QUY TRÌNH KIỂM TRA TỔNG số VI SINH vật HIẾU KHÍ

Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C
BÀI 1:QUY TRÌNH KIỂM TRA TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ
1.Định nghĩa:
Vi sinh vật hiếu khí là vi sinh vật tăng trưởng và hình thành trong điều
kiện có oxy phân tử
2.Ý nghĩa của việc kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí:
Tổng số vi sinh vật hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ
sinh của thực phẩm,đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật,nguy cơ hư
hỏng ,thời hạn bảo quản của sản phẩm,mức độ vệ sinh trong quá trình chế
biến và bảo quản thực phẩm
Sự tăng trưởng vi sinh vật trong thực phẩm dẫn đến biến đổi chất
lượng : 10
6
tế bào/g(ml) là ranh giới để phân biệt thực phẩm có dấu hiệu hư
hỏng hay không.Một vài trường hợp vsv=10
6
tế bào/g(ml) chưa có dấu hiệu
hư hỏng rõ ràng về mặt hóa học.Đặc biệt ở sữa khi có 10
5
tế bào/g(ml) sữa bị
chua: 10
6
-10
7
tế bào/g(ml) sữa có mùi hôi;10
8
tế bào/g(ml) tất cả thực phẩm
có mùi hôi không chấp nhận được;10
9
-10
10

tế bào/g(ml) thực phẩm thay đổi
cấu trúc
3.Quy trình kiểm tra:
Trang 1
Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C

1ml(10
-1
)+ 9ml nước

1ml(10
-1
)+ 9ml nước
nước vô trùng nước vô trùng

Stomacher .10gr thực phẩm 10
-2
10
-3
+ 90ml NaCl 0.85%
(10
-1
)
Bước 1: đồng nhất mẫu
Cho 10 g thực phẩm vào 90 ml NaCl 0.85% vô trùng(hoặc H
2
0 vô
trùng )vào bao PE vô trùng.Tiến hành đồng nhất bằng máy stomacher 30”
thu được nồng độ 10
-1

Bước 2 : pha loãng mẫu
Chuẩn bị các ống nghiệm và pipet vô trùng.Dùng pipet 10ml vô trùng
lấy 9 ml NaCl vô trùng vào các ống nghiệm .Dùng micropipet 1ml vô trùng
lấy 1ml từ nồng độ 10
-1
đưa vào ống nghiệm thứ nhất . Tiến hành rung lắc
ống nghiệm bằng máy rung ống nghiệm votex, thu được nồng độ 10
-2
.Làm
tương tự với các nồng độ kế tiếp
Lưu ý khi pha loãng mẫu:
Trang 2
Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C
-Nồng độ pha loãng phụ thuộc vào tình trạng vệ sinh của thực
phẩm,thời gian bảo quản, điều kiện bảo quản,kinh nghiệm người kiểm
nghiệm….
-Tiến hành thao tác bên ngọn lửa đèn cồn.Các ống nghiệm,pipet phải
vô trùng.Sử dụng 1 micropipet 1ml/ 1 nồng độ pha loãng mẫu để tránh hiện
tượng sai số
-Mỗi lần lấy mẫu phải lắc đều
Bước 3: nuôi cấy dịch mẫu
Nuôi cấy ít nhất ở 3 nồng độ pha loãng mẫu liên tiếp
Dùng micropipet 1ml vô trùng lấy 1ml dịch mẫu cho vào đĩa,ít nhất 2
đĩa/nồng độ
Chuẩn bị môi trường đã tiệt trùng,để nguội 45
0
C,đổ môi trường vào
các đĩa đã chứa 1ml dịch mẫu .Xoay nhẹ đĩa theo vòng tròn nhằm trộn đều
dịch mẫu với môi trường để thu được những khuẩn lạc tách rời.Khi môi
trường đông lại,lật ngược đĩa,ủ trong trong tủ ổn nhiệt Memmert

Nếu muốn kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu khí,dùng môi trường P.C.A
hoặc N.A
Nếu muốn kiểm tra tổng số men, mốc dùng môi trương P.D.A hoặc
Sabouraund
Thời gian ủ vi khuẩn hiếu khí 24-48h/30-37
0
C.Thời gian ủ men,mốc
72h/30-37
0
C
Bước 4: đếm số khuẩn lạc /đĩa/các nồng độ(25-250 khuẩn lạc/đĩa)
Kết quả thí nghiệm
Nồng độ
10
-1
10
-2
10
-3
Đĩa 1 Đĩa 2 Đĩa 1 Đĩa 2 Đĩa 1 Đĩa 2
Số khuẩn lạc 48 130 113 125 105 120
Bước 5: tính kết quả theo công thức
Trang 3
Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C
n = c/(n1+0.1n2)*d
n : tổng số tế bào / ml (g) mẫu thực phẩm(cfu/g(ml))
c : tổng số khuẩn lạc đếm được
n1 : số đĩa đếm được ở nồng độ thư nhất
n2 : số đĩa đếm được ở nồng độ thư hai
d : nồng độ pha loãng thứ nhất được đếm

=>n=
)2.1,02(
100).120105125113(
+
+++
=21045
≈
21000 cfu/g(ml)
4.Môi trường sử dụng
4.1.Môi trường Nutrient Agar
Peptone :5.0g
Meat extract :3.0g
Agar :12.0g
Nước cất :1000ml
pH sau thanh trùng : 7.0
±
0.2
Hấp thanh trùng ở 121
0
C/15 phút
4.2.Môi trường Plate Count agar
Peptone :5.0g
Meat extract :2.5g
D(+) glucose :1.0g
Agar :14.0g
Nước cất vừa đủ :1000ml
pH sau thanh trùng : 7.0
±
0.2
Hấp thanh trùng ở 121

0
C/15 phút
4.3.Môi trường Sabouraund
Peptone :20g
Glucose :40g
Trang 4
Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C
Agar :20g
Nước :1000ml
Hấp thanh trùng ở 121
0
C/15 phút
BÀI 2: KIỂM TRA TỔNG SỐ COLIFORM
1.Những kiến thức chung về COLIFORM
Coliform là nhóm trực khuẩn gram- , không bào tử , hiếu khí hoặc kị
khí tùy ý, có khả năng lên men đường lactose, sinh hơi ở 37
o
C /24 – 48h.
Coliform và Feacal coliform (coliform phân) là nhóm vi sinh vật dùng
để chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh trong thực
phẩm. Nhóm coliform gồm những vi sinh vật hiếu khí và kị khí tùy ý, gram -
, không bào tử , hình que, lên men đường lactose và sinh hơi trong môi
trường lỏng, dựa vào nhiệt dộ tăng trưởng, nhóm này được chia thành 2
nhóm nhỏ là coliform và coliform phân có nguồn gốc từ phân các loài động
vật. Trên thực tế kiểm nghiệm coliform phân được quan tâm nhiều hơn
coliform. Coliform phân có nguồn gốc từ ruột người và các động vật máu
nóng bao gồm các giống escherichia, kebsiella, enterobater. Khi coliform
phân hiện diện ở một số lượng lớn trong mẫu thì mẫu có khả năng chứa các
vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong phân.Chỉ tiêu tổng coliform không thích
hợp để làm chỉ tiêu chỉ thị cho việc nhiễm bẩn nguồn nước bởi phân. Tuy

nhiên việc xác định số lượng Feacal coliform có thể sai lệch do có một số vi
sinh vật (không có nguồn gốc từ phân) có thể phát triển ở nhiệt độ 44
o
C. Do
đó số lượng E. coli được coi là một chỉ tiêu thích hợp nhất cho việc quản lý
nguồn nước.
Trong các thành viên nhóm coliform phân thì E.coli là loài được quan
tâm nhiều về vệ sinh an toàn thực phẩm.
Loài vi sinh vật này phân bố ở mọi nơi, có trong ruột người và các
động vật máu nóng.
Trang 5
Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C
*một số hình ảnh về coliform:
Fecal Coliform
375 x 294
Chromocult® Coliform Agar ES
297 x 300
2.Ý nghĩa của việc kiểm tra chỉ tiêu
Trang 6
Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C
Coliform được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị. Số lượng hiện diện
của chúng trong thực phẩm, nước được dùng để chỉ thị cho khả năng hiện
diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. Số lượng coliforms cao thì khả năng
hiện diện của vi sinh vật gây bệnh khác cao.
Colifrorm chịu nhiệt( coliform phân):
• Là thành phần trong hệ vi sinh vật đường ruột ở người và các
động vật máu nóng.
• Được xem là vi sinh vật chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình
chế biến, bảo quản , vận chuyển thực phẩm, nước uống cũng như chỉ
thị sự ô nhiễm phân trong môi trường.

• Lên men đường lactose trong môi trường E.C ở 44.5
o
C.
• Có khả năng sinh indol 24h/44.5
o
C.
• Kết quả sinh hóa nghiệm pháp imvic là + + - -
3.Quy trình kiểm tra
Phương pháp MPN :
Nguyên tắc:
Mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân , 2 nồng độ kế tiếp nhau
khác nhau 10 lần. Mẫu được ủ trong môi trường thích hợp có ống durham.
Mỗi nồng độ pha loãng được lặp lại 3 ống. Theo dõi sự sinh hơi trong từng
ống nghiệm. Xác định ống dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào
bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g
hoặc 1ml mẫu ban đầu
Sơ đồ quy trình kiểm tra :
Trang 7
Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C
1ml(10
-1
)+ 9ml nước 1ml(10
-2
)+ 9ml
nước vô trùng nước vô trùng



Stomacher
10gr thực phẩm 10

-2
10
-3
+ 90ml NaCl 0.85%( 10
-1
)

hình 1.1
Bước 1:
10gr thực phẩm + 90ml NaCl 0.85% hoặc là nước vô trùng, stomacher
thu được nồng độ 10
-1
. mục đích đồng nhất là để phân bố đều vi sinh vật.
Trang 8
Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C
Bước 2:
Pha loãng mẫu để giảm số lượng vi sinh vật có trong mẫu ban dầu.
Lấy 1ml mẫu ở nồng độ 10
-1
cho vào ống nghiệm thứ nhất, sau đó cho 9ml
nước vô trùng. Ta được ống nghiệm có nồng độ 10
-2
. Sau đó lấy 1ml mẫu ở
nồng 10
-2
cho vào ống nghiệm thứ hai + 9ml nước vô trùng thu được ống
nghiệm có nồng độ 10
-3
. tương tự như trên ta thu được các ống nghiệm có
nồng độ 10

-4
, 10
-5
…..
Bước 3:
Nuôi cấy dịch mẫu trong môi trường Laury Tryptose (LT) ở 3 nồng độ
liên tiếp(10
-1
,10
-2
,10
-3
) như sau : Mỗi nồng độ lấy 3 ống nghiệm. Cho vào
mỗi ống nghiệm 1 ống durham, cho môi trường LT vào 9 ống nghiệm sao
cho ngập ống durham. Ghi 3 nồng độ liên tiếp bên ngoài ống nghiệm(mỗi
nồng độ 3 ống nghiệm). Tiếp đến cho 1ml dung dịch mẫu ở nồng độ 10
-1
vào 3 ống nghiệm có ghi nồng độ 10
-1
(chứa môi trường LT),tương tự cho các
ống nghiệm ở những nồng độ tiếp theo. (hình 1.1) ủ ở 37
o
C/24h
Những lưu ý khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường Laury
Trytose (LT):
-Tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn.
- Nhớ lắc mẫu trước khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường
Laury Trytose.
- Không lắc những ống có ống durham
Bước 4:

Đọc kết quả các ống Laury Tryptose . Có 3 trường hợp xảy ra:
+ ống durham không thay đổi
+ ống durham nổi lên trên
+ ống durham sinh hơi.
Trang 9
Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C
Đọc kết quả các ống LT dương tính, sau đó cấy chuyền các ống LT
dương tính này vào các ống môi trường BGBL 2% bằng cách lấy que cấy
vòng nhúng vào môi trường LT dương tính ở trên,rồi cho vào ống có môi
trường BGBL. Ghi nồng độ trên sản phẩm. Ủ 37
o
C /24h.
Ống LT + : môi trường đục và ống durham ( ống chuông) nổi hoặc có
bọt khí trong ống chuông (thể tích bọt khí trong ống chuông =1/10 thể tích
ống chuông).
Ống LT - : không có hiện tượng gì xảy ra
Bước 5:
Đọc kết quả ống BGBL dương tính. Lập tỷ lệ các ống BGBL dương
tính ở 3 nồng độ liên tiếp. Tra bảng Mac Crady tìm số MPN tương ứng
+ ống BGBL dương tính: môi trường đục và ống durham ( ống chuông)
nổi hoặc có bọt khí trong ống chuông( thể tích bọt khí =1/10 thể tích ống
chuông).
+ ống BGBL âm tính: không có hiện tượng gì xảy ra.
Bước 6:
Tính kết quả:
Tổng số coliform (cfu/g hoặc cfu/ml)= số MPN
×
10
n
n là số nguyên dương của nồng độ pha loãng đầu tiên được nuôi cấy.

Bước 7:
Từ kết quả tính được, so sánh với tiêu chuẩn về an toàn vệ sinh thực
phẩm.
4. Môi trường sử dụng:
Môi trường BGBL 2% : là môi trường dùng để phát hiện và đếm
coliforms, coliforms phân, E.coli trong sữa, thực phẩm, nước.
Nguyên tắc:
Trang 10
Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C
Mật bò ( bile) và brilliant green ức chế hầu hết các vi khuẩn gram
+
và
vi khuẩn gram
–
không phải coliform. Brilliant green có nồng độ đặc hiệu
nhằm ngăn vi khuẩn kị khí lên men lactose sinh trưởng ở 44
0
C , Tránh được
hiện tượng dương giả, lúc này coliform phát triển làm đục môi trường và
sinh khí trong ống durham do lên men lactose.
5.Các thiết bị ,dụng cụ sử cho thí nghiệm
Bình erlen, đèn cồn, que cấy vòng, ống nghiệm ,nồi autoclave, tủ sấy,
ống durham , micropipet, mẫu là tương ớt.
6.Kết quả thí nghiệm

_ _ _
10
-1
+ + _

10
-2

Trang 11
Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C
_ _ _
10
-3
Tỷ lệ của BGBL dương tính ở 3 nồng độ (10
-1
:10
-2
:10
-3
) = (0,2,0)
Tra bảng Mac Crady ta được số MPN =6.2N/g
∑
coliform
= 6.2
×
10
1
=62 (cfu/ml)
BÀI 3: KIỂM TRA TỔNG SỐ E.COLI
Escherichia coli là dạng coliform có nguồn gốc từ phân, phát triển
được ở 44ºC, sinh indol (phản ứng ind+), sinh acid (phản ứng MR+),
không sinh aceton (phản ứng V.P-) và không sử dụng citrate làm nguồn
cacbon (phản ứng cit-).Là trực khuẩn gram-, có khả năng gây bệnh tiêu
chảy và sinh nội độc tố.Được coi là vi sinh vật chỉ thị cho sự nhiễm phân
và chất lượng vệ sinh thực phẩm.

Các chủng E.coli có khả năng gây bệnh ở người :
- Các chủng truyền thống gây tiêu chảy ở trẻ sơ sinh và trẻ em.
- Các chủng yếm khí không bắt buộc gây tiêu chảy không thường xuyên
có quan hệ gần gũi với hệ vi sinh vật bình thường ở đường ruột.
- Các chủng sinh độc tố bền hoặc không bền với nhiệt hoặc cả hai.
- Các chủng gây lây nhiễm đường ruột.
1.Mục đích thí nghiệm: Xác định E.coli trong mẫu thực phẩm.
Ở đây, nhóm tiến hành kiểm tra tổng số E.coli trên mẫu tương ớt.
2. Nguyên tắc: mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân, hai nồng độ
kế tiếp nhau khác nhau 10 lần. Mẫu được ủ trong môi trường thích hợp có
ống durham. Mỗi nồng độ pha loãng được lặp lại 3-5 ống. Theo dõi sự sinh
hơi trong từng ống nghiệm. Xác định các ống dương tính ở mỗi nồng độ pha
Trang 12