Báo cáo thực hành môn hoá sinh

Báo cáo thực hành hoá sinh

nhóm 2

MỤC LỤC
BÀI
1
2
3
4
5
6
7

NỘI DUNG
CÁC KỸ THUẬT VÀ KỸ NĂNG CƠ BẢN TRONG
PHÒNG THÍ NGHIỆM SINH HÓA
ĐỊNH TÍNH PROTEIN VÀ ACI AMIN
HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYM
LIPID, ENZYM DỊCH VỊ VÀ DỊCH TỤY
XÉT NGHIỆM GLUCOSE, CHOLESTEROL VÀ
UREA MÁU
XÉT NGHIỆM PROTEIN VÀ BILIRUBINE TRONG
MÁU
XÉT NGHIỆM HÓA SINH NƯỚC TIỂU

0

TRANG
2
12

19
23
26
29
31


Báo cáo thực hành hoá sinh

nhóm 2

BÀI 1
CÁC KỸ THUẬT VÀ KỸ NĂNG CƠ BẢN
TRONG PHÒNG THỰC TẬP SINH HÓA
Mục tiêu học tập: Sau khi học xong bài này sinh viên phải:
1. Trình bày được 8 nội qui trong phòng thí nghiệm sinh hóa
2. Trình bày được các nguyên tắc cấp cứu cơ bản trong phòng thí nghiệm
3. Sử dụng thành thạo một số dụng cụ cơ bản trong phòng xét nghiệm sinh hóa
4. Lấy và bảo quản được mẫu bệnh phẩm đúng quy định
5. Hiểu nguyên tắc của phương pháp đo quang để áp dụng trong việc định lượng chất
1. NỘI QUI PHÒNG THỰC TẬP SINH HÓA
- Sinh viên (SV) phải đến đúng giờ, vắng mặt phải có giấy xin phép. SV đến trễ quá
10 phút không được vào phòng thí nghiệm (PTN).
- SV không được tự ý đổi nhóm thực tập
- Trước khi vào PTN, SV phải đọc kỹ lý thuyết và thực hành cho buổi thực tập
- Trong khi thực tập SV phải:
 Mặc áo blouse có đeo bảng tên.
 Giữ gìn trật tự.
 Kiểm tra dụng cụ (thiếu, bể), báo cho cán bộ kỹ thuật trong 15 phút đầu.
 Sử dụng dụng cụ của đúng nhóm mình.

 Không rời PTN trong lúc thực tập, không ra về trước giờ quy định.
 Thực tập xong, SV rửa sạch sẽ dụng cụ, ký trả và dọn vệ sinh nơi thực tập.
 Nếu dụng cụ bị mất mát hay hư bể, nhóm thực tập chịu trách nhiệm làm tờ tự
kiểm (xử lý sẽ tùy trường hợp cụ thể).
 Mỗi sinh viên thực tập làm bài tường trình kết quả học tập và nộp lại cuối
buổi.
 Kết quả kỳ thi thực tập được tính trên: điểm chuyên cần, thao tác thực tập, kết
quả bài tường tình thực tập và điểm kiểm tra cuối kỳ thực tập.
 Không tự ý khởi động các thiết bị, máy móc trong PTN.
 Chú ý: Để đảm bảo an toàn cần nhớ:
1


Báo cáo thực hành hoá sinh

nhóm 2

- Không được đổ nước vào acid đậm đặc
- Không được hút hóa chất bằng miệng.
- Không được tự sử dụng thiết bi, máy móc và hóa chất khi chưa được phép của cán
bộ phụ trách.
2. CÁC KỸ THUẬT CẤP CỨU CƠ BẢN TRONG PTN SINH HÓA
Áp dụng tạm thời khi chuyển bệnh nhân đến bệnh viện hoặc cho các trường hợp nhẹ
2.1. Phỏng ở da
-

Phỏng da vật nóng
- Phỏng nhẹ: Dùng gạc tẩm dung dịch acid piric bão hòa đắp lên.
- Phỏng nặng: Đắp nhẹ gạc tẩm dung dịch acid piric lên vết phỏng, sau đó đưa đến
bệnh viện. Tránh băng chặt và tránh dùng vaselin hay thuốc mỡ.

-

Phỏng do hóa chất
Trước tiên là làm trôi hóa chất khỏi da bằng cách ngâm vết phỏng vào trong chậu

nước lớn hoặc để dưới vòi nước chảy nhẹ. Sau đó dùng hóa chất trung hòa.
- Phỏng do acid: đắp vải mùng tẩm dung dịch Natri bicarbonate 8%.
- Phỏng do kiềm: đắp vải mùng tẩm dung dịch acid piric 3%.
 Phỏng ở mắt
Acid hay Brom: Tắm mắt tức khắc trong ly nước đầy hoặc 2 bàn tay



chụm lại vốc nước. Sau đó tắm mắt trong dung dịch Natri bicarbonate
1%.
Chất kiềm vào mắt: Tắm mắt trong nước như trên, xong tắm tiếp trong



dung dịch acid boric 1%.
 Ngộ độc




Chất độc vào miệng:
-

Acid: súc miệng nhiều lần bằng dung dịch Natri bicarbonate 1%.

-

Kiềm: súc miệng nhiều lần bằng dung dịch acid boric 1%.

-

Các hóa chất khác: súc miệng nhiều lần bằng nước lạnh.

Nhiễm hơi độc:
-

Mang nạn nhân để nơi thoáng khí. Cho uống 1 ly café đen hay 1
muỗng súp siro cafein.

-

Hô hấp nhân tạo (nếu cần) trong lúc chuyển đến bệnh viện.

 Điện giật
2


Báo cáo thực hành hoá sinh

-

nhóm 2

Trước hết ngắt cầu dao điện ở bất cứ nơi nào có cầu dao điện, nới rộng

quần áo nạn nhân khi đem ra nơi thoáng.

-

Hô hấp nhân tạo khi chuyển đến bệnh viện ( trường hợp nặng)

 Hỏa hoạn
-

Ngọn lửa nhỏ: dập tắt bằng khăn, vải bố ướt hay cát.
Lửa bắt cháy quần áo: lăn vài vòng dưới đất sẽ dập tắt ngon lửa trong
khi các bạn lấy vải bố trùm lên chỗ cháy và ép sát cho đến khi tắt lửa.

-

Tránh việc chạy hoảng loạn.

Tóm lại: khi bị ngộ độc, phỏng … SV nên báo với nhân viên phụ trách PTN để được
chăm sóc kịp thời.
3. CÁCH SỬ DỤNG MỘT SỐ DỤNG CỤ THƯỜNG DÙNG
3.1. Ống nghiệm
– Thường là ống hình trụ, làm bằng thủy tinh, thường được đặt trong giá để.
– Ống nghiệm thường được dùng làm phản ứng (nên phân biệt với ống ly tâm).
– Khi đun ống trên ngọn lửa đèn cồn cần chú ý:


Ống nghiệm chỉ được chứa 1/3 ống nghiệm.



Ống nghiệm được kẹp bằng gỗ hay kẹp kim loại và cầm nghiêng 1 góc 45 0.
Luôn lắc nhẹ ống nghiệm khi đun.



Miệng ống phải quay vào chỗ không có người (tránh bắn, phỏng người
khác).



Không đun trực tiếp ở đáy ống nghiệm mà đun ở nửa phần trên.

3.2. Cốc có mỏ (Becher)
- Cốc có mỏ dùng để đựng dung dịch trong PTN hay để đun, khi đun phải lót lưới
cách nhiệt ở phía dưới, đun xong không để trực tiếp lên vật lạnh (vỡ).
- Nhiều hình dạng và kích thước (5 ml - 5 lít) khác nhau, chia vạch hoặc không.
3.3. Bình cầu (Ballon)
- Có nhiều loại và dung tích khác nhau, nhưng đều làm bằng thủy tinh chịu nhiệt.
- Đáy có thể tròn hay đáy bằng. Loại đáy tròn thường được dùng đun hoặc lắp vào
các hệ thống chưng cất, đáy bằng dùng chiết tách các chất rắn ra khỏi chất lỏng.
- Loại bình có vạch để chỉ thể tích chính xác mà dung dịch chiếm được gọi là bình
định mức. Bình định mức có nhiều thể tích khác nhau: 25ml, 50ml, 100ml..bình
định mức được dùng để pha nồng độ theo thể tích của dung dịch.
3


Báo cáo thực hành hoá sinh

nhóm 2

3.4. Ống đong
- Dùng để đong một lượng dịch gần đúng. Có dung tích từ 5ml đến 2 lít.
- Thường được làm bằng thủy tinh hay polythylen.
3.5. Ống hút (Pipette)
- Pipette được làm bằng thủy tinh
- Trên pipette thường có chia vạch để chỉ thể tích dung dịch chứa bên trong (vd:
5ml, 1ml) hoặc loại pipette thể tích (pipette volume) có bầu ở giữa để chỉ lượng
dung dịch chứa bên trong.
- Khi sử dụng chú ý xem đầu pipette có vạch nhám hay không (vạch nhám có thể
nhám, không màu hay được sơn bằng các màu vàng, đỏ, xanh…)
 Có vạch nhám: khi hút ta thổi giọt cuối cùng.
 Không vạch nhám: khi hút ta không thổi giọt cuối cùng.
- Trước khi hút, kiểm tra lại thể tích và tên dung dịch cần hút.
- Dùng ball cao su để hút (không hút bằng miệng).
- Khi sử dụng nhớ dùng pipette thẳng đứng, dùng ngón trỏ để, dùng ngón trỏ để
điều chỉnh thể tích muốn lấy, chú ý phải để ống hút ngang với tầm nhìn của mắt.
 Hiện nay, ngoài loại pipette thường có loại Micropipette (pipette tự động):


Có thể dùng để hút chính xác một lượng dung dịch rất nhỏ (μl).



Có thể điều chỉnh thể tích dung dịch cần lấy một cách nhanh chóng, dễ
dàng và ít sai số do thao tác.

3.6. Bình nón (Erlenmeyer)
- Bình thủy tinh, hình nón, ùng để chứa dung dịch, hay dùng để chuẩn độ thể tích.
- Có nhiều kích thước khác nhau: 50ml, 100ml, 200ml.
3.7. Ball cao su

- Thường được làm bằng cao su.
- Dùng cùng với pipette thủy tinh để tránh hút bằng miệng.
3.8. Một số dụng cụ khác:


Cọ ống nghiệm.



Lưới tráng Amiant.



Phễu lọc.



Đũa khuấy bằng thủy tinh hay polyethylen.
4


Báo cáo thực hành hoá sinh

nhóm 2

Kẹp ống nghiệm.



4. CÁCH LẤY VÀ BẢO QUẢN MẪU BỆNH PHẨM

4.1. Chuẩn bị dụng cụ
Mẫu máu lấy để phân tích các chỉ số hóa sinh thường là máu tĩnh mạch, có khi là
máu động mạch hoặc mao mạch. Dụng cụ để lấy máu gồm:
-

Bơm, kim tiêm (loại dùng một lần)

-

Dây thắt (bằng cao su mềm, độ đàn hồi tốt).

-

Ống đựng bệnh phẩm: ống nghiệm 5 - 10ml, nút phải sạch và khô.

-

Chất chống đông sử dụng: Heparin, Natri citrat, Natri oxalat. Sự lựa chọn
chất chống đông tùy thuộc vào mục đích xét nghiệm.

4.2. Chuẩn bị bệnh nhân
Lấy máu vào lúc sáng sớm, đã nhịn đói 12 tiếng vì nồng độ các chất trong máu phản
ánh trung thực thông số thực của bệnh nhân, tránh các yếu tố có thể gây sai số.
Chuẩn bị lấy máu, bệnh nhân nghỉ khoảng 15 - 20 phút, giải thích cho bệnh nhân
cách lấy máu để bệnh nhân yên tâm khi tiến hành lấy máu. Nhất là trong một số xét
nghiệm như phân tích các rối loạn thăng bằng acid base, tránh tăng thông khí, dẫn đến
kiềm hô hấp, dẫn đến thông số định lượng sẽ bị sai lệch.
4.3. Cách lấy máu
4.3.1. Lấy máu tĩnh mạch
Thường lấy máu ở khủy tay. Bệnh nhân có thể nằm hoặc ngồi, tay duỗi thoải mái

trên vật cứng. Dùng dây thắt ở khủy tay 2-3cm, tiêm kim vào tĩnh mạch, kéo nhẹ bơm
tiêm ra kiểm tra xem kim đã vào tĩnh mạch chưa (nếu có khi kéo bơm sẽ có máu). Bỏ dây
thắt rồi mới lấy máu để tránh hiện tượng ứ máu, có thể làm tăng lượng CO 2, O2 và thay
đổi thành phần máu.
4.3.2. Lấy máu động mạch
Lấy máu động mạch phức tạp, có thể gây nguy hiểm cho bệnh nhân, vì vậy cần
những bác sĩ, kỹ thuật viên có kinh nghiệm. Khi lấy máu động mạch nên để máu tự động
chảy vào bơm tiêm (do áp lực động mạch). Nên tráng bơm tiêm bằng heparin.
4.3.3. Lấy máu ở trẻ em
Thường lấy máu toàn phần hoặc máu mao mạch. Vị trí lấy máu thường là ở gót
chân. Dùng khăn ẩm và ấm lau vị trí lấy máu, sát khuẩn rồi dùng kim vô khuẩn để lấy

5


Báo cáo thực hành hoá sinh

nhóm 2

máu. Bỏ giọt máu đầu tiên, những giọt tiếp theo nên hứng vào ống thủy tinh chứa
heparin.
Máu xét nghiệm sinh hóa gồm ba loại: Máu toàn phần, huyết tương, huyết thanh.
Máu sau khi lấy ra khỏi cơ thể sẽ bị đông lại do trong thành phần có ion Ca 2+. Loại bỏ ion
Ca2+ thì máu sẽ không đông. Các chất loại bỏ ion Ca2+ gọi là chất chống đông máu. Có
nhiều loại chất chống đông như EDTA (muối ethylen diamin tetraacetic acid), kali oxalat,
natri citrat. EDTA thường được dùng cho các xét nghiệm huyết học (15mg/ml). Kali
oxalat ngày nay y học ít sử dụng, natri citrat thường dùng cho các xét nghiệm phân tích
các yếu tố chống đông (dung dịch 3.28%). Heparin (0,01-0,1ml/ml máu) có chứa chất
kháng thrombin và kháng các yếu tố Xa. Heparin thường được sủ dụng khi làm các xét
nghiệm sinh hóa máu như: phân tích khí máu, phân tích hóa sinh, lâm sàng và cấp cứu.

Máu có chứa chất chống đông gọi là máu toàn phần, ly tâm lấy phần dịch ở trên gọi
là huyết tương có chứa các yếu tố đông máu. Khi máu không chứa chất đông cục máu
đông lại và hình thành theo cơ chế đông máu tự nhiên. Ly tâm lấy phần dịch ở trên là
huyết thanh.
4.3.4. Cách lấy huyết thanh
Lấy máu vào ống nghiệm, đậy ống nghiệm bằng nút cao su hoặc bông mỡ (bông
gòn không thấm nước) rồi để ở nhiệt độ phòng trong vài giờ. Nếu ta cần có huyết thanh
nhanh để phân tích thì có thể cầm ống nghiệm trong lòng bàn tay hoặc có thể để ống
nghiệm trong tủ ấm để cục huyết thanh hình thành một cách tự nhiên, tiết ra huyết thanh
nhiều nhất. Khi cục máu đã đông, dùng que thủy tinh nhỏ sợi bạch kim nhẹ nhàng tách
phần cục huyết dính vào thành ống. Cục huyết sẽ co lại và nhanh tiết ra huyết thanh. Gạn
lấy huyết thanh trong hoặc dùng pipette để hút huyết thanh. Nếu huyết thanh lẫn hồng
cầu, đem ly tâm lại (300 vòng/ phút trong 5 phút) lấy phần huyết thanh. Một số xét
nghiệm cần lấy huyết thanh ngay (định lượng kali, natri) thì li tâm khi cục máu đông hình
thành và tách cục huyết khỏi dính vào thành ống, thời gian không nên quá 1 giờ.
4.3.5. Cách lấy máu toàn phần hay huyết tương
Xét nghiệm máu toàn phần hay huyết tương để tránh hoặc loại trừ sai số cso thể gặp
do hoại huyết và ngăn ngừa các chất khuếch tán từ hồng cầu vào huyết tương.
Thường chất chống đông được cho sẵn vào ống đựng mẫu máu, khi cho máu vào cần
lắc đều liên tục để tránh máu đông lại. Ly tâm lấy phần dịch ở trên.
6


Báo cáo thực hành hoá sinh

nhóm 2

4.3.6. Bảo quản mẫu máu
Thời gian bảo quản cho phép với các mẫu huyết thanh và huyết tương khoảng 4h ở
nhiệt độ phòng và trên 1-2 ngày ở nhiệt độ 2 – 8 0C. Muốn giữ lại mẫu lâu hơn thì cần để

ở nhiệt độ 00C. Đối với mẫu để định lượng enzym cần tuân theo các quy địnhcụ thể của
phương pháp định lượng. Thực tế có những chất tương đối bền vững ở nhiệt độ 20 0C
trong khoảng thời gian dài hơn như Cl, K, Na, Mg, Fe, hemoglobin, acid uric,
cholesteron, tryglycerid, phosphotid.
5. LẤY NƯỚC TIỂU


Chuẩn bị dụng cụ
Bình chứa nước tiểu, thường dùng bình thủy tinh có chia độ theo ml, lít…hoặc ống

nghiệm thủy tinh 10ml-15ml, được rửa sạch sấy khô và có nút.


Cách lấy nước tiểu
- Với các xét nghiệm định tính thông thường:
Dùng nước tiểu bất kỳ thời gian nào trong ngày, lấy nước tiểu giữa dòng, bỏ phần

đầu (dễ có tạp nhiễm bởi dịch nhầy, tế bào bong, vi khuẩn). Một số trường hợp nên lấy
vào thời gian thích hợp như:
o Viêm tiết niệu thì nên lấy nước tiểu lúc ngủ dậy.
o Nghi ngờ glucose niệu thì lấy nước tiểu sau bữa ăn 2 giờ.
o Urobilinogen dễ phát hiện khoảng 14-16 giờ.
- Với các xét nghiệm định lượng:
Thường thu góp nước tiểu 24h. Thường cho thêm vào mỗi bình vài giọt thymol
trong rượu hoặc 5ml xyanua 4%. Đến giờ ấn định cho bệnh nhân tiểu hết, bỏ phần nước
tiểu đó. Trong 24 giờ tiếp theo thu tất cả nước tiểu bệnh nhân vào 1 bình sạch, chú ý lấy
cả phần nước tiểu khi bệnh nhân đi đại tiện. Ngày hôm sau vào giờ thứ 24, cho bệnh nhân
tiểu lần cuối cùng vào bình. Đo thể tích nước tiểu 24h và lấy 0.5 lít gửi đến phòng thí
nghiệm kèm theo các thông tin sau: thể tích nước tiểu 24h, tên, tuổi, giới tính, chế độ ăn,
khối lượng nước uống, những thuốc đã dùng, trạng thái nghỉ ngơi hay hoạt động của

bệnh nhân, chẩn đoán.
- Bảo quản mẫu nước tiểu:

7


Báo cáo thực hành hoá sinh

nhóm 2

Khi phân tích nước tiểu nên dùng nước tiểu tươi, để ở nhiệt độ phòng. Nếu chưa
phân tích mấu ngay có thể để mẫu ở 2 – 8 0C trong vòng 3 ngày, đối với mục đích phân
tích hormon hoặc nồng độ thuốc, ở điều kiện không bị phân hủy. Nếu cần giữ mẫu hơn 3
ngày thì để mẫu dưới 00C. Nói chung không dùng hóa chất để bảo quản.
6. LẤY VÀ BẢO QUẢN MỘT SỐ DỊCH KHÁC
6.1. Lấy dịch vị
Mục đích là để chẩn đoán các bệnh trong dạ dày, phát hiện vi khuẩn gây bệnh. Dịch
vị lấy sau khi bệnh nhân nhịn đói 12 giờ. Khi bị hẹp môn vị hay hang vị thì phải rửa dạ
dày từ chiều hôm trước. Các thuốc ảnh hưởng đến sự bài tiết dịch vị phải được ngừng sử
dụng ít nhất 24 giờ trước khi làm các nghiệm pháp. Trước đây, dịch vị được lấy bằng ống
hút Einhorn. Dịch vị để chẩn đoán tế bào, nghiên cứu tác dụng của HCl, pepsin trong
dịch vị. Ngày nay chẩn đoán bệnh dạ dày thường được dùng kỹ thuật nội soi. Kỹ thuật
này cho phép bác sĩ quan sát niêm mạc dạ dày, tình trạng bài tiết dịch vị và lấy dịch vị
cũng như lấy mẫu niêm mạc dạ dày để phân tích. Mẫu dịch vị nên phân tích sau khi lấy.
6.2. Lấy dịch não tủy
Là lớp dịch trong các khoang dưới màng nhện bao bọc xung quanh não tủy, ở trong
ống nội tủy, não thất, bảo vệ cho trung ương thần kinh đối với các biến đổi về áp lực,
sang chấn. Mỗi thương tổn dù nhỏ của não tủy đều ảnh hưởng đến tính chất của dịch não
tủy. Phân tích những biến đối đó có thể chẩn doánđược một số bệnh về thần kinh, theo
dõi sự tiến triển của bệnh. Lấy dịch não tủy phức tạp đòi hỏi bác sĩ có kinh nghiệm. Khi

chọc dịch não tủy nên hứng bệnh phẩm vào hai ống nghiệm có nút cao su. Trong tường
hợp xuất huyết màng não hai ống đều lẫn máu. Trong tường hợp dịch não tủy có lẫn máu
nhưng do chọc phải mạch máu thì chỉ ở 1 có máu, ống hai không có. Nên tiến hành phân
tích mẫu ngay.
6.3. Cách lấy sữa
Cần lấy 3 mẫu sữa với thời gian khác nhau.
 Mẫu đầu đươc lấy vào buổi sáng sớm trước lúc cho con bú bữa đầu trong ngày.
 Mẫu thứ hai được lấy lúc đang cho con bú giữa trưa.
 Mẫu thứ ba lấy vào buổi tối sau khi cho bú xong bữa tối.
Khi lấy mẫu nên ghi tuổi của sữa (như lấy sữa vào tháng thứ mấy). Có thể lấy mẫu
sữa cùng một lúc: mẫu đầu lấy trước khi cho bú, mẫu thứ hai khi đang cho bú, mẫu thứ
ba lấy sau khi cho bú, khối lượng 3 lần bằng nhau.
8


Báo cáo thực hành hoá sinh

nhóm 2

Bảo quản sữa có thể để ở nhiệt độ 0-40C trong 24 giờ.
7. NGUYÊN TẮC PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG
7.1. Định luật cơ bản về sự hấp thu ánh sáng: Định luật Beer – Lambert
Chiếu 1 chùm tia đơn sắc có bước sóng λ, cường độ I o vào 1 dung dịch màu đồng
nhất có nồng độ C, chiều dày lớp dung dịch mà ánh sáng đi qua là 1. Khi đi qua dung
dịch, một phần ánh sáng bị hấp thu (I h), một phần bị phản xạ (Ip), phần còn lại I đi qua
dung dịch:
Io = Ih + Ip + I
Vì Ip rất nhỏ nên: Io = Ih + I
Trên thực nghiệm, Bongueur và Lambert đã chứng minh và nêu ra định luật
“Những lớp chất dày đồng nhất trong điều kiện khác nhau, luôn luôn hấp thu một tỉ

lệ như nhau của chùm tia rọi vào những lớp chất đó”.
Beer – Lambert mô tả sự liên hệ giữa các yếu tố trên bằng một định luật biểu diễn
sau:

I

I
= 10-klC

hay

Io

log

= klC

Io

Với k = hệ số hấp thu, phụ thuộc vào bản chất của chất màu và dung môi, bước
sóng của chùm tia và nhiệt độ.
I
= T (Transmittance) = Độ truyền quang, độ thấu quang ( %)
Io
I
= D (OD = Densite optique) = Mật độ quang của dung dịch

Log
Io

D = Log 100%T

D = klC

Chú ý: Định luật Beer – Lambert chỉ đúng với chùm tia đơn sắc.
Theo công thức trên, trong cùng một điều kiện, khi k và l không đổi, ta nhận thấy
mật độ quang tỷ lệ thuận với nồng độ dung dịch. Do đó, nếu so sánh nồng độ chưa biết
của một dung dịch với nồng độ mẫu, ta có:
D = klC

D

Do = klCo

Do

C

C

Co

C =

=

Co

Do
9

Báo cáo thực hành hoá sinh

nhóm 2

Nếu biết được mật độ quang của ống đo (thử - D), mật đọ quang ống mẫu (chuẩn Do) và nồng độ của ống mẫu (chuẩn - Co), ta tính được nồng độ C của ống muốn đo.
7.2. Phương pháp định lượng đo quang:
Dựa trên cơ sở mật độ đo quang của dung dịch của một chất phụ thuộc vào nồng độ
của chất đó, ta dùng máy quang phổ kế (photometre) để đo mật độ quang của chất mà ta
cần xác định nồng độ.
Chuyển chất X cần xác định nồng độ, không màu thành hợp chất có màu đặc biệt
RX bằng thuốc thử thích hợp:

R+X

RX

(X không màu, muốn đo; RX có màu)
Đặc điểm: ánh sáng sau khi đi qua dung dịch, được chiếu lên tế bào quang điện để
chuyển thành dòng điện mà cường độ của nó đo nhờ 1 điện kế nhạy.
Trong các phép định lượng đo quang, người ta thường đo OD (mật độ quang) của
các dung dịch màu đối chiếu với ống trắng (ống chứng). Ống trắng là ống chứa thuốc thử
như ống đo, trừ chất ta cấn xác định.

10


Báo cáo thực hành hoá sinh

nhóm 2

BÀI 2
ĐỊNH TÍNH PROTEIN VÀ ACIDE AMIN
MỤC TIÊU
1. Trình bày được các nguyên tắc của phương pháp định tính protein và acid amin.
2. Thực hiện một số phản ứng hóa học dựa trên các tính chất hóa học và vật lý của
acid amin, peptid, protein đã học.
3. Áp dụng tìm protein trong nước tiểu bằng phương pháp acid Sulfosalicylic 3%.
4. Nhận định, biện luận và giải thích kết quả.
NỘI DUNG: gồm 7 phản ứng
1. Phản ứng Ninhydrin
2. Phản ứng Biuret
3. Phản ứng tủa protein bởi nhiệt với môi trường acid yếu
4. Phản ứng tủa protein bởi acid mạnh và không đun nóng
5. Tìm protein trong nước tiểu bằng 2 phương pháp: đông kết và Heller.
THÍ NGHIỆM 1: Phản ứng Ninhydrin
1. Nguyên tắc
Dung dịch protein, peptid hoặc acid amin khi đun nóng với Ninhydrin 0,2 % sẽ tạo
thành phức chất có màu xanh tím.
Protid
Dung dịch

Peptid

t0
+ Ninhydrin 0,2%

Xanh tím

Acid amin
Ninhydrin là một chất oxy hóa, tạo nên phản ứng khử carboxyl oxy hóa của acid
amin với H2O, tạo thành CO2, NH3 và một aldehyd ngắn đi một carbon so với acid amin
ban đầu và ninhydrin bị khử. Sau đó, Ninhydrin bị khử tiếp tục tác dụng lại với NH 3 vừa
phóng thích và kết hợp với một phân tử Ninhydrin thứ hai, tạo thành sản phẩm ngưng kết
có màu xanh tím.
Đây là phản ứng chung cho các protid và acid amin tự do. Phản ứng này cho phép
nhận dạng tất cả các acid amin có nhóm -NH 2 và -COOH tự do. Ngoại trừ prolin, có
nhóm -OH tác dụng với Ninhydrin cho màu vàng.

11


Báo cáo thực hành hoá sinh

nhóm 2

2. Tiến hành
Dung dịch

Ống 1

Ống 2

1 ml

-

-

1 ml

1 ml

1 ml

Nước cất
DD lòng trắng trứng
Ninhydrin 0,2%

Đun sôi - quan sát, nhận xét và giải thích kết quả
3. Kết quả

1

2

- Ống 1 không có hiện tượng
- Ống 2 màu xanh tím.
4. Biện luận
Ninhydrin tác dụng với acid amin trong điều kiện đun nóng tạo thành CO 2, NH3,
aldehyd và ninhydrin bị khủ. Sau đó, ninhydrin bị khử ngưng tụ với ninhydrin không bị
khử tạo nên sản phẩm màu xanh tím
Thí nghiệm 2: Phản ứng Biuret (xác nhận các liên kết peptid)
1. Nguyên tắc:
Protein tác dụng với Cu2+ trong môi trường kiềm tạo phản ứng màu tím hồng, phản
ứng xảy ra do các liên kết peptid.
Sở dĩ gọi phản ứng Biuret (có nhóm CO-NH, giống như một liên kết peptid) cũng
cho phản ứng tương tự, tạo phức hợp có màu giống như protein.
Sự tạo thành biuret:

12


Báo cáo thực hành hoá sinh

nhóm 2

NH2
NH2
O

C

O

NH2

+

O

C
NH

C
O

NH2

NH2

C
NH2

Ure

Biure

2. Tiến hành: Cho vào ống nghiệm
Dung dịch

Ống 1

Ống 2

1 ml

-

-

1 ml

NaOH 40 %

0.5 ml

0.5 ml

DD CuSO4 1 %

3 giọt

3 giọt

Nước cất
DD lòng trắng trứng

Lắc đều - quan sát màu, nhận xét và giải thích kết quả
3. Kết quả

1

2

- Ống 1: màu xanh nhạt
13

+ NH3


Báo cáo thực hành hoá sinh

nhóm 2

- Ống 2: màu tím hồng.
4. Biện Luận
- Ống 1: có màu xanh nhạt là màu của Cu(OH) 2.
- Ống 2: dung dịch có màu tím hồng là do dung dịch có protein tác dụng với Cu 2+

trong môi trường kiềm tạo phức chất màu tím hồng.
Thí nghiệm 3: Phản ứng tủa protein bởi nhiệt và môi trường acid yếu
1. Nguyên tắc:
Protein hòa tan trong nước hình thành dung dịch keo, protein tích điện cùng dấu và
mang lớp áo nước (hydrat hóa). Nhờ tích điện cùng dấu nên các tiểu phân protein đẩy
nhau và nhờ có lớp áo nước nên chúng ngăn cách nhau, vì vậy dung dịch keo được bền
vững.
Nếu làm mất 2 yếu tố trên thì các tiểu phân protein do chuyển động sẽ gặp nhau,
dính vào nhau thành những hạt to và kết tủa.
a. Làm mất điện tích của protein
-

Thêm chất điện giải: NaCl, (NH4)2SO4….

-

Đưa pH của môi trường chứa protein về pHi đẳng điện của protein.

b. Làm mất lớp áo nước của protein
-

Thêm chất khử nước: alcohol, aceton, (NH4)2SO4 ...

-

Biến tính protein: đun sôi, acid, kiềm mạnh hoặc muối kim loại nặng.

2. Thuốc thử:
-

Dung dịch Acid acetic 1 % và 10 %

-

Dung dịch NaCl bão hòa

-

Dung dịch NaOH 10 %

3. Tiến hành: cho vào 5 ống nghiệm:
1

2

3

4

5

1ml

1 ml

1ml

1ml

1ml

Acid acetic 1%

-

2 giọt

-

-

-

Acid acetic 10%

-

-

5 giọt

5 giọt

-

NaCl bão hòa

-

-

-

2 giọt

-

NaOH 10%

-

-

-

-

2 giọt

Long trắng trứng đã thẩm tích

Đun sôi cách thủy 900 trong 5 phút
Nhận xét, ghi kết quả từng ống và giải thích hiện tượng.
14


Báo cáo thực hành hoá sinh

nhóm 2

4. Kết quả:

1

2

3

4

5

5. Biện luận:
- Ống 1: bị nhiệt đun làm biến tính protein, mất lớp áo nước của protein tích điện
cùng dấu và tạo tủa
- Ống 2: mất lớp áo nước của protein tích điện cùng dấu và tạo tủa
- Ống 3: acid acetid không đủ làm mất lớp áo nước của protein tích điện cùng dấu
và không tạo tủa
- Ống 4: vừa mất điện tích vừa mất lớp áo nước nên tạo tủa nhiều
- Ống 5: không tủa vì lượng kiềm không đủ mạnh làm biến tính protein và lớp áo
nước của protein
Thí nghiệm 4: Phản ứng tủa bởi acid mạnh và không đun nóng
1. Nguyên tắc
Acid vô cơ mạnh và acid hữu cơ có tác dụng làm biến tính và kết tủa đại đa số
protein.
2. Hóa chất
Acid vô cơ:

- HNO3

Acid hữu cơ:

- H2SO4

- Acid trichloracetic
- Acid sulfosalicylic

- HCl

3. Tiến hành
1

2

15

3

4


Báo cáo thực hành hoá sinh

nhóm 2

Lòng trắng trứng

2 ml

2 ml

2 ml

Để nghiêng ống nghiệm 450, nhỏ từ từ các acid đậm đặc lên thành ống nghiệm
HCl đậm đặc

3 giọt

HNO3 đậm đặc

3 giọt

H2SO4 đậm đặc

3 giọt

Acid sulfosalicylic 3%

1 ml
Để yên

Lắc đều

Quan sát hiện tượng – Giải thích
4. Kết quả

1

2

3

4

5. Biện luận
- Ống 1: tạo tủa trắng ít.
- Ống 2: tạo tủa trắng ít.
- Ống 3: tạo tủa trắng nhiều.
- Ống 4: tạo tủa trắng đục.
Thí nghiệm 5: Tìm protein trong nước tiểu
1. Phương pháp đông kết: tủa protein bằng acid yếu + đun nóng.
-

Cho vào ống nghiệm 2 ml nước tiểu, đun sôi trong 2 phút

-

Sau đó thêm vào khoảng 3 - 5 giọt acid acetic 1%.

-

Nếu trong nước tiểu có protein thấy trầm hiện (tủa).

2. Phương pháp Heller: tủa protein bằng acid mạnh và không đun
-

Cho vào ống nghiệm 2 ml nước tiểu.
16

Báo cáo thực hành hoá sinh

nhóm 2

-

Nghiêng ống nghiệm và cho vào từ từ 1 ml HNO3 đậm đặc.

-

Quan sát ở mặt phân cách 2 chất lỏng thấy protein kết tủa như một đám mây
mờ.

Chú ý: Nếu nước tiểu quá cô đặc hoặc có acid uric cũng cho kết quả như trên (dương
tính giả). Trường hợp này có thể tránh được bằng cách pha loãng nước tiểu 3 - 4 lần.
3. Kết quả:

1

2

- Ống 1: dương tính
- Ống 2: âm tính

17


Báo cáo thực hành hoá sinh

nhóm 2

BÀI 3
HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYM
S.G.O.T (Serum Glutamic Oxaloacetic Transaminase).
S.G.P.T (Serum Glutamic Pyruvic Transaminase).
Được tổng hợp từ gan và tim, thuộc nhóm phân hoá tố chuyển nhóm amin.
Xét nghiệm GOT và GPT giúp ta chẩn đoán, theo dõi các bệnh về gan, tim
Phương pháp ENZYMATIC (U.V Test)
1. NGUYÊN TẮC
xảy ra theo phản ứng sau đây:

GOT

α - cetoglutarat + L . Aspartat

GOT

L . Glutamat + Oxaloacetat

Oxaloacetat + NADH + H+

MDH

L . Malat + NAD+

GPT

xảy ra theo phản ứng sau đây:

α . Cetoglutarat + L . Alanin

Pyruvat + NADH + H+

GPT

L . Glutamat + Pyruvat
L . Lactat + NAD+

MDH

2. MẪU THỬ
Huyết thanh hay huyết tương (kháng đông Heparin).
3. THUỐC THỬ: Dạng KIT pha sẵn, gồm các hoá chất sau đây:
-

Reagent 1: Tris buffer pH 7.5


L. Aspartate (GOT) hoặc L. Alanin (GPT)



α - cetoglutarat

-

Reagent 2: Enzym/ Coenzym


Malat dehydrogenase/ NADH,H+



Lactat dehydrogenase/ NADH,H+

4. KỸ THUẬT
U
Reagent 1

800 µl
18


Báo cáo thực hành hoá sinh

nhóm 2

Reagent 2

200 µl

Huyết thanh (hay huyết tương)

100 µl

Trộn đều – Đọc Abs sau 1 phút.
Kế tiếp đọc Abs sau 1 phút – 2 phút – 3 phút (sau đó lấy ∆Abs tính kq).
5. KẾT QUẢ

- Trị số bình thường

19


Báo cáo thực hành hoá sinh

-

GOT:

nhóm 2

-

Nam < 37

GPT:

UI/L

Nam < 40

UI/L
Nữ

< 31 UI/L

Nữ

< 31 UI/L

- Kết quả thí nghiệm: GOT: 18 UI/L; GPT: 27 UI/L Bình thường
XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘNG AMYLASE TRONG NƯỚC TIỂU
( PP. WOHLGEMUTH ) :
1. Nguyên tắc
Dùng phương pháp pha loãng dần nước tiểu để tìm lượng enzym tối thiểu phân
hủy hết 2ml dd hồ tinh bột 0,1% ở 370C trong 30 phút.
Kiểm soát độ phân hủy của hồ tinh bột bằng iod. Tính hoạt độ của Amylase theo
đơn vị Wholgemuth.
Định nghĩa 1 đơn vị Wholgemuth: là lượng Amylase có khả năng thủy phân 1ml
dd hồ tinh bột 1%o ở nhiệt độ 37oC trong 30 phút.
2. Thuốc thử :
- Dung dịch NaCl 9%.
- Dung dịch hồ tinh bột 1%o : Cân chính xác 1g tinh bột, hòa tan trong nước sôi cho tan.
Thêm nước cất vừa đủ 1 lít , bảo quản với acid benzoic. Để trong tủ lạnh.
- Dung dịch iod N/50.
3. Tiến hành :
Lấy 8 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 8 :
- Cho vào mỗi ống nghiệm 1ml dd NaCl 9%
- Cho vào ống 1 : 1ml nước tiểu. Tráng ống hút bằng cách hút lên hút xuống 1- 2 lần.
Trộn đều.
- Hút 1ml của ống 1 cho sang ống 2. Cũng tráng và trộn đều như trên.
- Hút 1ml của ống 2 sang ống 3. Tiếp tục làm như vậy đến ống 7. Đến ống số 7 hút ra 1
ml bỏ đi. Như vậy nước tiểu ở các ống theo thứ tự đã được phân pha loãng theo tỉ lệ :

Tỉlệnướctiểu

Ống 1

Ống 2

Ống 3

Ống 4

Ống 5

Ống 6

Ống 7

Ống 8

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

1/128

0

- Thêm nhanh vào mỗi ống đúng 2ml hồ tinh bột 1%o, lắc đều. Để cách thuỷ 37 oC trong
30 phút.

- Lấy ra, cho nhanh vào mỗi ống 1 giọt dd iod N/50. Lắc đều.
20


Báo cáo thực hành hoá sinh

nhóm 2

- Quan sát màu của các ống ở ngay thời điểm trên.
+ Các ống nào mà tinh bột bị thuỷ phân hoàn toàn thành maltose, glucose thì
không màu.
+Các ống tinh bột bị thuỷ phân dở dang thì dextrin có màu trung gian.
+ Ống còn tinh bột có máu xanh dương.
4. Kết quả :

- Chọn ống để biểu thị kết quả : Chọn ống có màu trung gian hay không màu ngay
trước ống có màu xanh dương trước hiện ra.
Thí dụ : ống 5 là ống đầu tiên có màu xanh. Ống biểu diễn kết quả là ống số 4.
Ống 4 có chứa 1/16 ml nước tiểu
1/16 ml nước tiểu có khả năng thuỷ phân 2ml dd hồ tinh bột 1%. Vậy 1 ml nước tiểu sẽ
thuỷ phân 2 x 16 = 32 ml hồ tinh bột.
Nước tiểu có hoạt độ Amylase là 32 đợn vị Wohlgemuth.

Hoạt độ Amylase theo đơn vị Wohlgemuth = Độ pha loãng nước tiểu
của ống biểu diễn kết quả x2
5. Biện luận :
* Bình thường : từ 16 đến 32 đơn vị.
( Có thể thay đổi từ 8 – 64 đơn vị Woglgemuth )
Amylase là một nhóm enzym thuỷ phân tinh bột hoặc glycogen, cắt đứt liên kết
glycosid 1-4, tạo thành các sản phẩm trung gian gọi là dextrin và cuối cùng là maltose,

glucose. Dextrin này cũng có màu sắc khác nhau khi tác dụng với iod.
Amylase huyết thanh có nguồn gốc chính từ các tuyến tuỵ và tuyến nước bọt,
được lọc ở cầu thận và bài tiết qua nước tiểu. Vì vậy, hoạt độ amylase trong nước tiểu
cũng có phản ánh hoạt độ amylase huyết thanh.
21


Báo cáo thực hành hoá sinh

nhóm 2

Trong viêm tuỵ cấp, amylase niệu có thể tăng quá 200 đv, đôi khi lên tới 4.0005.000 đv. Trị số tối đa vào lúc 12 - 24 giờ, sau khi xuất hiện những triệu chứng đầu và trở
lại bình thường sau 2- 3 ngày. Vì trị số amylase trong nước tiểu rất hay thay đổi, nên nếu
chỉ định lượng trong mẩu nước tiểu thì kết quả sẽ ít chính xác hơn khi kết hợp với
amylase huyết thanh.
Trường hợp có suy thận, định lượng amylase (huyết thanh và nước tiểu ) đều
không có giá trị chuẩn đoán.
Amylase giảm có ý nghĩa rất ít.

22


Báo cáo thực hành hoá sinh

nhóm 2

BÀI 4
LIPID, ENZYM DỊCH VỊ VÀ DỊCH TỤY
A. ĐẠI CƯƠNG
Lipid thuộc nhóm các hợp chất không tan hoặc ít tan trong nước & dung môi phân

cực, dễ tan trong các dung môi hữu cơ (không phân cực) như : Cloroform, methanol,
ether, benzen…
Nhũ tương dầu trong nước là một nhũ tương không bền, khi cho thêm 1 chất nhũ
tương hóa như: xà phòng, muối mật, protein… sẽ được nhũ tương bền.
Thủy phân chất béo trong môi trường kiềm mạnh như: NaOH, KOH đun nóng cho
xà phòng & glycerol (gọi là sự xà phòng hóa).
Lipid đóng vai trò quan trọng trong việc tham gia cấu tạo các mô động vật, cung
cấp năng lượng cho cơ thể.
Lipid thức ăn đưa vào cơ thể (chủ yếu là Triglycerid) nhờ các men tiêu hóa: Lipase
& các men khác được thủy phân để tạo thành những chất: acid béo, glycerol, sphingozin,
cholesterol cùng 1 số sản phẩm thủy phân không hoàn thành như mono & diglycerid.
Những sản phẩm trên lại được tổng hợp lại thành Lipid tại tế bào ruột vào hệ tuần hoàn,
phần lớn đi theo đường bạch huyết dưới dạng kết hợp Lipoprotein – chất này ở máu, dưới
tác dụng của men Lippoprotein lipase lại được phân hủy thành các sản phẩm glycerol,
acid béo… Acid béo được thoái hóa theo con đường  oxy hóa tạo thành những mẫu
acetyl coenzym A. Quá trình này xảy ra chủ yếu ở gan. Một phần acetyl coenzym A vào
chu trình Krebs tạo thành CO 2 & H2O. Trong điều kiện rối loạn chuyển hóa, acetyl
coezym A cũng có thể tích tụ lại để tạo thành những sản phẩm acid aceto acetic, acid 
hydroxy butyric & aceton; 3 chất này có tên chung là Cetonic (thể Ceton). Sự gia tăng
của các chất Ceton trong máu gây hiện tượng nhiễm acid đồng thời kéo theo sự bài xuất
các chất này qua nước tiểu.
B. CÁC THÍ NGHIỆM: 4 thí nhiệm
THÍ NGHIỆM 1: KHẢO SÁT TÍNH HÒA TAN
Cho vào 2 ống nghiệm:

Dầu ăn
Nước cất
Ethar (hay alcol)

Ống 1

5 giọt
1ml

Ống 2
5 giọt
1ml
23


Báo cáo thực hành hoá sinh

nhóm 2

Aceton
Lắc kỹ

Kết quả:

1

2

Biện luận:
- Ống 1: Dầu có tỉ trọng nhỏ hơn nước, nên nổi trên mặt nước.
- Ống 2: Dầu tan trong các dung môi hữu cơ tạo thành nhũ tương bền.
THÍ NGHIỆM 2: SỰ NHŨ TƯƠNG HÓA
Nhũ tương hóa trong nước là 1 nhũ tương không bền, khi cho thêm 1 chất làm nhũ
tương hóa như: xà phòng, muối mật, protein, Na2CO3, lecithin… sẽ được nhũ tương bền.
Cho vào 3 ống nhiệm:

Nước cất
Dầu ăn
Na2CO3 10%
Xà phòng

Ống 1
10ml
1 giọt
10 giọt

Ống 2
10ml
1 giọt
10 giọt

24