ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR TRONG ĐỊNH DANH CÁC E. COLI GÂY TIÊU CHẢY Ở TRẺ EM DƯỚI 5 TUỔI

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 11 * Số 1 * 2007

Nghiên cứu Y học

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR TRONG ĐỊNH DANH CÁC E. COLI
GÂY TIÊU CHẢY Ở TRẺ EM DƯỚI 5 TUỔI
Đỗ Thị Thu Hương*, Nguyễn Vũ Trung*, Lê Văn Phủng**

TĨM TẮT
Mục tiêu: Tìm hiểu tỉ lệ nhiễm 5 loại E. coli gây tiêu chảy bao gồm EPEC, EHEC, ETEC, EIEC và EAEC ở trẻ
em dưới 5 tuổi bị tiêu chảy.
Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu cắt ngang. Chúng tơi ứng dụng quy trình Multiplex PCR sử dụng
nhiều cặp mồi đặc hiệu để định danh 5 loại E. coli gây tiêu chảy. Khảo sát trên 213 trẻ em dưới 5 tuổi bị tiêu chảy đến
khám và điều trị tại Bệnh viện nhi Trung ương, Bệnh viện Saintpaul và Bệnh viện Thanh nhàn của thành phố Hà nội
(nhóm bệnh) và 100 trẻ khỏe mạnh (nhóm chứng). Từ tháng 9 năm 2000 đến tháng 9 năm 2001.
Kết quả: Trong nhóm bệnh tỉ lệ phân lập của các E. coli gây tiêu chảy là 24,9% trong đó EAEC chiếm tỉ lệ cao
nhất là 15,9%, tiếp theo lần lượt là EPEC (3,8%), EHEC (2,8), EIEC (1,9%) và ETEC (0,5%). Trong nhóm lành có 6
trẻ phân lập được EAEC (6,0%), 1 trẻ nhiễm ETEC (1%) và 2 trẻ nhiễm EPEC (2%). Các triệu chứng lâm sàng trên
bệnh nhi khơng đặc trưng cho từng loại E. coli.

ABSTRACT
A MULTIPLEX PCR PROTOCOL WAS APPLIED TO DETERMINE THE INCIDENCE
OF E. COLI DIARRHEA IN CHILDREN UNDER 5 YEARS OLD
Do Thi Thu Huong, Nguyen Vu Trung, Le Van Phung
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 11 - No 1 - 2007: 31 - 34
Objective: The study determines the incidence of E. coli diarrhea in children includes: EAEC, EPEC, EHEC,
EIEC and ETEC in the children under 5 years old with acute diarrhea.
Methods: Cross-sectional study. A multiplex PCR protocol using type – specific primers was applied to
determine the incidence of E. coli diarrheal species in children include: EAEC, EPEC, EHEC, EIEC and ETEC. The
study examined 213 children under 5 years old with acute diarrhea (patient group) were admitted to Central children
hospital, Saint Paul hospital, Thanh Nhan hospital and 100 healthy children (healthy group) from 01. 09. 2000 to

01.09. 2001.
Results: Among 213 children of the patient group: 53 cases (24,9%) had E. coli diarrhea with 34 cases (15,9%)
had EAEC, 8 cases (3,8%) had EPEC, 4 cases (1,9%) had EIEC, 1 case (0,5%) had ETEC and among 100 children of
* Khoa Vi sinh – BV. Đà Nẵng
**Trường Đại học Y - Hà nội

the healthy group: 9 case (9,0%) had E. coli diarrhea with 6 cases (6,0%) had EAEC, 2 cases (2,0%) had EPEC, 1 case
(1,0%) had ETEC. No significant difference of clinical symptom were found among children who had 5 species E. coli
diarrhea.
(Enterohaemorrhagic)
và
EAEC
ĐẶT VẤN ĐỀ
(Enteroaggregative).
Việc
định
danh
c{c
E.
coli
Tiêu chảy do vi khuẩn l| một trong những
chủ yếu dựa v|o định túp huyết thanh, tuy nhiên
ngun nh}n quan trọng g}y tử vong cho trẻ em
dựa v|o kh{ng ngun O, H v| K c{c E. coli được
lứa tuổi dưới 5 tuổi. Đứng đầu trong c{c căn
ph}n th|nh 700 týp huyết thanh nên việc định
ngun vi khuẩn l| c{c E. coli gây tiêu chảy,
danh các E. coli gây tiêu chảy kh{ phức tạp(6).
chiếm tỉ lệ khoảng 20 – 30%(4). Dựa v|o khả năng
Trong nghiên cứu n|y, chúng tơi đã ứng dụng

g}y tiêu chảy c{c E. coli được chia th|nh 5 loại
phương ph{p Multiplex PCR để chẩn đo{n c{c E.
gồm
EPEC
(Enteropathogenic),
ETEC
coli g}y tiêu chảy, đ}y l| một phương ph{p
(Enterotoxigenic), EIEC (Enteroinvasive), EHEC
31


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 11 * Số 1 * 2007

Nghiên cứu Y học
Ial
BfpA
pCVD

nhanh v| đặc hiệu nhờ sử dụng những cặp mồi
đặc hiệu cho từng loại E. coli (2,5).
Bệnh cảnh l}m s|ng m| căn nguyên do 5 loại
E. coli thường là:
- EAEC g}y nên một sự x}m lấn dai dẳng tại lớp
niêm mạc ruột non l|m biến đổi về hình th{i tại đ}y,
hậu quả g}y nên một tiêu chảy cấp hay kéo d|i v|
dẫn đến tình trạng kém hấp thu c{c chất dinh dưỡng
ở trẻ.
- EIEC g}y nên c{c tổn thương khu trú có thể
l| c{c tổn thương dạng loét tại niêm mạc đại
tr|ng g}y nên hội chứng lỵ ở bệnh nhi.

- ETEC g}y bệnh do t{c động của hai độc tố ruột
của vi khuẩn g}y nên một với tiêu chảy cấp dạng tả
với ph}n nhiều nước, kèm nôn mửa...
- EHEC có hai loại gồm c{c EHEC điển hình
(O157: H7) v| không điển hình (EHEC non O157).
C{c EHEC O157: H7 thường g}y tiêu chảy kèm
theo viêm đại tr|ng xuất huyết v| hội chứng tan
máu urê huyết cao.
- EPEC t{c động v|o tế b|o biểu mô niêm
mạc ruột l|m tho{i hóa c{c vi nhung mao l|m rối
loạn qu{ trình hấp thu nước v| điện giải tại đ}y
v| g}y tiêu chảy trên trẻ(3,7).

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Kỹ thuật n|y được thực hiện trên 213 mẫu
ph}n của c{c trẻ bị tiêu chảy đến kh{m v| điều trị
tại 3 bệnh viện l| Viện Nhi trung ương, Bệnh viên
Saint – Paul v| Thanh nh|n của Th|nh phố H|
nội. Nhóm chứng được thực hiện trên 100 mẫu
ph}n của trẻ em tại một nh| trẻ của Tp H| nội.
C{c mẫu bệnh phảm trên được tiến h|nh nuôi
cấy trên môi trường Mac Conkey Sorbitol
(SMAC), chọn khuẩn lạc E. coli t{ch chiết ADN
của vi khuẩn ở nhiệt độ 1000 C/ 20 phút. Các
ADN được t{ch chiết được trộn chung với c{c cặp
mồi đặc trưng cho 5 loại E. coli để thực hiện PCR
đa mồi (PCR vòng ngo|i). Trong bảng sau trình
bày c{c cặp mồi, đoạn gien đích, kích thước đoạn
đặc hiệu của mỗi loại E. coli
Đoạn gen

đích
elt B
est A
Vt 1
Vt 2
Eae A

Mồi

Vi khuẩn

LT l-r
ST12 l-r
VT 1 l-r
VT2 l-r
Eae u-l

ETEC
ETEC
EHEC
EHEC
EHEC/EPEC

Cỡ sản
phẩm (bp)
322
147
130
298
376

SHIG 1-2
BfpA u-1
EA 1-2

EIEC
EPEC
EAEC

320
367
630

Chạy trên m{y lu}n nhiệt theo chương trình:
96 C/ 4phút; 30 chu kỳ: (940C/20 giây, 550C/20
giây và 720C/10giây); 720C/7 phút. C{c sản phẩm
được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide
v| điện di đọc kết quả nếu dương tính chọn 5 đến
10 khuẩn lạc đại diện ria cấy ra 5 đến 10 vùng
kh{c nhau trên môi trường SMAC, t{ch chiết
ADN v| thực hiện PCR đơn mồi hay đặc hiệu
(PCR vòng trong) với một cặp mồi duy nhất.
0

KẾT QUẢ
Tổng số 313 mẫu khảo s{t với 213 trẻ bị tiêu
chảy v| 100 trẻ trong nhóm chứng kết quả được
trình b|y tại bảng 1
Bảng 1: Sự phân bố của các E. coli gây tiêu chảy
Các loại

E. coli

ETEC
EPEC
EHEC
EIEC
EAEC
Tổng
cộng

Nhóm bệnh
Nhóm chứng (n =
(n=213)
100)
Số dương %
Số dương %
tính
tính
1
0,5
1
1,0
8
3,8
2
2,0
6
2,8
0
0

4
1,9
0
0
34
15,9
6
6,0
53
24,9
9
9,0

Giá trị
p

> 0,05
> 0,05
> 0,05
> 0,05
< 0,05
< 0,05

Nhận xét:
Trong nhóm bệnh tỉ lệ ph}n lập của E. coli
g}y tiêu chảy l| 24,9% v| trong nhóm chứng l|
9,0 % sự kh{c biệt giữa hai tỉ lệ n|y có ý nghĩa
thống kê (p<0,05). Trong nhóm bệnh cả 5 loại E.
coli đều được ph}n lập với EAEC chiếm tỉ lệ cao
nhất l| 15,9 % tiếp theo l| EPEC 3,8 %.

Trong nhom chứng ph}n lập được 3 loại E.
coli là EAEC (6,0), EPEC (2,0) và ETEC (1,0), tuy
nhiên chỉ có tỉ lệ ph}n lập của EAEC l| kh{c biệt
có ý nghĩa thống kê giữa nhóm bệnh v| nhóm
chứng (p<0,05).
Bảng 2: Sự phân bố của các E. coli theo tuổi
Các loại Từ 0 –24 tháng
E. coli

(n=183)
Số dương

Từ 25 – 59 tháng Giá trị
(n =30)

%

tính

Số dương

p
%

tính

ETEC

1

0,5

0

0

>0,05

EHEC

6

3,3

0

0

>0,05

32


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 11 * Số 1 * 2007
EPEC

8

4,4

0

0

>0,05

EIEC

2

1,1

2

6,7

>0,05

EAEC

32

17,5

2

6,7

>0,05

Nhận xét: Trong nhóm trẻ từ 0 đến 24 th{ng
tuổi ph}n lập được cả 5 loại E. coli với EAEC
chiếm tỉ lệ cao nhất l| 17,5 %, tiếp đến l| EPEC
(4,4%) v| EHEC (3,3%). Trong nhóm trẻ từ 25 đến
60 th{ng tuổi chỉ ph}n lập được 2 loại E. coli là
EIEC v| EAEC vớI tỉ lệ 6,7%, tuy nhiên c{c kh{c
biệt về tỉ lệ giữa hai nhóm không có ý nghĩa
thống kê (p>0,05).
Bảng 3: Sự liên quan giữa các E. coli gây tiêu chảy với kết
quả soi phân trực tiếp trong cùng một bệnh phẩm.
Loại E. coli

Bạch cầu
Hồng cầu Kén amibe
Dương % Dương % Dươn %
tính
tính
g tính
EAEC (n=34)
11
32,4
1
2,9
5
14,7
EPEC (n=4)
3
37,5
1
12,5

1
12,5
EIEC (n=7)
3
75,0
3
75,0
1
25,0

Nhận xét: 75% các trường hợp nhiễm EIEC có sự
hiển diện của bạch cầu và hồng cầu trong phân. Các
trường hợp nhiễm EAEC có 14,7% có nhiễm kèm với
kén amibe và 32,4% có sự hiện diện của bạch cầu
trong phân.
Bảng 4: Sự liên quan giữa các loại E. coli với một số
triệu chứng lâm sàng
Sốt  37

0

Loại E. coli
Số ca
(%)
EAEC
14 (51,8)
(n=27)
EPEC (n=7) 4 (57,1)
EHEC (n=6) 2 (66,6)

Mất nước
độ B

Nôn

Số ca
(%)
14
4 (14,8)
(51,8)
4 (57,1) 2 (28,5)
2 (66,6) 2 (66,6)

Số ca (%)

Kèm với bệnh
viêm đường
hô hấp cấp
Số ca (%)

KẾT LUẬN
Từ 213 mẫu bệnh phẩm ph}n của 213 trẻ em
dưới 5 tuổi bị tiêu chảy, chúng tôi đã ph}n lập
được 53 chủng E. coli g}y tiêu chảy chiếm tỉ lệ l|
24,9% trong đó EAEC đóng vai trò quan trọng
nhất chiếm tỉ lệ l| 15,9%, tiếp theo l| EPEC (3,7%);
EHEC (2,8%); EIEC (1,9%) và ETEC là 0,5%.
Đặc biệt c{c chủng EHEC đã được ph}n lập
l| c{c chủng EHEC non – O157 nên bệnh cảnh
l}m s|ng trên bệnh nhi chỉ l| c{c tiêu chảy đơn

thuần.
Trong nhóm tiêu chảy g}y nên do EAEC có
35,4% trường hợp có tiêu chảy kéo d|i trên hai
tuần v| trên 50% bệnh nhi bị nhiễm EAEC có kèm
với bệnh viêm đường hô hấp trên. C{c trường
hợp tiêu chảy do EIEC thường được biểu hiện
bằng một hội chứng lỵ, tuy nhiên c{c triệu chứng
l}m s|ng trên bệnh nhi không đặc trưng cho từng
loại E. coli. Các E. coli g}y tiêu chảy đã đề kh{ng
với Chloramphenicol v| Co-trimoxazole ở mức
trên 70%.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.
2.
3.
4.

3 (42,8)
1 (16,6)

Bảng 5: Mức độ nhạy cảm với kháng sinh của các
chủng E. coli

Chloramphenicol
Co- trimoxazole
Nalidixic acid
Amikacin
Cefotaxime
Ciprofloxacin

Nhận xét: Trong bảng 5 cho thấy hai kh{ng sinh
đã bị c{c chủng E. coli đề kh{ng ở mức trên 70% l|
Chloramphenicol và Co-trimoxazole, tuy nhiên đối
với bốn kh{ng sinh còn lại vi khuẩn vẫn còn nhạy
cảm ở mức trên 80%.

15 (55,5)

Nhận xét: C{c triệu chứng l}m s|ng trên đều
không đặc hiệu cho từng loại E. coli g}y tiêu chảy,
tuy nhiêm một điều đ{ng lưu ý l| có trên 50%
bệnh nhi bị nhiễm EAEC có kèm với bệnh viêm
đường hô hấp trên.

Kháng sinh

Nghiên cứu Y học

Nhạy cảm Trung gian Đề kháng
%
%
%
26,8
0
73,2
12,2
0
87,7
92,7

0
7,3
97,6
0
2,4
82,9
0
17,1
100
0
0

5.
6.

7.
8.
9.

Võ thị Dương Huy, Nguyễn Thanh Bảo (1991) “Tiêu chảy
cấp do Escherichia coli”, Tạp chí vệ sinh phòng dịch, 1(2) tr 29 - 33
Lê Văn Phủng (2000), “Một số ứng dụng của PCR trong vi
sinh vật”, Tạp chí Y học thực hành, 1 (393) tr 25 - 27
Ho|ng thị Thu Thủy (1988), “Góp phần nghiên cứu các chủng
Escherichia coli gây tiêu chảy cấp ở trẻ em tạI Hà nộI”Luận văn
phó tiến sĩ Y học, Trường đại học Y H| nội
Chu Văn Tường (1991), “Tiêu chảy cấp”, Bách khoa thư bệnh
học,tr. 174 – 175
Biswas R., Nelson E.A., Lewindon P.J., (1996) “Molecular
Epidemiology of Escherichia coli diarrhea in children in

Hongkong” J,Clin. Microbio., 34(12) pp. 3233 – 3234
Echeverria P., Savarino S.J., Yamamoto T. (1993) “Escherichia
coli diarrhoea”, Bacillier Clin. Gastroenterology, 7(2), pp 243- 260
Nataro J.P., Kaper J.B. (1998), “Diarrheagenic Escherichia
coli”Rev. Clin. M icrobiolo 11(2), pp. 142 – 201.
Schimidt H., Knop C., Franke S. (1995) “Development of PCR
for screening of Enteroaggregative Escherichia coli”, J. Clin. M
icrobiolo 33 (3), pp 701 - 705

Sjukhus H (2000), “ETEC, EHEC, EIEC, EPEC and other
verotoxigenic enterobacterriaceae detection with PCR and
agarose gel electrophoresis of the PCR products”, Kliniskt
Bakteriologiska Labo., 9, pp. 1-9

33