Nghiên cứu nhân giống in vitro cây đinh lăng lá nhỏ (Polycias fruticosa L. Harm)

Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là nghiên cứu do tôi trực tiếp thực hiện. Các số liệu
và kết quả trong luận văn là trung thực. Tôi cam đoan rằng các thông tin, trích dẫn
của luận văn đó được chỉ dẫn nguồn gốc và nghiên cứu đầy đủ. Nếu sai tôi hoàn
toàn chịu trách nhiệm.
Sinh viên
Nguyễn Thị Bảo Ngọc

LỜI CẢM ƠN
1

Để hoàn thành được luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
1

Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

Ban giám hiệu nhà trường, các thầy cô giáo, kĩ thuật viên phòng thí
nghiệm - Khoa Nông học - Trung tâm Công nghệ sinh học - Trường Đại học
Nông - Lâm Bắc Giang đã tạo điều kiện tốt nhất giúp đỡ tôi trong suốt thời
gian thực tập tốt nghiệp tại trường.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Th.S Nguyễn Thị Chuyên, đã
tận tình chỉ bảo, hướng dẫn động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi
trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè đã
luôn động viên, khích lệ, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học
tập và nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn!
Sinh viên
Nguyễn Thị Bảo Ngọc

MỤC LỤC

2
Khóa luận tốt nghiệp

2
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
BA
Cs

: Benzyl-amino-purine
: Cộng sự

CT

: Công thức

CV

: Coeficient of Variation

Đ/C

: Đối chứng

IBA

: Indole-3-butyric acid

Kineti

: Furfurylaminopurine

LSD

: Least Significant Difference Test

MS

: Murashige and skoog

NAA

: Naphthalene Acetic Acid

3
Khóa luận tốt nghiệp

3
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

4
Khóa luận tốt nghiệp

4
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài

Nguồn tài nguyên cây thuốc của Việt Nam rất phong phú, đa dạng và
có nhiều cây thuốc quý. Trong số đó có cây Đinh lăng.
Đinh lăng (PolysciasfruticosaL.Harms) có tác dụng hồi phục sức khỏe,
chống stress, tăng khả năng chịu đựng của cơ thể, giảm rối loạn tiền đình,
phòng chống nhiễm ký sinh trùng sốt rét, bức xạ siêu cao. Đinh lăng còn có
tác dụng kháng viêm, giảm đau, chống xơ vữa động mạch dựa trên tác dụng
hạ cholesterol toàn phần và lipid toàn phần trong huyết thanh (Nguyễn Thị
Thu Hương và cs, 2001).
Đinh lăng có nhiều loài thuộc chi Polyscias, như Đinh lăng lá trổ, Đinh
lăng lá ráng, Đinh lăng lá tròn và Đinh lăng lá nhỏ…. Trong đó loài đinh lăng
lá nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) Harms) là loài được dân gian sử dụng rộng rãi
làm thuốc tăng cường sức khỏe và hoạt huyết dưỡng não từ rất lâu đời (Phạm
Hoàng Hộ, 1999).
Đã từ lâu, y học cổ truyền nước ta đã dùng Đinh lăng lá nhỏ dưới dạng
thuốc sắc, rượu ngâm hoặc bột khô để chữa ho, tắc tia sữa, làm lợi sữa, làm
thuốc chữa kiết lỵ, thuốc tăng lực cho các đô vật trong dịp hội hè. Đặc biệt
rượu và nước sắc rễ Đinh lăng lá nhỏ ngày xưa được các lương y dùng để
chữa chứng suy nhược cơ thể, làm thuốc bổ tăng lực. Trong dân gian, ngoài
công dụng ăn gỏi cá có nơi dùng Đinh lăng chữa ho, ho ra máu, thông tiểu,
thông sữa, kiết lỵ nặng. Tại Ấn Độ, theo K. M. Naikairai, Đinh lăng được
dùng chữa sốt, làm săn da (Đỗ Tất Lợi, 2004)
Trong Đinh lăng có 2 hợp chất chính và quan trọng là polyacetylen và
saponin (Vo et al., 1998). Hợp chất saponin, đặc biệt là triterpen có tác dụng tích
cực chống oxy hóa, chống stress và các triệu chứng trầm cảm. Hợp chất
polyacetylen có vai trò chống ung thư, chống oxy hóa, kháng khuẩn và kháng

5
Khóa luận tốt nghiệp

5

Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

nấm. Ngoài ra trong Đinh lăng còn chứa 20 acid amin và các loại acid amin không
thay thế được như lysine, methionin, tryptophan, cysteine (Ngô Ứng Long, 1985).
Trong đó, hai hợp chất polyacetylen panaxynol và hepadeca 1,8 (e) dien - 4,6 diyn - 3,10 diol trong cây Đinh lăng cũng có chủ yếu trong nhân
sâm, điều này cho thấy có khả năng sử dụng Đinh lăng để thay thế cho nhân
sâm (Nguyễn Trần Châu và cs, 2007).
Trong khi đó, một trong các nguyên nhân khiến cho các sản phẩm chứa
Đinh lăng còn khá ít trên thị trường là do nguồn cung cấp cây giống chủ yếu là
giâm cành, chất lượng cây giống lại không cao, nếu trồng theo phương pháp tự
nhiên thì mất 3-5 năm mới thu hoạch rễ và hàm lượng saponin triterpen tự nhiên
trong cây không đủ đáp ứng nhu cầu về dược liệu. Việc đáp ứng nhanh và bền
vững nguồn cây giống có chất lượng tốt đang là yêu cầu cấp bách.
Việc ứng dụng công nghệ nhân giống in vitro trên cây Đinh lăng là
phương pháp ưu việt nhằm thu nhận nguồn nguyên liệu ổn định, cây giống
đồng đều, sạch bệnh, làm tăng hoạt chất sinh học so với nguyên liệu ban đầu.
Phương pháp này đã được áp dụng rộng rãi trên thế giới cũng như ở Việt Nam
đây là một hướng đi tương đối mới, cho nhiều tiềm năng kinh tế đang được
các nhà khoa học cũng như các nhà nhân giống quan tâm từ mức độ nghiên
cứu đến quy mô sản xuất thương mại.
Để đáp ứng những nhu cầu thực tế trên, tôi quyết định thực hiện đề
tài: “Nghiên cứu nhân giống in vitro cây đinh lăng lá nhỏ (Polycias
fruticosa L. Harm)”
2. Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu quy trình nhân giống Đinh lăng lá nhỏ bằng kỹ thuật in

vitro để nhân nhanh giống cây Đinh lăng lá nhỏ.
3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl 2
0.1% đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm và vi khuẩn.
6
Khóa luận tốt nghiệp

6
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Cytokine (kinetine,BA)
đến khả năng nhân nhanh chồi cây Đinh lăng lá nhỏ .
Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Cytokine thích hợp nhất
kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Đinh lăng lá nhỏ.
Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng NAA đến khả năng ra rễ
của chồi cây Đinh lăng lá nhỏ.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp tài liệu khoa học về ảnh
hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của
giống cây Đinh lăng lá nhỏ bằng phương pháp in vitro.
Kết quả nghiên cứu góp phần phát triển việc nghiên cứu kỹ thuật nhân
giống cây dược liệu nói chung và cây Đinh lăng nói riêng.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu thành công sẽ bổ sung tài liệu tham khảo phục vụ

cho giảng dạy và các nghiên cứu khác. Đồng thời nâng cao kỹ năng tiếp cận
công tác nghiên cứu khoa học phục vụ cho sau này.
Góp phần nhân giống cây Đinh lăng, tạo ra một số lượng cây giống lớn,
đồng đều có chất lượng cao để cung cấp phục vụ cho sản xuất và thị trường
tiêu dùng.

7
Khóa luận tốt nghiệp

7
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nguồn gốc và vị trí phân loại cây Đinh lăng
Đinh lăng có nguồn gốc ở vùng đảo Polynésie thuộc cộng hòa Pháp
nằm ở phía nam Thái Bình Dương. Tên khoa học của Đinh lăng là Polyscias
fruticosa L.Harms, được L.Harms mô tả và định tên vào năm 1894. Ngoài ra,
Đinh lăng còn có tên gọi khác là cây gỏi cá hay cây Nam dương lâm.
- Loài: P. fruticosa
- Chi: Polyscias
- Phân họ: Aralioideae
- Họ: Araliaceae - Họ ngũ gia bì
- Bộ: Apiales
- Lớp: Dicolyledoneae - Lớp hai lá mầm

- Ngành: Magnoliophyta - Ngành Mộc lan
- Giới: Plantae - Giới thực vật
Chi Polyscias có gần 100 loài, phân bố rải rác ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt,
nhất là một số đảo ở Thái Bình Dương. Ở Việt Nam, có 7 loài, đều là cây trồng (Đỗ
Huy Bích và cs, 2004).
1.2. Đặc điểm sinh thái
Đinh lăng là loại cây chịu hạn, không ưa nước, phát triển tốt ở vùng
đất, tơi xốp có độ ẩm trung bình (Nguyễn Bá Hoạt, 2005) . Cây cũng có thể
chịu bóng râm, trồng được trên nhiều loại đất, thậm chí với một lượng đất rất
ít trong chậu nhỏ, cây vẫn có thể sống được theo kiểu cây cảnh bonsai ((Đỗ
Huy Bích và cs, 2004). Đinh lăng sinh trưởng mạnh vào mùa xuân hè, ra hoa
và quả vào tháng 4 đến tháng 7. Cây trồng ở các tỉnh phía bắc có hiện tượng
tàn lụi vào mùa đông do khí hậu lạnh, thường trồng bằng cành sau 2 đến 3
năm thì cây có quả, hạt. Đinh lăng có khả năng tái sinh dinh dưỡng mạnh
nhưng chưa quan sát được cây con mọc từ hạt. Cây thường được trồng bằng
8
Khóa luận tốt nghiệp

8
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

cách giâm cành, cây được 4 đến 5 tuổi trở lên sẽ cho nhiều hoạt chất nhất.
(Đỗ Huy Bích và cs, 2004).
1.3. Đặc điểm hình thái
Đinh lăng (Polyscias fruticosa L. Harm.) thuộc họ Ngũ gia bì

(Araliaceae) nên nó mang một số đặc điểm chung của họ này như: Là cây
thân gỗ hay cây bụi, đôi khi là các cây thân thảo sống lâu năm, chúng thường
có lá kép hình lông chim hay hình chân vịt và có các hoa nhỏ mọc thành chùy
lớn, rễ cây có dáng như người gồm một rễ cái và nhiều rễ phụ. Tuy nhiên,
Đinh lăng cũng có một số đặc điểm riêng dùng để phân biệt với các loài khác
như sau:
• Thân
Đinh lăng là loại cây gỗ nhỏ, dạng bụi, xanh tốt quanh năm, cây thường
cao 1 - 1,5 m (có thể cao đến 2m hoặc hơn). Vỏ thân màu trắng nhạt, hơi xám,
thân nhẵn, không có gai, ít phân nhánh, phân cành thấp, thân mang nhiều vết
sẹo lá to hình chữ V, máu xám và những nốt lỗ vỏ, vỏ thân có mùi thơm nhẹ
(Đỗ Tất Lợi, 2003).
• Lá
Lá kép ba lần lông chim, mọc so le, dài 20 - 40 cm, không có lá kèm rõ.
Lá chét có cuống nhỏ mảnh dài 3 - 15 cm, dạng màng, phiến lá chét có răng
cưa không đều, đôi khi chia thùy, gốc và đầu thuôn nhọn, có chóp nhọn, dài 3
- 10 cm, rộng 0,6 - 4 cm. Cuống lá dài, phát triển thành bẹ to ở phần cuối. Lá
có mùi thơm khi vò nát (Đỗ Tất Lợi, 2003).
• Hoa
Hoa nhỏ thành cờ, tán ngắn dài 7 - 18 cm, cụm hoa mọc ở ngọn thành
chùy ngắn mang nhiều tán, mỗi tán có 15 - 20 hoa nhỏ, lá bắc rộng, sớm rụng.
Đài hoa hình chén, gồm 5 lá đài. Hoa nhỏ, màu lục nhạt hoặc trắng xám, có 5
cánh hình trứng thuôn dài 2 - 3 mm, có 5 nhị, chỉ nhị ngắn và mảnh, dài khoảng
1,5 mm, bao phấn kéo dài, bầu hạ, 2 ô, có rìa trắng nhạt (Đỗ Tất Lợi, 2003).
9
Khóa luận tốt nghiệp

9
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A

Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

• Quả
Quả dẹt, hình trứng rộng, màu tráng bạc, dài 4 - 5 mm, rộng 3 mm và
dày 1,5 - 2 mm, có vòi tồn tại. Hạt hình thận và hình khối 3 cạnh màu trắng,
kích thước 1 - 3 mm, vỏ hạt lồi lõm. Cây ra hoa, quả vào tháng 4 đến tháng 7
(Từ điển bách khoa dược học, 1999).
• Rễ
Rễ hình củ cà rốt, cong queo, dài 15 - 30 cm, đường kính 0,5 - 2,5
cm, đầu trên to, phía dưới thuôn nhỏ. Mặt ngoài màu trắng xám, có nhiếu nếp
nhăn dọc, nhiều lỗ bì nằm ngang, nhiều vết tích của rễ con và các đoạn rễ còn
sót lại. Thường hợp thành một bó rễ củ, thể chất cứng giòn, dễ bẻ gãy, mặt bẻ
lởm chởm, mặt cắt ngang màu vàng, gỗ chiếm 2/3 bán kính, các tia ruột từ
giữa tỏa ra, mùi thơm nhẹ, vị hơi ngọt (Từ điển bách khoa dược học, 1999).
Trong tự nhiên, dễ có sự nhầm lẫn giữa các cây cùng tên Đinh lăng
nhưng không được dùng làm thuốc như:
+ Đinh lăng lá tròn (Polyscias balfouriana Baill.): Lá thường chỉ có 3
lá chét trên một cuống dài, lá chét hình tròn, đầu tù.
+ Đinh lăng lá to hay Đinh lăng lá ráng (Polyscias ilicifolia (Merr.)
Baill.): Lá kép, có 11 - 13 lá chét, lá chét hình mác có răng cưa to và sâu.
+ Đinh lăng trổ hay Đinh lăng viền bạc (Polyscias guilfoylei Baill.): Lá
kép có 7 lá chét, lá chét thường có viền trắng. Loại này lại có 2 thứ là:
- Polyscias guilfoylei Baill. var. laciniata Baill.
- Polyscias guilfoylei Baill. var. victoriae Baill.
1.4. Thành phần hóa học
Vỏ, rễ và lá Đinh lăng chứa saponin, alkaloit, các vitamin B1, B2, B6,
C, 20 axit amin, glycosit, phytosterol, tanin, axit hữu cơ, tinh dầu, nhiều

nguyên tố vi lượng: K, Mn, Ca, Mg, Fe, Lo, Zw và 21,10 % đường. Trong lá
còn có saponin tripterpen (1,65 %), một genin đã xác định được là axit
oleanolic (Đỗ Huy Bích và cs, 2004).
10
Khóa luận tốt nghiệp

10
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

Từ lá Đinh lăng, trung tâm sâm và dược liệu TP.Hồ Chí Minh thuộc Viện
Dược liệu đã phân lập được năm hợp chất polyacetylen là panaxynol,
panaxydol, heptadeca - 1,8 (E) - dien - 4,6 diyn - 3,10 diol, heptadeca - 1,8 (E)
- dien - 4,6 diyn - 3 ol - 10 on và heptadeca - 1,8 (Z) - dien - 4,6 diyn - 3 ol - 10
on. Hai hợp chất sau chỉ có trong lá Đinh lăng mà chưa thấy có trong các cây
khác thuộc chi Panax và họ Araliaceae, điều đó nói lên sự độc đáo về mặt hóa
học của Đinh lăng. Trong rễ Đinh lăng cũng tìm thấy năm hợp chất
polyacetylen nhưng chỉ có panaxydol, panaxynol và heptadeca - 1,8 (E) - dien 4,6 diyn - 3,10 diol là trùng hợp với các chất trong lá. Ba chất này có tác dụng
kháng khuẩn mạnh và chống một số dạng ung thư (Đỗ Huy Bích và cs, 2004).
Hai hợp chất chính và quan trọng trong cây Đinh lăng là polyacetylen và
saponin tripterpen. Trong đó, hợp chất polyactylen tác chiết được có tính kháng
khuẩn rất mạnh và kháng một số dạng ung thư, còn hợp chất saponin tripterpen
có tác dụng chống stress, chống trầm cảm, chống oxy hóa rất tốt. Đồng thời,
hai hợp chất panaxynol và heptadeca - 1,8 (E) - dien - 4,6 diyn - 3,10 diol trong
cây Đinh lăng cũng là hai hợp chất chủ yếu trong cây Nhân sâm, điều này cho
thấy khả năng sử dụng Đinh lăng thay thế Nhân sâm làm thuốc chữa bệnh

(Trần Công Luận và cs, Công trình nghiên cứu khoa học 1987-2000).
1.5. Tình hình sử dụng Đinh lăng ở Việt Nam và trên thế giới
1.5.1. Trên thế giới
Cây Đinh lăng có nguồn gốc từ đảo Polynésie ở Thái Bình Dương.
Hiện nay, cây được trồng rộng rãi ở Malaysia, Indonesia, Campuchia, Lào,
Việt Nam, Trung Quốc (Đỗ Huy Bích và cs, 2004).
Tại Ấn Độ, theo Naikarai K.M., Đinh lăng được dùng làm thuốc săn da
và trị sốt. Tại Trung Quốc, Đinh lăng được sử dụng để tăng cường sức khỏe,
chữa chứng mất ngủ, chữa ho, dị ứng… Ở Campuchia, người ta còn dùng lá
phối hợp với các loại thuốc khác làm bột hạ nhiệt và cũng dùng làm thuốc
giảm đau.
11
Khóa luận tốt nghiệp

11
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

1.5.2. Ở Việt Nam
Đinh lăng đã xuất hiện từ rất lâu trong nhân dân và được trồng khá phổ
biến ở vườn gia đình, đình chùa, trạm xá, bệnh viện… để làm cảnh, làm thuốc
và rau gia vị (Đỗ Huy Bích và cs, 2004).
Trong y học cổ truyền, Đinh lăng được sử dụng nhiều trong điều trị các
căn bệnh như ho ra máu, dị ứng, mẩn ngứa, làm lành vết thương, lợi tiểu, kiết
lị nặng, tăng sức dẻo dai của cơ thể… Lá Đinh lăng phơi khô đem lót gối hoặc
trải giường cho trẻ em nằm phòng bệnh kinh giật. Phụ nữ sau khi sinh uống

nước sắc lá Đinh lăng khô, thấy cơ thể nhẹ nhõm khỏe mạnh, có nhiều sữa, lá
tươi 50 - 100g băm nhỏ cùng với bong bóng lợn, trộn với gạo nếp nấu cháo ăn
cũng lợi sữa. Cả thân, rễ và lá Đinh lăng đều có thể sử dụng nhưng rễ tốt hơn
thân và lá (Võ Văn Chi, 2004), (Lê Trần Đức, 1997).
Hiện nay, để thuận tiện hơn cho việc sử dụng đinh lăng làm thuốc, Công
ty cổ phần Dược phẩm Traphaco đã sản xuất cao đặc Đinh lăng dưới dạng
thuốc bổ, viên nén hoạt huyết dưỡng não. Ngoài ra, còn có một số chế phẩm từ
Đinh lăng hiện dùng như tinh sâm PANA (Viện Y học Quân sự), rượu thuốc
ngọt, viên ngậm DINLAN (Trung tâm Sâm Việt Nam), trà Đinh lăng...
1.6. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.6.1. Sơ lược lịch sử nuôi cây mô tế bào thực vật
Năm 1838, hai nhà sinh vật học người Đức Schleiden và Schwan đã
đề xướng thuyết tế bào và nêu rõ: “Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm
nhiều đơn vị nhỏ, các tế bào hợp thành. Các tế bào phân hóa đều mang các
thông tin di truyền có trong các tế bào đầu tiên, đó là trứng sau thụ tinh, và
là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể” (Nguyễn
Đức Thành, 2000).
Năm 1902, Harberland là người đầu tiên đã quan niệm rằng bất kì một tế
bào nào của cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành
một cá thể hoàn chỉnh. Ông đã cho rằng “Bằng nuôi cấy mô tế bào đã phân lập,
12
Khóa luận tốt nghiệp

12
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

người ta có thể tạo ra các phôi nhân tạo từ các tế bào sinh dưỡng”. Ông cũng đã
tiến hành nuôi cấy mẫu lá của một số cây lá mầm như: Erythronium,
Tradescantia, tuy nhiên đã không thành công (Vũ Văn Vụ và cs, 2009).
Năm 1922, Kotte, học trò của Harberland và Robbins, người Mỹ, lặp lại
thực nghiệm của Haberland với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hoà
thảo. Trong môi trường lỏng gồm có muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh
trưởng khá mạnh, tạo nên một hệ rễ nhỏ mang cả rễ phụ. Tuy nhiên, sự sinh
trưởng như vậy chỉ tồn tại trong một thời gian sau đó chậm dần và dừng lại,
mặc dù các tác giả đã chuyển sang môi trường mới (Nguyễn Đức Thành, 2000)
.
Năm 1934, được xem là giai đoạn thứ hai của nuôi cấy mô và tế bào
thực vật khi White thành công trong việc duy trì mô rễ cây cà chua trong môi
trường lỏng có chứa muối khoáng, đường saccarozơ và dịch chiết nấm men.
Qua thí nghiệm, ông thấy rằng có thể thay dịch chiết nấm men bằng các
vitamin nhóm B (B1, B3, B6) (Dodd J. H., Roberts L. W, 1999).
Năm 1939, độc lập với Nobercourt, Gautheret cũng đã duy trì được sinh
trưởng của mô sẹo cà rốt trong một thời gian dài. Năm 1941, Van Overbeek và
cộng sự đã phát hiện thấy nước dừa có ảnh hưởng tích cực đến sự phát sinh phôi
và tạo mô sẹo ở cây họ cà (Dodd J. H., Roberts L. W, 1999). Cũng trong thời
gian này, nhiều chất điều hoà sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin như NAA,
2,4-D đã được tổng hợp. Nhiều tác giả xác nhận cùng với nước dừa, 2,4-D và
NAA đã giúp tạo mô sẹo thông qua phân chia tế bào ở nhiều đối tượng thực vật
mà trước đó rất khó nuôi cấy (Nguyễn Kim Thanh, 2005).
Năm 1954, Skoog bổ sung chế phẩm ADN chiết từ tinh dịch cá bẹ vào
môi trường nuôi cấy mô thân cây thuốc lá. Ông nhận thấy chế phẩm này có
tác dụng kích thích sinh trưởng mô nuôi cấy rõ rệt. Một năm sau, Skoog và
cộng sự đã xác nhận chất gây ra hiện tượng trên là 6-furfuryl amino purine và
đặt tên là kinetin. Sau đó người ta đã tìm ra và tổng hợp một số chất có tác
13

Khóa luận tốt nghiệp

13
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

dụng kích thích phân bào tương tự như kinetin và cùng với kinetin gọi chung
là nhóm cytokinin. Cytokinin được tách chiết từ thực vật bậc cao đầu tiên là
zeatin có trong mầm ngô. Các hợp chất này có khả năng kích thích sự phân
chia tế bào của các mô đã biệt hoá cao như tế bào thịt lá hoặc nội nhũ của hạt
đã phơi khô (Dodd J. H., Roberts L. W, 1999).
Nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, Morel (1960) đã tạo ra được các
protocorm (mô sẹo) từ địa lan. Khi để trong các điều kiện nhất định, các
protocorm có thể phát triển thành cây lan con và hoàn toàn sạch bệnh. Cùng
năm đó, Cocking ở trường đại học tổng hợp Nottingham đã thu được các tế bào
trần (protoplast) dùng cho nuôi cấy từ mô thực vật được xử lý với enzym
xenlulaza. Năm 1966, Guha và cộng sự đã tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy túi
phấn của cây cà độc dược (Datura inoxia). Việc tạo cây đơn bội thành công ở
nhiều loài thực vật thông qua nuôi cấy bao phấn và hạt phấn đã đóng góp rất
lớn cho các ngiên cứu di truyền và lai tạo giống (Vũ Văn Vụ và cs, 2009).
Từ những năm 1970 trở đi, các nhà khoa học đã chú ý vào triển vọng
của kỹ thuật nuôi cấy protoplast, khi hai tác giả người Nhật Bản là Nagata và
Takebe đã thành công trong việc làm cho protoplast thuốc lá tái tạo được
xenlulozo. Năm 1978, Melchers và cộng sự đã lai tạo thành công protoplast
của cà chua với protoplast của khoai tây, mở ra một triển vọng mới trong lai
xa ở thực vật (Vũ Văn Vụ và cs, 2009).

1.6.2. Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là quá trình nuôi cấy in vitro các nguyên
liệu như đoạn thân, đoạn rễ, vảy củ hay mẫu mô, cánh hoa có kích thước phù
hợp được nuôi cấy trong ống nghiệm với điều kiện vô trùng và môi trường
thích hợp để tạo thành mô hay cây hoàn chỉnh (Vũ Văn Vụ và cs,2009).
Ưu điểm của phương pháp này là: Cho hệ số nhân giống cao nên có
thể tạo ra số lượng cây lớn trong thời gian ngắn; Thực hiện quanh năm không

14
Khóa luận tốt nghiệp

14
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên; Tạo ra cá thể mới giữ được đặc tính của cây
ban đầu (Nguyễn Ngọc Dung, 1998), (Ngô Ứng Long, 1985).
1.6.3. Tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vậy
Trong nhiều thập kỷ qua, nuôi cấy mô tế bào thực vật đã phát triển
mạnh mẽ ở nhiều quốc gia trên thế giới. Có thể nói đây là công cụ cần thiết
trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của nghành sinh học
Nhờ áp dụng các kĩ thuật nuôi cấy mô như: nuôi cấy mô phân sinh, callus,
nuôi cấy phôi, nuôi cấy rễ tơ, nuôi cấy tế bào trần... con người đã thúc đẩy thực
vật sinh sản nhanh hơn, gấp nhiều lần tốc độ vốn có trong tự nhiên. Điều này sẽ
góp phần tạo ra hàng loạt các cá thể mới giữ nguyên các tính trạng di truyền của
cơ thể mẹ và rút ngắn thời gian để đưa một giống mới vào sản xuất với quy mô

lớn (Nguyễn Hoàng Lộc, 2006), (Vũ Văn Vụ và cs, 2008).
Ngoài ra, dựa vào kỹ thuật nuôi cấy, có thể duy trì và bảo quản được
nhiều giống cây trồng quý hiếm, hoặc loại bỏ các mầm bệnh của những loài sinh
vật sinh dưỡng. Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần có thể tạo ra
những con lai về mặt di truyền mà phương pháp nhân giống cổ điện không thực
hiện được. Bên cạnh đó, các nhà nghiên cứu đã thu nhận các chất trao đổi thứ
cấp từ tế bào nuôi cấy, dẫn đến sự ổn định và độc lập hơn, ít lệ thuộc vào sản
xuất thực vật ở ngoài tự nhiên “Mở ra triển vọng sử dụng kỹ thuật này để nuôi
cấy sinh khối lớn có khả năng tổng hợp những chất sinh học để thu nhận các
hợp chấp trên quy mô công nghiệp” (Quách Thị Liên, 2004).
Ưu điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vật trong điều kiện in vitro dễ sản
xuất các hợp chất thứ cấp:
Các tế bào thực vật có thể được nuôi cấy trong điều kiện nhân tạo mà
không phụ thuộc vào thời tiết và địa lý. Không cẩn thiết để vận chuyển và bảo
quản một số lượng lớn các nguyên liệu thô.
Có thể kiểm soát chất lượng và hiệu quả sản phẩm bằng cách loại bỏ
những trở ngại trong quá trình sản xuất thực vật, như là chất lượng của
15
Khóa luận tốt nghiệp

15
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

nguyên liệu thô, sự đồng nhất giữa các lô sản xuất và sự hư hỏng trong quá
trình vận chuyển và bảo quản.

Một số sản phẩm trao đổi chất được sản xuất được từ nuôi cấy mô dịch
huyền phù có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh (Nguyễn Hoàng Lộc, 2006).
Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung các kỹ thuật nhân giống vô
tính cổ điển như dâm cành, dâm chồi, chiết, ghép, tách dòng... một kỹ thuật
tiến bộ với những ưu thế như tính khả thi rộng, tốc độ nhân giống cực kỳ cao
và có tiềm năng công nghiệp hóa (Lê Trần Bình, 1997).
Một ý nghĩa không kém phần quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật là
mở ra những hướng mới trong nghiên cứu sinh lý và di truyền thực vật như: cơ
chế tổng hợp các chất, sinh lý phân tử, di truyền - đột biến, sinh lý sinh dưỡng ở
các tế bào thực vật và nhiều đề sinh học khác…(Vũ Văn Vụ và cs, 2008).
1.6.4. Tính toàn năng của tế bào thực vật
Năm 1902, Nhà Sinh lý thực vật học người Đức Haberlandt, đã tiến hành
nuôi cấy các tế bào thực vật để chứng minh tế bào là toàn năng. Haberlandt cho
rằng mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều có khả năng tiềm tàng để phát
triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Ông nhận thấy, mỗi tế bào của cơ thể đa bào
đều phát sinh từ hợp bào thông qua quá trình phân bào nguyên nhiễm. Điều đó có
nghĩa là mỗi tế bào của một sinh vật sẽ chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết
của một cơ thể hoàn chỉnh. Khi gặp điều kiện thuận lợi nhất định, những tế bào đó
có thể sẽ phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh.
Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì: “Tất cả mọi tế bào của một cơ
thể đều chứa bộ gene y hệt nhau, do đó tất cả các tế bào của một cơ thể có tiềm
năng tổng hợp những kiểu protein – enzym giống hệt nhau và nếu được nuôi
trong môi trường thích hợp đều có thể phát triển thành cây nguyên vẹn đặc trưng
cho loài cụ thể và ra hoa, kết trái bình thường. Khả năng đó của tế bào được gọi
là tính toàn năng của tế bào thực vật” (Nguyễn Đức Thành, 2002).

16
Khóa luận tốt nghiệp

16

Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt đã đưa ra chính là cơ sở lí
luận của nuôi cấy mô tế bào thực vật. Cho đến nay, con người đã hoàn toàn
chứng minh được khả năng tái tạo của một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một
tế bào riêng rẽ (Nguyễn Đức Thành, 2002).
1.6.5. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
Theo (PGS.TS Nguyễn Quang Thạch, 2015): Cơ thể thực vật trưởng
thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác
nhau. Tuy nhiên, tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên
(tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử phân chia hình thành nhiều tế
bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa).
Sau đó từ tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các
tế bào chuyên hóa đặc biệt cho các mô, cơ quan khác nhau của cơ thể.
Tế bào phôi sinh -> Tế bào dãn -> Tế bào phân hóa có chức năng riêng biệt.
Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng
chuyên hóa, chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình. Trong
trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế
bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ cho ra các tế bào mới có khả năng tái
sinh thành cây hoàn chỉnh. Qúa trình này gọi là quá trình phản phân hóa tế
bào,ngược lại với phân hóa tế bào. Sự phân hóa và phản phân hóa được biểu
thị bằng biểu đồ:

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là
kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào

17
Khóa luận tốt nghiệp

17
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

thực vật xét đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực
vật một cách có định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào.
Trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật (Nguyễn Đức Thành, 2002).
1.7. Một số yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.7.1. Vật liệu nuôi cấy
Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho quá trình nhân
giống in vitro. Do đó, việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy thích hợp là cần thiết.
Đối với Đinh lăng, vật liệu khởi đầu cho nhân giống vô tính in vitro có
thể là chồi đỉnh, đỉnh sinh trưởng, hoặc đoạn thân non. Các vật liệu này cần
được đảm bảo vô trùng trước khi tiến hành nuôi cấy in vitro. Phương pháp vô
trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là sử dụng các chất hóa học. Đối với
các thí nghiệm nuôi cấy Đinh lăng in vitro, tôi sử dụng đỉnh sinh trưởng đã
qua khử trùng để phục vụ cho việc nhân giống in vitro.
1.7.2. Điều kiện nuôi cấy
Điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái của tế bào và
mô trong quá trình nuôi cấy in vitro. Trong đó, ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm là
ba điều kiện có vai trò quan trọng nhất (Nguyễn Đức Thành, 2002).
Nhiệt độ: Là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào và
các quá trình trao đổi chất trong nuôi cấy mô, nhiệt độ nuôi cấy thường giữ ổn

định ở 25 - 280C, nhiệt độ còn ảnh hưởng tới hoạt động của Auxin (Vũ Văn
Vụ và cs, 2009).
Ánh sáng: Các nghiên cứu cho thấy ánh sáng rất cần thiết cho sự phát
sinh hình thái mẫu nuôi cấy. Các loại mẫu cấy khác nhau có nhu cầu về thời
gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng khác nhau. Thời gian chiếu sáng với đa số
các loài cây thích hợp là 12 - 18h/ngày. Cường độ ánh sáng thích hợp cho
nuôi cấy mô là 1000 - 2500 lux (Vũ Văn Vụ và cs, 2009).
Độ ẩm: Trong các bình nuôi cấy thì độ ẩm tương đối luôn luôn là 100%.

18
Khóa luận tốt nghiệp

18
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

1.7.3. Thành phần môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy mô tế bào có thành phần thay đổi tùy theo loài
thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan được nuôi cấy. Đối với cùng một loại mô,
cơ quan nhưng mực đích nuôi cấy mô không giống nhau, môi trường sử dụng
cũng khác nhau khá cơ bản. Môi trường nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn
sinh trưởng và phát triển của mẫu nuôi cấy (Vũ Văn Vụ và cs, 2009).
Môi trường dinh dưỡng có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết
cho sự phân chia, phân hóa tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây.
Thành phần hóa học của môi trường đóng vai trò quyết định đến sự thành
công hay thất bại của nuôi cấy mô tế bào thực vật. Mỗi một loại vật liệu khác

nhau có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường, khi bắt đầu nghiên
cứu một số loài mới hoặc giống mới cần phải lựa chọn cho đối tượng nghiên cứu
một loại môi trường cơ bản phù hợp.
Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy
thục vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác được sử dụng cho
mục đích này, trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng rất phổ
biến như MS, WP. Ví dụ môi trường MS ( Murashige & Skoog, 1962) là môi
trường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, môi
trường MS thích hợp cho cả thực vật 1 lá mầm, 2 lá mầm. Hay môi trường
Gramborg (1965) còn gọi là B5 dùng thử nghiệm trên đậu tương, được sử
dụng trong tách và nuôi tế bào trần.
Tuy có rất nhiều loại môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật nhưng
đều gồm một số thành phần cơ bản sau (Lê Trần Bình, 1997):
- Các muối khoáng đa lượng vi lượng
- Nguồn cacbon
- Các vitamin và aminoacid
- Chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường
- Các chất điều hòa sinh trưởng
19
Khóa luận tốt nghiệp

19
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

1.7.3.1. Nguồn cacbon

Mặc dù mẫu cấy vẫn có khả năng quang hợp, nhưng rất yếu vì vậy phải
bổ sung thêm nguồn cacbon để mẫu cấy có thể tổng hợp được các chất hữu cơ
giúp tế bào phân chia. Thông thường nguồn cacbon bổ sung là đường saccharose
và glucose với liều lượng 20-30 g/l dung dịch (Trần Thị Lệ và cs, 2008).
1.7.3.2. Nhóm nguyên tố vi lượng
Là những nguyên tố thường được sử dụng với hàm lượng thấp hơn
300mg/l dung dịch nhưng rất nhiều nguyên tố vi lượng được chứng minh là
không thể thiếu đối với sự phát triển của mô: Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, I, Bo, Co. Các
nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzyme (Đỗ Văn
Vịnh, 2007).
Bảng 1.1. Các vi lượng thông dụng được sử dụng trong
nuôi cấy mô tế bào thực vật
Tên vi lượng
Mangan (Mn)
Bo (B)
Kẽm (Zn)
Đồng (Cu)
Molypden (Mo)
Coban (Co)
Iôt (I)

Dạng sử dụng
MnSO4.4H2O
H3BO3
Zn(SO4).H2O
CuSO4.5H2O
(ZH4)6Mo7O24.4H2O
NaMoO4.2H2O
CoCl2.6H2O
KI

Nồng độ µM/l
15 – 100
6 – 100
15 – 30
0,04 - 0,08
0,0007 - 1,0
0,1 - 0,4
2,5 - 20,0

1.7.3.3. Nhóm nguyên tố đa lượng
Nguyên tố đa lượng là những nguyên tố muối khoáng như: N, P, K,
Mg, Ca, Na, S, được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm. Các nguyên tố này có
chức năng tham gia vào quá trình trao đổi chất giữa các tế bào thực vật với
môi trường và xây dựng nên thành tế bào, môi trường nhiều nito thích hợp
cho việc hình thành chồi, với môi trường nhiều kali sẽ giúp cho quá trình trao
đổi chất diễn ra mạnh mẽ (Trần Thị Lệ và cs, 2008).
20
Khóa luận tốt nghiệp

20
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

1.7.3.4. Vitamin
Do các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy có khả năng tổng hợp được

hầu hết các loại vitamin nhưng không đủ về số lượng. Do đó trong quá trình
nuôi cấy in vitro, các vitamin cần được bổ sung vào môi trường với nộng độ
thích hợp. Đặc biệt là các vitamin nhóm B như: B1, B2, B3, B5, B6. Trong
đó, B1 được xem là vitamin quan trọng nhất cho sự phát triển của thực vật
(Nguyễn Đức Thành, 2002).
Bảng 1.2. Bốn loại vitamin thường dùng
Tên Vitamin

Nồng độ sử dụng (mg/l)
100

Myo-inositol
Axit Nicotinic (vitamin B3)

0,5 – 1,0

Pyridoxine HCl (vitamin B6)

0,05 – 0,5

Thiamine HCl (vitamin B1)

10 – 50

Các vitamin được pha ở dạng dung dịch mẹ có nồng độ cao từ 500 đến
1000 lần dung dịch làm việc. Dung dịch vitamin dễ bị hỏng do nấm, khuẩn
nhiễm tạp và dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao, vì vậy cần bảo quản trong điều kiện
lạnh dưới 0OC hoặc chỉ pha chế trước khi sử dụng (Đỗ Văn Vịnh, 2007).
1.7.3.5. Các chất phụ gia hữu cơ
Các chất phụ gia được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm kích thích sự

sinh trưởng của mô sẹo và các cơ quan khác như: Nước dừa, khoai tây, chuối,
dịch chiết nấm men. Trong thành phần của nước dừa chứa các axit amin, axit hữu
cơ, đường, Myo – inositol và các chất có hoạt tính Auxin, các gluoxit của
Cytokinin. Ngoài ra, khoai tây và chuối cũng hay được sử dụng, vì trong thành
phần của chúng có chứa một số vitamin và các kích thích tố có tác dụng tích cực
đến sự sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy (Vũ Văn Vụ và cs, 2009).
1.7.3.6. Các chất làm đông cứng môi trường
21
Khóa luận tốt nghiệp

21
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

Một số chất được sử dụng để làm môi trường nuôi cấy đông đặc lại để
tạo thành giá thể cho mẫu phát triển như agar: Dây là một loại polysaccharid
làm từ rong biển và có khả năng ngậm nước cao, ở 80 0C Agar ngậm nước và
tồn tại ở trạng thái lỏng, còn ở dưới 40 0C nó tồn tại ở trạng thái rắn. Trong
môi trường có tính axit cao, khả năng đông đặc của agar giảm. Nồng độ
thường sử dụng 5-8g/l (Trần Thị Lệ và cs, 2008).
1.7.3.7. Các chất điều tiết sinh trưởng tới quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật
Hiện nay người ta đã phát hiện thấy 5 nhóm chất điều tiết sinh trưởng ở
thực vật đó là auxin, cytokinin, ethylen, giberelin, axit absixic. Những chất
này được phân thành các nhóm dựa vào tính tương đồng về cấu trúc và chức
năng sinh lý, tuy nhiên về chức năng nhiều khi chúng có tác động chồng chéo
và hỗ trợ nhau. Còn một số nhóm khác điều khiển từng giai đoạn sinh trưởng

nhất định. Trong nuôi cáy mô tế bào người ta thường sử dụng ba nhóm chất
điều tiết sinh trưởng là dẫn xuất của auxin, cytokinin và giberelin.
Nhóm Auxin
Auxin là nhóm chất kích thích sinh trưởng chính được các nhà sinh lý
học thực vật phát hiện và quan tâm sớm nhất. Auxin là những hormon thực
vật có tác dụng kích thích sinh trưởng, kéo dài tế bào và phân hóa cơ quan,
kiểu tác động của nó liên quan đến làm chuyển đổi và mềm hóa màng tế bào.
Chính chức năng này đã được người ta sử dụng và đánh giá hoạt tính của nó.
Nhóm auxin bao gồm các chất sau: 2,4 Diclorophenoxy axetic axit
(2,4D), α - naphtylaxetic (α - NAA), Indolaxetic axit (IAA), trong đó 2,4D dễ
gây độc nhưng có tác dụng kích thích quá trình phân chia tế bào thường được
sử dụng nhiều nhất, NAA có tác dụng tạo rễ cho cây con. Tuy nhiên, tầm quan
trọng của bất cứ chất điều tiết sinh trưởng nào đều có thể được đánh giá thông
qua số các công trình nghiên cứu về chúng.
Nhóm Cytokinin

22
Khóa luận tốt nghiệp

22
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

Việc phát hiện ra xytokinin gắn liền với kỹ thuật nuôi cây mô tế bào
thực vật. Năm 1955 Miller và Skoog phát hiện và chiết xuất từ tinh dịch cá
thu một hợp chất có khả năng kích thích sự phân chia tế bào rất mạnh mẽ

trong nuôi cấy mô gọi là kinetin (6 - furfuryl - aminopurin - C 10H 9N 5O).
Letham và Miller (1963) lần đầu tiên đã tách được xytokinin tự nhiên ở dạng
kết tinh từ hạt ngô gọi là zeatin và có hoạt tính tương tự kinetin. Sau đó người
ta đã phát hiện xytokinin có ở trong tất cả các loại thực vật khác nhau và là
một nhóm phytohormone quan trọng ở trong cây.
Trong các loại xytokinin thì 3 loại sau đây là phổ biến nhất: Kinetin (6 furfuryl - aminopurin), 6 - benzin - aminopurin và Hiện nay người ta đã phát
hiện ra nhiều loại xytokinin trong các bộ phận đang sinh trưởng của cây.
Nhiều nghiên cứu khẳng định rằng xytokinin được hình thành chủ yếu trong
hệ thống rễ. Ngoài ra một số cơ quan còn non đang sinh trưởng mạnh cũng có
khả năng tổng hợp xytokinin như chồi, lá non, quả non, tầng phát sinh....
Người ta cũng đã phát hiện ra kinetin là loại xytokinin có nhiều ở trong
nước dừa. Xytokinin được vận chuyển trong cây không phân cực như auxin, có
thể vận chuyển theo hướng ngọn và hướng gốc. Xytokinin có thể ở dạng tự do và
dạng liên kết tương tự như các phytohormone khác. Ở trong cây chúng bị phân
giải dưới tác dụng của enzyme, tạo nên sản phẩm cuối cùng là urê. Các xytokinin
tổng hợp được sử dụng trong kỹ thuật nuôi cấy mô là kinetin và benzyladenin.
Vai trò đặc trưng của xytokinin là kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ.
Vì vậy người ta xem chúng như là các chất hoạt hóa sự phân chia tế bào, nguyên
nhân là do xytokinin hoạt hóa mạnh mẽ quá trình tổng hợp axit nucleic và
protein dẫn đến kích sự phân chia tế bào. Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt lên sự hình
thành và phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi.
Người ta đã chứng minh rằng sự cân bằng giữa tỷ lệ auxin (phân hóa
rễ) và xytokinin (phân hóa chồi) có ý nghĩa rất quyết định trong quá trình phát
sinh hình thái của mô nuôi cấy in vitro cũng như trên cây nguyên vẹn. Nếu tỷ
23
Khóa luận tốt nghiệp

23
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A

Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

lệ auxin cao hơn xytokinin thì kích thích sự ra rễ, còn tỷ lệ xytokinin cao hơn
auxin thì kích thích ra chồi.
Ðể tăng hệ số nhân giống, người ta thường tăng nồng độ xytokinin trong
môi trường nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi. Ở trong cây rễ là cơ quan tổng hợp
xytokinin chủ yếu nên rễ phát triển mạnh thì hình thành nhiều xytokinin và kích
thích chồi trên mặt đất cũng hình thành nhiều. Xytokinin kìm hãm quá trình già
hóa của các cơ quan và của cây nguyên vẹn. Nếu như lá tách rời được xử lý
xytokinin thì duy trì được hàm lượng protein và chlorophin trong thời gian lâu
hơn và lá tồn tại màu xanh lâu hơn. Hiệu quả kìm hãm sự già hóa, kéo dài tuổi thọ
của các cơ quan có thể chứng minh khi cành dâm ra rễ thì rễ tổng hợp xytokinin
nội sinh và kéo dài thời gian sống của lá lâu hơn. Hàm lượng xytokinin nhiều làm
cho lá xanh lâu do nó tăng quá trình vận chuyển chất dinh dưỡng về nuôi lá. Trên
cây nguyên vẹn khi bộ rễ sinh trưởng tốt thì làm cho cây trẻ và sinh trưởng mạnh,
nếu bộ rễ bị tổn thương thì cơ quan trên mặt đất chóng già. Xytokinin trong một
số trường hợp ảnh hưởng lên sự nảy mầm của hạt và của củ. Vì vậy nếu xử lý
xytokinin có thể phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ của hạt củ mầm.
Nhóm cytokinin là nhóm chất hóa học có ảnh hưởng quyết định đến
kích thích phân chia tế bào. Đại diện cho nhóm này gồm: 6 - benzyl
aminopurine (BAP), 6 - Dimethylalylamino purine (2iP); Zeatin.
Rất nhiều cytokinin được phát hiện trong những nghiên cứu liên quan
đến nuôi cấy mô, nó kích thích phân hóa cơ quan của những tế bào không
phân chia. Nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học đã sử dụng kết hợp BAP
và NAA để tạo chồi từ mắt ngủ hay đỉnh sinh trưởng. Rachael keolanui đã sử
dụng BAP để tạo chồi khoai môn từ các mắt ngầm và đỉnh sinh trưởng.
Nhóm Ethylen

Ethylen là nhóm có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của
cây nhưng gần đây nó mới được coi là một hormon thực vật. Ethylen thường
được sử dụng để làm chính quả như ở chuối, hồng, hồng xiêm... làm ra hoa
24
Khóa luận tốt nghiệp

24
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

đồng loạt ở dứa, nó cũng ảnh hưởng đến quá trình phân bào. Đối với cà chua
trong điều kiện nồng độ ethylen cáo xẽ kéo dài khoảng ra rễ ở thân cây...
Nhóm Axit absixic
Axit absixic là hợp chất ức chế sinh trưởng thực vật tự nhiên ảnh hưởng
đến tính ngủ nghỉ của hạt, mầm và rụng lá, tăng cường ra hoa cho một số cây
ngăn ngày thông qua hiệu quả tổng hợp ARN và protein.
Nhóm Gibberellin
Giberelin được tách chiết lần đầu tiên từ dịch tiết của nấm bởi các nhà
khoa học Nhật Bản vào những năm 1935-1938. Gibberellin được tổng hợp trong
các mô đỉnh, tồn tại trong cả hạt non và quả đang phát triển. Gibberellin có tác
dụng chính trong việc hoạt hóa phân bào của mô phân sinh lóng, kéo dài lóng
cây. Nó cũng kích thích sự kéo dài của tế bào, tăng kích thước của chồi nuôi cấy.
GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất (Trần Thị Lệ và cs, 2008).
1.7.4. Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
Theo (PGS.TS. Ngô Xuân Bình và cs, 2003): Trong nuôi cấy mô, tế
bào gồm 5 giao đoạn sau:

Giai đoạn 1: Giai đoạn chuẩn bị
Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống in
vitro. Mục đích của giai đoạn này phải tạo được nguyên liệu thực vật vô trùng
để đưa vào nuôi cấy.
Mẫu đưa từ bên ngoài vào phải đảm bảo các yêu cầu sau: Tỷ lệ nhiễm
thấp, tỷ lệ sống cao, tốc độ sinh trưởng nhanh.
Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu, nồng độ và thời
gian xử lý diệt khuẩn. Vật liệu thường được chọn và đưa vào nuôi cấy là:
Đỉnh sinh trưởng, chồi nách, hoa tự, hoa, thân đoạn, mảnh, lá, rễ.
Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy

25
Khóa luận tốt nghiệp

25
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A