hợp chất ankaloic trong thiên nhiên đặc biệt là trong các loại cây hai lá mầm như cây lá ngón, cau lùn, cây thuốc phiện, cà độc dược, cây mã tiền

MỞ ĐẦU
Việt Nam ta là một nước nhiệt đới, nóng, ẩm và mưa nhiều, có nguồn
dược liệu rất phong phú, đa dạng và một nền y học dân tộc phát triển lâu
đời. Từ xa xưa, ông cha ta đã biết cách sử dụng nhiều loại thảo dược trong
việc dưỡng thương, trị bệnh và bồi bổ cơ thể. Như vậy, những cây thuốc dân
gian đóng vai trò hết sức quan trọng trong đời sống hằng ngày của con người.
Trong bài tiểu luận này em sẻ trình bày một hợp chất rất quan trọng trong
nhiều loại thực vật mà nếu không biết sẻ rất ảnh hưởng đến sức khỏe của mỗi
chúng ta khi ăn uống hay sử dụng các cây cỏ. Đó là hợp chất Ankaloic trong
thiên nhiên đặc biệt là trong các loại cây hai lá mầm như cây lá ngón, cau lùn,
cây thuốc phiện, cà độc dược, cây mã tiền…
Có nhiều bộ môn khoa học nghiên cứu về cây thuốc ra đời. Việc
nghiên cứu cây thuốc đã giúp cho chúng ta hiểu rõ về thành phần và cấu trúc
hóa học, hoạt tính sinh học, tác dụng dược lí của cây thuốc. Trên cơ sở các
nghiên cứu đó có thể tạo ra chất mới có hoạt tính sinh học cao như mong
muốn để làm thuốc chữa bệnh.
Nhưng một điều đặc biệt quan trọng là làm sao để chiết xuất được hợp
chất mà ta mong muốn, vì vậy em sẻ trình bày một số phương pháp để tách
các hợp chất ankaloic phục vụ cho điều trị một số bệnh và dùng trong công
tác gây tê để phẫu thuật trong y khoa.
Trong quá trình hoàn thành bài tiểu luận không thể tránh khỏi
thiếu sót, rất mong nhận được ý kiến đóng góp từ thầy cô và các bạn để bài
tiểu luận được hoàn chỉnh.
Xin chân thành cảm ơn!

MỤC LỤC
1


Contents
TỔNG QUAN ANKALOIC........................................................................................................................4

1.1 Khái niệm ankaloic:............................................................................................................4
1.2 Phân loại:...........................................................................................................................4
1.2.1 Nhóm quinolizidin:.......................................................................................................4
1.2.2 Nhóm nicotinana.........................................................................................................5
1.2.3 Nhóm tropan................................................................................................................5
1.2.4 Nhóm isoquinolin........................................................................................................5
1.2.5 Nhóm quinolin.............................................................................................................5
1.2.6 Nhóm indol...................................................................................................................5
1.3 Lý tính................................................................................................................................6
1.4 Hóa tính :............................................................................................................................9
1.5 Tác động sinh học...............................................................................................................9
PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT...............................................................................................................12
2.1 Phương pháp chiết xuất ancaloit:....................................................................................12
2.1.1 Để phân lập ancaloit phải qua quy trình sau:..............................................................12
2.1.1.1 Nghiền nhỏ nguyên liệu thành bột rồi ngâm với dung dịch HCl 1%...........................12
2.1.1.2 Lọc lấy dung dịch muối, kiềm hóa để lấy ancaloit hoàn toàn khỏi muối...................12
2.1.1.3 Cất cuốn hơi nước hoặc chiết bằng dung môi hữu cơ như clorofom, benzen v.v......12
2.1.1.4 Chạy sắc ký hoặc sắc ký bản mỏng điều chế...phân lập riêng từng ancaloit..............12
2.1.1.5 Xác định cấu trúc các ancaloit thử hoạt tính sinh học..............................................12
2.1.2. Thuốc thử phát hiện ancaloit.....................................................................................13
2.1.3.Các thuốc thử thông thường tạo kết tủa với ancaloit :.................................................13
2.1.4.Các nhóm ancaloit hiện nay bao gồm:.........................................................................13
2.2.Thuộc tính hóa lý:..............................................................................................................18
2.3 Sự tạo thành alkaloid trong cây:........................................................................................18
2.4 Phân bố trong thiên nhiên:...............................................................................................19
QUI TRÌNH CHIẾT XUẤT CÁC CHẤT......................................................................................................20
3.1 Hợp chất Conessin và cây Mức hoa trắng:........................................................................20
2

3.1.1 Hợp chất Conessin:....................................................................................................20
3.1.2. Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế Conessin từ dược liệu..........................21
3.1.3.1 Qui trình chiết xuất alcaloid toàn phần từ vỏ thân cây Mức hoa
trắng:...............................................................................................................................21
3.1.3.2 Qui trình phân lập Ankaloic toàn phần từ vỏ cây hoa Mức trắng:
............................................................................................................................................22
3.1.3.3 Qui trình tinh chế conessin từ alcoloid toàn phần … … … … … … … … … … … … … . . 2 3
3.2 Chiết xuất, phân lập và tinh chế Nuciferin từ lá Sen.........................................................24
3.2.1 Qui trình chiết xuất alcaloid toàn phần từ lá cây Sen:................................................24
3.2.2 Xây dựng qui trình phân lập Nuciferin từ alcoloid toàn phần của lá Sen:....................25
3.2.3 Tinh chế Nuciferin......................................................................................................26
KẾT LUẬN..............................................................................................................................................27
TÀI LỆU THAM KHẢO...........................................................................................................................28
PHỤ LỤC...............................................................................................................................................29

3


TỔNG QUAN ANKALOIC
1.1 Khái niệm ankaloic:
Polonopski định nghĩa: “Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ,
đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi
có trong động vật, thường có dược tính mạnh và cho những phản ứng hóa học
với một số thuốc thử chung của alkaloid.”
Tuy nhiên cũng có một số chất được xếp vào nhóm alkaloid nhưng nitơ
không có dị vòng mà ở mạch nhánh như: ephedrine trong Ma hoàng Ephedra
sinica Staf., capsaisin trong Ớt Capsicum annuum L., hordenin trong mầm mạch
nha Hordenum sativum Jess., colchicine trong hạt cây tỏi độc Colchicum
autumnale L.. Một số alkaloid không có phản ứng với kiềm như colchicine lấy từ
hạt tỏi độc, ricinin lấy từ hạt thầu dầu Ricinus communis L., theobromin trong

hạt cây cacao Theobroma cacao L. và có alkaloid phản ứng với acid yếu như
arecaidin và guvacin trong hạt cau Areca catechu L..
Ankaloit có tính chất hoạt động sinh lý cao đối với cơ thể người và động
vật, nhất là đối với hệ thần kinh.Với một lượng nhỏ có thể là loại thuốc đặc hiệu,
nhưng lượng tương đối lớn nó là chất độc gây chết người.\
1.2 Phân loại:
Về cấu tạo, ankaloit có đến 250 dạng cấu trúc khác nhau với gần 6000 chất
tự nhiên (>5500).Vì vậy, người ta phân loại dựa vào cấu trúc của ankaloit thành
gần 20 nhóm, nhưng ngày nay, người ta còn đề nghị chia thành các nhóm nhỏ
hơn. Ankaloit thường có cấu tạo khác nhau, nhưng chung quy lại nó có chứa một
số dị vòng nitơ và được chia thành các nhóm chính sau:
1.2.1 Nhóm quinolizidin:
ví dụ: Spartein trong Cytisus scoparius.

4


1.2.2 Nhóm nicotinana.

1.2.3 Nhóm tropan.

1.2.4 Nhóm isoquinolin.

1.2.5 Nhóm quinolin.

1.2.6 Nhóm indol.
5


1.3 Lý tính

Phần lớn alcaloid trong thiên nhiên công thức cấu tạo có oxy nghĩa là trong
công thức có C, H, N, O, những alcaloid này thường ở thể rắn ở nhiệt độ thường.
Ví dụ:

Morphine

Codein

Strychnin

6


Quinin

Reserpin
Những alcaloid thành phần cấu tạo không có oxy thường ở thể lỏng. Nhưng
cũng có một số trường hợp ngoại lệ.
Ví dụ:

Coniin

7


Nicotin

Các alcaloid ở thể rắn thường kết tinh được và có điểm chảy rõ ràng, nhưng
cũng có một số alcaloid không có điểm chảy vì bị phân hủy ở nhiệt độ trước khi
chảy.

Những alcaloid ở thể lỏng bay hơi được và thường vững bền, không bị phân
hủy ở nhiệt độ sôi nên cất kéo được bằng hơi nước để lấy ra khỏi dược liệu.
Mùi vị
Đa số không mùi, có vị đắng và một số ít có vị cay như capsaixin, piperin…
Màu sắc
Hầu hết các alcaloid đều không màu, trừ một số alcaloid có màu vàng như
berberin, palmatin, chelidonin.
Độ tan
Alkaloid base không tan trong nước, dễ tan trong các dung môi hữu cơ như
methanol, ethanol, ether, chloroform, benzen…
Muối alkaloid dễ tan trong nước, hầu như không tan trong các dung môi
hữu cơ ít phân cực.

8


Dựa vào độ tan khác nhau của alcaloid base và muối alcaloid người ta sử
dụng dung môi thích hợp để chiết xuất và tinh chế alcaloid.
1.4 Hóa tính :
Một số alkaloid có tác dụng như base mạnh có khả năng làm xanh giấy quỳ
đỏ như nicotin.
- Đa số các alcaloid đều có tính base yếu.
- Một số tính base rất yếu như cafein, piperin…
- Vài trường hợp ngoại lệ như colchicin, ricinin, theobromin không có phản
ứng kiềm.
- Cá biệt cũng có chất có phản ứng acid yếu như arecaidin, guvacin.
Do có tính base yếu nên có thể giải phóng alcaloid ra khỏi muối của nó
bằng dung dịch kiềm trung bình và mạnh như NH4OH, NaOH…
Các alcaloid cho phản ứng với một số thuốc thử chung của alcaloid.
1.5 Tác động sinh học

Công dụng của alkaloid rất đa dạng và phong phú, tùy theo từng loại
alkaloid.
- Tác dụng lên hệ thần kinh
- Kích thích thần kinh trung ương: strychnine, caffeine
- Ức chế thần kinh trung ương: morphin. Codein
- Kích thích thần kinh giao cảm: ephedrine

- Liệt giao cảm: yohimbin

9


- Kích thích phó giao cảm: pilocarpin

- Liệt phó giao cảm: atropine

- Gây tê: cocaine

- Tác dụng hạ huyết áp: reserpine, serpentin

- Tác dụng chống ung thư: taxol, vinblastine, vincristine

10


- Tác dụng diệt ký sinh trùng, diệt khuẩn: quinine, berberine, arecoline,
emetine.

Arecoline

11


Emetine

PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT
2.1 Phương pháp chiết xuất ancaloit:
Trong cây các ancaloit luôn tồn tại ở dạng các muối với các axít hữu cơ và
mỗi họ cây thường có một dãy ancaloit cùng nhóm, trong đó có nhóm chính và
nhóm phụ. Hàm lượng của chúng phụ thuộc vào giống cây, mùa vụ và địa lý.
2.1.1 Để phân lập ancaloit phải qua quy trình sau:
2.1.1.1 Nghiền nhỏ nguyên liệu thành bột rồi ngâm với dung dịch HCl 1%
(hoặc bằng dung dịch xôđa) để chuyển hóa hoàn toàn ancaloit thành muối
clohiđrat dễ tan.
2.1.1.2 Lọc lấy dung dịch muối, kiềm hóa để lấy ancaloit hoàn toàn khỏi
muối.
2.1.1.3 Cất cuốn hơi nước hoặc chiết bằng dung môi hữu cơ như
clorofom, benzen v.v.
2.1.1.4 Chạy sắc ký hoặc sắc ký bản mỏng điều chế...phân lập riêng từng
ancaloit.
2.1.1.5 Xác định cấu trúc các ancaloit thử hoạt tính sinh học, đem sản
phẩm thử nghiệm, ứng dung.
Có 2 cách để chiết xuất ancaloit: chiết bằng dung môi hữu cơ và chiết
bằng dung dịch nước axit hoặc ancol .
Phương pháp 1: Chiết bằng dung môi hữu cơ
Để chiết ancaloit bằng dung môi hữu cơ, trước hết bột dược liệu phải được
tẩm dung dịch bazơ để chuyển ancaloit muối trong dược liệu thành dạng bazơ.
12

Bazơ thường dùng là dung dịch NH3, Ca(OH)2, Na2CO3, NaOH.
Dung môi có thể dùng là clorofom, ete, benzen, etyl clorua.
Clorofom là dung môi thích hợp nhất cho hầu hết ancaloit bazơ (trừ
ancaloit N bậc 4 và N-oxit có cách xử lí riêng).
Phương pháp 2: Chiết bằng dung dịch axit hay axit loãng trong ancol.
Khác với phương pháp trên, phương pháp này sử dụng dung dịch axit vô
cơ hay hữu cơ kết hợp với rượu để chiết ancaloit dưới dạng muối hoà tan.
Chiết bằng axit
Dịch chiết trung hòa axit, cô cạn, hòa tan cặn trong axit, loại tạp, kiềm
hoá rồi chiết lại bằng dung môi hữu cơ, bốc hơi dung môi, hòa cặn trong clorofom
để chấm sắc ký. Cách chiết này loại được nhiều tạp và nếu dùng natri
hydrocarbonat để kiềm hoá có thể chiết ñược ancaloit có chứa phenol.
Chiết bằng dung dịch axit loãng trong ancol.
Thu dịch chiết dược liệu trong dung môi ancol - axit. Bốc hơi dung môi, lắc
dịch chiết đậm đặc với dung môi hữu cơ (ete, clorofom) để loại tạp. Kiềm hoá
dung dịch nước axit rồi chiết bằng dung môi hữu cơ, bốc hơi dung môi thu được
cặn ancaloit thô. Với cách chiết này, ancaloit không bị mất nhưng dịch chiết lẫn
nhiều tạp.
2.1.2. Thuốc thử phát hiện ancaloit.
2.1.3.Các thuốc thử thông thường tạo kết tủa với ancaloit :
- Thuốc thử Dragendorff tạo kết tủa vàng da cam đến đỏ với ancaloit
- Thuốc thử Mayer tạo kết tủa màu trắng hoặc vàng cam với ancaloit
- Thuốc thử Wagner (Bouchardat) tạo kết tủa vàng nâu với ancaloit.
Các thuốc thử thông thường tạo màu với ancaloit :
- Dung dịch H2SO4 đậm đặc (D = 1,84 g/ml)
- Dung dịch HNO3 đậm đặc (D = 1,4 g/ml )

13

2.1.4.Các nhóm ancaloit hiện nay bao gồm:
- Nhóm pyridin: piperin, coniin, trigonellin, arecaidin, guvacin, pilocarpin,

cytisin, nicotin, spartein, pelletierin.
- Nhóm pyrrolidin: hygrin, cuscohygrin, nicotin

- Nhóm tropan: atropin, cocain, ecgonin, scopolamin

- Nhóm quinolin: quinin, quinidin, dihydroquinin, dihydroquinidin,
strychnin, brucin, veratrin, cevadin

14


Quinolin
- Nhóm isoquinolin: Các ancaloit gốc thuốc phiện như morphin, codein,
thebain, papaverin, narcotin, sanguinarin, narcein, hydrastin, berberin.

- Nhóm phenethylamin: mescalin, ephedrin, dopamin, amphetamin

- Nhóm indol:
Các tryptamin: DMT, N-metyltryptamin, psilocybin, serotonin

Tryptamin
Các ergolin: Các ancaloit từ cựa ngũ cốc/cỏ như ergin, ergotamin, axít
lysergic v.v
15

Ergolin
Các beta-cacbolin: harmin, harmalin, yohimbin, reserpin, emetin

Yohimbin
Các ancaloit từ chi Ba gạc (Rauwolfia): reserpin

- Nhóm purin:
Các xanthin: caffein, theobromin, theophyllin

- Nhóm terpenoit:
Các ancaloit aconit: aconitin
16


Các steroit: solanin, samandari (các hợp chất amoni bậc bốn): muscarin,
cholin, neurin

Các
ancaloit từ dừa cạn (chi Vinca) và các họ hàng của nó: vinblastin, vincristin.
Chúng là các chất chống ung thư và liên kết các nhị trùng (dime) tubulin tự do,
vì thế phá vỡ cân bằng giữa trùng hợp (polyme hóa) và phản trùng hợp vi quản,
tạo ra sự kìm hãm các tế bào trong pha giữa của quá trình phân bào.

17


2.2.Thuộc tính hóa lý:
Phân tử lượng: khoảng 100-900
Các ancaloit không chứa các nguyên tử ôxy trong cấu trúc thông thường là
chất lỏng ở điều kiện nhiệt độ phòng (ví dụ nicotin, spartein, coniin).

Các ancaloit với các nguyên tử ôxy trong cấu trúc nói chung là các chất rắn
kết tinh ở điều kiện nhiệt độ phòng (ví dụ: berberin)
Hoạt hóa quang học
Tính kiềm phụ thuộc vào khả năng sẵn có của các cặp điện tử đơn độc trên
nguyên tử nitơ & và kiểu khác (dị) vòng cùng các phần thay thế.
Khả năng tạo ra muối với các axít vô cơ (ví dụ: với HCl, H 2SO4, HNO3) hay
các axít hữu cơ (như các muối tartrat, sulfamat, maleat)
2.3 Sự tạo thành alkaloid trong cây:
Nhờ phương pháp đánh dấu đồng vị phóng xạ người ta đã chứng minh được
alkaloid tạo ra từ các acid amin. Người ta đã dùng acid amin có C 14 và N15 đưa
vào môi trường nuôi cấy hoặc tiêm vào thân cây. Alcaloid sau chiết xuất và phân
lập có tính phóng xạ. Làm phản ứng phân hủy để tìm nguyên tử phóng xạ thì
thấy được hầu hết nguyên tử nitơ và các nguyên tử carbon của acid amin đều
nằm trong cấu trúc nhân cơ bản của alkaloid.
Nơi tạo ra alkaloid không phải luôn luôn là nơi tích tụ alkaloid. Nhiều
alkaloid được tạo ra ở rễ lại vận chuyển lên phần trên mặt đất của cây, sau khi
thực hiện những biến đổi thứ cấp chúng được tích lũy ở lá, quả hoặc hạt như cây
thuốc phiện, cây caphe,... chúng được tạo ra ở rể nhưng lại được chứa ở lá, quả,
hoa…
Vd: L-hyoscryamin trong cây Beladon được tạo ra ở rễ, sau đó chuyển lên
phần trên mặt đất. Khi cây 1 tuổi thân cây chứa nhiều alcaloid hơn lá, khi cây 2
tuổi thân cây hóa gỗ nhiều hơn, hàm lượng alcaloid giảm xuống, hàm lượng
alcaloid ở phần ngọn đạt được mức tối đa vào lúc cây ra hoa và giảm đi khi quả
chín.
2.4 Phân bố trong thiên nhiên:
Alkaloid có phổ biến trong thực vật, tập trung ở một số họ:
18


- Apocynaceae (họ Trúc đào) có gần 800 alkaloid.

- Papaveraceae (họ Thuốc phiện) gần 400 alkaloid.
- Fabaceae (họ Đậu) 350 alkaloid.
- Solanaceae (họ Cà) gần 200 alkaloid.
Ở nấm có alkaloid trong nấm cựa khỏa mạch (Claviceps purpurea), nấm
Amanita phalloides.
Ở động vật, cũng đã tìm thấy alkaloid ngày càng tăng, alkaloid samandarin,
samandaridin, samanin có trong tuyến da của loài kỳ nhông. Bufotenin,
bufotenidin, dehydrobufotenin lấy từ nhựa cóc.

Trong cây, alkaloid thường tập trung ở một số bộ phận nhất định.
Rất ít trường hợp trong cây chỉ có một alkaloid duy nhất mà thường có hỗn
hợp nhiều alkaloid, trong đó alkaloid có hàm lượng cao được gọi là alkaloid
chính.
Các alkaloid ở trong những cây cùng một họ thực vật cũng thường có cấu
tạo rất gần nhau.
Hàm lượng alkaloid trong cây thường rất thấp, Một số dược liệu chứa 1-3%
alkaloid đã được coi là hàm lượng khá cao.
Hàm lượng alkaloid trong cây phụ thuộc vào nhiều yếu tố như khí hậu, ánh
sáng, chất đất, phân bón, giống cây, bộ phận thu hái và thời kỳ thu hái. Vì vậy
đối với mỗi dược liệu cần nghiên cứu cách trồng trọt, thu hái và bảo quản để có
hàm lượng hoạt chất cao.
Trong cây, alkaloid ít khi ở trạng thái tự do (alkaloid base), mà thường ở
dạng muối của các acid hữu cơ như citrat, tactrat, oxalat, acetat…
Có một số ít trường hợp alkaloid kết hợp với đường tạo ra dạng
glycoalkaloid như solasonin và solamacgin trong cây Cà lá xẻ (Solanum
laciniatum).
19


QUI TRÌNH CHIẾT XUẤT CÁC CHẤT

3.1 Hợp chất Conessin và cây Mức hoa trắng:
3.1.1 Hợp chất Conessin:
Conessin được phân bố trong một số loài thuộc chi Holarrhena, họ
Trúc đào. Trong nghiên cứu này vỏ thân cây Mức hoa trắng (còn được gọi là
cây Mộc hoa trắng, Sừng trâu, Thừng mực lá to ) được lựa chọn để chiết xuất
Conessin vì Mức hoa trắng là một cây phân bố rộng rãi ở Việt Nam, vỏ thân
cây chứa nhiều alcaloid trong đó Conessin là thành phần chính. Thành phần
hóa học của vỏ thân cây, phương pháp chiết xuất, phân lập hợp chất từ vỏ
thân cây cũng như phương pháp định tính, định lượng hợp chất Conessin trong
dịch chiết dược liệu bằng sắc kí đã được các tác giả trong nước và nước
ngoài nghiên cứu sơ bộ.

Công thức cấu tạo của Conessin

Công thức phân tử: C24H40N2
Trọng lượng phân tử: 356,59
20


Danh pháp (IUPAC): (3β)-N,N- dimethylcon-5-enin-3-amine.
Tính chất lí – hóa: Conessin là tinh thể hình lăng trụ (kết tinh trong
aceton) điểm chảy là 125oc. [α]D = 1,9o (trong CHCl3) và + 21o6 (trong
C2H5OH), muối hydroclorid, hydrobromid và oxalat của Conessin tồn tại
dưới dạng tinh thể. Độ tan trong nước của Conessin base là 1/5, độ tan trong
ethanol 90o là 1/11, ít tan trong ether.
3.1.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế
Conessin từ dược liệu.
3.1.2.1 Qui trình chiết xuất alcaloid toàn phần từ vỏ
thân cây Mức hoa trắng:
Cân khoảng 400 g bột dược liệu, làm ẩm bằng 100 ml dung dịch HCl

10%, bổ sung 1 600 ml dung dịch HCl 10% đến ngập hết dược liệu và
ngâm trong 24 giờ. Rút dịch chiết và lọc. Tiếp tục chiết thêm bột dược liệu 2 lần
nữa bằng cách bổ sung 600 ml dung dịch HCl 10% đến ngập dược liệu,
mỗi lần ngâm lạnh trong 6 - 8 giờ. Gạn để thu dịch chiết và lọc. Gộp các dịch
chiết acid thu được, kiềm hóa dịch chiết acid bằng amoniac đặc đến pH = 9 10. Để lắng và gạn bỏ phần dịch ở trên bằng cách lọc qua giấy lọc. Hút kiệt
nước. Có thể tiến hành li tâm rồi gạn bỏ dịch nước ở trên, thu được cắn. Chiết
alcaloid base trong cắn và giấy lọc nhiều lần bằng cloroform, mỗi lần 300 ml,
cho đến khi thử bằng thuốc thử Dragendorff không cho tủa vàng. Gộp dịch
chiết, cất thu hồi cloroform dưới áp suất giảm. Chuyển cắn thu được ra cốc có
mỏ, cô cách thủy tới cạn, sấy ở 60 oC trong 3 giờ, thu được 12,0 g alcaloid toàn phần.
Qui trình chiết xuất alcaloid toàn phần từ vỏ thân Mức hoa trắng được thể
hiện tóm tắt như sơ đồ ở Phụ lục 1.
3.1.2.2 Qui trình phân lập Ankaloic toàn phần từ vỏ cây
hoa Mức trắng:
12,0 g cắn alcaloid toàn phần được hòa tan trong 300 ml ether dầu hỏa,
rửa giấy lọc và tủa bằng 50 ml ether dầu hỏa. Lắc 3 lần dịch chiết ether dầu
hỏa với dung dịch HCl 10%, mỗi lần 150 ml. Gộp các dịch chiết nước acid và
21


kiềm hóa dịch chiết nước acid bằng Na2CO3 đến pH = 9 - 10 bằng cách cho từ từ
Na2CO3 vào dung dịch, đồng thời khuấy đều đến khi dung dịch trong và
không có bọt. Chiết bằng ether dầu hỏa 3 lần, mỗi lần 300 ml. Gộp các dịch
chiết ether dầu hỏa và làm khan dịch chiết bằng cách lọc dịch chiết ether dầu
hỏa qua giấy lọc khô, cất thu hồi ether dầu hỏa, cắn thu được hòa tan trong 50
ml dung dịch acid oxalic 17,5% trong ethanol. Để yên ở nhiệt độ phòng để thu
được tinh thể Conessin hydrooxalat, lọc lấy tinh thể. Hòa tan tinh thể thu được
trong 300 ml nước. Kiềm hóa dung dịch đến pH = 9 - 10 bằng cách cho từ từ
Na2CO3 đến khi hết bọt để tạo tủa Conessin base. Chiết Conessin base 4 lần
bằng ether dầu hỏa, mỗi lần 50 ml. Gộp các dịch chiết ether dầu hỏa và làm

khan dịch chiết bằng cách lọc dịch chiết ether dầu hỏa qua giấy lọc khô, cất thu
hồi ether dầu hỏa, thu được sản phẩm PL1. Đem kết tinh sản phẩm PL1 trong
aceton, để yên ở nhiệt độ phòng thu được Conessin tương đối tinh khiết. Lọc lấy
tinh thể, sấy dưới áp suất giảm ở 60 oC trong 4 giờ, sử dụng chất hút ẩm là
phosphor pentoxyd (P2O5) thu được 2,55 g sản phẩm PL2.
Xác định hàm lượng Conessin bằng HPTLC cho thấy sản phẩm phân lập
được đạt độ tinh khiết khoảng 82,50%.
Qui trình phân lập Conessin từ alcaloid toàn phần được thể hiện tóm tắt
như sơ đồ ở Phụ lục 2.
3.1.2.3 Qui trình tinh chế conessin từ alcoloid toàn phần của vỏ thân
cây Mức hoa trắng:
Bước 1: Tinh chế bằng sắc kí cột
1.Chuẩn bị cột sắc kí: Dùng cột thủy tinh trung tính có đường kính 3 cm,
chiều dài 50 cm, được lắp thẳng đứng trên giá, phía dưới cột có van để
điều chỉnh tốc độ dung môi. Khóa van, cho một ít dung môi rửa giải vào cột.
Lót một lớp bông mỏng ở phía đáy cột, ngay trên van để chất nhồi sau khi được
nhồi vào cột không gây tắc cột.
2. Nhồi cột: Cân 50 g chất nhồi cột silica gel 60 (0,04 – 0,063 mm), được
hoạt hóa ở 100 oC trong 3 giờ, sau đó ngâm trong toluen 1 giờ, khuấy đều rồi
đổ từ từ lên cột. Mở khóa cột để dung môi chảy từ từ, để các hạt chất nhồi cột
lắng xuống (có thể dùng đũa thủy tinh có bọc cao su gõ nhẹ vào cột, để tránh
22


cột bị khô). Ổn định trong khoảng 3 giờ. Đến khi khoảng cách từ mặt trên lớp
chất nhồi đến mặt trên dung môi rửa giải còn khoảng 1 cm thì đóng khóa cột.
3. Đưa mẫu lên cột: Hòa 2,55 g PL2 trong 5 ml benzen, đổ từ từ vào cột
để tránh xáo động lớp chất nhồi trong cột, dùng pipet tráng vòng quanh
bên trong cột trước khi thêm dung môi rửa giải.
4. Dùng lần lượt các hỗn hợp dung môi sau để rửa giải: 100 ml hỗn

hợp toluen : ethyl acetat (98 : 2).
150 ml hỗn hợp toluen : ethyl acetat (95: 5) 50 ml hỗn hợp toluen : ethyl
acetat (93 : 7).
Tốc độ rửa giải 2 ml/phút (khoảng 40 giọt/phút). Bỏ khoảng 100 ml dịch
rửa giải đầu tiên, lấy 180 ml dịch rửa giải tiếp theo (xác định sự có mặt của
hoạt chất bằng TLC trong các phân đoạn), cất thu hồi dung môi được sản phẩm
TC1.
Bước 2: Kết tinh lại trong dung môi
Kết tinh 3 lần sản phẩm TC1 trong aceton, lọc lấy tinh thể, sấy dưới áp
suất giảm ở 60

o

C trong 4 giờ, sử dụng chất hút ẩm là phosphor

pentaoxyd (P2O5) thu được 2 g sản phẩm có hàm lượng Conessin khoảng 99%.
Sự có mặt của Conessin trong sản phẩm được khẳng định bằng phổ
khối lượng kết quả thu được như Hình sau.

Hình . Kiểm tra khối lượng phân tử của Conessin bằng phổ khối (ESI-MS)

Qui trình tinh chế Conessin được thể hiện tóm tắt như sơ đồ ở Phụ lục 3.
3.2 Chiết xuất, phân lập và tinh chế Nuciferin từ lá Sen
23


3.2.1 Qui trình chiết xuất alcaloid toàn phần từ lá cây Sen:
Cân khoảng 320 g bột dược liệu, làm ẩm bằng NH4OH 10%, thêm 2,5 lít
ethanol 96o và chiết nóng bằng cách đun hồi lưu cách thủy trong 2 giờ. Gạn
và lọc lấy dịch lọc, rửa lại bã dược liệu bằng ethanol. Dịch chiết ethanol được

cất thu hồi ethanol dưới áp suất giảm ở 60 oC. Hòa tan cắn bằng dung dịch HCl
5% (pH = 2). Tiến hành chiết (3 - 4 lần) đồng lượng dịch chiết acid với ether
dầu hỏa để loại tạp chất. Kiềm hóa dịch chiết acid bằng dung dịch amoniac
đặc tới pH = 10 - 11. Chiết 5 - 6 lần đồng lượng bằng cloroform (đến khi dịch
chiết nước cho phản ứng âm tính với thuốc thử Dragendorff), thu được dịch
chiết cloroform. Cất dưới áp suất giảm để thu hồi dung môi cloroform, hòa tan
cặn thu được bằng 50 ml methanol và chuyển ra cốc có mỏ, bay hơi tới cạn,
sấy ở 60 oC trong 3 giờ, thu được 2,85 g alcaloid toàn phần.
Qui trình chiết xuất alcaloid toàn phần từ lá Sen được thể hiện tóm tắt như
sơ đồ ở Phụ lục 7.
3.2.2 Xây dựng qui trình phân lập Nuciferin từ alcoloid toàn phần của
lá Sen:
1. Chuẩn bị cột sắc kí: Dùng cột thủy tinh trung tính có đường kính 3
cm, chiều dài 50 cm, được lắp thẳng đứng trên giá, phía dưới cột có van để
điều chỉnh tốc độ dung môi. Khóa van, cho một ít dung môi rửa giải vào cột.
Lót một lớp bông mỏng ở phía đáy cột, ngay trên van để chất nhồi sau khi được
nhồi vào cột không gây tắc cột.
24


Nhồi cột: Cân 50 g chất nhồi cột silica gel 60 (0,04 – 0,063 mm), cho
vào cốc thủy tinh có chứa 300 ml cloroform, khuấy đều rồi đổ từ từ lên cột.
Mở khóa cột cho dung môi chảy từ từ để các hạt chất nhồi cột lắng xuống
(có thể dùng đũa thủy tinh có bọc cao su gõ nhẹ vào cột, để tăng nhanh quá
trình lắng), trong quá trình này luôn bổ sung dung môi lên cột, tránh để cột bị
khô. Ổn định cột trong khoảng 3 giờ và đến khi khoảng cách từ mặt trên lớp
chất nhồi đến mặt trên dung môi rửa giải còn khoảng 1 cm thì đóng khóa cột.
2.Đưa mẫu lên cột: Hòa tan khoảng 2,85 g alcaloid toàn phần trong 10 ml
cloroform, thêm 5 g chất nhồi cột silica gel 60, trộn đều, cất thu hồi dung
môi được hỗn hợp bột tơi. Chuyển nhẹ nhàng vào cột, tránh xáo động lớp chất

nhồi trong cột, dùng pipet tráng vòng quanh bên trong cột trước khi thêm
dung môi rửa giải.
3.Dùng hỗn hợp dung môi n-Hexan : aceton : NH3 đặc (3 : 1 : 0,1) để
rửa giải. Tốc độ rửa giải 2 ml/phút (khoảng 40 giọt/phút). Bỏ khoảng 75 ml
dịch rửa giải đầu tiên và lấy 100 ml dịch rửa giải tiếp theo, cất thu hồi dung
môi được cặn, sấy dưới áp suất giảm ở 60 oC trong 4 giờ, sử dụng chất hút ẩm
là phosphor pentoxyd (P2O5) thu được khoảng 2,1 g sản phẩm phân lập
chứa hoạt chất Nuciferin khoảng 96,2%.
Qui trình phân lập Nuciferin từ alcaloid toàn phần được thể hiện tóm tắt
như sơ đồ ở Phụ lục 8.
3.2.3 Tinh chế Nuciferin
Tinh thể Nuciferin thu được sau khi phân lập được hòa tan trong một
lượng vừa đủ cloroform rồi chấm lên 3 bản mỏng silica gel tráng sẵn (Merck) và
được khai triển bằng 3 hệ dung môi khác nhau.
Hệ I: n-Hexan : aceton : NH4OH (3 : 1 : 0,1).
Hệ II: Cloroform : methanol (10 : 1).
Hệ III: Cloroform : ethyl acetat (5 : 1).
Phát hiện vết bằng thuốc thử Dragendorff. Soi dưới đèn tử ngoại ở bước
sóng 254 nm. Với cả 3 hệ dung môi đều chỉ có một vết trên sắc kí đồ song
song với chuẩn liên kết chứng tỏ Nuciferin tinh chế được đã tinh khiết. Vì vậy,
để đơn giản qui trình tinh chế được lựa chọn là kết tinh lại nhiều lần trong
25