bộ gen lục lạp của giống lúa 93 - 11 (đại
diện loài phụ Indica) và giống lúa Peiai'64S (giống lúa lai thuộc loài phụ Indica,
nhưng nguồn gốc mẹ thuộc loài phụ Japonica) cho thấy sự phân chia bộ gen lục
lạp của hai loài phụ Indica và Japonica xảy ra cách đây khoảng 86.000 - 200.000
năm trước.

3


Bảng 2.1. Phân loại chi Oryza
Nhóm/loài

Tên khác

Số nhiễm
sắc thể

Bộ gen

24

AA

24

AA

24

AA

24

AA

I. Nhóm O. sativa
1. O. sativa L
2. O. nivara Shama et Shastry
3. O. rufipogon Griff.

O. rufipogon
O.

perennis,

O. rufipogon

4. O. glaberrima Steud.
5. O. barthii A. Chev.

O. breviligulata

24

AA

6. O. longistaminata Chev. et Roehr

O. barthii

24

AA

24

AA

7. O. meridionalis Ng
II. Nhóm O. officinalis

O. latifolia

8. O. officinanis Wall ex Watt

O. minuta

24

CC

9. O. minuta Presl et Presl

O. officinanis

48

BBCC

10. O. rhizomatis Vaughan

24

CC

11. O. eichingeri Peter

24

CC

24,

BB,

48

BBCC

13. O. latifolia Desv

48

CCDD

14. O. alta Swallen

48

CCDD

15. O. grandiglumis (Doell) Prod

48

CCDD

16. O. australiensis Domin

24

EE

17. O. brachyantha Chev. et Roehr.

24

FF

18. O. schlechteri Pilger

48

Chưa rõ

19. O. ridleyi Hook. f.

48

Chưa rõ

20. O. longiglumis Jansen

48

Chưa rõ

24

Chưa rõ

24

Chưa rõ

12. O. punctata Kotschy ex. Steud.

O. schweinfurthia

III. Nhóm O. ridleyi

IV. Nhóm O. meyeriana
21. O. meyeriana (Zoll. et Mor. ex
Steud) Baill
22. O. granulata Nees et Am. ex Watt.

Nguồn: Vaughan (1994)

4


Tác giả Vitte et al. (2004) cũng cho rằng hai loài phụ Indica và Japonica
được phân hoá độc lập với nhau, cách đây khoảng 200.000 năm. Trong khi đó,
tác giả Jianxin phân tích ADN nhân tế bào và cho rằng lúa Indica và Japonica
được tách ra từ một tổ tiên chung, cách đây khoảng 440.000 năm (Jianxin and
Bennetzen, 2004).
Jason et al. (2006) nghiên cứu biến đổi trình tự ADN của ba vùng gen bằng
phương pháp địa lý - thực vật để khảo sát quá trình thuần hoá lúa trồng. Kết quả
cho thấy, cây lúa trồng đã được thuần hóa ít nhất là hai lần từ các quần thể khác
nhau của loài Oryza rufipogon và sản phẩm của hai lần biến đổi này đã tạo ra hai
loài phụ là Indica và Japonica.
Tác giả Zhu et al. (2007) trên cơ sở giải mã trình tự ADN của 10 gen ở nhân
tế bào của lúa cho rằng, quá trình thuần hoá liên quan chặt chẽ với quá trình giảm
đa dạng di truyền của các giống lúa dại. Đa dạng di truyền của lúa Japonica thấp
hơn 2 lần so với đa dạng di truyền của lúa Indica.
2.1.2. Bệnh đạo ôn trên lúa
Nấm gây bệnh đạo ôn trên cây lúa ở giai đoạn vô tính được đặt tên là P.
oryzae (syn. Pyricularia oryzae), ở giai đoạn hữu tính được đặt tên là
Magnaporthe grisea và gần đây dựa vào các nghiên cứu phân tử, được đặt tên là
M. oryzae (Hà Viết Cường, 2008). Ở luận văn này, chúng tôi sử dụng tên gọi
Pyricularia oryzae.
Bệnh đạo ôn do nấm Pyricularia oryzae gây ra, là một trong những bệnh
gây hại quan trọng nhất trên cây lúa. Bệnh đạo ôn được phát hiện tại Italia năm
1560, sau đó là ở Trung Quốc năm 1637, Nhật Bản năm 1760, Mỹ năm 1906 và
Ấn Độ năm 1913, … Ở nước ta, Vincens (người Pháp) đã phát hiện nguồn bệnh ở
Nam Bộ vào năm 1921. Năm 1951, Roger (người Pháp) cũng đã xác định sự xuất
hiện và gây hại của bệnh ở vùng Bắc Bộ (Vũ Triệu Mân và cs., 2007). Bệnh đạo
ôn đã được tìm thấy ở ít nhất 85 quốc gia và chưa có nơi nào báo cáo là tiêu diệt

được hoàn toàn mầm bệnh. Thiệt hại về năng suất do bệnh đạo ôn gây ra có thể lên
tới 75% hoặc cao hơn nữa nếu gặp điều kiện thuận lợi cho bệnh phát triển.
Triệu chứng:
Nấm có thể xâm nhiễm gây bệnh ở tất cả các bộ phận trên mặt đất gồm: lá,
đốt thân, cổ lá, cổ bông, cổ gié. Các nghiên cứu gần đây cho thấy mức độ mẫn
cảm của lá tỷ lệ thuận với mức độ mẫn cảm trên cổ bông (Hà Viết Cường, 2008).

5


Tính mẫn cảm của cây đối với nấm phụ thuộc nhiều vào yếu tố môi trường cũng
như các yếu tố liên quan đến phát triển của cây. Tính mẫn cảm thường giảm theo
tuổi cây và tuổi lá; tính mẫn cảm tăng mạnh khi bón thừa đạm. Trái lại bón Si
làm giảm tính mẫn cảm. Ngoài ra, đặc điểm vết bệnh thay đổi đáng kể theo mức
độ mẫn cảm.

Hình 2.1. Đạo ôn gây hại trên lá,

Hình 2.2. Ruộng lúa bị bệnh

cổ lá, cỏ bông

đạo ôn hại nặng

Tác nhân gây bệnh:
Nấm thuộc lớp nấm túi (Ascomycetes), tuy nhiên ngoài tự nhiên nấm chỉ
sinh sản vô tính tạo cành bào tử phân sinh và bào tử phân sinh không màu, 2
vách ngăn, hình quả lê (hoặc nụ sen) (Hà Viết Cường, 2008).

Hình 2.4. Bào tử nấm

Hình 2.3. Nấm sinh sản vô tính
tạo cành bào tử
Xâm nhiễm gây bệnh:

Nấm đạo ôn là nấm bán sinh dưỡng (hemibiotroph) với pha sinh dưỡng
biotroph ở giai đoạn sớm của quá trình xâm nhiễm.

6


Hình 2.5. Quá trình xâm nhiễm gây bệnh của bào tử nấm đạo ôn
Giai đoạn sớm của quá trình xâm nhiễm bao gồm pha tiền xâm nhập
(prepenneration): bào tử nấm tiếp xúc trên bề mặt lá, đỉnh bào tử nứt vỡ và tiết ra
một giọt chất nhầy gắn kết chặt bảo tử và bề mặt lá. Lớp chất nhày này chứa các
hợp chất cacbohydrat và glycoprotein (Hà Viết Cường, 2008).
Tiếp theo bào tử nấm nảy mầm tạo ống mầm, hình thành một tế bào ở đỉnh
ống mầm và phát triển thành vòi áp (appressorium). Vòi áp của nấm là một cấu
trúc dạng vòm, có vách dày, màu đậm do bị melanin hóa. Sự melanin hóa làm
vách vòi áp trở nên chắc chắn hơn. Bên trong vòi áp, nấm tích lũy nhiều glycerol
và do vậy áp lực trương của vòi áp nấm đạo ôn rất lớn, có thể tới 80 at (Hà Viết
Cường, 2008).
Tiếp theo quá trình tiền xâm nhập là xâm nhập của bào tử: Từ vòi áp sẽ
hình thành một sợi nấm nhỏ gọi là đế xâm nhập (infection peg) để xâm nhập trực
tiếp qua tầng cutin và vào bên trong tế bào biểu bì. Bên trong tế bào biểu bì, đỉnh
đế xâm nhập sẽ phình to tạo thành vòi hút. Nấm sẽ tiết các enzyme và các
effector qua màng vòi hút vào tế bào ký chủ để hấp thu dinh dưỡng, dần dần vách
tế bào ký chủ sụp đổ và nấm tiếp tục phát triển sang tế bào bên cạnh (Hà Viết
Cường, 2008).
Bệnh đạo ôn là một trong số các loại bệnh phổ biến và nguy hại nhất đối

với lúa, có hơn 85 quốc gia trồng lúa trên thế giới phát hiện dịch bệnh. Bệnh có
khả năng thích nghi cao với các điều kiện của môi trường, nơi có khí hậu ôn hòa,
độ ẩm cao, hay ở những vùng đất thấp và những vùng núi cao nhiệt đới. Bệnh có

7


thể làm cho cây lúa cháy rụi hoàn toàn nếu bị nhiễm bệnh sớm ở giai đoạn mạ.
Nếu nhiễm muộn ở giai đoạn trổ, bệnh làm thối đốt thân, thối cổ gié làm cây đổ
gãy, hạt lép hay làm giảm trọng lượng hạt. Theo báo cáo, năng suất lúa bị giảm
do đạo ôn gây ra có thể lên tới 80% ở vùng dịch (Awoderu and Esuruoso, 1974)
và ước tính, cứ 10% gié bị nhiễm bệnh thì năng suất thất thu 6% và tỷ lệ hạt kém
phẩm chất (gạo xay ra thường bị nát, tỷ lệ tấm cao, không đủ tiêu chuẩn xuất
khẩu) tăng 5% (Phạm Văn Kim, 2002). Với những tác hại gây ra, bệnh đạo ôn là
một trong những bệnh có sức tàn phá mạnh nhất trong các bệnh hại lúa, nó đe
dọa nghiêm trọng tới nguồn an ninh lương thực của thế giới (hàng năm mất
khoảng 157 triệu tấn). Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện ở vùng Nam Bộ rất
sớm, từ thời Pháp thuộc năm 1921 do Vincens (người Pháp). Hiện nay, bệnh đạo
ôn đã gây tác hại nghiêm trọng ở một số nước như Nhật Bản, Ấn Độ, Philippin
và Việt Nam (Gheysen, 2004).
Theo thống kê của Cục Bảo vệ thực vật, vụ đông Xuân 2003 - 2004 tổng
diện tích lúa bị nhiễm đạo ôn ở miền Bắc là 202.998 ha, trong đó diện tích bị
nhiễm đạo ôn lá là 178.147 ha (diện tích bị nặng là 4.348 ha), diện tích bị nhiễm
đạo ôn cổ bông là 24.752 ha. Hầu hết các giống phổ biến trong sản xuất đều bị
nhiễm đạo ôn với mức độ khác nhau: Khang dân 18, Q5, Bắc thơm, VN10,
DT10, DT11. v.v. Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là vùng trồng lúa lớn
nhất Việt Nam, khi bị nhiễm bệnh đạo ôn thiệt hại cho năng suất lúa ước tính
giảm tới 20%. Một vài năm trở lại đây, trước những biến đổi bất lợi của điều kiện
ngoại cảnh bệnh đạo ôn có nguy cơ bùng phát triên diện rộng và có thể phát triển
thành dịch nếu không được phát hiện kịp thời, hầu hết các giống chất lượng đang

trồng phổ biến (OM149, OMCS2000) đều bị nhiễm đạo ôn với các mức độ khác
nhau. Trong vụ đông Xuân 2005 - 2006 bệnh gây thiệt hại lớn ở hầu hết các địa
phương (An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ) trên giống lúa OM1490, thiệt hại cho
năng suất ước tính giảm từ 20 - 80%. Để phòng trừ bệnh đạo ôn, nông dân
thường sử dụng thuốc hóa học như một phương thức hữu hiệu, ở một số nơi khác
nông dân thường tiến hành phun nhiều lần và trộn nhiều loại thuốc với nhau, điều
này đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe của chính người nông dân đồng
thời môi trường xung quanh cũng bị ảnh hưởng.
Đến nay, bộ gen của nấm đạo ôn đã được giải trình tự đầy đủ do nhóm
nghiên cứu của Ralph (Đại học Bắc Carolina, Mỹ) tiến hành. Kết quả giải trình tự
gen đã xác định Pyricularia oryzae có hơn 11000 gen và tiết ra gần 800 protein để

8


xâm nhập và lây nhiễm sang lúa. Những thụ thể này nằm trên bào tử của nấm (bào
tử được phát tán nhờ gió). Theo nhóm nghiên cứu, nhận dạng các thụ thể này là
một bước tiến lớn trong quá trình chống bệnh đạo ôn (Ralph et al., 2005).
Những nghiên cứu miễn dịch học đã chỉ ra rằng lúa có hai hệ thống miễn
dịch bẩm sinh, có thể bảo vệ chúng trước sự tấn công của nhiều nguồn bệnh khác
nhau. Các receptor trên màng phát hiện ra tính chất không chuyên biệt của chủng
gây bệnh được gọi là PAMPs (pathogen associated molecular pattern). Hệ thống
miễn dịch đầu tiên được kích hoạt là PTI (PAMP - triggered immunity). Trong
phản ứng này nguồn bệnh có nhiều phân tử “effector” nhằm tránh né hệ thống
miễn dịch PTI. Nếu một nguồn bệnh tránh né được hệ thống bảo vệ thứ nhất, nó
phải vượt qua hệ thống bảo vệ thứ hai để gây bệnh cho lúa. Hệ thống tự bảo vệ
thứ hai được gọi là ETI (effector triggered immunity: miễn dịch nhờ kích hoạt
effector). ETI bị kích hoạt bởi các protein của gen kháng bệnh (R). Chúng hoạt
động như những receptor trong tế bào, ghi nhận trực tiếp hoặc gián tiếp các
effector của nguồn bệnh. Người ta gọi các effector của nguồn bệnh là protein

không chứa độc tính (Avr proteins), mã hoá cho các protein này là các gen Avr
tương ứng (gen không độc) (Chisholm et al., 2006).
Khả năng kháng bệnh đạo ôn của lúa do các gen kháng chịu trách nhiệm và
được đặt tên theo tên nấm Pyricularia (Pi). Hiện nay, các nhà khoa học trên thế
giới đã xác định được 96 gen kháng đạo ôn chính. Ngoài ra, việc giải mã xong
trình tự gen cây lúa năm 2002 đã mở ra nhiều triển vọng cho việc ứng dụng công
nghệ sinh học trong chọn tạo các giống lúa kháng bệnh đạo ôn (Yu et al., 2002).
2.1.3. Cơ sở di truyền tính kháng đạo ôn trên lúa
Đã có nhiều nghiên cứu về tính kháng, cơ chế kháng và di truyền tính
kháng bệnh đạo ôn ở cây lúa đối với các chủng nấm gây bệnh.
Năm 2000, Tsunematsu et al. đã giới thiệu bộ giống đơn gen trên nền di
truyền của giống LTH, bộ này gồm 31 dòng mang 24 gen kháng bệnh đạo ôn
khác nhau. Hai vấn đề quan trọng là sự đa dạng của quần thể nòi sinh lý bệnh
trong từng vùng và đơn gen nào còn hiệu lực trong quá trình đồng tiến hóa (coevolution) của sự tương tác. Như vậy, nghiên cứu chọn tạo các giống lúa kháng
bệnh đạo ôn, đặc biệt là các giống lúa kháng bền vững luôn được xem như là
biện pháp hữu hiệu, ít tốn kém và ít ảnh hưởng đến môi trường trước nguy cơ
dịch bệnh luôn có khả năng bùng phát, các nòi nấm bệnh mới luôn có khả năng
hình thành. Trên thực tế, có rất nhiều cách gọi tên cho tính kháng bệnh, nhưng
9


xét về bản chất nhiều cách gọi khác nhau là một. Dựa vào sự kiểm soát của gen
kháng đạo ôn đối với cây chủ, người ta chia tính kháng bệnh đạo ôn ở lúa thành
ba kiểu chính: kháng định lượng, hay kháng ngang đối với rất nhiều nòi nhưng
kháng không cao; kháng định tính, hay kháng dọc đối với một hoặc hai nòi và
kháng rất cao; kháng bền vững (durable resistance), không có qui định về bao
nhiêu gen điều khiển nhưng kháng trong thời gian rất dài, giống kháng được
trồng trên diện rộng (Johnson, 1983).
Tính kháng đa gen hay kháng ngang cũng được gọi là kháng bền vững, hay
kháng định lượng. Tính kháng bền vững là do sự kết hợp của nhiều gen kháng

tạo nên, còn được gọi là đặc tính kháng đa gen (Bonman and Mackill, 1988;
Johnson and Bonman, 1991). Đặc tính kháng đa gen được thể hiện rất rõ ở giống
lúa có tính kháng bền Moroberekan, giống này có hơn 10 gen kháng chính và
nhiều gen kháng phụ khác. Đặc tính kháng đa gen cũng được tìm thấy ở một số
giống lúa như: OS6, Lac23, BL123, Tẻ Tép, IR24...
Gen kháng đạo ôn ở lúa chia thành: gen kháng chính và gen kháng phụ.
Gen kháng chính biểu hiện thông qua hiệu quả chất lượng, di truyền đơn giản và
chuyên tính về nòi. Gen kháng phụ là những gen mà hoạt động của chúng mang
tính hỗ trợ đóng góp vào khả năng kháng của cây chủ, nhờ những gen này mà
phạm vi phát triển của bệnh được giới hạn. Những gen kháng phụ ngày càng
được quan tâm hơn khi những cá thể mang gen kháng chính có sự biểu hiện kém
bền về tính kháng. Những gen kháng phụ được quan tâm gồm các gen kháng
theo locus kiểm soát tính trạng số lượng QTLs của bệnh đạo ôn.
Tính kháng bệnh đạo ôn ở cây lúa được quy định bởi hệ thống các gen có
trong cây lúa. Hiện nay, các nhà khoa học đã phát hiện được khoảng 96 gen
kháng đạo ôn, trong đó đa số đều là gen trội, chỉ một số ít là gen lặn (pi-21, pi55)
(Jeung et al., 2007). Hiện nay có 7 gen đã được tách dòng: Pi-b, Pi-ta, Pi9, Pi36,
Pi2, Pid2, Piz-t (Liu et al., 2005). Một số gen kháng được xác định thuộc một
locus hoặc liên kết rất chặt với nhau. Ví dụ locus Pi-k của NST số 11 có 5 gene
kháng (Pik-s, Pik-p, Pik-m, Pik-h, Pik-g), Pi31(t) ở NST 12 liên kết với gen Pi6(t), Pi-157 và Pi-ta (Mackill and Bonman, 1992; McCouch and Doege, 1995;
Naqvi and Chattoo, 1996).
Hiện có khoảng 40 gen kháng chủ đối với nấm P.oryzae đã được xác đinh
trên lúa với khoảng gần 10 gen đã được chọn. Trong số các gen này, Pi-ta là gen
kháng được nghiên cứu nhiều nhất. Pi-ta là gen nằm ở vùng trung tâm của nhiễm

10


sắc thể số 12. Protein Pi-ta là một protein (928 aa) kháng R thuộc lớp CNL (CCNB-LRR) hoạt động tại tế bào chất. Vùng lặp giàuleucine (LRR) của Protein Pita tương tác trực tiếp với AvrPi-ta để tạo tính kháng. Các allen pi-ta (lặn) ở các
giống nhiễm bệnh mã hóa cho một protein chỉ khác 1 aa so với allen Pi-ta (trội)

(aa 918: ở alen Pi-ta là alanine, còn ở alen pi-ta là serine). Các gen kháng như
Pi-ta2 là gen allen của Pi-ta (Hà Viết Cường, 2008).
Tính kháng của gen Pi-ta được hình thành khi nó tương tác hiệu quả với
gen AVR-Pita của P.oryzae, gen AVR-Pita nằm trên NST số 3, mã hóa cho
metalloprotease, mang tín hiệu kích thích bài tiết, có đầu tận cùng N và các
chuỗi pro-protein. Khi nấm P.oryzae ký sinh trên cây ký chủ thì protein AVRPita sẽ đi vào trong tế bào sau đó cắt bỏ 47 aa ở đầu N thành AVR-Pita176. LRD
của protein Pi-ta liên kết đặc hiệu với AVR-Pita176, từ đó kích hoạt tính kháng
của cây.
2.2. CHỈ THỊ ADN SỬ DỤNG TRONG CHỌN TẠO GIỐNG LÚA KHÁNG
ĐẠO ÔN
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis phát minh ra
vào năm 1985. Bản chất của kỹ thuật PCR là sự tổng hợp nhân tạo ADN, tạo ra
số lượng lớn các đoạn ADN mới, với sự tham gia của các thành phần chính gồm:
ADN khuôn, dNTP, mồi (chỉ thị), enzyme polymerase tổng hợp ADN (Taq),
MgCl2 và đệm PCR. Kỹ thuật PCR hiện đã được hoàn thiện tới mức tự động hóa
trên cơ sở tìm ra enzyme tổng hợp ADN có khả năng chịu nhiệt cao từ vi khuẩn
Thermus aquaticus và việc chế tạo thành công máy chu kỳ nhiệt.
2.2.1. Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) và SCAR
(Sequence Characterized Amplified Region)
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) nghĩa là đa hình các đoạn
ADN được nhân bản ngẫu nhiên. RAPD là một kỹ thuật được xây dựng dựa trên
kỹ thuật PCR, với những mồi được thiết kế ngẫu nhiên có chiều dài khoảng 10
nucleotide (Williams et al., 1990). Khi phản ứng diễn ra, các mỗi RAPD gắn
ngẫu nhiên vào khuôn ADN ở bất kỳ vị trí nào mà có trình tự bổ sung với nó.
Phản ứng sau đó xảy ra với sự tham gia của enzyme Taq, dNTP và các thành
phần khác.
RAPD là một kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để xác định các chỉ thị liên kết
với gen kháng đạo ôn. Naweed et al. (1995) sử dụng kỹ thuật RAPD với 468 mồi
ngẫu nhiên đã xác định được 2 chỉ thị liên kết với gen Pi-10t ở giống lúa Tongil.
11

Sandhu et al. (2003) đã sử dụng 7 mồi RAPD để phân tích đa hình giữa
các dòng kháng và dòng nhiễm đạo ôn của 3 giống lúa trồng ở Braxin. Kết quả
đã chỉ ra sự khác biệt rõ ràng giữa các dòng kháng và dòng nhiễm, 9 băng ADN
khuếch đại bởi 7 mồi đã được xác định như các chỉ thị trội cho chọn các dòng
lúa kháng đạo ôn.
Do chỉ thị RAPD có hạn chế là độ nhạy bị phụ thuộc vào điều kiện của
phản ứng, đôi khi kết quả không lặp lại được, nên người ta đã khắc phục bằng
cách nhân dòng những băng RAPD đặc hiệu, xác định trình tự của chúng rồi thiết
kế những đoạn mồi dài khoảng 20bp từ cả hai đầu và gọi là chỉ thị SCAR
(Sequence - Characterized Amplified Region). Các chỉ thị SCAR ưu điểm hơn
các chỉ thị RAPD bởi chúng ít ảnh hưởng bởi các điều kiện phản ứng, mức độ lặp
lại cao, tiến hành nhanh và cho các sản phẩm đặc hiệu. Tác giả Sobir et al.
(2005) đã sử dụng 2 chỉ thị SCAR để xác định sự có mặt của 2 gen kháng Pi-b và
Pi-ta trên 28 kiểu gen ở lúa (gồm 22 dạng trồng trọt và 6 dạng hoang dại). kết
quả phân tích chỉ ra, 15 kiểu mang cả 2 gen trong đó có Oryza rufipogon, 6 kiểu
mang gen Pi-b trong đó có Oryza glumaepatula, Oryza officialis, Oryza latifolia
và Oryza malapuzhaensis.
2.2.2. Chỉ thị STS (Sequence Tagged Sites)
Loại chỉ thị này được đưa ra nhờ việc xác định trình tự 2 đầu mỗi đoạn của
mẫu dò dùng trong RFLP phát hiện được đa hình liên kết gen, chọn một đoạn đặc
hiệu để thiết kế mồi dùng cho phản ứng PCR. Đây là loại chỉ thị đồng trội có thể
phân biệt được gen ở trạng thái đồng hợp tự và dị hợp tử. Trình tự mồi STS phát
hiện sự biến đổi ở mức allen của gen trong phân tử ADN. Nhược điểm chỉ thị
STS là đòi hỏi phải biết trước được một vài trình tự ADN của gen. Ở lúa, sử
dụng các chỉ thị STS trong tìm kiếm các gen kiểm soát hoặc liên quan đến tính
kháng đạo ôn được tiến hành một cách dễ dàng. Qua phân tích di truyền trên
quần thể con lai F3 của cặp lai C101LAC (giống cho gene kháng Pi-1) và CO39
(giống dễ mắc bệnh đạo ôn) bằng kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length

Polymorphism), tác giả Wu et al. (2004) đã thiết kế được một cặp mồi STS cho
chọn lọc các dòng lúa mang gene kháng Pi-1. Tác giả Masahiro et al. (2008)
cũng đã phát triển được một chỉ thị STS sử dụng cho chọn các dòng lúa mang
gen kháng Pi-b trong 7 giống lúa nội địa của Hàn Quốc.
2.2.3. Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeates)
SSR là chỉ thị nghiên cứu đa hình những đoạn ADN lặp lại đơn giản, đơn vị

12


lặp từ 1 – 6 nucleotide. Bản chất đa hình của SSR được sinh ra do sự nhân bội từ
ADN tổng số của hệ gen nhờ sử dụng 2 đoạn mồi chặn biên 2 đầu với trình tự
của vùng lặp lại. Giá trị của SSR là ở chỗ nó sinh ra đa hình từ rất nhiều vùng
tương ứng, bao phủ rộng khắp hệ gen và phân biệt được trạng thái alen khác nhau
của gen (chỉ thị đồng trội), có thể phân biệt được đồng hợp tử và dị hợp tử, dễ
dàng phát hiện bằng PCR. Đối với các nghiên cứu về bệnh lúa, SSR là một trong
những kỹ thuật di truyền được xem là rất thích hợp trong lập bản đồ liên kết di
truyền, phân tích đa dạng và trong các chương trình chọn giống kháng đạo ôn.
Tác giả Fjellstrom et al. (2004) đã phân tích trình tự genome gần locus Pi-z của
dạng lúa Nipponbare, đã phát hiện một lượng lớn các đoạn SSR có thể sử dụng
làm chỉ thị. Trong đó ba chỉ thị SSR gồm: AP5659-1, AP5659-3 và AP5659-5
liên kết rất chặt với locus Pi-z đã được phát triển để chọn giống lúa mang gene
kháng Pi-z.
2.2.4. Chỉ thị SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
Những thay đổi một nucleotide trong trình tự genome của các cá thể trong
quần thể được gọi là đa hình nucleotide đơn (SNP). Ở thực vật, SNP đang được
thay thế cho SSR như chỉ thị cho các ứng dụng trong di truyền và chọn giống.
SNP có số lượng lớn, ổn định, hiệu quả, cho phép tự động hóa và ngày càng kinh
tế hơn (Duran et al., 2009; Edwards and Batley, 2010). Hơn nữa, SNP xảy ra cả ở
các vùng mã và không mã của DNA nhân và lục lạp. Nguồn SNP hiện đang được

phát triển và thông tin rộng rãi cho nhiều ứng dụng ở lúa. Các nguồn này bao
gồm cơ sở dữ liệu SNP, phương tiện để xác định các SNP mang nhiều thông tin
cho các mục đích ứng dụng và bộ SNP cho đánh giá được thiết kế theo đặt hàng
phục vụ mục đích chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử.
Có rất nhiều phương pháp để phát hiện SNP bao gồm các phương pháp lai
(lai allele đặc biệt, SNP microarray), các phương pháp sử dụng các emzyme
(RFLP, PCR, phương pháp kéo dài mồi, sử dụng 5’- nuclease v.v.), các phương
pháp dựa trên tính chất vật lý của DNA đối với các sản phẩm PCR (SSCP, điện
di gradient nhiệt độ, sắc ký lỏng cao áp biến tính v.v.) và phương pháp giải trình tự.
SNP được sử dụng trong lập bản đồ di truyền (Raman et al., 2014; Wu et al., 2014),
trong nghiên cứu đa dạng di truyền (Kaur et al., 2014; Frascaroli et al., 2013), trong
nhận biết giống và trong chọn giống (Ha et al., 2007).

13