Báo cáo THỰC TẬP MÔN HÓA SINH- "ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ '''' potx

Trường ĐHKH-Huế
Khoa Sinh Học


Báo cáo




THỰC TẬP MÔN HÓA SINH











Huế, 11/2010
Bài 1. ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ

I. Theo phương pháp Bertrand
Tất cả các nhóm aldehyd hay nhóm ceton tự do trong những điều kiện xác định có
khả nămg khử Cu
2+
thành kết tủa Cu
2
O.

Vì vậy, phương pháp này dùng để định lượng các loại aldose, cetose, các
disaccharide có tính khử.
Khi dùng phương pháp này, muốn có kết quả tốt, cần phải đảm bảo các điều kiện
sau:
Loại Protein và các chất khác ra khỏi dung dịch cần nghiên cứu bằng cách dùng
dung môi thủy ngân, base acetate, hỗn hợp CuSO
4
và NaOH (1V
CuSO4 8%
1V
NaOH 1.25%
)
THời gian đun 3 phút kể từ khi có bọt khí đầu tiên xuất hiện.
Hàm lượng đường trọng dịch nghiên cứu lấy ước tính khoảng không quá 160mg tốt
nhất 10-90mg. pha loãng mẫu nếu quá đặc.
Phải bảo vệ kết tủa Cu
2
O không bị oxyl hóa bởi lớp không khí bề mặt.
- Nguyên tắc:
Khi đun sôi dịch kiềm của Cu
2+
với dung dịch đường sẽ tạo thành kết tủa Cu
2
O, sau
khi rửa bằng nước, hòa tan kết tủa Cu
2
O bằng Fe
2
(SO
4

)
3
, Cu
2+
sẽ chuyển thành Cu
+
và
Fe
3+
sẽ chuyển thành Fe
2+
.
Chuẩn độ Fe
2+
bằng dd KMnO
4
0.1N biết lượng KMnO
4
đã dùng để tích ra lượng
đồng. Tử lượng đồng ấy, đối chiếu bảng cho sẵn sẽ tính được lượng đường trong mẫu.
Các phản ứng như sau:
Cu
2+
Cu
+
Phản ứng Fehling

Phản

ứng kết tủa Cu

2
O:
Cu
2
O + Fe
2
(SO
4
)
3
+ H
2
SO
4
2CuSO
4
+ 2FeSO
4
+ H
2
O
Phản ứng chuẩn độ bằng dd KMnO4 0.1N
10 FeSO
4
+ 2KMnO
4
+ H
2
SO
4

5Fe
2
(SO
4
)
3

2. Đối tượng, hóa chất, thiết bị
2.1 Đối tượng
Quả Hồng
2.2 Hóa chất
Dung dịch Fehling
Fe
2
(SO
4
)
3
: 5g Fe
2
(SO
4
)
3
+ 20ml H
2
SO
4
đậm đặc cho nước cất đến 90ml kiểm tra
bằng dd KMnO

4
0.1N khi có màu hòng nhạt bền 30 giây. Thêm nước cất đủ 100ml.
2.3 Thiết bị
Hệ thống hút lọc chân không
Bình tam giác, phễu, chày và cối sứ.
Giấy lọc, cân (chính xác 0.001g).


II. Tiến hành thí nghiệm
1. Chuẩn bị mẫu
Cân 2gram cho vào cối sứ, thêm ít nước cất ngiền thành dạng chất đồn thể.
Cho 20ml nước cất vào, tiếp tục ngiền rồi để lắng, lấy phần nước và rửa sạch cối
khoảng 3 lần.
Cho lên phễu lọc có giấy lọc chuyên dụng. Sau đó định mức lên 100ml
2. Phản ứng Fehling:
Cho vào bình tam giác 5ml dịch lọc và 20ml fehling, đậy bình bằng phễu nhỏ và
đun sôi. Khi thấy bọt khí đầu tiên xuất hiện và có kết tủa đỏ gạch tính thời gian 3 phút, để
nguội cho kết tủa lắng.
3. Rửa kết tủa Cu
2
O
Tiến hành rửa trên phễu lọc Bunce
Dồn tủa về một phia. Chiết từ từ dịch Fehling qua phễu lọc. Quá trình rửa cần cho
nước cất ấm vào dần dần, để ngẵn tủa tiếp xúc với không khí. Mở máy cho dịch Fehling
hút nhanh xuống bình, thử pH của tủa trong bình tam giác khi không còn tính kiềm là kết
thúc quá trình rửa.
4. Hòa tan kết tủa Cu
2
O:
Đặt phễu lọc lên bình nón, cho vào bình kết tủa 15ml Fe

2
(SO
4
)
3
chảy từ từ rồi lắc
đều để tủa tan hoàn toàn. nếu kết tủa vẫn chưa tan hết thì cho thêm. Dùng nước cất nóng
rửa bình chứa tủa và phễu lọc cho đến khi không còn phản ứng acid là kết thúc gian đoạn
này.
5. Chuẩn độ bằng dd KMnO
4
0.1N
Cho dd KMnO
4
0.1N lên buret rồi chuẩn độ dịch đã hoàn thành xong, đến khi xuất
hiện màu hồng nhạt bền trong 20-30 giây, kết thúc quá trình chuẩn độ.
Ghi lại số ml dd KMnO
4
0.1N đã dùng.
6. Tính kết quả.
cứ 1ml KMnO
4
0.1N tương đương 1mg Cu. như vậy mCu có trong dịch là:
36.6
1
xVg
c
=

V

c
là số ml KMnO
4
0.1N dùng chuẩn độ.
Tra bảng ta sẽ có kết quả:

BÀI 2: ĐỊNH LƯỢNG LIPID THÔ BẰNG MÁY SOXHLET

1.1. Mục đích yêu cầu
- Mục đích: giúp sinh viên nắm vững phương pháp xác định hàm lượng lipid thô
bằng phương pháp dùng máy so màu.
- Yêu cầu: phải nắm vững kiến thức lý thuyết về phương pháp xác định hàm lượng
lipid thô, các thao tác tiến hành thí nghiệm phải hết sức cẩn thận.
1.2. Nguyên tắc
Trong tế bào, lipid ở dạng tự do và liên kết. Lipid tự do tập trung chủ yếu ở các cơ
quan dự trữ như hạt, quả (ở thực vật) và mô mỡ (ở động vật). Chính vì vậy để xác định
hàm lượng lipid, ta chiết rút lipid ra khỏi nguyên liệu bằng dung môi hữu cơ. Ở đây ta
dùng petrol ether để trích lipid ra khỏi một lượng mẫu biết trước (mẫu đã được sấy khô)
trên máy soxhlet.
Khi đã trích li hết lipid ra khỏi mẫu, ta tiến hành sấy mẫu khô lại đến khôi lượng
không đổi. Từ đó xác định hàm lượng lipid thô có trong 100g mẫu theo công thức:
100%
21
x
m
mm
X
−
=

Trong đó: X là hàm lượng lipid tính theo %
m: là trọng lượng mẫu đem chiết rút lipid
m
1
: trọng lượng gói mẫu trước khi chiết rút lipid (kể cả khối lượng giấy lọc)
m
2
: trọng lượng gói mẫu đã được sấy khô tuyết đối sau khi chiết rút lipid
1.3. Hóa chất dụng cụ
- Hóa chất: ethylic
- Dụng cụ: cối chày sứ, giấy lọc, bếp điện, tủ sấy, bộ soxlet
1.4. Tiến hành thí nghiệm
- Bước 1: chuẩn bị mẫu
Đối tượng thí nghiệm: đậu lạc
+ Đem mẫu cho vào cối chầy sứ nghiền mịn. Sau đó đem sấy
khô ở nhiệt độ 100 – 105
0
C đến khi khối lượng không đổi.
+ Mẫu sau khi được sấy khô ta cân 5g cho vào giấy lọc (đã được
sấy khô tuyệt đối) gói lại ba gói, đây chính là trọng lượng m
1

- Bước 2: chiết rút lipid
+ Rửa sạch và làm khô bộ soxlet sau đó cho mẫu vào ống hình
trụ sao cho mẫu chiếm khoảng 1/3 thể tích của ống.
+ Đổ ethylic vào ngập mẫu ở phía trên ống hình trụ còn ở dưới
bình cầu ta đổ ethylic khoảng 2/3 bình. Lắp kính bình cầu với ống
hình trụ.
+ Cho nước chảy vào ở vòi dưới và chảy ra ở vòi trên của ống
sinh hàn đồng thời bật bếp điện đ

un bình cầu chứa ethylic, khi đó hơi
ethylic bốc lên gặp lạnh ở ống sinh hàn sẽ ngưng tụ lại và rơi vào ống
hình trụ để hòa tan lipid tự do có trong mẫu. Ta điều chỉnh nhiệt độ
của bếp điện khoảng 40 – 50
0
C sao cho cứ sao khoảng 10 phút thì
dung môi ethylic chảy qua eo của ống hình trụ và tràn xuống bình hình
cầu. Ta đun trong vòng 10 -12 giờ cho đến khi tách chiết hết lipid ra khỏi mẫu. Cần chú ý
trong quá trình đun nếu nghĩ giữa chừng thì phải cho dung môi ngập mẫu mới tắt bếp.
+ Để thử lipid đã được chiết hết hay chưa, ta lấy vài giọt dung môi từ ống hình trụ
nhỏ vào miếng giấy lọc, để khô mà nếu thấy vết loang của dung môi không phân biệt
được với nền giấy trắng thì xem như đã chiết hết lipid và ta kết thúc quá trình chiết rút.
+ Sau khi chiết rút xong ta lấy các gói mẫu ra và cho bay hết dung môi, đem sấy
khô ở nhiệt độ 100 – 105
0
C trong vòng 1 – 1,5h, sau đó tiếp tục sấy khô ở nhiệt độ thấp
hơn cho đến khối lượng không đổi. Đem mẫu đã được sấy khô đến khối lượng không đổi
ra cân ta thu được trong lượng m
2

1.5. Kết quả và nhận xét:
- Kết quả:
Qua quá trình chiết rút lipid từ mẫu ta thu được kết quả như sau:


Mẫu (m=5g)

m
1
(g)

m
2
(g)
100%
21
x
m
mm
X
−
=


Đậu lạc
6.185 3.960 44.5%

Nhận xét: Qua bảng kết quả trên cho ta thấy hàm lượng lipid trong đậu lạc khá cao.
Hàm lượng lipid chiếm gần một nữa lượng chất có trong củ.
Qua bài thí nghiệm này giúp cho sinh viên nắm được các bước cơ bản của phương
pháp chiết rút lipid bằng máy soxlet, và rèn luyện được kỹ năng làm thí nghiệm.
BÀI 3: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP LOWRY

4.1.Mục đích yêu cầu
- Mục đích: Giúp sinh viên nắm được phương pháp xây dưng đồ thị chuẩn protein
và phương pháp xác định hàm lượng potein trong mẫu.
- Yêu cầu: nắm vững kiên thức lý thuyết, trong quá trình tiến hành thí nghiệm phải
cẩn thận.
4.2. Nguyên tắc

Dựa vào phản ứng màu giữa protein với thuốc thử Folin. Do trong môi trường kiềm
với sự có mặt của một lượng nhỏ Cu
2+
protein sẽ tạo thành phức chất màu xanh. Cường
độ màu của dung dịch tỷ lệ thuận với hàm lượng protein có trong mẫu (có nghĩa là hàm
lượng protein trong mẫu cao thi phức chất bắt màu đậm). Sau đó dùng máy so màu để
xây dựng đồ thị chuẩn, và thông qua đồ thị chuẩn ta tính được hàm lượng protein có
trong mẫu.
4.3. Dụng cụ hóa chất
- Dụng cụ:
Máy so màu, ống nghiệm, pipet, Micropiet, bình định mức
- Hóa chất: Albumin
+ Dung dịch đệm phosphat 0.1M, pH = 7
+ Dung dịch Na
2
CO
3
2% tan trong NaOH 0.1N (dung dịch A)
+ Dung dịch CuSO
4
1% (dung dịch B
1
)
+ Dung dịch Seignett 2% (dung dịch B
2
)
+ Dung dịch C: hỗn hợp 0.5ml dung dịch B
1
, 0.5ml dung dịch B
2

và 50ml dung
dịch A (dung dịch C chuẩn bị trước khi dùng 30 phút)
+ Thuốc thử Folin 0.5N. Chú ý thuốc thử Folin được đựng trong chai màu và bảo
quản lạnh, thuốc thử này có màu vàng, khi dùng nếu thấy có màu xanh thì cho vài giọt
brom đun trong 15 phút thì sẽ có màu vàng trở lại và dùng được.
4.4. Tiến hành thí nghiệm
4.4.1. Cách xây dựng đồ thị chuẩn protein
- Pha dung dịch chuẩn Albumin (1%): cân chính xác 1g albumin hòa tan trong nước
cất và định mức đến 100ml.
- Chuẩn bị dãy gồm 6 ống nghiệm khô sạch, sau đó cho vào các ống nghiệm những
chất như bảng sau:









TT
Hóa chất
MT 1 2 3 4 5
Nước cất (ml) 1 0.995 0.99 0.98 0.97 0.96
Albumin (ml) 0 0.005 0.01 0.02 0.03 0.04
Dung dịch C (ml) 4 4 4 4 4 4
Folin (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Hàm lượng albumin
(µg/ml)
0 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4

Khi cho dung dịch C vào các ống nghiệm ta lắc đều và để trong 10 phút, sau đó cho
vào mỗi ống nghiệm 0.5ml dung dịch Folin để yên trong 30 phút. Sau đó đem so màu ở
bước sóng 620nm ta thu được kết quả như sau:

Hàm
lượng
Albumin(µg/ml)
0.05 0.1 0.2 0.3 0.4
OD 0.175 0.29 0.40 0.515 0.623

Sử dụng phần mềm oringin 7.5 xây dựng đồ thị chuẩn protein:

Linear Regression for Data1_B:
Y = A + B * X = 0.0643 + 1.121X

Parameter Value Error

A 0.0643 0.00219
B 1.121 0.00661


R SD N P

0.99995 0.00209 5 <0.0001



Đồ thị chuẩn protein
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Hµm l- î ng protein (mg)
OD
B
Data1B



4.4.2. Tiến hành xác định hàm protein trong mẫu
Trước hết ta phải chiết mẫu bằng cách cân 3g mẫu đậu xanh rồi nghiền trong các
cối sứ được làm lạnh với dung dịch đệm phosphat 0.1N. Sau đó dùng đệm phosphat định
mức đến 200ml, như vậy mẫu đã được pha loãng 200 lần. Sau đó chia mẫu vào các ống
ly tâm và đem ly tâm trên máy li tâm ở 10000 vòng trong thời gian 15 phút. Sau khi ly
tâm ta thu phần dịch trong cho vào lọ và bảo quản lạnh để thực hiện các thí nghi
ệm tiếp
theo. Còn với mẫu sữa đậu nành thì ta lấy 2ml + 6ml nước cất (fa loãng 4 lần) để thí
nghiệm
- Sau khi chuẩn bị xong dịch chiết ta chuẩn bị dãy nhiều ống nghiệm khô sạch. Một
ống nghiệm chứa mẫu trắng đối chứng, còn ba ống chứa mẫu.
- Ta cho vào ống mẫu trắng 1ml nước cất và 5ml dung dịch C, tương tự các ống
khác ta cho vào mỗi ống 1ml mẫu và 5ml dung dịch C, để yên trong 10 phút sau đó cho
vào mỗi ống 0.5ml dung dịch Folin lắc đều để yên trong 30 phút. Sau đó đem so màu ở
bước sóng 650nm, mẫu trắng dùng để chuẩn máy so màu.

Kết quả:

Đối tượng: Độ fa loãng Không pha
loãng
2 lần 3 lần 4 lần 8 lần
Đậu xanh 0.048 0.020 0.02
0.047 0.019 0.02
0.047 0.021 0.018
TB:0.0473 0.02 0.0193

Sữa Lần 1 0.835 0.489
Lần 2 0.834 0.488
Lần 3 0.837 0.488
TB:
0.8353 0.4883


Dựa vào phương trình đồ thị chuẩn: Y = A + B * X = 0.0643 + 1.121X. Ta tính
được hàm lượng protein trong mẫu như sau:
Y đxanh: 0.0643+1.121x0.0473 = 0.117323
Y sữa: 0.0643+1.121x0.8353x4=3.809785

4.5. Nhận xét kết luận
Qua kết quả trên ta thấy hàm lượng protein trong các đối tượng khác nhau, ở trên ba
đối tượng thí nghiệm thì đậu xanh có hàm lượng protein cao nhất, tiếp đến là sữa. Và qua
kết quả này cho ta thấy được hàm lượng protein trong sữa là tương đối cao, chính vì vậy
những loại sữa này có tác dụng rất lớn trong việc cung cấp nguồn protein cho con người.
Đặc biệt thông qua bài học này giúp cho sinh viên nắm được phương pháp xây
dựng đồ thị chuẩn proetin và biết cách xác định hàm lượng protein trong mẫu, qua đó
giúp sinh viên rèn luyện được kỷ năng làm thí nghiệm.
BÀI 4: ĐỊNH LƯỢNG ACID AMIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ TRÊN
GIẤY

6.1. Mục đích yêu cầu
- Mục đích: nhằm giúp sinh viên nắm vững nguyên tắc và làm quen với phương
pháp định lượng acid amin bằng sắc ký trên giấy.
- Yêu cầu: phải chuẩn bị đầy đủ hóa chất dụng cụ thí nghiệm, các thao tác thí
nghiệm phải cẩn thận chính xác để không làm ảnh hưởng đền kết quả thí nghiệm.
6.2. Nguyên tắc
Trong quá trình chạy trên giấy sắc ký, do giấy sắc ký được cấu tạo từ các sợi
cellulose, do đó các acid amin tan trong dung môi sắc ký sẽ chạy theo các mạch với lực
mao dẫn khác nhau tùy vào trọng lượng phân tử của các acid amin. Vì vậy kết thúc quá
trình chạy sắc ký thì mỗi loại acid amin sẽ nằm ở những vị trí khác nhau cách nhau
khoảng nhất định trên giấy sắc ký. Bằng việc sử dụng các thuốc thử hiện màu, thôi màu
ta có thể định lượng được các acid amin trong mẫu thông qua việc so màu của dung dịch
thôi màu khi ngâm các vết sắc ký trong dung dịch sắc ký, ta so màu ở bước sóng 530nm.
6.3. Hóa chất dụng cụ
- Hóa chất:
+ Các acid amin chuẩn: Prolin, Valin, Lysin, Isoleusin
+ Butanol, acid acetic, nước cất
+ Ninhydrin, aceton, CuSO
4

.5H
2
O
+ Cồn methylic hoặc ethylic
- Dụng cụ:
+ Giấy sắc ký
+ Bình sắc ký
+ Máy so mày
+ Pipet, ông nghiệm
6.4. Tiến hành thí nghiệm
- Pha dung môi sắc ký (dung môi 1): butanol : aceton : nước cất = 4 : 1 : 5
- Thuốc thử hiện màu: Ninhydrin 0,5g + aceton vừa đủ 100ml.
- Thuốc thử thôi màu: CuSO
4
.5H
2
O 5mg + 22ml nước cất + cồn metylic hoặc cồn
etylic vừa đủ 100ml.
- Tiến hành định lượng acid amin: ta dùng bút chì kẻ một đường cách mép giấy sắc
ký khoảng 9-12cm, chia đường thẳng đó thành những đoạn bằng nhau cách nhau 3-4 cm,
cách hai đầu mép giấy sắc ký 5cm.
+ Dùng micropipet chấm dung dịch acid amin lên đường thẳng đã vạch sẵn, chú ý
chấm những chầm nhỏ để khô rồi mới chấm tiếp.
+ Cho giấy sắc ký vào bình sắc ký đã chứ
a sẵn dung môi ở trên và bắt đầu cho chạy
sắc ký.
+ Kết quả: ta thu được các vết acid amin khác nhau: bao gồm các vết riêng lẽ và các
vết hỗn hợp. Ta đối chiếu các vết acid amin hỗn hợp với các vết acid amin riêng lẽ ta có
thể thấy rằng vết trên của hỗn hợp là hỗn hợp của Lysin và Prolin còn vết dưới là Isoeusin
và Valin chập vào nhau. Kết quả này có thể chỉ mang tính tương đối do trong quá trình

làm thí nghiệm có thể có nhiều sai sót.
6.5. Nhận xét kết luận
Qua kết quả trên ta thấy hàm lượng acid amin trung bình của mỗi loại trong các hỗn
hợp khác nhau là khác nhau. Trong quá trình chạy sắc ký ta thấy các acid amin chạy
tương đối đều. Tuy nhiên kết quả này chỉ mang tính chất tương đối do các vệt acid amin
không nằm rời nhau trên giấy sắc ký. Qua bài thí nghiệm này giúp sinh viên nắm được
những kiến thức cơ bản cách định lượng acid amin bằng phương pháp sắc ký trên giấy.
Bài 5. Định lượng Cellulose


1. Nguyên tắc.
Phương pháp định lượng Cellulose dựa vào tính chất của nó trong một hợp chất bền
đối với tác dụng của acid mạnh và base mạnh, không bị phân hủy dưới tác dụng của acid
yếu, còn các chất khác thường đi kèm theo với cellulose như hemicellulose, lignin ít bền
với tác dụng của acid và base nên bị oxyl hóa, phân giải và tan vào dung dịch khi xử lý
nguyên liệu bằng dung dịch base hoặc hỗn hợp acid nitric với acid acetic.
2. Hóa chất
Dung dịch acid nitric đặc(d=1.4)
Dung dịch acid acetic đặc
Rượu ethylic 96%
3. Tiến hành
3.1 Đối tượng là quả hồng
Cân 1g mẫu đã nghiền nhỏ và sấy khô ở nhiệt độ không đổi, cho vào bình tam giác
250ml
Thêm vào bình 16.5ml hỗn hợp gồm 15ml acid nitric đặc và 1.5ml acid acetic đặc. Lắp
ống làm lạnh hồi lưu vào bình, đun sôi trong 30 phút. Để nguội pha loãng hỗn hợp bằng
nước nóng. Lọc qua giấy lọc đã sấy khô tuyệt đối và biết trước khối lượng.
Rửa kết tử cellulose nhiều lần bằng nước cất nóng
Rửa bằng rượu ethylic 96% một đến hai lần.
Rửa bằng ete ethylic.

Sấy giấy lọc chứa mẫu ở nhiệt độ 100-105oC đến khối lượng không đổi. Vì có thể dư lại
một lượng nhỏ hemicellulose, lignin nên cellulose gọi là cellulose thô
4. Tính kết quả
Hàm lượng cellulose được tính như sau:
W
Ax
X
100
=
Trong đó: X: Hàm lượng cellulose tính %
A: khối lượng cellulose gram
W: Khối lượng mẫu thí nghiệm
%7.0
1
100007.0
==
x
X

5. Nhận xét, kết luận
Nhận xét:
hàm lượng phần trăm cellulose trong quả hồng rất thấp (0.7%). Bởi vì, đối tượng
thí nghiệm đã chín và lượng cellulose cũn không còn nhiều.

Kết luận:
Qua bài này, em đã biết cách xác định hàm lượng cellulose thô, nó sẽ giúp ích cho
em sau này khi ra trường và đi làm. Em chân thành cảm ơn Thầy.
Bài 6. XÁC ĐỊNH PROTEIN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI SDS
1.Yêu cầu ,mục đích :

1.1 Mục đích :
- Giúp sinh viên nắm vững lý thuyết
- Biết được phương pháp xác định protein bằng phương pháp điện di SDS.
1.2 Yêu cầu :

- Chuẩn bị đầy đủ hóa chất và dụng cụ trước khi tiến hành thí nghiệm. Đọc kỹ lý
thuyết
-Thao tác nhanh nhẹn, cẩn thận.
2.Nguyên tắc :
-Điện SDS là phép phân ly các phân tử protein có khối lượng khác nhau . SDS có
điện tích âm rất lớn và có khả năng liên kết với mạch peptide để biến tích cấu trúc bặc hai
và bặc ba của protein bằng cách bọc xung quanh khung polypeptide. Như vậy , số lượng
SDS tương tác với protein tỉ lệ với khối lượng kích thước phân tử protein và điện tích
SDS bám vào và có thể làm bất cứ phân tử pprotein nào cũng chuyển động trong điện
trường từ c
ực âm sang cực dương.Do đó, bằng phương pháp điện di có thể tách biệt các
phân tử protein có khối lượng phân tử khác nhau.
3. Hóa chất và dụng cụ
3.1 Hóa chất:
1. Acrylamide 30%
Acrylamide 29 g
Bisacrylamide 1 g
Định mức 100 mL bằng nước cất 2 lần
Bảo quản 4
o
C
2. Tris 2 M (pH 8,8)
Tris base 121 g
Nước cất 2 lần 300 mL
Chỉnh pH = 8,8 bằng HCl đậm đặc

Định mức 500 ml bằng nước cất 2 lần
3. SDS 10%
SDS 10 g
Định mức 100 mL với nước cất 2 lần
4. APS 10%
APS 1g
Định mức 10 mL với nước cất 2 lần
5. TEMED
Bảo quản ở 4
o
C
6. 4X separating gel pH 8,8
Tris 2M pH 8,8 75 mL
SDS 10% 4 mL
Định mức 100 mL với nước cất 2 lần
7. 4X stacking gel pH 6,8
Tris 2M pH 8,8 25 mL
Nước cất 2 lần 25 mL
Chỉnh pH = 6,8 bằng HCl đậm đặc
SDS 10% 4 mL
Định mức 100ml với nước cất 2 lần
8. 2X SDS sample buffer
Tris 2M pH 8,8 6,25 mL
Nước cất 2 lần 30 mL
Chỉnh pH = 6,8 bằng HCl đậm đặc
SDS 4 g
Glycerol 20 mL
β- mercaptoethanol 10 mL
Bromophenol blue 0,2 g
Định mức với nước cất 2 lần tới 100 mL

Bảo quản ở -20
o
C
9. 10X Electrophresis buffer pH 8,3
Tris base 30 g
Glycine 144 g
SDS 10 g
Nước cất 2 lần 1000 mL
Chỉnh pH = 8,3 bằng HCl đậm đặc
10. Gel staining
Coomassie brilliant blue R
250
2,5 g
Methanol 450 mL
Glacial acid acetic 100 mL
Nước cất 2 lần 450 mL
11. Gel destaining
Methanol 300 mL
Glacial acetic acid 100 mL
Nước cất 2 lần 600 mL

12.Dung dịch gel destaining
13. Nước cất

14.(NH
4
)
2
SO
4

3.2 Dụng cụ :
-Micro pipet,máy chạy điện di, máy ly tâm,giấy thấm,hộp nhựa.
3.3 Đối tượng :
-Thơm.
4. Các bước tiến hành:
4.1. Đổ gel
Bước 1: Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất đầy đủ.
Bước 2: Lau sạch các tấm kính bằng ethanol, sau đó lau lại thật sạch bằng nước cất.
Gắn các tấm kính vào giá đỡ. Thử độ thấm lắp ghép bằng nước cất, nếu nước chảy ra từ
khe ghép nhiều thì phải làm lại.
Bước 3: Pha dung dịch separating gel 12%.
DW 1,68 mL
Acrylamide 1,92 mL
Separating buffer 1,2 mL
TEMED 6
μL
APS 30
μL
Vortex khoảng 1 - 2 phút, đổ nhanh vào giữa 2 tấm kính đã chuẩn bị sẵn lên đến
hơn 3/4 độ cao tấm kính. Cho nhanh nước cất vô trùng vào bên trên gel. Sau khi đông
(kiểm tra bằng dung dịch thừa ở ngoài hoặc thấy vạch phân cắt ở 2 pha trên gel), nghiêng
gel lại cho nước chảy ra hết và làm khô bề mặt gel bằng giấy thấm.
Bước 4: Pha dung dịch stacking gel 5%
DW 0,88 mL
Acrylamide 260
μL
Stacking buffer 380
μL
TEMED 2

μL
APS 12
μL
Vortex khoảng 1 phút, đổ nhanh vào giữa 2 tấm kính, bên trên separating gel cho
hết độ cao tấm kính. Cẩn thận đặt lược vào giữa 2 tấm kính sao cho không có bọt khí.
Theo dõi gel đông, cứ khoảng 2 phút dùng pipette thêm stacking gel vào phía trên lược để
bổ sung lương gel bị chảy ra ngoài (nếu có).
4.2. Chuẩn bị mẫu:
-Mẫu được chuẩn bị như ở bài định lượng prôtein bằng phương pháp Bradford.
Bước 5: Tính toán lấy 5 mẫu chứa khoảng 30
μg protein và 5 μL sample buffer, 5
mẫu chứa 20
μg protein và 5 μL sample buffer.5 mẫu chứa 10 μg protein và 5 μL sample
buffer.1 mẫu là dung dịch chuẩn.
4.3. Chạy điện di
Bước 6: Cho gel vào buồng điện di, đổ ngập bằng đệm chạy (1X Electrophoresis
buffer). Chú ý không để bọt khí ở phía dưới tấm kính, dùng pipette làm sạch gel thừa
trong các giếng. Chạy prerun khoảng 5 phút ở 80 - 100 V.
Bước 7: Dùng Hamilton syringe load mẫu vào các giếng, cẩn thận để mẫu không bị
tràn ra ngoài.
Bước 8: Chạy điện di ở điện thế 60 V trong khoảng từ 3 giờ cho đến khi vạch màu đi
hết độ dài tấm kính (thời gian thay đổi tùy theo mẫ
u).
4.4. Nhuộm và rửa gel
Bước 9: Lấy gel ra khỏi buồng điện di, cho vào dụng cụ nhuộm (thường là các hộp
nhựa) có chứa dung dịch gel staining, lắc nhẹ khoảng 25 vòng/phút trong khoảng từ 10 -
15 phút.
Bước 10: Rửa gel bằng dung dịch gel destaining trên máy lắc nhẹ, khoảng 10 phút
thay dung dịch rửa 1 lần cho đến khi hoàn thành.
5.Kết quả :

- Hàm lượng protein của thơm tương đối thấp.
6.Kết luận:
-Hàm lượng protein tương đối thấp.
-Biết được nguyên tắc của việc xác định protein bằng phương pháp điện di SDS




Bài 7. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD

1.Mục đích,yêu cầu :
1.1.Mục đích:
-Giúp sinh viên nắm vững lý thuyết
- Biết được phương pháp xác định protein tổng số
1.2.Yêu cầu:
- Phải nắm vững kiến thức lý thuyết về phương pháp xác định protein tổng số,
phải chuẩn bị đầy đủ hóa chất dung cụ thí nghiệm. Trong quá trình tiến hành thí nghiệm
phải hết sức cẩn thận để tránh những sự cố đáng tiếc và ảnh hưởng đến kết quả thí
nghiệm.
2. Nguyên tắc :
-Xác định hàm lượng protein tổng số trên 1g dựa vào phương pháp Bradford bằng
cách đo hấp thụ quang của dịch chiết protein ở λ=595 nm và tính toán hàm lượng protein
theo đường chuẩn albumin huyết thanh bò.
3.Dụng cụ và hóa chất:
3.1. Dung cụ:
-Micro pipet,cối,chày,giấy lọc,
-Máy lọc chân không,máy do OD,máy ly tâm.
3.2 Hóa chất :
- Dung dịch Bardford 1X ,thuốc thử nihidrin (NH

4
)
2
SO
4
.
4. Tiến hành thí nghiệm:
4.1 Đối tượng:
- Quả thơm
4.2 Cách chuẩn bị mẩu chiết:
-Lấy 5g thịt quả thơm nghiền nát sau đó hòa tan 20ml với nước cất rồi lọc chân
không.Tiếp tục dùng nước cất tráng bã sau khi lọc cho đến lúc hết protein trong bã bằng
cách thử thuốc thử nihidrin
-Kết tủa thuận nghịch dung dịch thu được bằng (NH
4
)
2
SO
4
.
5 Tiến hành :
-Mẫu sau khi lọc thì ly tâm với độ 15000 vòng/phút ở 4
o
c dùng micro pipet hút 4
μL dung dịch mẫu và 200 μL dung dịch bardford 1X vorter 30 giây sau đó đo OD ở
bước sóng 595 nm và tiến hành do lặp lại 3 lẫn
-Mẫu blank thay mẫu bằng nước cất.
6.Kết quả :
-Đường chuẩn protein có phương trình là:
Y = 0.0643 + 1.121* X

- Trong đó:
Y: Hàm lượng protein
X: Chỉ số OD
X
1
= 0.916
X
2
= 0.92
X
3
= 0.917
X =( 0.916 + 0.92 + 0.917) /3 = 0.918
Thay vào phương trình ta được hàm lượng protein trong 1g
Y =( 0.0643 + 1.121 * 0.918 ) /5= 0.2187 g

7.Kết luận:
- Hàm lượng protein tương đối thấp