Nghiên cứu và chế tạo cảm biến sinh học điện hoá độ nhạy cao sử dụng điện cực in các bon ứng dụng trong chẩn đoán bệnh sớm (tt)

MỞ ĐẦU
Ung thư là bệnh có tỷ lệ bệnh nhân tử vong cao đứng thứ hai trên thế giới
với hơn 200 loại ung thư khác nhau. Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) xếp Việt
Nam ở vị trí 78 trên 172 quốc gia, vùng lãnh thổ được khảo sát với tỉ lệ tử vong
110/100.000 người, nằm trong 50 nước thuộc nhóm 2 của bản đồ ung thư thế
giới. Tuy nhiên, phần lớn bệnh nhân mắc bệnh ung thư tại Việt Nam đến khám
và điều trị ở giai đoạn khối u đã chuyển thành ác tính và di căn nên tỷ lệ chữa
khỏi bệnh là thấp, chi phí điều trị tốn kém. Hiện nay, việc khám và chữa bệnh
ung thư tại các bệnh viện chủ yếu dựa vào các phương pháp truyền thống như
siêu âm, chụp cộng hưởng từ và sinh thiết. Kết quả của các phương pháp này
phụ thuộc vào kích thước và đặc tính của khối u nên thường phát hiện khi bệnh
ở giai đoạn đã phát triển và không hiệu quả trong phát hiện ung thư giai đoạn
sớm. Các chỉ dấu khối u thường được sinh ra từ tế bào ung thư và biểu mô và
có nồng độ cao hơn mức ở người bình thường. Các chỉ dấu khối u có thể xác
định được bằng các kỹ thuật truyền thống như ELISA, PCR, miễn dịch phóng
xạ (RIA), phổ huỳnh quang, phổ khối và sắc kí. Các kỹ thuật này cho phép
phát hiện chỉ dấu khối u với độ chính xác và độ chọn lọc cao; tuy nhiên yêu
cầu thời gian phân tích lâu, chi phí hóa chất cao, phân tích đơn lẻ từng chất chỉ
dấu. Cảm biến sinh học điện hóa với ưu điểm độ nhạy và độ chọn lọc cao, thời
gian phân tích ngắn, cho phép phát hiện chất cần phân tích ở nồng độ thấp,
đơn giản và rẻ tiền, khả năng tích hợp trong các thiết bị đo cầm tay ứng dụng
phép phân tích tại chỗ đang là phương pháp được ưu tiên lựa chọn để phát hiện
chỉ dấu khối u. Chính vì vậy, tác giả quyết định chọn đề tài “Nghiên cứu và
chế tạo cảm biến sinh học điện hóa độ nhạy cao sử dụng điện cực in các
bon ứng dụng trong chẩn đoán bệnh sớm”.
Mục tiêu nghiên cứu của luận án:
(1) Phát triển cảm biến sinh học phổ tổng trở điện hóa sử dụng điện cực in lưới
thương mại với chi phí thấp hướng đến ứng dụng thực tế trong các thiết bị cầm
tay.
(2) Cải tiến và phát triển các kỹ thuật biến tính bề mặt điện mực in các bon
nhằm nâng cao hiệu suất cố định đầu thu sinh học cũng như tăng cường đáp

ứng tín hiệu đối với cảm biến phổ tổng trở điện hóa.
(3) Chế tạo cảm biến sinh hóa điện hóa có độ nhạy và độ chọn lọc cao phát
hiện chỉ dấu khối u (bao gồm các kháng nguyên α-hCG, PSA, AFP) ứng dụng
trong chẩn đoán sớm một số bệnh ung thư và cảm biến điện hóa enzyme xác
định glucose trong máu.
Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu:
Phương pháp nghiên cứu của luận án là phương pháp nghiên cứu thực nghiệm.
1


Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án:
- Về lý luận khoa học: các kết quả thu được của luận án đã góp phần làm sáng
tỏ cơ chế hoạt động cảm biến sinh học điện hóa phổ tổng trở sử dụng đầu thu
sinh học tự nhiên (kháng thể) và đầu thu sinh học bán tổng hợp aptamer.
- Về thực tiễn: kết quả nghiên cứu của luận án hướng tới phát triển cảm biến
sinh học có cấu trúc đơn giản, giá thành thấp, thời gian phân tích ngắn, độ nhạy
và độ chọn lọc cao, cho phép phát hiện chỉ dấu khối u trong giai đoạn sớm của
bệnh. Cảm biến sinh học đã chế tạo có định hướng ứng dụng trong các thiết bị
cầm tay đáp ứng yêu cầu xét nghiệm tại chỗ.
Những đóng góp mới của luận án:
1. Luận án đã đóng góp các kết quả mới về công nghệ chế tạo hạt nano vàng
phân tán đều trên bề mặt điện cực in lưới mực in các bon nhằm thay thế
điện cực in lưới mực in vàng. Hơn thế nữa giải pháp công nghệ này giúp
phân tán đều đầu thu sinh học trên bề mặt điện cực, nhờ đó nâng cao hiệu
suất bắt cặp giữa đầu thu và chỉ dấu sinh học cần phân tích.
2. Luận án đóng góp ba giải pháp biến tính bề mặt điện cực in lưới mực in các
bon bằng hệ vật liệu mới nhằm nâng cao hiệu suất cố định đầu thu sinh học
và đáp ứng tín hiệu đối với cảm biến phổ tổng trở điện hóa. Hệ vật liệu bao
gồm: (i) Polyme dẫn đồng trùng hợp polypyrrole-polypyrrole cacboxyl
(PPy-PPa); (ii) Vật liệu lai cấu trúc nano hai chiều giữa polyme đồng trùng

hợp PPy-PPa và ôxít graphene dạng khử điện hóa (erGO); (iii) Vật liệu lai
giữa poly(para-aminothiophenol) và hạt nano vàng.
3. Ứng dụng thành công đầu thu sinh học bán tổng hợp aptamer trong chế tạo
cảm biến phổ tổng trở điện hóa xác định chỉ dấu ung thư tiền liệt tuyến. Kết
quả nghiên cứu này là tiền đề cho định hướng nghiên cứu về cảm biến phổ
tổng trở điện hóa phát hiện chỉ dấu sinh học với chi phí thấp, không yêu
cầu điều kiện bảo quản nghiêm ngặt.
4. Ứng dụng thành công cấu trúc đa lớp giữa vật liệu polyme ôxy hóa-khử
Osmium và enzyme trong cảm biến cảm biến điện hóa enzyme thế hệ thứ
2. Kết quả nghiên cứu này là tiền đề cho định hướng nghiên cứu về cảm
biến điện hóa đo dòng phát hiện chỉ dấu sinh học trên cơ sở tác nhân sinh
học enzyme.
5. Xây dựng quy trình chế tạo quy mô phòng thí nghiệm 06 cảm biến điện hóa
sử dụng điện cực in lưới mực in các bon cho phép xác định nồng độ chỉ dấu
khối u trong ngưỡng phát hiện sớm các bệnh ung thư (ung thư u tế bào mầm
tinh, ung thư tiền liệt tuyến và ung thư gan). Các cảm biến đã chế tạo có độ
nhạy và độ chọn lọc cao, yêu cầu lượng mẫu phân tích nhỏ (cỡ 3µL), thời
gian phân tích nhanh (khoảng 30 phút), thao tác đơn giản, có khả năng tích
hợp với thiết bị cầm tay.
2


Bố cục của luận án:
Chương 1. Cảm biến sinh học điện hóa ứng dụng chẩn đoán bệnh sớm
Chương 2. Thực nghiệm và các phương pháp nghiên cứu
Chương 3. Cảm biến miễn dịch phát hiện chỉ dấu α-hCG ứng dụng chẩn đoán
u tế bào mầm tinh
Chương 4. Cảm biến aptamer phát hiện chỉ dấu PSA ứng dụng chẩn đóa ung
thư tiền liệt tuyến
Chương 5. Cảm biến miễn dịch phát hiện chỉ dấu AFP ứng dụng chẩn đoán

ung thư gan
Chương 6. Cảm biến điện hóa glucose
CHƯƠNG 1. CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HÓA ỨNG DỤNG CHẨN
ĐOÁN BỆNH SỚM
1.1 Cảm biến sinh học
Theo Hiệp hội Quốc tế về Hóa học và Hóa học ứng dụng (IUPAC –
Internatonal Union of Pure and Applied Chemistry), cảm biến sinh học
(biosensor) là một thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp thông tin, phân tích
định lượng hoặc bán định lượng của chất cần phân tích thông qua việc sử dụng
đầu thu sinh học được cố định lên bộ phận chuyển đổi tín hiệu [101, 168]. Cấu
tạo của một cảm biến sinh học bao gồm ba phần chính: đầu thu sinh học, bộ
phận chuyển đổi và bộ phận xử lý đọc tín hiệu.
1.2 Cảm biến sinh học điện hóa
Cảm biến sinh học điện hóa là cảm biến hoạt động dựa trên nguyên tắc
chuyển đổi tín hiệu do tương tác sinh học thành tín hiệu điện của hệ điện hóa
(tín hiệu dòng, tín hiệu điện áp, tín hiệu độ dẫn, tín hiệu tổng trở) [123, 263].
Cảm biến loại này có ưu điểm như thời gian đáp ứng nhanh, độ nhạy và độ
chọn lọc cao. và được ứng dụng trong các phép phân tích y sinh trong y tế,
trong công nghệ sinh học thực phẩm hoặc kiểm soát các thông số môi trường
[24, 188, 207].
Cảm biến sinh học phổ tổng trở điện hóa dựa trên nguyên tắc nhận biết
tương tác sinh học xảy ra trên bề mặt điện cực và làm thay đổi trở kháng phức
của hệ điện hóa. Phép đo phổ tổng trở được khảo sát trong dung dịch điện ly
có cặp chất ôxy hóa-khử được gọi là phổ tổng trở Faradaic (EIS faradaic);
trong dung dịch điện ly không có cặp chất ôxy hóa-khử được gọi là phổ tổng
trở không Faradaic (EIS nonfaradaic) [31]. Mô hình mạch tương đương
Randles được áp dụng đối với hệ điện hóa khảo sát trong dung dịch điện ly có
cặp chất ôxy hóa-khử, bao gồm 3 thành phần là Rs là điện trở của dung dịch
điện ly, Rct điện trở truyền điện tích, Cdl là điện dung lớp kép, trở kháng
Warburg ZW.

1.2.1 Điện cực điện hóa
3


4 mm

(a)

(b)

Tiếp xúc
thiết bị

Điện cực
làm việc cácbon
(2,64 mm2)

Vùng mặt
nạ không
thấm nước

Điện cực đối

12,5 mm

Điện so sánh
Ag/AgCl

Điện cực
làm việc vàng

(3,67 mm2)

Hình 1.18. Điện cực in lưới màng dày của hãng BioDevice Technology (Nhật Bản)
(a) điện cực làm việc mực in các bon; (b) điện cực làm việc mực in vàng.

Điện cực in lưới màng dày có nhiều ưu điểm như: giá thành thấp, cho phép
sản xuất hàng loạt, thiết kế linh hoạt, độ lặp lại cao, nguồn nguyên liệu phong
phú. Điện cực làm việc sử dụng mực in cácbon hay kim loại (vàng hoặc platin),
điện cực so sánh sử dụng mực in Ag/AgCl. Mực in cácbon với ưu điểm dòng
phông nền thấp và giá thành rẻ và khả năng tương thích sinh học cao nên được
lựa chọn trong cảm biến sinh học [151].
1.2.2 Phân loại cảm biến sinh học điện hóa
1.2.2.1 Cảm biến đo dòng
1.2.2.2 Cảm biến đo điện thế
1.2.2.3 Cảm biến đo độ dẫn
1.2.2.4 Cảm biến đo phổ tổng trở
1.3 Ung thư và một số chỉ điểm khối u
1.3.1 Chỉ dấu hCG và ung thư tế bào mầm tinh
hCG (Human chorionic gonadotropin) thuộc họ nội tiết glycoprotein được
sản sinh từ các cộng bào nuôi của nhau thai và tế bào mầm của khối u [31].
Nồng độ hCG đối với người bình thường ở cả nam và nữ không mang thai nằm
trong khoảng 0 ÷ 5 mIU/mL; đối với phụ nữ tiền mãn kinh là thấp hơn 9,5
mIU/mL. Khi nồng độ chỉ dấu hCG tăng thì có thể bệnh nhân mắc các bệnh lý
liên quan đến u lá nuôi thời kì thai nghén đối với nữ, u tế bào mầm xuất hiện
trong cơ quan sinh dục của cả nam và nữ [12, 18, 68, 153].
1.3.2 Ung thư tiền liệt tuyến và kháng nguyên PSA
PSA là một glycoprotein được mã hóa bởi gen KLK3 (Kallikrein-3) được
tiết ra bởi các tế bào biểu mô của tuyến tiền liệt bình thường và mô bướu [14,
128]. Nồng độ PSA trong huyết thanh thường thấp hơn 4 ng/mL và gia tăng
trong ung thư tiền liệt tuyến (UTTLT) cũng như một số bệnh lý khác như phì

đại tuyến tiền liệt, viêm tuyến tiền liệt. Giá trị nồng độ PSA nằm trong “vùng
xám” có giá trị từ 4 đến 10 ng/mL có nguy cơ mắc UTTLT.
1.3.3 Chỉ dấu sinh học AFP và ung thư gan nguyên phát
AFP là chỉ dấu sinh học ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị ung thư gan
nguyên phát. Người bình thường có AFP thấp hơn 10 ng/mL. AFP tăng cao
4


trong phần lớn bệnh nhân ung thư gan nguyên phát và bệnh viêm gan siêu vi.
Ở người có khối u bướu gan mà không có bệnh lý ở gan trước đó, ngưỡng AFP
tăng cao hơn 100 ng/mL có giá trị chẩn đoán ung thư gan nguyên phát.
1.4. Nghiên cứu về cảm biến sinh học điện hóa ứng dụng phát hiện chỉ dấu
khối u
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Phương pháp điện hóa
2.1.1 Phương pháp phổ tổng trở điện hóa (EIS)
Phổ tổng trở điện hóa là một công cụ hiệu quả cho phép nghiên cứu các
hiện tượng hóa lý xảy ra trên bề mặt phân chia rắn-lỏng. Nguyên lý của EIS
dựa trên việc phân tích trở kháng phức thu nhận được khi đặt điện áp xoay
chiều lên hệ điện hóa với tần số được thay đổi liên tục từ giá trị cao đến thấp.
Ưu điểm của cảm biến sinh học điện hóa phổ tổng trở là điện áp đặt trên điện
cực rất nhỏ nên không làm ảnh hưởng đến hoạt tính của các thành phần sinh
học. Phổ trở kháng phức thực nghiệm được mô phỏng bằng mô hình mạch
tương đương Randles.
2.1.2 Phương pháp quét thế tuần hoàn (CV)
Nguyên lý cơ bản của phương pháp CV là áp đặt một điện thế biến đổi tuần
hoàn lên điện cực làm việc và ghi lại dòng tuân theo định luật Nernst. Phương
pháp này cho phép điều khiển quá trình phản ứng điện hóa thông qua các thông
số điện áp, tốc độ quét thế. Trong nội dung luận án, tác giả sử dụng phương
pháp CV để tổng hợp hạt nano vàng trên điện cực SPCE, tổng hợp vật liệu

polyme, khử điện hóa graphene oxít trên điện cực SPCE. Ngoài ra, phương
pháp CV còn giúp cho việc phân tính tính chất lớp vật liệu polyme biến tính
trên bề mặt điện cực và đánh giá tương tác kháng nguyên – kháng thể thông
qua việc xác định các thông số đặc trưng Epa, Epc, Ipa, Ipc.
2.2 Phương pháp khảo sát tính chất và hình thái học vật liệu
2.3 Công nghệ vi lưu ly tâm
2.3.1 Giới thiệu
2.3.2 Thiết kế và quy trình chế tạo chíp vi lưu ly tâm
Chíp vi lưu ly tâm kiểu cấu trúc van xi phông bằng phương pháp khuôn
đúc sử dụng vật liệu polydimethylsiloxane (PDMS) ứng dụng kết hợp với điện
cực thương mại của hãng DropSens mã DRP-110 và DRP-AUTR10. Việc thu
nhỏ kích thước buồng phản ứng sẽ giảm đáng kể lượng dung dịch hóa chất và
mẫu phân tích tiêu hao từ 100 µL trong phương pháp nhỏ giọt giảm xuống còn
5 µL.

5


Tấm cố định

Chip vi lưu

Điện cực
Giá đỡ

Hình 2.8. Thiết kế giá đỡ gắn với trục quay của máy ly tâm: a) Thứ tự lắp ghép chíp vi lưu
và điện cực; b) Vị trí bốn hệ chíp vi lưu-điện cực được cố định đồng thời trên giá đỡ.

2.4 Quy trình thực nghiệm chế tạo cảm biến
2.4.1 Tổng hợp hạt nano vàng trên điện cực làm việc SPCE

Tiến hành tổng hợp hạt nano vàng trên điện cực SPCE bằng phương pháp
quét thế tuần hoàn. Tiến hành nhỏ 35 µL dung dịch HAuCl4 100 µM pha trong
dung dịch đệm PBS 100 mM lên trên bề mặt SPCE sao cho bao phủ cả 3 điện
cực (bao gồm cả Ag/AgCl, điện cực đối và điện cực làm việc). Tiến hành quét
thế tuần hoàn từ -0,6 V ÷ +0,5 V vs. Ag/AgCl, tốc độ quét 50 mV/s và bước
nhảy 10 mV.
2.4.2 Màng đơn lớp tự lắp ghép (SAM) alkanethiol
- Màng đơn lớp tự lắp ghép SAM (MHDA): Axít 16-mercaptohexadecanoic
(MHDA) là axít hữu cơ chuỗi mạch dài gồm 16 nguyên tử các bon, có một đầu
là nhóm cacboxyl (-COOH) và đầu còn lại là nhóm thiol (-SH). Ngâm toàn bộ
phần điện cực làm việc của cảm biến trong 100 µL dung dịch MHDA nồng độ
1 mM phân tán trong dung môi ethanol và giữa tại nhiệt độ phòng trong 12
giờ. Sau bước này trên bề mặt điện cực hình thành màng SAM có nhóm chức
cacboxyl hướng lên trên bề mặt.
- Màng đơn lớp tự lắp ghép SAM (p-ATP): Phân tử p-ATP có cấu trúc mạch
vòng benzen có gắn nhóm chức thiol (-SH) và nhóm chức amin (-NH2) tại vị
trí para. Điện cực làm việc của cảm biến được ngâm trong 100 µL dung dịch
của p-ATP nồng độ 25 mM phân tán trong dung môi ethanol và được ủ tại
nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian từ 6 đến 24 giờ. Như vậy, sau bước này
bề mặt điện cực cảm biến hình thành màng SAM có nhóm amin hướng lên
trên bề mặt.
2.4.3 Tổng hợp vật liệu polyme bằng phương pháp trùng hợp điện hóa
2.4.3.1 Polyme đồng trùng hợp PPy-PPa
2.4.3.2 Vật liệu lai cấu trúc nano hai chiều giữa polyme đồng trùng hợp PPyPPa và erGO
2.4.3.3 Vật liệu lai poly(p-ATP) và hạt nano vàng
2.4.4 Cố định đầu thu sinh học bằng liên kết cộng hóa trị
6


2.4.4.1 Liên kết cộng hóa trị thông qua nhóm amin của đầu thu sinh học

Hình 2.11. Cơ chế phản ứng tạo liên kết giữa nhóm amin (NH2) của đầu thu sinh học và nhóm
cacboxyl (-COOH) trên bề mặt điện cực sử dụng hợp chất NHS và EDC [260].

2.4.4.2 Liên kết cộng hóa trị thông qua nhóm cacboxyl của đầu thu sinh học

Hình 2.12. Cơ chế phản ứng tạo liên kết giữa nhóm cacboxyl (-COOH) của kháng thể và
nhóm amin (NH2) trên bề mặt điện cực sử dụng EDC [260].

2.5 Khảo sát hoạt động của cảm biến phổ tổng trở điện hóa
Bước 1. Chuẩn bị mẫu chỉ dấu sinh học cần phân tích
Bước 2. Phản ứng đặc hiệu giữa đầu thu sinh học và chỉ dấu sinh học phân tích
Bước 3. Khảo sát phổ tổng trở điện hóa
Vật liệu biến
tính điện cực
SPCE
Màng đơn
lớp tự lắp
ghép SAM

Vật liệu
polyme

Mô hình

Mạch điện tương đương

Rs , Rct , Z C =

Cdl

C và
Warburg

dl

Rs
Rct

ZW

CPE và
Warburg

Phẩn tử trong
mạch điện

Rct
ZW

2.6 Quy hoạch số liệu thực nghiệm
7

ZW =

j Cdl

,

1

( j )1/ 2 .W

Rs , Rct , Z CPE =

CPE

Rs

ZW =

1

1
( j ) .Q

1

( j )1/ 2 .W

n

,


CHƯƠNG 3. CẢM BIẾN MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN CHỈ DẤU α-hCG
ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN U TẾ BÀO MẦM TINH
3.1 Mở đầu
3.2 Thực nghiệm

(a)

(b)

Hình 3.1. (a) Linh kiện vi cân tinh thể thạch anh QCM 5 MHz được ghép nối với bộ tạo dao
động QCM25 của hãng Stanford Research Systems, (b) Hệ thiết bị khảo sát hoạt động của
QCM ở chế độ đo động.

(b)

(a)

(c)

Hình 3.2. (a) Ảnh hiển vi điện tử quét bề mặt điện cực mực in vàng, (b) Điện cực mực in vàng
SPAuE của hãng BioDevice Technology, (c) Hệ thiết bị điện hóa AutoLab PGSTAT 12.

3.2.3 Quy trình cố định mAb α-hCG trên điện cực vàng
OH

OH
O

S

S

OH
O

S

SPAuE

S

O

S

O N
O

OH

OH
O

OO N
O
O

O

(EDC)
R1-N=C=N-R2
(NHS)

S

S

O O N OO N OO N
O
O
O
O

S

SPAuE

O

S

O

S

O

O N
O

NH
O

O

-NH2
(Kháng thể)
Cố định
kháng thể

S

S

O
NH
O

S

SPAuE

O N O
O

O

S

O

S

NH

NH
O

(Ethanolamine)
Loại bỏ các liên kết
không đặc hiệu

NH

O

S

S

NH
O

S

NH

O

S

NH
O

O

S

SPAuE

Hình 3.3. Quy trình công nghệ cố định mAb α-hCG lên điện cực vàng thông qua màng SAM.

3.2.4 Khảo sát hoạt động của cảm biến mAb α-hCG/SAM(MHDA)/QCM
Cảm biến dựa trên linh kiện QCM được khảo sát ở chế độ đo trong pha
lỏng động, độ dòng chảy của dung dịch là 3 mL/giờ, độ pH của dung dịch đo
là 7,4 [64]. Sự suy giảm tín hiệu tần số cộng hưởng của linh kiện QCM được
ghi nhận ngay trong quá trình bơm dung dịch. Thời gian cho mỗi phép phân
tích khảo sát tương tác kháng nguyên-kháng thể là 80 phút.
8


3.2.5 Khảo sát hoạt động của cảm biến mAb α-hCG/SAM(MHDA) /SPAuE
Cảm biến được tiến hành đo phổ trở kháng phức trong dung dịch gồm có 0,1
M KCl và 5 mM [Fe(CN)6]3-/4- trong dải tần số từ 100 kHz đến 50 mHz tại thế
một chiều 0,16V và thế xoay chiều 10
-Z (Ω)
mV. Sử dụng phần mềm khớp (fit) phổ
tổng trở với mô hình mạch tương
đương Randles và xác định giá trị của
phần tử trong mạch. Xây dựng đồ thị
phụ thuộc của giá trị Rct vào nồng độ
kháng nguyên α-hCG. Khi phản ứng
miễn dịch xảy ra giữa kháng nguyên và
kháng thể trên bề mặt điện cực sẽ hình
R

∆R
Z (Ω)
thành khối điện môi cản trở quá trình Hình 3.5. Nguyên lý hoạt động của cảm
truyền điện tích đến điện cực, Rct tăng biến miễn dịch phổ tổng trở điện hóa.
theo lượng kháng nguyên bắt cặp với
kháng thể.
3.3 Kết quả và thảo luận
3.3.1 Cảm biến miễn dịch nhạy khối lượng mAb α- hCG/SAM(MHDA)/QCM
3.3.1.1 Hiệu suất cố định kháng thể
Cdl

im

RS

W
ZW

RCT

[Fe(CN)6]3-/4-

[Fe(CN)6]3-/4-

[Fe(CN)6]3-/4-

[Fe(CN)6]3-/4-

e-

e-

e-

S

CT

re

0
Linh kiÖn QCM

-100

-100

§é dÞch tÇn sè f (Hz)

§é dÞch tÇn sè f (Hz)

0

-200
-300

SAM (MHDA)/QCM

-400
NHS-EDC/SAM (MHDA)/QCM

-500

-200
-300
-400
-500
-600

mAb hCG/NHS-EDC/SAM (MHDA)/QCM

-600

-700
0

10

20
30
Thêi gian (phót)

40

0

50

5

10

15

20

25

30

Nång ®é kh¸ng nguyªn -hCG (ng/mL)

Hình 3.6 Độ dịch tần sau mỗi bước chế tạo của
cảm biến nhạy khối lượng sử dụng QCM 5 MHz.

Hình 3.8 Đường đặc trưng chuẩn
của cảm biến nhạy khối lượng.

Hiệu suất cố định kháng thể đánh giá theo công thức (Nkháng thể/NNHS) x 100%;
kết quả thu được là 2,88% cao hơn so với nghiên cứu của Wang chỉ là 0,14%
[299]. Như vậy có thể thấy quy trình cố định kháng thể chúng tôi nghiên cứu
là hoàn toàn phù hợp.
3.3.1.2 Đặc trưng chuẩn của cảm biến
Khảo sát thống kê với 03 cảm biến độc lập với cùng quy trình chế tạo, tần
số suy giảm mạnh trong khoảng nồng độ kháng nguyên từ 100 pg/mL đến 7,0
9


ng/mL và suy giảm không đáng kể khi nồng độ kháng nguyên tăng trong
khoảng từ 12 đến 27 ng/mL.

3.3.2 Cảm biến miễn dịch điện hóa mAb α-hCG/SAM(MHDA) /SPAuE
30
25

R (k) = 16,65 + 0,22*C (ng/mL)
ct
LOD = 9,35 ng/ml

40
(k)

20

50

ct

15

30

R

-Z" (k)

60

Nång ®é kh¸ng nguyªn -hCG
20 ng/mL
0

30 ng/mL
100 pg/mL
70 ng/mL
4 ng/mL
100 ng/mL
10 ng/mL

20

10

10

5
Z' (k)

0

0
0

10

20

30

40

50

60

Hình 3.10. Phổ trở kháng phức đáp ứng
của cảm biến với kháng nguyên α-hCG có
nồng độ 0÷100 ng/mL

0

20
40
60
80
100
Nång ®é kh¸ng nguyªn -hCG (ng/mL)

Hình 3.11. Đường đặc trưng chuẩn của
cảm biến mAb hCG/SAM(MHDA) /SPAuE.

Khảo sát với 5 mẫu trắng và 3 mẫu cảm biến độc lập ứng với mỗi điểm
nồng độ. Kết quả cho thấy Rct thay đổi tuyến tính trong khoảng nồng độ kháng
nguyên từ 4 đến 100 ng/mL, giới hạn phát hiện của cảm biến là 9,35 ng/mL
với diện tích điện cực làm việc là 3,67 mm2.
3.4 Kết luận
Tối ưu qui trình công nghệ cố định màng kháng thể bằng màng SAM dựa
trên linh kiện QCM. Cảm biến nhạy khối lượng hoạt động tốt trong dải nồng
độ thấp và sai số nhỏ hơn 5%.
Cảm biến miễn dịch điện hóa không đánh dấu sử dụng điện cực mực in
vàng (SPAuE) có giá thành rẻ hơn nhiều so với QCM, yêu cầu một lượng nhỏ
dung dịch mẫu, dễ tích hợp với các thiết bị cầm tay là cơ sở cho việc chế tạo

cảm biến sinh học sử dụng một lần. Kết quả cho thấy cảm biến mAb
hCG/MHDA/SPAuE đáp ứng yêu cầu đối với xét nghiệm đối với các bệnh
liên quan đến chỉ dấu α-hCG.
CHƯƠNG 4. CẢM BIẾN APTAMER PHÁT HIỆN CHỈ DẤU PSA ỨNG
DỤNG CHẨN ĐOÁN UNG THƯ TIỀN LIỆT TUYẾN
4.1 Mở đầu
4.2 Thực nghiệm

10


(b)

(a)

(c)

Hình 4.2. (a) Ảnh hiển vi điện tử quét bề mặt điện cực mực in các bon, (b) Điện cực mực in
các bon SPCE của hãng BioDevice Technology, (c) Hệ thiết bị điện hóa Vertex Invium.

4.3 Kết quả và thảo luận
4.3.1 Cảm biến aptamer phổ tổng trở điện hóa
Do DNA aptamer có kích thước nhỏ hơn kháng thể và mang điện tích âm
nên tín hiệu của cảm biến có thể được giải thích liên quan đến hai cơ chế xảy
ra đồng thời. Đối với cảm biến aptamer sự tăng hay giảm của giá trị Rct phụ
thuộc vào cơ chế nào chiếm ưu thế hơn.
[Fe(CN)6]3-/4-

[Fe(CN)6]3-/4[Fe(CN)6]3-/4-

[Fe(CN)6]3-/4-

[Fe(CN)6]3-/4[Fe(CN)6]3-/4-

eS

AuNP
AuNP

S

SPCE

[Fe(CN)6]3-/43-/4-

[Fe(CN)6]

[Fe(CN)6]

OH
S

S

S

S

S

S

S

[Fe(CN)6]

[Fe(CN)6]

S

S

S

S

OH

OH

S

S

S

OH
S

S

S

S

[Fe(CN)6]3-/4e-

e-

PSA
S

[Fe(CN)6]3-/4[Fe(CN)6]3-/4-

[Fe(CN)6]3-/4-

3-/4-

3-/4-

OH
S

S

SPCE

(b)
3-/4-

S

AuNP

S

OH
S S

OH
S
S

PSA

S

S

S S

S

AuNP

OH

S

S

S

AuNP

OH S
S

S

OH S
S

S

OH

OH
S

OH
S S

e-

S S

(a)

OH

S

S

SPAuE

S

S

S

S

S

S

S

OH

OH

S

S

S

S

S

SPAuE
COOH

PSA

Kháng nguyên PSA;

Aptamer;

Ethanolamine;

S

SAM Axit 16-Mercaptohexadecanoic

Hình 4.5. Mô hình quá trình động học xảy ra trên bề mặt điện cực trong phép đo trở kháng
phức Faradaic sử dụng cặp chất dò [Fe(CN)6] 3-/4-;(a) điện cực SPAuE, (b) điện cực AuNPsSPCE.

Cơ chế về hàng rào tĩnh điện: Aptamer được cố định trên bề mặt điện cực sẽ
hình thành hàng rào điện thế âm cản trở điện tử truyền đến bề mặt điện cực.
Nếu kháng nguyên mang điện tích dương khi phản ứng với aptamer sẽ làm
giảm hàng rào tĩnh điện giúp cho sự chuyển điện tử đến điện cực dễ dàng và
điện trở Rct giảm [100, 115].
Cơ chế về hiệu ứng không gian: Khi kháng nguyên liên kết đặc hiệu với
aptamer sẽ tạo thành khối điện môi trên bề mặt điện cực, tạo thành vùng không
gian cản trở quá trình truyền điện tích đến điện cực dẫn tới Rct tăng [39, 57,

108, 175].
11


4.3.2 Cảm biến PSA-Aptamer/SAM (MHDA)/SPAuE
4.3.2.1 Đặc tính điện hóa sau mỗi bước công nghệ
10

10

PSA-Aptamer/SAM(MHDA)/SPAuE

6
(b)

4
(d)

§iÖn cùc SPCE
AuNPs-SPCE
SAM (MHDA)/AuNPs-SPCE
Aptamer (5 g/mL)/SAM (MHDA)/AuNPs-SPCE
PSA (10 ng/mL)/Aptamer/SAM (MHDA)/AuNPs-SPCE

8

-Z''(k)

-Z''(k)

PSA/aptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE

§iÖn cùc SPAuE
SAM (MHDA)/SPAuE
Aptamer (5 g/mL)/SAM (MHDA)/SPAuE
PSA (10 ng/mL)/Aptamer/SAM (MHDA)/SPAuE

8

6

4

(c)
(b)

2

2

(d)

(e)

(a)

(c)

(a)

0

0
8

10

12

14

16

18

20

22

Z'(k)

Hình 4.6. Phổ EIS sau mỗi bước công nghệ
chế tạo của cảm biến PSAaptamer/SAM(MHDA)/SPAuE.

2

4

6

8

10

12

Z'(k)

Hình 4.11. Phổ EIS sau mỗi bước công
nghệ chế tạo của cảm biến PSAaptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE.

Kết quả phép đo phổ tổng trở đã cho thấy aptamer được cố định thành công
trên bề mặt điện cực thông qua màng SAM của MHDA cũng như đã xảy ra
tương tác đặc hiệu giữa aptamer và kháng nguyên PSA trên bề mặt điện cực
cảm biến. Với điện cực AuNPs-SPCE, hiệu suất cố định aptamer là 56% trong
khi điện cực SPAuE là 72%. Tuy nhiên, độ nhạy của cảm biến cảm biến sử
dụng AuNPs-SPCE đạt 73% trong khi giá trị này chỉ đạt 18% đối với cảm biến
sử dụng điện cực planar SPAuE. Việc sử dụng điện cực AuNPs-SPCE giúp
phân tán aptamer và tăng hiệu suất bắt cặp giữa aptamer và kháng nguyên PSA.
4.3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ aptamer lên tín hiệu cảm biến trên điện cực
SPAuE
Trên điện cực SPAuE xác suất cố định aptamer trên điện cực vàng lớn nên
hiệu ứng màn chắn tĩnh điện sẽ chiếm ưu thế. Tín hiệu cảm biến thăng giáng và
không theo quy luận nhất định. Đường chuẩn của cảm biến không đáp ứng được
yêu cầu tuyến tính trong dải nồng độ thuộc “vùng xám” trong xét nghiệm chẩn
đoán UTTLT.

12

5

PSA-aptamer/SAM/SPAuE

PSA-aptamer/SAM/SPAuE

0

-1

RCT (k)

RCT (k)

0

-2

-5

-3

Nång ®é aptamer cè ®Þnh

-10

100 g/mL
50 g/mL
5 g/mL

Nång ®é aptamer cè ®Þnh

-4

-15

50 g/mL
5 g/mL

-5
0

2

4

6

8

10

12

14

16

0

2

4

Nång ®é PSA (ng/mL)

6

8

10

12

14

16

Nång ®é PSA (ng/mL)

Hình 4.7. Khảo sát sự phụ thuộc của ∆Rct như một hàm của nồng độ PSA của cảm biến
PSA-aptamer/SAM(MHDA)/SPAuE với nồng độ aptamer 5, 10, 100 µg/mL.

4.3.3 Cảm biến PSA-Aptamer/SAM (MHDA)/AuNPs-SPCE
4.3.3.1 Phân tán aptamer
AuNP – 5 CVs

AuNP – 10 CVs

AuNP – 15 CVs

AuNP – 20 CVs

Hình 4.8. Ảnh SEM bề mặt điện cực SPCE sau khi tổng hợp hạt nano vàng bằng phương pháp
quét thế vòng với số vòng quét: 5, 10, 15, 20 vòng.

Hình 4.9. Phổ EDS của điện cực AuNPs-SPCE với cac hạt nano vàng được tổng hợp bằng
phương pháp quét điện thế tuần hoàn 20 chu kỳ.

4.3.3.2 Đặc tính điện hóa sau mỗi bước công nghệ
13


4.3.3.3 Đặc trưng của cảm biến
4.0

(a) PSA-aptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE

0.6

(b) PSA-aptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE

3.5
Nång ®é kh¸ng nguyªn PSA
0 ng/mL,
8 ng/mL
2 ng/mL,
10 ng/mL
4 ng/mL,
12 ng/mL

6 ng/mL,
14 ng/mL

2.5

0.5
0.4
Rct (k)

-Z" (k)

3.0

2.0
1.5

0.3
0.2
Rct(k)=0,0275+0,0518*PSA(ng/mL)

1.0

2

0.1

R =0,9845

0.5
0.0

0.0
2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

Z' (k)

5.5

6.0

6.5

7.0

0

2

4

6
8
10
Nång ®é PSA (ng/mL)

12

14

Hình 4.12. a) Đáp ứng phổ tổng trở của cảm biến tại các nồng độ kháng nguyên PSA từ 0
ng/mL đến 14 ng/mL; b) Đường đặc trưng chuẩn của cảm biến PSAaptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE.

Rct (k)

Các kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ hạt vàng cũng như nồng độ
aptamer cố định cho thấy tín hiệu của cảm biến đạt kết quả tốt nhất với 10
vòng quét tổng hợp hạt nano vàng
0.6
−hCG
và nồng độ của aptamer là 5
Protein TAU
amylin
µg/mL. Đường kính của bán cung
0.5
PSA
trong phổ EIS tăng khi nồng độ
0.4
kháng nguyên PSA tăng, hiệu ứng
không gian chiếm ưu thế. Cảm
0.3

biến có tính chọn lọc và độ tuyến
0.2
tính cao trong dải nồng độ PSA từ
2 đến 10 ng/mL, giới hạn phát hiện
0.1
LOD= 1,95 ng/mL. đáp ứng được
0.0
yêu cầu phát hiện chỉ dấu PSA ứng
2
4
6
8
10
12
14
Nång ®é (ng/mL)
dụng trong chẩn đoán sớm ung thư Hình 4.14. Độ chọn lọc của cảm biến PSAtiền liệt tuyến.
Aptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE.
4.4 Kết luận
Hạt nano vàng tổng hợp trên điện cực SPCE cho phép phát triển màng SAM
alkanethiol giống như trên điện cực SPAuE. Kết quả này rất có ý nghĩa, điện
cực SPCE với giá thành thấp khi được biến tính bởi hạt nano vàng trên bề mặt
sẽ cho phép sử dụng như điện cực vàng. Bên cạnh đó, các hạt nano vàng giúp
phân tán đều đầu thu sinh học được cố định trên bề mặt điện cực.
Các kết quả đáp ứng phổ tổng trở điện hóa của hai loại cảm biến trên điện
cực SPAuE và AuNPs-SPCE được giải thích một cách khoa học và đầy đủ bởi
hiệu ứng không gian và hiệu ứng màn chắn tĩnh điện. Các lý giải này cũng giải
thích được những mâu thuẫn trong kết quả công bố của nhóm tác giả Be Liu
(2012) và Jolly Pawan (2015).
14

CHƯƠNG 5. CẢM BIẾN MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN CHỈ DẤU AFP
ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN UNG THƯ GAN
5.1 Mở đầu
5.2 Thực nghiệm
5.2.2 Cố định mAb AFP lên điện cực PPy-PPa/SPCE và PPy-PPa/erGO-SPCE
O

Pyrrole-2-carboxylic axit (Pa)

OH

N

N
H

Pyrrole (Py)

N
H

n

SPCE

Polyme

O

O
O

NH
O

(EDC)
R1-N=C=N-R2

(a)

N
H

N
H

O

-NH2

n

N
H

SPCE

N

H

n

SPCE

Cố định
kháng thể

(NHS)

SPCE
O

N

N
H

Polyme

SPCE

N
H

N
H

n

SPCE

Graphene oxit (GO)

NH
O

O

erGO

O

O

OH

(b)

N
H

SPCE

n

O

-NH2

Cố định
kháng thể

Pyrrole-2-carboxylic axit (Pa)
(NHS)

N
H

N
H

n

SPCE

Pyrrole (Py)

Hình 5.1. Quy trình cố định kháng thể AFP bằng liên kết cộng hóa trị giữa nhóm amin của
kháng thể và nhóm cacboxyl của polyme PPy-PPa: (a) trên điện cực SPCE; (b) trên điện cực
erGO-SPCE.

5.2.3 Cố định mAb AFP lên điện cực SPCE biến tính bởi màng SAM(p-ATP)
NH2
S

SPCE

SPCE

SPCE
Tạo màng SAM

Tạo hạt nano vàng

O
(EDC)
R1-N=C=N-R2 + R3-C-OH
(Ab)

Xử lý EDC
Cố định kháng thể

Kháng thể AFP

Kháng nguyên AFP
NH

NH

NH

NH

AuNP
S

S

SPCE

SPCE

Ethanolamine
NH2

Phản ứng miễn dịch
kháng nguyên - kháng thể

4-Aminothiolphenol (p-ATP)
SH

Hình 5.2. Quy trình công nghệ cố định kháng thể AFP bằng liên kết cộng hóa trị giữa nhóm
cacboxyl của kháng thể và nhóm amin của SAM (p-ATP) trên điện cực AuNPs-SPCE.

5.2.4 Cố định mAb AFP lên điện cực SPCE biến tính bởi vật liệu lai poly(pATP) và hạt nano vàng

15


NH2
S

SPCE

SPCE

SPCE

To ht nano vng

To mng SAM
To mng polymer

N
S

AuNP

S

S

H

N

H
AuNP

AuNP

N

H
S

AuNP

AuNP

S

AuNP

S

S

AuNP

AuNP

AuNP

S

S

NH2

NH2
N H

N

N H

H

H

N

SPCE

N H

H

H

N

X lý EDC
C nh khỏng th

SPCE

H

H

SPCE

O
(EDC)
R1-N=C=N-R2 + R3-C-OH
(Ab)

Phn ng min dch
khỏng nguyờn - khỏng th

NH2

Khỏng th AFP

Khỏng nguyờn AFP

Ethanolamine

AuNP

4-Aminothiolphenol (p-ATP)
SH

Hỡnh 5.3. Quy trỡnh cụng ngh c nh khỏng th AFP bng liờn kt cng húa tr gia nhúm
cacboxyl ca khỏng th v nhúm amin ca vt liu lai polyme (p-ATP) v ht nano vng trờn
in cc AuNPs-SPCE.

5.3. Kt qu v tho lun
5.3.1 Cm bin min dch in húa mAb AFP/PPa-PPy/SPCE
5.3.1.1 Polyme ng trựng hp PPy-PPa trờn in cc SPCE
5.3.1.2 Ti u húa t s hp phn ca monome Pa vi Py
40

I / A

20
10

-

COO

SPCE
Tỷ số Pa / Py
0 mM : 160 mM
40 mM : 120 mM
80 mM : 80 mM
120 mM : 40 mM
160 mM : 0 mM

Dao động đặc tr-ng của Py

PPy-PPa/SPCE
tại các vị trí khác nhau
(1)

C-ờng độ (a.u.)

30

0

-10

(2)

(3)

-20

G-band

(4)

D-band

-30

điện cực SPCE trần

-40

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

300

0.6

600

900

1200

1500

1800

2100

2400

-1

Số sóng (cm )

E / V vs. Ag/AgCl

Hỡnh 5.6. ỏp ng dũng-th ca in cc
c tng hp mng PPy-PPa/SPCE vi t l
Pa so vi Py thay i t 0 n 100% mol.

Hỡnh 5.5. Ph Raman ca mng polyme ng
trựng hp PPy-PPa trờn in cc SPCE.
(b)

T l hp phn ca Pa vi Py l 1:3
(40mM:120 mM) cho mng polyme cú
ỏp ng in húa tt nht (Hỡnh 5.6).

Mng polyme cú dng bụng sỳp l v
phỏt trin a tng trờn b mt in cc
(Hỡnh 5.4b). Phộp o quang ph Raman
c thc hin ti bc súng kớch thớch
l 632,8 nm, vch ph ti s súng 1398
n 1400 cm-1 khng nh s cú mt ca
16

Hỡnh 5.4b. nh SEM b mt mng
polyme PPy-PPa trờn in cc SPCE.


nhóm cacboxyl trong cấu trúc màng polyme đồng trùng hợp.
5.3.1.3 Đặc trưng chuẩn của cảm biến
4.0

4.0

a)

2.0

2.5
2.0

1.5

1.5

1.0

1.0

0.5

0.5

0.0

0.0

2

3

4

5

6

LOD = 2,46 ng/mL

3.0

Rct(k)

2.5

mAb AFP/PPy-PPa/SPCE

3.5

Nång ®é AFP
0 ng/mL ;
5 ng/mL
10 ng/mL;
20 ng/mL
30 ng/mL;
40 ng/mL
50 ng/mL;
60 ng/mL
70 ng/mL;
80 ng/mL
90 ng/mL;
100 ng/mL

3.0
-Z"(k)

b)

mAb AFP/PPa-PPy/SPCE

3.5

7

8

9

R2 = 0,984
Rct (k) = 0,312 + 0,04*AFP (ng/mL)

n sè mÉu = 3
0

10

20

40

100

80

60

Nång ®é AFP(ng/mL)

Z'(k)

Hình 5.7. Đáp ứng phổ tổng trở điện hóa của cảm biến mAb AFP/PPy-PPa/SPCE với nồng
n samples = 3
độ kháng nguyên AFP thay đổi từ 0 đến 100 ng/mL.
40

a)

mAb AFP/PPa-PPy/SPCE

14

b)

30

mAb AFP/PPy-PPa/SPCE

12
20

Ipc(A)

I / A

10
10
0

-10

Nång ®é AFP
0 ng/mL;

-20
-30

8
6
4

5 ng/mL

10 ng/mL;

20 ng/mL

40 ng/mL;

60 ng/mL

80 ng/mL;

100 ng/mL

Ipc() = 0,37 + 0,158*AFP (ng/mL)

2

R2 = 0,99

0

-40
-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0

E / V vs. Ag/AgCl

20

40

60

80

100

Nång ®é AFP (ng/mL)

Hình 5.8. Đáp ứng dòng thế của cảm biến mAb AFP/PPy-PPa/SPCE với nồng độ kháng
R = 0,984
nguyên AFP thay đổi từ 0 đến 100 ng/mL.
2

5.3.2 Cảm biến miễn dịch điện hóa mAb AFP/PPa-PPy/erGO-SPCE
5.3.2.1 Khử điện hóa GO trên SPCE
20

SPCE
GO-SPCE
erGO-SPCE 30CVs

a)

18
16
-Z" (k)

14

40
2.0

1.0

SPCE
GO-SPCE
erGO-SPCE

-0.4

-0.2

20

0.5

12

3

4

5

6

10

7

I / A

0.0

10
8

0

-10

6

-20

4
2
0

b)

30

1.5

-30

0

5

10

15

20

25 30
Z' (k)

35

40

45

-40

50

0.0
0.2
0.4
E / V vs. Ag/AgCl

0.6

Hình 5.10. Đặc trưng điện hóa của điện cực erGO-SPCE khảo sát trong dung dịch đo gồm 5
mM [Fe(CN)6] 3-/4- và KCl 0,1 M. a) Đáp ứng phổ EIS, b) Đáp ứng dòng-thế tại tốc độ quét
50 mV/s.

17


Điện cực sau khi phủ GO có độ dẫn
kém, sau khử điện hóa erGO-SPCE với
30 vòng quét cho đáp ứng dòng thế cao
hơn so với điện cực SPCE ban đầu. Độ
dẫn và tốc độ truyền điện tử được cải
thiện khi sử dụng điện cực erGO-SPCE.
Tỷ số IG/ID giảm khi số vòng quét
tăng, Tỷ số này khá cách biệt giữa 10 và
20 vòng quét CV nhưng sai khác khá nhỏ

tại số vòng quét là 20 và 30. Điều kiện tối
ưu khử điện hóa GO là 30 vòng quét.

G-band

D-band

C-êng ®é a.u.

ID/IG = 1,02

800

(a) GO

ID/IG = 2,21

(b) erGO 10CVs

ID/IG = 2,67

(c) erGO 20CVs

ID/IG = 2,70

(d) erGO 30CVs

1000

1200

1400

1600

1800

Sè sãng (cm-1)

Hình 5.11. Phổ Raman của màng GO và
erGO trên điện cực SPCE.

5.3.2.2 Hình thái học bề mặt điện cực
a)

SPCE

b)

c)

erGO/SPCE

d)

GO/SPCE

PPa-PPy/erGO/SPCE

Hình 5.12. Ảnh SEM của a) bề mặt điện cực SPCE trần, b) có nhỏ phủ GO, c) điện cực

SPCE biến tính bởi erGO và d) điện cực được tổng hợp vật liệu lai cấu trúc nano hai
chiều giữa PPy-PPa và erGO.

Hình thái bề mặt erGO-SPCE khác biệt hẳn so với điện cực ban đầu với
các nếp gấp giúp tăng diện tích bề mặt riêng của điện cực. Màng PPy-PPa được
tổng hợp trên điện cực erGO/SPCE nhiều nếp nhăn tựa như cấu trúc của vỏ
não người; hình thái này hoàn toàn khác biệt so với cấu trúc dạng bông súp lơ
của polyme PPy-PPa trên điện cực SPCE.
5.3.2.3 Đặc trưng chuẩn của cảm biến
18


7

5
a) mAb AFP/PPa-PPy/erGO-SPCE 1.2

-Z''(k)

4
3

b)

mAb AFP/PPa-PPy/erGO-SPCE

6

0.9
0.6

LOD=0,34 ng/mL

5

0.3

Rct(k)

Nång ®é AFP
0 ng/mL ;
0,1 ng/mL
1 ng/mL;
5 ng/mL
10 ng/mL;
20 ng/mL
30 ng/mL;
40 ng/mL
50 ng/mL;
60 ng/mL
70 ng/mL;
80 ng/mL
90 ng/mL;
100 ng/mL

0.0
3

4

5

6

2

4
3
R2 = 0,996

2

1

Rct (k) = 0,375 + 0,057*AFP (ng/mL)

1
n sè mÉu = 3

0

0

2

4

6

8

10
Z'(k)

12

14

0

20

40
60
80
Nång ®é AFP (ng/mL)

100

Hình 5.13. Đáp ứng phổ tổng trở điện hóa của cảm biến mAb AFP/PPy-PPa/erGO-SPCE với
nồng độ kháng nguyên AFP thay đổi từ 0 đến 100 ng/mL.

Rct()

Vùng đáp ứng tuyến tính cua cảm biến mở rộng từ 0,1 ng/mL đến 100 ng/mL.
Độ nhạy của cảm biến đạt 57 /ng.mL-1 cao hơn 1,4 lần so với cảm biến sử
dụng polyme PPy-PPa (40 /ng.mL-1).
5.3.3 Cảm biến miễn dịch điện hóa mAb AFP/SAM(p-ATP)/ AuNPs-SPCE
5.3.3.1 Ảnh hưởng của mật độ hạt nano vàng
5.3.3.2 Ảnh hưởng của thời gian tạo màng SAM
Thời gian tạo màng đơn lớp

quyết định đến tính ổn định
3000
6 giê
12 giê
và độ bền của màng SAM.
18 giê
2500
24 giê
Với thời gian tạo màng SAM
2000
là 18 và 24 giờ đáp ứng tín
hiệu Rct không ổn định do
1500
điện cực SPCE ngâm quá lâu
1000
trong môi trường ethanol sẽ
ảnh hưởng đến chất lượng của
500
điện cực. Chúng tôi chọn điều
0
kiện tối ưu để tổng hợp màng
10
50
100
Nång ®é AFP (ng/mL)
SAM trên điện cực 20 CVs
Hình 5.18. Đáp ứng tín hiêu Rct của cảm biến với
AuNPs-SPCE là 12 giờ.
thời gian tổng hợp màng SAM là 6, 12, 18, 24 giờ.
5.3.3.3 Đặc trưng điện hóa sau mỗi bước công nghệ

19


4.0

mAb AFP/poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE
3.5

SPCE
AuNPs-SPCE

3.0

poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE
mAb AFP/poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE
antigen AFP (5 ng/mL)

-Z" (k)

2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
2

4

6

8

10

12

14

Z' (k)

Hình 5.19. Phổ EIS sau mỗi bước công nghệ
chế tạo của cảm biến mAb AFP/SAM(pATP)/AuNPs-SPCE.

Hình 5.24. Phổ EIS sau mỗi bước công
nghệ chế tạo của cảm biến mAb
AFP/poly(p-APT)/AuNPs-SPCE.

5.3.3.4 Đặc trưng chuẩn của cảm biến
4.0

3.5

mAb AFP/SAM p-ATP/AuNPs-SPCE

a)
3.5

2.5

2.0

b)

mAb AFP/SAM p-ATP/AuNPs-SPCE
LOD = 1,41 (ng/mL)

2.5

Rct (k)

3.0

-Z" (k)

3.0

Nång ®é AFP (ng/mL)
0 ng/mL,
1 ng/mL
10 ng/mL,
20 ng/mL
30 ng/mL,
40 ng/mL
50 ng/mL,
60 ng/mL
70 ng/mL,
80 ng/mL
90 ng/mL,
100 ng/mL

2.0
1.5

R2 = 0,987

1.0

1.5

RCT (k) = 0,19 + 0,035*AFP (ng/mL)

0.5

1.0
0.5

0.0

0.0

-0.5

n samples = 3
2

3

4

5

6

7

8

Z' (k)

0

20

40

60
AFP (ng/mL)

80

100

Hình 5.20. Đáp ứng phổ tổng trở điện hóa của cảm biến mAb AFP/SAM(p-ATP)/SPCE với
nồng độ kháng nguyên AFP thay đổi từ 0 đến 100 ng/mL.

Đáp ứng tính hiệu tốt hơn so với PPy-PPa/SPCE, tuy nhiên vẫn thấp hơn
so với cấu trúc vật liệu lai hai chiều PPy-PPa/erGO-SPCE.
5.3.4 Cảm biến miễn dịch điện hóa mAb AFP/poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE
5.3.4.1 Poly(p-ATP) kết hợp hạt nano vàng trên điện cực AuNPs-SPCE

5.3.4.2 Phổ Raman của màng poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE
b)

Hình 5.21b. SEM bề mặt màng polyme
(p-ATP)

Hình 5.23. Phổ Raman của màng poly(pATP) trên điện cực SPCE
20


Phức chất nano vàng và monome p-ATP cho mạng polyme phát triển theo
cấu trúc 3D. Trên đặc trưng quang phổ Raman xuất hiện hai píc tương ứng với
vạch phổ G band (tại số sóng 1350 cm-1) và vạch D band (tại số sóng 1580 cm1
) của vật liệu các bon trên điện SPCE. Các píc tại số sóng 1081 cm-1, 1143
cm-1, 1181 cm-1, 1403 cm-1 lần lượt tương ứng với dao động các liên kết đặc
trưng của poly(p-ATP) [98, 178, 316].
5.3.4.3 Đặc trưng điện hóa sau các bước công nghệ
5.3.4.4 Đường trưng chuẩn của cảm biến
60

90

a)

80

40

30

30 ng/mL,
50 ng/mL,
70 ng/mL,

40 ng/mL
60 ng/mL
80 ng/mL

90 ng/mL,

100 ng/mL

b)

mAb AFP/poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE

LOD = 0,13 (ng/mL)

70
60
RCT (k)

50

-Z" (k)

mAb AFP/poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE
Nång ®é AFP (ng/mL)
0 ng/mL,
1 ng/mL

10 ng/mL,
20 ng/mL

50
40
30

20

R2 = 0,985

20
10

RCT (k) = 3,27 + 0,73*AFP (ng/mL)

10

n samples = 3

0
0
0

20

40

60

0

80

Z' (k)

20

40
60
AFP (ng/mL)

80

100

Hình 5.25. Đáp ứng phổ tổng trở điện hóa của cảm biến mAb AFP/poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE
với nồng độ kháng nguyên AFP thay đổi từ 0 đến 100 ng/mL

Cảm biến mAb AFP/poly(p-ATP)/SPCE có LOD=0,13 ng/mL và độ nhạy
730 /ng.mL-1. Độ nhạy của cảm biến lớn hơn 21 lần so với cảm biến sử dụng
màng SAM (p-ATP) và lớn hơn 13 lần so với cảm biến sử dụng vật liệu lai
cấu trúc nano hai chiều giữa polyme PPy-PPA/erGO-SPCE.
5.4 Kết luận
Quy trình khử điện hóa graphene oxít tạo erGO trên SPCE không sử dụng
hóa chất độc hại và thời gian được rút ngắn rất nhiều so với phương pháp hóa
học đã được xây dựng thành công. Lớp erGO trên SPCE giúp cải thiện độ dẫn
cũng như làm tăng diện tích bề mặt riêng của điện cực, qua đó cải thiện đặc
tính nhạy của cảm biến. Cấu trúc lai poly(p-ATP) và hạt nano vàng đóng vai
trò liên kết chéo trong mạng polyme giúp tăng tốc độ truyền điện tử đến điện

cực cũng như tăng độ nhạy của cảm biến.
CHƯƠNG 6. CẢM BIẾN ĐIỆN HÓA GLUCOSE
6.1 Glucose và đường huyết
6.2 Cảm biến điện hóa enzyme GOx
6.3 Polyme ôxy hóa khử Osmium và cảm biến GOx
Polyme Ossmium (Os(dmbpy)2PVI) là một dạng phức chất của Tris đóng
vai trò như chất trung gian giúp vận chuyển điện tử từ vùng hoạt động FAD của
enzyme GOx đến bề mặt điện cực cảm biến theo chuỗi phản ứng.
21


Glucose

Gluconolactone

Polymer oxy hóa khử Osmium

Glu cos e + GOx( FAD) → Gluconolactone + GOx ( FADH 2 ) (6.11)

GOx( FADH 2 ) + 2Os

3+

2Os

2+

→ GOx( FAD) + 2Os + 2 H
2+

→ 2Os 3+ + 2e−

+

(6.12)

OsIII

OsII

OsII

OsIII

(6.13)
[Os(4,4′-dimethyl-2,2′bipyridine)2(polyvinylimidazole)10Cl]+/2+

e-

Hình 6.3. Nguyên lý hoạt động của cảm biến điện hóa Glucose/(GOx/Osmium)n/AuNPs-SPCE

6.4 Thực nghiệm
6.5 Kết quả và thảo luận
6.5.1 Khảo sát hình thái bề mặt cấu trúc đa lớp (GOx/Osmium)
AuNPs-SPCE

Osmium/AuNPs-SPCE

a)

b)

(GOx-Osmium)/AuNPs-SPCE

(GOx-Osmium)4/AuNPs-SPCE

c)

d)

Hình 6.5. Ảnh hiển vi điện tử quét SEM
(a) bề mặt điện cực AuNPs-SPCE, (b) Osmium/AuNPs-SPCE
(c) (GOx/Osmium)/AuNPs-SPCE, (d) (GOx/Osmium)4/AuNPs-SPCE

6.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của số lớp (GOx/Osmium)
Số lớp (GOx/Osmium) tăng sẽ làm tăng số lượng enzyme trên bề mặt điện
cực cảm biến do đó làm tăng tín hiệu của cảm biến. Khi số lớp lớn hơn 4, màng
đa lớp cản trở quá trình truyền điện tích đến điện cực, tín hiệu dòng của cảm
biến có xu hướng giảm.

22


500

Sè líp (GOx/Osmium)
1
2
3
4

5
6

150

100

MËt ®é dßng (A/cm2)

MËt ®é dßng (A/cm2)

200

50

400

Sè líp (GOx/Osmium)
1
2
3
4
5
6

300

200

100

0

§iÖn ¸p -0,02 V (vs. Ag/AgCl)
0

-50
-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0

0.6

20

40

60

80

100

Nång ®é glucose (mM)

§iÖn ¸p vs. Ag/AgCl (V)

Hình 6.6. (a) Đáp ứng dòng-thế của cảm biến với số lớp (GOx/Osmium) từ 1 đến 6 trong
môi trường dung dịch glucose nồng độ 10 mM pha trong đệm PBS pH 7,4; (b) Đường đặc
trưng đáp ứng mật độ dòng theo nồng độ glucose của cảm biến với số lớp (GOx/Osmium)
khác nhau tại điện áp -0,02V (vs. Ag/AgCl).

6.5.3 Đáp ứng dòng-thế của cảm biến (GOx/Osmium)4/AuNPs-SPCE
C¶m biÕn (GOx-Os)4/AuNPs/SPCE

160

Glucose (mM)
0

120

1
2

80

4
6

40

8
10

C¶m biÕn (GOx-Os)4/AuNPs/SPCE

500

Glucose (mM)

MËt ®é dßng (A/cm2)

MËt ®é dßng (A/cm2)

200

400

20
30

300

40
50
60

200

70
80

90
100

100

0
0

-40
-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

§iÖn ¸p vs. Ag/AgCl (V)

§iÖn ¸p vs. Ag/AgCl (V)

Hình 6.7. Đặc trưng dòng - thế của cảm biến (GOx/Osmium)4/AuNPs-SPCE khảo sát
trong dung dịch glucose nồng độ 0 - 100 mM với tốc độ quét là 5 mV/s.

Trên đường đặc trưng dòng thế xuất hiện rõ rệt píc ôxy hóa tại điện áp -0,02
V vs. Ag/AgCl. Trong dải nồng độ từ 0 đến 10 mM, mối quan hệ giữa đáp ứng
dòng và nồng độ là một đường tuyến tính với phương trình J(µA/cm2) = 20,83
+ 16,47*C (mM), trong đó C là nồng độ glucose trong dung dịch, với R2 = 0,99.
500

MËt ®é dßng (A/cm2)

6.6 Kết luận
Cảm biến điện hóa phát
hiện glucose trên cơ sở cấu
trúc đa lớp giữa polyme oxy
hóa - khử Osmium và enzyme
GOx có độ nhạy đạt 18,72
µA/mM.cm2 với diện tích điện
cực là 2,64 mm2, cho phép
cảm biến hoạt động ở điện áp
thấp (-0,02 V vs. Ag/AgCl).

400

300
250

J (A/cm2) = 20,83 + 16,47* Glucose(mM)
R2=0,9964

200

200

150
100

100
50
0

0
0

20

40

0

2

4

60

6

80

8

10

12

100

Nång ®é glucose (mM)

Hình 6.8. Đặc trưng đáp ứng mật độ dòng theo nồng
độ glucose của cảm biến (GOx-Os)4/AuNPs-SPCE
làm việc tại điện áp -0,02V (vs. Ag/AgCl)
23


KẾT LUẬN
1. Làm chủ công nghệ tạo lớp hạt vàng kích thước nano phân tán đều trên bề
mặt điện cực SPCE bằng phương pháp quét điện thế tuần hoàn. Điện cực SPCE
với giá thành rẻ khi được biến tính bởi hạt nano vàng sẽ cho phép sử dụng tương
tự như điện cực mực in vàng giá thành cao. Bên cạnh đó, các hạt nano vàng còn
giúp phân tán đều đầu thu sinh học cố định trên bề mặt điện cực, giúp nâng cao
hiệu suất bắt cặp giữa đầu thu sinh học và chỉ dấu sinh học cần phân tích. Kết

quả này có ý nghĩa khoa học trong nghiên cứu cảm biến sinh học.
2. Nghiên cứu thành công ba giải pháp biến tính bề mặt điện cực SPCE bằng vật
liệu cấu trúc nano giúp nâng cao hiệu suất cố định đầu thu sinh học cũng như
cải thiện đáp ứng tín hiệu đối với cảm biến phổ tổng trở điện hóa. (i) Polyme
đồng trùng hợp polypyrrole- polypyrrole cacboxyl (PPy-PPa); (ii) Vật liệu lai
cấu trúc nano hai chiều giữa polyme đồng trùng hợp PPy-PPa và ôxít graphene
dạng khử điện hóa (erGO); (iii) Vật liệu lai giữa polyme poly(paraaminothiophenol) và hạt nano vàng.
3. Thành công trong việc xây dựng và đưa ra quy trình công nghệ tối ưu giúp cố
định đầu thu sinh học bằng liên kết cộng hóa trị giữa các nhóm chức amin hoặc
cacboxyl trên đầu thu sinh học với nhóm chức biến tính trên bề mặt điện cực.
4. Đã phát triển thành công 06 loại cảm biến phổ tổng trở điện hóa Faradaic trên
cơ sở điện cực in lưới màng dày có độ nhạy và độ đặc hiệu cao đối với các chỉ
dấu khối u: α-hCG, PSA, AFP.
➢ Cảm biến mAb hCG /SAM (MHDA) /SPAuE: dải tuyến tính phát hiện chỉ
dấu α-hCG từ 4 ÷ 100 ng/mL với LOD = 9,35 ng/mL.
➢ Cảm biến PSA-aptamer /SAM (MHDA) /AuNPs-SPCE: dải tuyến tính phát
hiện chỉ dấu PSA từ 0 ÷ 10 ng/mL với LOD = 1,95 ng/mL.
➢ Cảm biến mAb AFP /PPa-PPy /SPCE: dải tuyến tính phát hiện chỉ dấu AFP
từ 5 ÷ 80 ng/mL với LOD =2,46 ng/mL và độ nhạy 40 /ng.mL-1.
➢ Cảm biến mAb AFP /PPa-PPy /erGO-SPCE: dải tuyến tính phát hiện chỉ dấu
AFP từ 0,1 ÷ 100 ng/mL với LOD = 0,34 ng/mL và độ nhạy 57 /ng.mL-1.
➢ Cảm biến mAb AFP /SAM (p-ATP) /AuNPs-SPCE: dải tuyến tính phát hiện
phát hiện chỉ dấu AFP từ 1 ÷ 80 ng/mL với LOD=1,41 ng/mL và độ nhạy 35
/ng.mL-1.
➢ Cảm biến mAb AFP /poly(p-ATP) /AuNPs-SPCE: dải tuyến tính phát hiện
phát hiện chỉ dấu AFP từ 1 ÷ 100 ng/mL có LOD=0,13 ng/mL và độ nhạy
730 /ng.mL-1.
5. Bước đầu chế tạo thành công cảm biến điện hóa enzyme glucose thế hệ thứ 2
trên cơ sở vật liệu polyme ôxy hóa-khử Osmium. Cảm biến hoạt động tại điều
kiện điện áp thấp (-0,02 V vs. Ag/AgCl) cho phép loại bỏ được các tín hiệu

không đặc hiệu do axít ascobic, axít uric có trong mẫu máu bệnh phẩm. Cảm
biến hoạt động tốt trong dải nồng độ glucose từ 0 đến 10 mM (R2 = 0,99).
24