Nghiên cứu và chế tạo cảm biến sinh học điện hoá độ nhạy cao sử dụng điện cực in các bon ứng dụng trong chẩn đoán bệnh sớm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

ĐỖ THỊ NGỌC TRÂM

NGHIÊN CỨU VÀ CHẾ TẠO CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HÓA
ĐỘ NHẠY CAO SỬ DỤNG ĐIỆN CỰC IN CÁC BON ỨNG DỤNG
TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH SỚM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ VẬT LÝ KỸ THUẬT

Hà Nội - 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

ĐỖ THỊ NGỌC TRÂM

NGHIÊN CỨU VÀ CHẾ TẠO CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HÓA
ĐỘ NHẠY CAO SỬ DỤNG ĐIỆN CỰC IN CÁC BON ỨNG DỤNG
TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH SỚM

Ngành: Vật lý kỹ thuật
Mã số: 9520401

LUẬN ÁN TIẾN SĨ VẬT LÝ KỸ THUẬT

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS. Trương Thị Ngọc Liên
2. GS.TS. Patrick Wagner

Hà Nội - 2018


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày lòng biết ơn sâu sắc nhất đến tập thể cán bộ hướng dẫn PGS.TS.
Trương Thị Ngọc Liên trường Đại học Bách khoa Hà Nội và GS.TS. Patrick Wagner trường
Đại học KU Leuven, Vương quốc Bỉ đã nhiệt tình chỉ bảo, định hướng và giúp đỡ về mặt
khoa học để tôi có thể hoàn thành luận án tiến sĩ.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thành viên trong phòng thí nghiệm Cảm biến sinh học
thuộc Bộ môn Vật liệu Điện tử, phòng thí nghiệm của GS. Yoshiakia Ukita thuộc Đại học
Yamanashi Nhật Bản, phòng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về Vật liệu và Linh kiện Điện
tử, Phòng thí nghiệm Siêu cấu trúc và Công nghệ nano y sinh thuộc Viện Vệ sinh dịch tễ,
Khoa Vật lý trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ và
tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi thực hiện các thí nghiệm trong thời gian nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ tài chính của đề tài NAFOSTED mã số
103.99.2012.12, đề tài VLIR-UOS mã số ZEIN2013RIP022 và đề tài AUN/SEED-Net CRC
2016-2018.
Tôi xin cảm ơn tới ban lãnh đạo Viện Vật lý kỹ thuật và trường Đại học Bách khoa Hà
Nội đã tạo điều kiện thuận lợi và hỗ trợ trong thời gian học tập. Tôi cũng xin cảm ơn tập thể
các thầy cô, anh chị và bạn bè đồng nghiệp thuộc bộ môn Vật liệu điện tử, Viện Hóa học và
Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hỗ trợ và
đóng góp những ý kiến quí báu về mặt chuyên môn trong quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tác giả xin dành những tình cảm chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình đã
luôn sát cánh, chia sẻ những khó khăn, thông cảm và động viên trong suốt quá trình học tập,
nghiên cứu.

Tác giả

Đỗ Thị Ngọc Trâm

i


LỜI CAM ĐOAN
Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tác giả thực hiện dưới sự hướng
dẫn của PGS.TS. Trương Thị Ngọc Liên và GS.TS. Patrick Wagner. Các số liệu và kết quả
trong luận án là trung thực và chưa được tác giả khác công bố trong bất kỳ công trình nào.
Tất cả các công trình đã công bố chung với thầy hướng dẫn khoa học và đồng nghiệp đều
được sự đồng ý của các tác giả trước khi đưa vào luận án.

Hà Nội, ngày…… tháng……năm 2018
TM tập thể hướng dẫn

Tác giả luận án

PGS.TS. Trương Thị Ngọc Liên

Đỗ Thị Ngọc Trâm

ii


MỤC LỤC
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .................................................................. viii
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................................... x
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ ........................................................................... xi
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HÓA ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN BỆNH
SỚM ...................................................................................................................................... 6

1.1 Cảm biến sinh học ........................................................................................................... 6
1.1.1 Đầu thu sinh học ....................................................................................................... 7
1.1.2 Bộ phận chuyển đổi tín hiệu ................................................................................... 13
1.1.3 Phương pháp cố định đầu thu sinh học ................................................................... 15
1.1.4 Các phương pháp cố định kháng thể....................................................................... 17
1.1.4.1 Hấp phụ vật lý .............................................................................................. 18
1.1.4.2 Liên kết cộng hóa trị .................................................................................... 18
1.1.4.3 Ái lực tương tác sinh học ............................................................................. 20
1.2 Cảm biến sinh học điện hóa........................................................................................... 21
1.2.1 Điện cực điện hóa ................................................................................................... 21
1.2.2 Phân loại cảm biến sinh học điện hóa ..................................................................... 24
1.2.2.1 Cảm biến đo dòng ........................................................................................ 24
1.2.2.2 Cảm biến đo điện thế.................................................................................... 26
1.2.2.3 Cảm biến đo độ dẫn ..................................................................................... 28
1.2.2.4 Cảm biến đo phổ tổng trở ............................................................................ 29
1.3 Ung thư và một số chất chỉ dấu khối u .......................................................................... 32
1.3.1 Chỉ dấu α-hCG và ung thư tế bào mầm tinh ........................................................... 34
1.3.2 Chỉ dấu PSA và ung thư tiền liệt tuyến .................................................................. 35
1.3.3 Chỉ dấu AFP và ung thư gan nguyên phát .............................................................. 36
1.4 Nghiên cứu về cảm biến sinh học điện hóa ứng dụng phát hiện chỉ dấu khối u ........... 36
1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước ........................................................................... 36
1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước ........................................................................... 47
1.4.3 Định hướng nghiên cứu của luận án ....................................................................... 47
iii


CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 49
2.1 Phương pháp điện hóa ................................................................................................... 49
2.1.1 Phương pháp phổ tổng trở điện hóa (EIS) .............................................................. 49
2.1.1.1 Mô hình mạch điện tương đương Randles ................................................... 50

2.1.1.2 Biểu diễn phổ tổng trở trong mặt phẳng phức ............................................. 51
2.1.2 Phương pháp quét thế tuần hoàn (CV) ................................................................... 53
2.2 Phương pháp khảo sát tính chất và hình thái học vật liệu ............................................. 54
2.2.1 Ảnh hiển vi điện tử quét phát xạ trường (FE-SEM) ............................................... 54
2.2.2 Phổ tán xạ năng lượng tia X (EDS) ........................................................................ 54
2.2.3 Phổ tán xạ Raman ................................................................................................... 54
2.3 Công nghệ vi lưu ly tâm ................................................................................................ 55
2.3.1 Giới thiệu ................................................................................................................ 55
2.3.2 Thiết kế và quy trình chế tạo chíp vi lưu ly tâm ..................................................... 55
2.3.3 Vận chuyển dung dịch trong chíp vi lưu ly tâm ..................................................... 57
2.4 Quy trình thực nghiệm chế tạo cảm biến ....................................................................... 58
2.4.1 Tổng hợp hạt nano vàng trên điện cực làm việc SPCE .......................................... 58
2.4.2 Màng đơn lớp tự lắp ghép (SAM) alkanethiol ........................................................ 58
2.4.3 Tổng hợp vật liệu polyme bằng phương pháp trùng hợp điện hóa ......................... 59
2.4.3.1 Polyme đồng trùng hợp PPy-PPa ................................................................ 59
2.4.3.2 Vật liệu lai cấu trúc nano hai chiều giữa polyme đồng trùng hợp PPy-PPa
và erGO ................................................................................................................... 60
2.4.3.3 Vật liệu lai poly(p-ATP) và hạt nano vàng .................................................. 61
2.4.4 Cố định đầu thu sinh học bằng liên kết cộng hóa trị............................................... 61
2.4.4.1 Liên kết cộng hóa trị thông qua nhóm amin của đầu thu sinh học .............. 62
2.4.4.2 Liên kết cộng hóa trị thông qua nhóm cacboxyl của đầu thu sinh học ........ 63
2.5 Khảo sát hoạt động của cảm biến phổ tổng trở điện hóa ............................................... 63
2.6 Quy hoạch số liệu thực nghiệm ..................................................................................... 65
2.6.1 Độ nhạy của cảm biến............................................................................................. 65
2.6.2 Khoảng tuyến tính của cảm biến ............................................................................ 66
2.6.3 Độ lặp lại của cảm biến .......................................................................................... 66
2.6.4 Giới hạn phát hiện của cảm biến ............................................................................ 66
iv

2.6.5 Độ chọn lọc của cảm biến ....................................................................................... 67
CHƯƠNG 3. CẢM BIẾN MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN CHỈ DẤU α-hCG ỨNG DỤNG
CHẨN ĐOÁN U TẾ BÀO MẦM TINH ............................................................................ 68
3.1 Mở đầu ........................................................................................................................... 68
3.2 Thực nghiệm .................................................................................................................. 69
3.2.1 Hóa chất .................................................................................................................. 69
3.2.2 Điện cực và linh kiện .............................................................................................. 70
3.2.3 Quy trình cố định mAb hCG trên điện cực vàng .................................................... 71
3.2.4 Khảo sát hoạt động của cảm biến mAb hCG/SAM(MHDA)/QCM ....................... 72
3.2.4.1 Vi cân tinh thể thạch anh ............................................................................. 72
3.2.4.2 Khảo sát hoạt động của cảm biến ................................................................ 73
3.2.5 Khảo sát hoạt động của cảm biến mAb hCG/SAM(MHDA)/SPAuE .................... 73
3.3. Kết quả và thảo luận ..................................................................................................... 74
3.3.1 Cảm biến miễn dịch nhạy khối lượng mAb hCG/SAM(MHDA)/QCM ................ 74
3.3.1.1 Hiệu suất cố định kháng thể ......................................................................... 74
3.3.1.2 Đặc trưng chuẩn của cảm biến .................................................................... 75
3.3.2 Cảm biến miễn dịch phổ tổng trở mAb hCG/SAM(MHDA)/SPAuE .................... 77
3.3.2.1 Đặc tính điện hóa sau mỗi bước công nghệ ................................................. 77
3.3.2.2 Đặc trưng chuẩn của cảm biến .................................................................... 79
3.4 Kết luận ......................................................................................................................... 81
CHƯƠNG 4. CẢM BIẾN APTAMER PHÁT HIỆN CHỈ DẤU PSA ỨNG DỤNG CHẨN
ĐOÁN UNG THƯ TIỀN LIỆT TUYẾN ............................................................................ 82
4.1 Mở đầu ........................................................................................................................... 82
4.2 Thực nghiệm .................................................................................................................. 83
4.2.1 Hóa chất .................................................................................................................. 83
4.2.2 Điện cực và linh kiện .............................................................................................. 84
4.2.3 Tổng hợp hạt nano vàng trên điện cực SPCE ......................................................... 84
4.2.4 Cố định aptamer ...................................................................................................... 86
4.3 Kết quả và thảo luận ...................................................................................................... 87
4.3.1 Cảm biến aptamer phổ tổng trở điện hóa ................................................................ 87

4.3.2 Cảm biến PSA-aptamer/SAM (MHDA)/SPAuE .................................................... 88
v


4.3.2.1 Đặc tính điện hóa sau mỗi bước công nghệ ................................................. 88
4.3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ aptamer lên tín hiệu cảm biến .............................. 89
4.3.3 Cảm biến PSA-aptamer/SAM (MHDA)/AuNPs-SPCE ......................................... 90
4.3.3.1 Phân tán aptamer ......................................................................................... 90
4.3.3.2 Đặc tính điện hóa sau mỗi bước công nghệ ................................................. 93
4.3.3.3 Đặc trưng chuẩn của cảm biến .................................................................... 95
4.3.3.4 Độ chọn lọc của cảm biến ............................................................................ 97
4.4 Kết luận ......................................................................................................................... 97
CHƯƠNG 5. CẢM BIẾN MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN CHỈ DẤU AFP ỨNG DỤNG CHẨN
ĐOÁN UNG THƯ GAN ..................................................................................................... 98
5.1 Mở đầu ........................................................................................................................... 98
5.2 Thực nghiệm .................................................................................................................. 99
5.2.1 Hóa chất và điện cực ............................................................................................... 99
5.2.2 Cố định mAb AFP lên điện cực PPy-PPa/SPCE và PPy-PPa/erGO-SPCE ........... 99
5.2.3 Cố định mAb AFP lên điện cực SPCE biến tính bởi SAM (p-ATP) .................... 100
5.2.4 Cố định mAb AFP lên điện cực SPCE biến tính bởi vật liệu lai poly(p-ATP) và hạt
nano vàng ....................................................................................................................... 100
5.3. Kết quả và thảo luận ................................................................................................... 101
5.3.1 Cảm biến miễn dịch điện hóa mAb AFP/PPy-PPa/SPCE .................................... 101
5.3.1.1 Polyme đồng trùng hợp PPy-PPa trên điện cực SPCE ............................. 101
5.3.1.2 Tối ưu hóa tỷ số hợp phần của monome Pa với Py .................................... 103
5.3.1.3 Đặc trưng chuẩn của cảm biến .................................................................. 104
5.3.2 Cảm biến miễn dịch điện hóa mAb AFP/PPa-PPy/erGO-SPCE .......................... 107
5.3.2.1 Khử điện hóa GO trên SPCE ..................................................................... 107
5.3.2.2 Hình thái học bề mặt điện cực ................................................................... 111
5.3.2.3 Đặc trưng chuẩn của cảm biến .................................................................. 112

5.3.3 Cảm biến miễn dịch điện hóa mAb AFP/SAM (p-ATP)/AuNPs-SPCE .............. 115
5.3.3.1 Ảnh hưởng của mật độ hạt nano vàng ....................................................... 115
5.3.3.2 Ảnh hưởng của thời gian tạo màng SAM ................................................... 118
5.3.3.3 Đặc trưng điện hóa sau mỗi bước công nghệ ............................................ 119
5.3.3.4 Đặc trưng chuẩn của cảm biến .................................................................. 120
vi


5.3.4 Cảm biến miễn dịch điện hóa mAb AFP/poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE ................. 121
5.3.4.1 Poly(p-ATP) kết hợp hạt nano vàng trên điện cực AuNPs-SPCE.............. 122
5.3.4.2 Phổ tán xạ Raman của màng poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE ......................... 124
5.3.4.3 Đặc trưng điện hóa sau các bước công nghệ ............................................. 125
5.3.4.4 Đặc trưng chuẩn của cảm biến .................................................................. 126
5.4 Kết luận ....................................................................................................................... 128
CHƯƠNG 6. CẢM BIẾN ĐIỆN HÓA GLUCOSE .......................................................... 129
6.1 Glucose và đường huyết .............................................................................................. 129
6.2 Cảm biến điện hóa enzyme GOx ................................................................................. 130
6.3 Polyme ôxy hóa khử Osmium và cảm biến GOx ........................................................ 133
6.4 Thực nghiệm ................................................................................................................ 133
6.4.1 Hóa chất và thiết bị ............................................................................................... 133
6.4.2 Quy trình chế tạo cảm biến (GOx/Osmium)n/AuNPs-SPCE ................................ 134
6.5 Kết quả và thảo luận .................................................................................................... 135
6.5.1 Khảo sát hình thái bề mặt cấu trúc đa lớp (GOx/Osmium) .................................. 135
6.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của số lớp (GOx/Osmium)................................................... 136
6.5.3 Đáp ứng dòng-thế của cảm biến (GOx/Osmium)4/AuNPs-SPCE ........................ 137
6.6 Kết luận ....................................................................................................................... 138
KẾT LUẬN ....................................................................................................................... 139
KIẾN NGHỊ....................................................................................................................... 140
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 141
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN ................................... 160

PHỤ LỤC ......................................................................................................................... - 1 -

vii


DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Tiếng Anh

Tiếng Việt

Ab

Antibody

Kháng thể

AFP

Alpha-fetoprotein

Ag

Antigen

Kháng nguyên

AuNPs

Gold nano-particles

Hạt nano vàng

BSA

Bovine serum albumin

Albumin huyết thanh bò

CA

Chronoamperometry

Kỹ thuật đo dòng – thời gian

CV

Cyclic voltammetry

Kỹ thuật quét thế tuần hoàn

DNA

Deoxyribo nucleic acid

Axít deoxyribonucleic

DPV

Different pulse voltammetry

Kỹ thuật đo dòng-thế xung vi phân

EDC

1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)
carbodimide

EDS

Energy dispertive spectroscopy

Phổ tán xạ năng lượng

EIS

Electrochemical impedance
spectroscopy

Phổ tổng trở điện hóa

ELISA

Enzyme linked immuno sorbent
assay

Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme

FAD

Flavin adenine dinucleotide

GDH

Glucose dehydrogenase

Enzyme glucose dehydrogenase

GMC

Graphitized mesoporous carbon

Các bon lỗ xốp trung bình

GOx

Glucose oxidase

Enzyme glucose oxidase

hCG

Human chorionic gonadotropin

IGCA

Immunogold chromatographic assay

IUPAC

Internatonal union of pure and applied Hiệp hội Quốc tế về hóa học và hóa
chemistry
học ứng dụng

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

mAb

monoclonal antibody

Kháng thể đơn dòng

MHDA

16-Mercaptohexadecanoic acid

Axít 16-mercaptohexadecanoic

viii

Kỹ thuật miễn dịch sắc kí sử dụng
hạt vàng


MIP

Molercularly imprinted polymer

Polyme in phân tử

MUA

11-Mercaptoundecanoic acid

Axít 11-mercaptoundecanoic

NHS

N-Hydroxysuccinimide

ODN

Oligo deoxyribo nucleotide

Pa

Pyrrole-2-cacboxylic acid

p-ATP

Para-aminothiophenol

PBS

Phosphate buffered saline

Đệm chứa muối phosphat

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi polymerase

PEGDGE

Poly(ethylene glycol)diglycidyl

PL

Photoluminescence

PPa

Polypyrrole cacboxylic acid

PPy

Polypyrrole

PSA

Prostate specific antigen

Py

Pyrrole

QCM

Quartz crystal microbalance

Vi cân tinh thể thạch anh

RNA

Ribo nucleic acid

Axít ribonucleic

SAM

Self assembled monolayer

Màng đơn lớp phân tử tự lắp ghép

SELEX

Systematic evolution of ligands by
exponential enrichment

SEM

Scanning electron microscopy

Hiển vi điện tử quét

SPAuE

Screen-printed gold electrode

Điện cực in lưới mực in vàng

SPCE

Screen-printed carbon electrode

Điện cực in lưới mực in các bon

SPR

Surface plasmon resonance

Kỹ thuật cộng hưởng plasmon bề mặt

STDEV

Standard deviation

Sai số chuẩn

SWSV

Square wave stripping voltammetry

Kỹ thuật đo xung vuông quét nhanh

Kỹ thuật phổ huỳnh quang

Ung thư tiền liệt tuyến

UTTLT

ix


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại enzyme [256]. ................................................................................... 10
Bảng 1.2. Nhóm chức thuộc amino axít tham gia cố định bằng liên kết cộng hóa trị
[178]................................................................................................................. 19
Bảng 1.3. Điện cực điện hóa trong cảm biến sinh học điện hóa. ...................................... 22
Bảng 1.4. Nồng độ ngưỡng chỉ dấu khối u trong huyết thanh của người [260]................ 32
Bảng 1.5. Các chỉ dấu khối u thông dụng trong chẩn đoán và điều trị một số bệnh ung
thư [32]. ........................................................................................................... 32
Bảng 1.6. Nồng độ hCG và β-hCG đối với người bình thường [201]. ............................. 34
Bảng 1.7. Mối liên hệ giữa nồng độ PSA toàn phần trong máu và tỷ lệ mắc bệnh
UTTLT [26]. .................................................................................................... 35
Bảng 2.1. Cố định đầu thu sinh học bằng liên kết cộng hóa trị. ....................................... 61
Bảng 2.2. Mô hình mạch tương đương khớp phổ tổng trở thực nghiệm. ......................... 65
Bảng 3.1. Số phân tử cố định trên bề mặt linh kiện QCM sau mỗi bước chế tạo. ............ 75
Bảng 3.2. Giá trị thành phần của mạch tương đương Randles sau mỗi bước thực hiện
quy trình chế tạo cảm biến mAb α-hCG/SAM(MHDA)/SPAuE. ................... 78
Bảng 3.3. Một số kết quả nghiên cứu cảm biến sinh học phát hiện chỉ dấu khối u hCG . 80
Giá trị thành phần của mạch tương đương Randles sau mỗi bước thực hiện
quy trình chế tạo cảm biến PSA-aptamer/SAM(MHDA)/SPAuE................... 89

Bảng 4.2. Giá trị thành phần của mạch tương đương Randles sau mỗi bước thực hiện
quy trình chế tạo cảm biến PSA-aptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE. ....... 94
Bảng 4.3. Một số kết quả nghiên cứu cảm biến đện hóa sử dụng đầu thu aptamer phát
hiện chỉ dấu khối u PSA .................................................................................. 96
Bảng 5.1. Số sóng đặc trưng trong phổ Raman của polyme PPy-PPa theo thực nghiệm
và so sánh với giá trị lý thuyết [179, 243]. .................................................... 102
Bảng 5.2. Giá trị thành phần của mạch tương đương Randles sau mỗi bước thực hiện
quy trình chế tạo cảm biến mAb AFP/SAM (p-ATP)/AuNPs-SPCE ........... 120
Bảng 5.3. Số sóng đặc trưng trong phổ Raman của poly(p-ATP) theo thực nghiệm. .... 124
Bảng 5.4. Giá trị thành phần của mạch tương đương Randles sau mỗi bước thực hiện
quy trình chế tạo cảm biến mAb AFP/poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE .............. 125
Bảng 5.5. Một số kết quả nghiên cứu cảm biến sinh học điện hóa phát hiện chỉ dấu
khối u AFP ..................................................................................................... 127
Bảng 6.1. Giá trị chuẩn của nồng độ đường huyết đối với người bình thường [5]. ........ 130
x


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Cấu trúc của cảm biến sinh học. ......................................................................... 6
Hình 1.2. Phân loại cảm biến sinh học theo cơ chế chuyển đổi tín hiệu và loại đầu thu
sinh học [134]. ................................................................................................... 7
Hình 1.3. Cấu trúc của phân tử globulin miễn dịch [66]. ................................................... 8
Hình 1.4. Lực tương tác giữa kháng nguyên – kháng thể [66]. .......................................... 9
Hình 1.5. Mô hình cấu trúc của RNA, DNA [287]. .......................................................... 11
Hình 1.6. Cấu trúc và tương tác giữa aptamer và chỉ dấu sinh học [288]......................... 12
Hình 1.7. Đầu thu sinh học nhân tạo tổng hợp bằng phương pháp in polyme phân tử
[255]................................................................................................................. 13
Hình 1.8. Biểu đồ tỷ lệ bài báo cảm biến sinh học theo cơ chế chuyển đổi tín hiệu. Số
liệu thống kê bài báo tìm kiếm theo từ khóa “electrochemical biosensor”,
“optical biosensor”, “piezoelectric biosensor”, “calorimetric biosensor” từ

năm 2000 ÷ 2018 theo website Science Direct [289]. ..................................... 14
Hình 1.9. Phương pháp cố định đầu thu sinh học: a) Hấp phụ vật lý, b) Liên kết cộng
hóa trị, c) Bẫy, d) Liên kết chéo, e) Hóa rắn [139]. ......................................... 15
Hình 1.10. Biểu đồ số lượng bài báo cảm biến sinh học phân loại theo phương pháp cố
định đầu thu sinh học. Số liệu thống kê bài báo tìm kiếm theo từ khóa
“adsorption”, “covalent”, “encapsulation”, “entrapment”, “cross-linking”
trong khoảng từ năm 2000 ÷ 2018 theo website Science Direct [289]. .......... 16
Hình 1.11. Định hướng cố định của kháng thể trên bề mặt điện cực [254]. ..................... 17
Hình 1.12. Kháng thể cố định trên bề mặt điện cực bằng liên kết cộng hóa trị; (a) giữa
nhóm amin (hoặc nhóm cacboxyl) trên kháng thể với nhóm cacboxyl (hoặc
nhóm amin) biến tính trên bề mặt điện cực; (b) giữa nhóm thiol sinh ra do
phản ứng khử liên kết cầu disulfide trên kháng thể bởi TCEP (hoặc 2-MEA)
và bề mặt điện cực vàng; (c) giữa nhóm aldehyde sinh ra do phản ứng ôxy
hóa gốc đường nằm ở đoạn Fc của kháng thể và nhóm hydrazide biến tính
trên bề mặt điện cực [254]. .............................................................................. 18
Hình 1.13. Kháng thể được cố định trên bề mặt điện cực thông qua ái lực tương tác:
(a) giữa protein G và kháng thể; (b) lai hóa giữa ssDNA cố định và ssDNA
gắn trên kháng thể [151]. ................................................................................. 20
Hình 1.14. Kháng thể cố định trên bề mặt điện cực thông qua ái lực tương tác giữa
Avidin/ Streptavidin với Biotin [181].............................................................. 21
Hình 1.15. Điện cực các bon thủy tinh (Glassy carbon electrode - GCE) và hệ điện hóa
ba điện cực sử dụng điện cực làm việc GCE. .................................................. 22
Hình 1.16. Điện cực điện hóa in lưới màng dầy (a) hệ 2 điện cực, (b) hệ 3 điện cực. ..... 23
xi


Hình 1.17. Điện cực in lưới mực in các bon của hãng Dropsen (Tây Ban Nha) (a) 1
điện cực làm việc; (b) 2 điện cực làm việc; (c) 4 điện cực làm việc; (d) 8
điện cực làm việc. ............................................................................................ 23
Hình 1.18. Điện cực in lưới màng dày của hãng BioDevice Technology (Nhật Bản) (a)

điện cực làm việc mực in các bon; (b) điện cực làm việc mực in vàng. ......... 23
Hình 1.19. Cơ chế hoạt động của cảm biến miễn dịch đo dòng cấu trúc “sandwich” dựa
trên tác nhân đánh dấu enzyme HRP, ALP và GOx [105]. ............................. 24
Hình 1.20. Cơ chế hoạt động của cảm biến miễn dịch đo dòng cấu trúc “sandwich” dựa
trên tác nhân đánh dấu: (a) muối của kim loại vàng, (b) kim loại bạc Ag, (c)
chấm lượng tử PbS và CdS [105]. ................................................................... 26
Hình 1.21. Điện cực chọn lọc ion ISE dùng trong cảm biến đo điện thế: (a) điện cực
màng chất lỏng; (b) điện cực màng chất rắn [252]. ......................................... 27
Hình 1.22. Cảm biến điện hóa đo điện thế dựa trên cấu trúc: (a) Transitor hiệu ứng
trường nhạy ion (ISFET), (b) Cảm biến điện thế chiếu sáng vùng (LAPS)
[74]................................................................................................................... 27
Hình 1.23. Cảm biến miễn dịch điện hóa đo độ dẫn dựa trên cấu trúc FET, điện tích
dương của kháng nguyên – kháng thể trên kênh dẫn làm giảm độ dẫn đối
với kênh dẫn là bán dẫn loại n và làm tăng độ dẫn đối với kênh dẫn là bán
dẫn loại p [34]. ................................................................................................. 28
Hình 1.24. Cảm biến DNA độ dẫn dựa trên cấu trúc dây nano polyme đồng trùng hợp
(poly EDOT-co-EDOT-COOH) giữa hai điện cực làm bằng kim loại vàng,
phản ứng lai hóa giữa chuỗi DNA dò và DNA đích làm thay đổi độ dẫn của
dây nano polyme [98]. ..................................................................................... 28
Hình 1.25. Mô hình mạch điện tương đương Randles mô phỏng tính chất điện của hệ
điện hóa trong dung dịch điện ly (a) không có cặp chất ôxy hóa - khử, (b)
có cặp chất ôxy hóa - khử [105]. ..................................................................... 29
Hình 1.26. Mô hình cấu trúc cảm biến miễn dịch kiểu tụ và mạch điện tương đương
[105]................................................................................................................. 30
Hình 1.27. Cảm biến miễn dịch phổ tổng trở điện hóa sử dụng chất dò [Fe(CN)6]3-/4-;
(a) đầu thu kháng thể cố định trên điện cực vàng, (b) đầu thu kháng thể liên
kết đặc hiệu với kháng nguyên cản trở quá trình truyền điện tích đến điện
cực, (c) mạch tương đương Randles và (d) phổ tổng trở biểu diễn trên mặt
phẳng Nyquist của cảm biến trước và sau phản ứng miễn dịch [105]............. 31
Hình 1.28. Biểu đồ thống kê số lượng bài báo cảm biến sinh học phát hiện chỉ dấu khối

u trong thời gian từ năm 2005÷2018 (dữ liệu từ nguồn Scopus truy cập ngày
01-08-2018): .................................................................................................... 37

xii


(a) Theo phương pháp chuyển đổi tín hiệu với từ khóa tìm kiếm “cancer biomarkers”
kết hợp với “electrochemical biosensor”, “optical biosensor”, “piezoelectric
biosensor”, “calorimetric biosensor”. .............................................................. 37
(b) Theo phương pháp đo tín hiệu với từ khóa tìm kiếm “electrochemical biosensor”,
“cancer biomarkers” kết hợp với “impedimetric”, “amperometric”,
“voltammetric”, “potentiometric”, “conductometric”. .................................... 37
Hình 1.29. Biểu đồ thống kê số lượng bài báo cảm biến sinh học điện hóa phát hiện
chỉ dấu khối u theo loại đầu thu sinh học với từ khóa tìm kiếm “cancer
biomarkers”,
“electrochemical
biosensor”,
“electrochemical
immunosensor”, “electrochemical aptasensor” (dữ liệu từ nguồn Scopus
truy cập ngày 01-08-2018). ............................................................................. 37
Hình 1.30. Cải thiện độ nhạy của cảm biến miễn dịch điện hóa phát hiện chỉ dấu khối
u bằng vật liệu nano; (a) biến tính bề mặt điện cực bằng vật liệu nano, (b)
tác nhân đánh dấu bằng vật liệu nano [247]. ................................................... 38
Hình 1.31. Quy trình công nghệ chế tạo cảm biến miễn dịch cấu trúc “sandwich” phát
hiện chỉ dấu khối u AFP trên cơ sở điện cực vàng được biến tính bởi hạt
nano vàng [263]. .............................................................................................. 39
Hình 1.32. Quy trình chế tạo cảm biến miễn dịch phát hiện chỉ dấu khối u EGFR trên
cơ sở điện cực vàng được biến tính bởi hạt nano vàng: tạo màng SAM
cysteamine trên hạt vàng, liên kết hóa học bởi chất trung gian pphenyldiisothiocyanate (PDITC), protein G liên kết qua nhóm NH2, protein
G liên kết đặc hiệu với vùng Fc của kháng thể EGFG [54]. ........................... 40

Hình 1.33. Quy trình chế tạo cảm biến miễn dịch phát hiện chỉ dấu khối u PSA trên cơ
sở điện cực GCE được biến tính bởi hạt nano vàng trên nền vật liệu poly(2,6Pyridinediamine) [269]. ................................................................................... 40
Hình 1.34. Quy trình chế tạo cảm biến miễn dịch cấu trúc sandwich phát hiện chỉ dấu
khối u IL-6 trên cơ sở điện cực ITO được biến tính bởi tổ hợp vật liệu nano
AuNPs – Graphene - Silica sol-gel [248]. ....................................................... 41
Hình 1.35. Quy trình công nghệ chế tạo cảm biến miễn dịch phát hiện chỉ dấu khối u
AFP trên cơ sở điện cực GCE được biến tính bởi tổ hợp vật liệu nano
AuNPs-PDA-Thi-GO [154]............................................................................. 42
Hình 1.36. Quy trình công nghệ chế tạo cảm biến miễn dịch sandwich phát hiện chỉ
dấu khối u CEA với kháng thể phát hiện được đánh dấu bởi tổ hợp vật liệu
nano AgNPs - AuNPs - Graphene [80]. .......................................................... 42
Hình 1.37. Quy trình công nghệ chế tạo cảm biến aptamer phổ tổng trở phát hiện chỉ
dấu Mucine trên cơ sở điện cực mực in các bon biến tính bởi MWCNT
[142]................................................................................................................. 44

xiii


Hình 1.38. Quy trình thực nghiệm cố định aptamer trên bề mặt SWCNT và sơ đồ thiết
lập hệ khảo sát SWCNT FET trong dung dịch [235]. ..................................... 44
Hình 1.39. (a) Tác nhân đánh dấu enzyme HRP và kháng thể Con A được cố định trên
SWCNT, (b) bề mặt điện cực GCE được biến tính bởi MWCNT/Au-Smannose và cơ chế đáp ứng tín hiệu dòng của cảm biến, (c) đường đặc trưng
chuẩn của cảm biến sử dụng tác nhân đánh dấu MWCNT kết hợp với
enzyme HRP và cảm biến sử dụng kháng thể đánh dấu bởi enzyme HRP
[280] ................................................................................................................ 45
Hình 1.40. (a) Quy trình tạo cấu trúc ôxít graphene dạng khử (rGO) kết hợp với AuNPs
và thionine (Thi) hoặc Prussian blue (PB), (b) cảm biến miễn dịch đa kênh
phát hiện đồng thời chỉ dấu CEA và AFP trên cơ sở điện cực được biến tính
bề mặt bởi rGO/Au/Thi và rGO/Au/PB [94]. .................................................. 46
Hình 2.1. (a) Quá trình điện hóa xảy ra tại phân biên giữa điện cực làm việc được áp

điện thế dương và dung dịch điện ly chứa cặp chất dò; (b) Mô hình mạch
điện tương đương Randles: Cdl điện dung lớp kép, Rct điện trở truyền điện
tích, Rs điện trở dung dịch, ZW trở kháng Warburg, IHP mặt phẳng
Helmholtz phía trong; OHP mặt phẳng Helmholtz bên ngoài; CE điện cực
đối và WE là điện cực làm việc [150]. ............................................................ 50
Hình 2.2. Biểu diễn phổ tổng trở ở vùng tần số cao trên mặt phẳng phức ....................... 52
Hình 2.3. Biểu diễn phổ tổng trở ở vùng tần số thấp trên mặt phẳng phức ...................... 52
Hình 2.4. Biểu diễn phổ tổng trở trên mặt phẳng Nyquist. ............................................... 53
Hình 2.5. Quan hệ giữa điện thế và dòng điện trong quét thế tuần hoàn .......................... 53
Hình 2.6. Cấu trúc thiết kế của chíp vi lưu a) chíp vi lưu một đầu vào, b) mặt cắt chíp
vi lưu. ............................................................................................................... 56
Hình 2.7. Ảnh hiển vi quang học của vi kênh với độ rộng khoảng 200 µm. .................... 57
Hình 2.8. Thiết kế giá đỡ gắn với trục quay của máy ly tâm: a) Thứ tự lắp ghép chíp vi
lưu và điện cực; b) Vị trí bốn hệ chíp vi lưu-điện cực được cố định đồng
thời trên giá đỡ. ................................................................................................ 57
Hình 2.9. Hình ảnh dòng dung dịch vận chuyển từ đầu vào qua kênh dẫn vào buồng
phản ứng và dung dịch thoát ra ngoài theo thời gian quay ly tâm với tốc độ
1200 vòng/phút. ............................................................................................... 58
Hình 2.10. Quy trình tổng hợp vật liệu lai cấu trúc nano hai chiều giữa polyme đồng
trùng hợp PPy- PPa và erGO trên điện cực SPCE bằng phương pháp điện
hóa quét thế tuần hoàn. .................................................................................... 60
Hình 2.11. Cơ chế phản ứng tạo liên kết giữa nhóm amin (NH2) của đầu thu sinh học
và nhóm cacboxyl (-COOH) trên bề mặt điện cực sử dụng hợp chất NHS và
EDC [219]........................................................................................................ 62
xiv


Hình 2.12. Cơ chế phản ứng tạo liên kết giữa nhóm cacboxyl (-COOH) của kháng thể
và nhóm amin (NH2) trên bề mặt điện cực sử dụng EDC [219]...................... 63
Hình 2.13. Quy trình xử lý mẫu máu toàn phần tách lấy phần huyết thanh: (a) mẫu máu

toàn phần, (b) mẫu máu sau khi để đông tự nhiên, (c) mẫu sau khi tách phần
máu đông, (d) mẫu huyết thanh ....................................................................... 64
Hình 3.1. (a) Linh kiện vi cân tinh thể thạch anh QCM 5 MHz được ghép nối với bộ
tạo dao động QCM25 của hãng Stanford Research Systems, (b) Hệ thiết bị
khảo sát hoạt động của QCM ở chế độ đo động. ............................................. 70
Hình 3.2. (a) Ảnh hiển vi điện tử quét bề mặt điện cực mực in vàng, (b) Điện cực mực
in vàng SPAuE của hãng BioDevice Technology, (c) Hệ thiết bị điện hóa
AutoLab PGSTAT 12. ..................................................................................... 70
Hình 3.3. Quy trình công nghệ cố định mAb α-hCG lên điện cực vàng thông qua màng
SAM(MHDA). ................................................................................................. 71
Hình 3.4. Sơ đồ hệ đo khảo sát hoạt động của cảm biến sinh học nhạy khối lượng sử
dụng linh kiện QCM. ....................................................................................... 73
Hình 3.5. Nguyên lý hoạt động của cảm biến miễn dịch phổ tổng trở điện hóa............... 73
Hình 3.6. Độ dịch tần sau mỗi bước chế tạo cảm biến nhạy khối lượng sử dụng linh
kiện QCM. ....................................................................................................... 75
Hình 3.7. Suy giảm tần số theo thời gian tại các nồng độ kháng nguyên từ 100 pg/mL
÷ 27 ng/mL của cảm biến mAb α-hCG/SAM (MHDA)/QCM. ...................... 76
Hình 3.8. Đường đặc trưng chuẩn của cảm biến nhạy khối lượng sử dụng giá trị độ
dịch tần số như một hàm của nồng độ kháng nguyên α-hCG. Giá trị tại mỗi
điểm đo và sai số được lấy trung bình của 3 cảm biến độc lập chế tạo cùng
quy trình và cùng điều kiện đo. ....................................................................... 77
Hình 3.9. Phổ EIS sau mỗi bước công nghệ chế tạo cảm biến mAb αhCG/SAM(MHDA)/SPAuE. ........................................................................... 78
Hình 3.10. Phổ tổng trở đáp ứng của cảm biến với kháng nguyên α-hCG có nồng độ
0÷100 ng/mL. Phép đo thực hiện bởi dung dịch điện hóa gồm 0,1M KCl và
5 mM [Fe(CN)6]3-/4-. Dải tần số quét 100 kHz ÷ 50 mHz, EDC = 0,16 V vs.
Ag/AgCl, Eac= 10 mV. .................................................................................... 79
Hình 3.11. Đường đặc trưng chuẩn của cảm biến mAb α-hCG/SAM(MHDA)/SPAuE.
......................................................................................................................... 79
Hình 4.1. (a) Ảnh hiển vi điện tử quét bề mặt điện cực mực in các bon, (b) Điện cực
mực in cácbon SPCE của hãng BioDevice Technology, (c) Hệ thiết bị điện

hóa Vertex Invium. .......................................................................................... 84

xv


Hình 4.2. Đặc trưng dòng thế của điện cực SPCE quét thế vòng 20 chu kì trong dung
dịch HAuCl4 1 mM pha trong PBS 100 mM; tốc độ quét 50 mV/s trong dải
điện áp từ -0,6 V đến 0,5 V vs. Ag/AgCl. ....................................................... 85
Hình 4.3. Đặc trưng dòng thế của điện cực trong dung dịch H2SO4 1M, tốc độ quét 50
mV/s, dải điện áp từ -0,2 V đến 1,4 V vs. Ag/AgCl. (a) Điện cực AuNPsSPCE, (b) So sánh điện cực AuNPs-SPCE và SPAuE .................................... 86
Hình 4.4. Mô hình quá trình động học xảy ra trên bề mặt điện cực trong phép đo phổ
tổng trở Faradaic sử dụng cặp chất dò [Fe(CN)6]3-/4-: (a) điện cực SPAuE,
(b) điện cực AuNPs-SPCE. ............................................................................. 87
Hình 4.5. Phổ EIS sau mỗi bước công nghệ chế tạo cảm biến PSAaptamer/SAM(MHDA)/SPAuE ....................................................................... 88
Hình 4.6. Khảo sát sự phụ thuộc của ∆Rct như một hàm của nồng độ PSA của cảm biến
PSA-aptamer/SAM(MHDA)/SPAuE với nồng độ aptamer 5, 10, 100
µg/mL. ............................................................................................................. 90
Hình 4.7. Ảnh hiển vi điện tử quét bề mặt điện cực SPCE sau khi tổng hợp hạt nano
vàng bằng phương pháp quét thế tuần hoàn với số vòng quét khác nhau: 5,
10, 15, 20 vòng. ............................................................................................... 91
Hình 4.8. Phổ EDS của điện cực AuNPs-SPCE với cac hạt nano vàng được tổng hợp
bằng phương pháp quét điện thế tuần hoàn 20 chu kỳ. ................................... 92
Hình 4.9. Sự phụ thuộc của ∆Rct theo nồng độ kháng nguyên PSA của cảm biến trên
điện cực AuNPs-SPCE với lượng aptamer cố định (5 µg/mL, 10 µg/mL, 25
µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL) và số vòng quét tạo hạt vàng: (a) 5 vòng,
(b) 10 vòng, (c) 15 vòng, (d) 20 vòng. ............................................................ 93
Hình 4.10. Phổ EIS sau mỗi bước công nghệ chế tạo của cảm biến PSAaptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE. ........................................................... 94
Hình 4.11. Đáp ứng phổ tổng trở của cảm biến PSA-aptamer/SAM(MHDA)/AuNPsSPCE với nồng độ kháng nguyên PSA từ 0 ng/mL đến 14 ng/mL. ................ 95
Hình 4.12. Đường đặc trưng chuẩn của cảm biến PSA-aptamer/SAM(MHDA)/AuNPsSPCE................................................................................................................ 96
Hình 4.13. Độ chọn lọc của cảm biến PSA-aptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE với

các kháng nguyên hCG, protein TAU, amylin và PSA ................................... 97
Hình 5.1. Quy trình cố định kháng thể AFP bằng liên kết cộng hóa trị giữa nhóm amin
của kháng thể và nhóm cacboxyl của polyme PPy-PPa: (a) trên điện cực
SPCE; (b) trên điện cực erGO-SPCE. ........................................................... 100
Hình 5.2. Quy trình công nghệ cố định kháng thể AFP bằng liên kết cộng hóa trị giữa
nhóm cacboxyl của kháng thể và nhóm amin của SAM (p-ATP) trên điện
cực AuNPs-SPCE. ......................................................................................... 100
xvi


Hình 5.3. Quy trình công nghệ cố định kháng thể AFP bằng liên kết cộng hóa trị giữa
nhóm cacboxyl của kháng thể và nhóm amin của vật liệu lai polyme (pATP) và hạt nano vàng trên điện cực AuNPs-SPCE. .................................... 101
Hình 5.4. (a) Đặc trưng dòng-thế của quá trình đồng trùng hợp PPy-PPa quét thế tuần
hoàn 20 chu kì trong dung dịch PBS 10 mM (pH 7,4) có chứa KCl 100mM,
monome Py 120 mM và Pa 40 mM với tốc độ quét 30 mV/s trong dải điện
áp từ -0,8 V đến 0,8 V vs. Ag/AgCl; (b) Ảnh SEM màng polyme PPy-PPa
trên điện cực SPCE. ....................................................................................... 102
Hình 5.5. Phổ Raman của màng polyme PPy-PPa trên điện cực SPCE (đo tại 4 vị trí
khác nhau) với bước sóng kích thích 632,8 nm. ............................................ 103
Hình 5.6. Đáp ứng dòng-thế của điện cực PPy-PPa/SPCE với tỷ lệ mol Pa so với Py
thay đổi từ 0 đến 100% mol trong dung dịch gồm [Fe(CN)6]3-/4- 5 mM và
KCl 0,1 M với tốc độ quét 50 mV/s. ............................................................. 104
Hình 5.7. (a) Đáp ứng phổ tổng trở điện hóa của cảm biến mAb AFP/PPy-PPa/SPCE
với nồng độ kháng nguyên AFP thay đổi từ 0 đến 100 ng/mL (đường đo
thực nghiệm được biểu diễn bằng các ký hiệu, đường nét liền biểu diễn
đường cong khớp theo mạch tương đương Randles); (b) Đường đặc trưng
chuẩn của cảm biến........................................................................................ 105
Hình 5.8. (a) Đáp ứng dòng-thế của cảm biến mAb AFP/PPy-PPa/SPCE với nồng độ
kháng nguyên AFP thay đổi từ 0 đến 100 ng/mL, (b) Đường đặc trưng chuẩn
của cảm biến thể hiện sự phụ thuộc Ipc vào nồng độ kháng nguyên AFP. .. 106

Hình 5.9. Đặc trưng dòng-thế quá trình khử GO trên bề mặt điện cực SPCE thành erGO
trong dung dịch PBS 100 mM (pH 6,6) với 30 chu kỳ quét. ......................... 108
Hình 5.10. Đặc trưng điện hóa của điện cực erGO-SPCE khảo sát trong dung dịch đo
gồm 5 mM [Fe(CN)6]3-/4- và KCl 0,1 M: (a) Đáp ứng phổ EIS, (b) Đáp ứng
dòng-thế tại tốc độ quét 50 mV/s................................................................... 109
Hình 5.11. Phổ Raman của GO và erGO trên điện cực SPCE với bước sóng kích thích
632,8 nm. ....................................................................................................... 110
Hình 5.12. Ảnh SEM (a) bề mặt điện cực SPCE trần, (b) điện cực GO/SPCE, (c) điện
cực erGO/SPCE, (d) vật liệu lai cấu trúc nano hai chiều giữa PPy-PPa và
erGO trên SPCE............................................................................................. 111
Hình 5.13. (a) Đáp ứng phổ tổng trở điện hóa của cảm biến mAb AFP/PPy-PPa/erGOSPCE với nồng độ kháng nguyên AFP thay đổi từ 0 đến 100 ng/mL (đường
đo thực nghiệm được biểu diễn bằng các ký hiệu, đường nét liền biểu diễn
đường cong khớp theo mạch tương đương Randles), (b) Đường đặc trưng
chuẩn của cảm biến........................................................................................ 113
Hình 5.14. (a) Đáp ứng dòng-thế của cảm biến mAb AFP/PPy-PPa/erGO-SPCE với
nồng độ kháng nguyên AFP thay đổi từ 0 đến 100 ng/mL, (b) Đường đặc
xvii


trưng chuẩn của cảm biến thể hiện sự phụ thuộc Ipc vào nồng độ kháng
nguyên AFP. .................................................................................................. 114
Hình 5.15. Ảnh SEM điện cực SPCE biến tính bởi AuNPs tổng hợp bằng phương pháp
quét thế tuần hoàn với số vòng quét khác nhau 10, 20, 40 và 60. ................. 115
Hình 5.16. Phổ tổng trở của điện cực SPCE biến tính bởi AuNPs với số vòng quét tạo
AuNPs (10, 20, 40, 60) và sau khi cố định kháng thể mAb AFP. ................. 116
Hình 5.17. Phổ tổng trở của điện cực SPCE biến tính bởi AuNPs với số vòng quét tạo
AuNPs (10, 20, 40, 60) trước và sau phản ứng giữa mAb AFP và kháng
nguyên AFP 100 ng/mL. ............................................................................... 117
Hình 5.18. Đáp ứng tín hiệu của các cảm biến mAb AFP/SAM (p-ATP)/AuNPs-SPCE
có thời gian tổng hợp màng SAM (6, 12, 18, 24 giờ) với kháng nguyên AFP

nồng độ (10, 50, 100 ng/mL). ........................................................................ 118
Hình 5.19. Phổ tổng trở sau mỗi bước thực hiện quy trình chế tạo của cảm biến mAb
AFP/SAM (p-ATP)/AuNPs-SPCE (đường đo thực nghiệm được biểu diễn
bằng các ký hiệu và đường nét liền biểu diễn đường cong khớp theo mạch
tương đương Randles). .................................................................................. 119
Hình 5.20. (a) Đáp ứng phổ tổng trở của cảm biến tại các nồng độ kháng nguyên AFP
từ 0 ng/mL đến 100 ng/mL (đường đo thực nghiệm được biểu diễn bằng các
ký hiệu, đường nét liền biểu diễn đường cong khớp theo mạch tương đương
Randles), (b) Đường đặc trưng chuẩn của cảm biến. .................................... 121
Hình 5.21. (a) Đặc trưng dòng-thế của quá trình tổng hợp vật liệu lai poly(p-ATP) và
hạt nano vàng trên điện cực AuNPs-SPCE, (b) Ảnh SEM của màng poly(pATP) trên điện cực SPCE. ............................................................................. 122
Hình 5.22. Cơ chế quá trình trùng hợp điện hóa poly(p-ATP) [284]. ............................ 123
Hình 5.23. Phổ Raman của màng poly(p-ATP) trên điện cực AuNPs-SPCE................. 124
Hình 5.24. Phổ tổng trở sau mỗi bước thực hiện quy trình chế tạo của cảm biến
mAb AFP/poly( p-ATP)/AuNPs-SPCE......................................................... 125
Hình 5.25. (a) Đáp ứng phổ tổng trở của cảm biến với nồng độ kháng nguyên AFP từ
0 ng/mL đến 100 ng/mL (đường đo thực nghiệm được biểu diễn bằng các
ký hiệu, đường nét liền biểu diễn đường cong khớp theo mạch tương đương
Randles), (b) Đường đặc trưng chuẩn của cảm biến. .................................... 126
Hình 6.1. Cấu trúc phân tử α-D-glucose và β-D-glucose [290]...................................... 129
Hình 6.2. Nguyên lý hoạt động của cảm biến điện hóa Glucose sử dụng enzyme GOx
(a) thế hệ thứ 1; (b) thế hệ thứ 2; (c) thế hệ thứ 3. ......................................... 130
Hình 6.3. Nguyên lý hoạt động của cảm biến điện hóa Glucose/(GOx/Osmium)n
/AuNPs-SPCE................................................................................................ 133
xviii


Hình 6.4. Quy trình công nghệ chế tạo cảm biến điện hóa glucose sử dụng cấu trúc đa
lớp (GOx-Osmium) trên điện cực AuNPs-SPCE. ......................................... 134
Hình 6.5. Ảnh hiển vi điện tử quét SEM: (a) bề mặt điện cực AuNPs-SPCE, (b)

Osmium/AuNPs-SPCE,
(c)
(GOx/Osmium)/AuNPs-SPCE,
(d)
(GOx/Osmium)4/AuNPs-SPCE. .................................................................... 135
Hình 6.6. (a) Đáp ứng dòng-thế của cảm biến với số lớp (GOx/Osmium) từ 1 đến 6
trong môi trường dung dịch glucose nồng độ 10 mM pha trong đệm PBS
pH 7,4 và (b) Đường đặc trưng đáp ứng mật độ dòng theo nồng độ glucose
của cảm biến với số lớp (GOx/Osmium) khác nhau tại điện áp -0,02V (vs.
Ag/AgCl). ...................................................................................................... 136
Hình 6.7. Đặc trưng dòng - thế của cảm biến (GOx/Osmium)4/AuNPs-SPCE khảo sát
trong dung dịch glucose nồng độ 0 - 100 mM với tốc độ quét là 5 mV/s. .... 137
Hình 6.8. Đặc trưng đáp ứng mật độ dòng theo nồng độ glucose của cảm biến (GOxOs)4/AuNPs-SPCE làm việc tại điện áp -0,02V (vs. Ag/AgCl). ................... 138

xix


MỞ ĐẦU
Ngày nay, cùng với sự bùng nổ dân số thế giới và quá trình đô thị hoá với tốc độ chóng
mặt có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của con người. Theo thống kê của cơ
quan nghiên cứu ung thư quốc tế IARC (International Agency for Research on Cancer), trên
toàn cầu hiện có khoảng 23 triệu người đang sống chung với căn bệnh này trong đó mỗi năm
có hơn 14 triệu người mắc mới và 8,2 triệu người tử vong. Ung thư là bệnh có tỷ lệ bệnh
nhân tử vong cao đứng thứ hai trên thế giới với hơn 200 loại ung thư khác nhau [60]. Tại
Việt Nam, số ca mắc mới ung thư từ 68.000 ca năm 2000 lên đến 126.000 năm 2010, và sẽ
vượt ngưỡng 200.000 ca vào năm 2020. Theo số liệu này, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO)
xếp Việt Nam ở vị trí 78 trên 172 quốc gia, vùng lãnh thổ được khảo sát với tỉ lệ tử vong
110/100.000 người, nằm trong 50 nước thuộc nhóm 2 của bản đồ ung thư thế giới [1]. Theo
các chuyên gia, số ca mắc ung thư tăng nhanh trong những năm gần đây do ba nguyên nhân
chính: thực phẩm không an toàn, môi trường ô nhiễm và tuổi thọ tăng. Tuy nhiên, phần lớn

bệnh nhân mắc bệnh ung thư tại Việt Nam đến khám và điều trị ở giai đoạn khối u đã chuyển
thành ác tính và di căn nên tỷ lệ chữa khỏi bệnh là thấp, chi phí điều trị tốn kém. Nguyên
nhân chính là do người dân chưa có thói quen khám bệnh định kì và các phương pháp phát
hiện sớm bệnh ung thư vẫn chưa phổ biến. Do vậy, có thể nói nhu cầu về xác định các chỉ
dấu sinh học ứng dụng chẩn đoán sớm bệnh ung thư là một nhu cầu cấp thiết hiện nay.
Hiện nay, việc khám và chữa bệnh ung thư tại các bệnh viện chủ yếu dựa vào các phương
pháp truyền thống như siêu âm, chụp cộng hưởng từ và sinh thiết. Kết quả của các phương
pháp này phụ thuộc vào kích thước và đặc tính của khối u nên thường phát hiện khi bệnh ở
giai đoạn đã phát triển [17]. Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, các chỉ dấu khối
u đã được nghiên cứu và đưa vào ứng dụng trong việc chẩn đoán sớm và theo dõi bệnh ung
thư [109, 241]. Chỉ dấu khối u thường được sản sinh từ tế bào ung thư, biểu mô và có nồng
độ cao hơn mức ở người bình thường. Các chất này có thể xác định được bằng các kỹ thuật
như ELISA [247], PCR [108], miễn dịch phóng xạ (RIA) [131], phổ huỳnh quang [59], phổ
khối [285] và sắc kí [217]. Các kỹ thuật truyền thống này cho phép phát hiện chỉ dấu khối u
với độ chính xác và độ chọn lọc cao; tuy nhiên yêu cầu thời gian phân tích lâu, chi phí hóa
chất cao, phân tích đơn lẻ từng chất chỉ dấu. Cảm biến sinh học điện hóa với ưu điểm độ
nhạy và độ chọn lọc cao, thời gian phân tích ngắn, cho phép phát hiện chất cần phân tích ở
nồng độ thấp, đơn giản và rẻ tiền, khả năng tích hợp trong các thiết bị đo cầm tay ứng dụng
phép phân tích tại chỗ đang là phương pháp được ưu tiên lựa chọn để phát hiện chỉ dấu khối
u. Đề tài nghiên cứu với tiêu đề “Nghiên cứu và chế tạo cảm biến sinh học điện hóa độ
nhạy cao sử dụng điện cực in các bon ứng dụng trong chẩn đoán bệnh sớm” đã được lựa
chọn cho luận án tiến sĩ.
➢ Mục đích nghiên cứu:
(1) Nghiên cứu cảm biến sinh học phổ tổng trở điện hóa sử dụng đầu thu sinh học (kháng
thể, aptamer, enzyme) trên cơ sở điện cực in lưới thương mại với chi phí thấp hướng
đến ứng dụng thực tế trong các thiết bị cầm tay.

1

(2) Cải tiến và phát triển các kỹ thuật biến tính bề mặt điện mực in các bon nhằm nâng cao
hiệu suất cố định đầu thu sinh học cũng như tăng cường đáp ứng tín hiệu đối với cảm
biến phổ tổng trở điện hóa.
(3) Chế tạo cảm biến sinh hóa điện hóa có độ nhạy và độ chọn lọc cao phát hiện chỉ dấu
khối u (bao gồm kháng nguyên α-hCG, PSA, AFP) ứng dụng trong chẩn đoán sớm một
số bệnh ung thư; cảm biến điện hóa enzyme xác định glucose trong máu.
➢ Đối tượng nghiên cứu:
- Nghiên cứu chế tạo cảm biến điện hóa phát hiện chỉ dấu khối u (α-hCG, PSA, AFP)
dùng trong chẩn đoán và điều trị đối với bệnh ung thư (tế bào mầm tinh, ung thư tiền liệt
tuyến, ung thư gan); phát hiện chỉ dấu sinh học glucose của bệnh đái tháo đường.
- Nghiên cứu các giải pháp biến tính bề mặt điện cực in lưới màng dày mực in các bon
giúp nâng cao hiệu suất cố định đầu thu sinh học cũng như cải thiện đáp ứng tín hiệu đối với
cảm biến phổ tổng trở điện hóa ứng dụng trong phát hiện chỉ dấu khối u.
➢ Phương pháp nghiên cứu:
Phương pháp nghiên cứu trong nội dung luận án là phương pháp thực nghiệm.
- Phương pháp quét thế tuần hoàn (CV) được sử dụng để tổng hợp hạt nano vàng, trùng
hợp điện hóa vật liệu polyme, khử điện hóa ôxít graphene trên nền điện cực SPCE.
Ngoài ra, phương pháp này còn được sử dụng để khảo sát tính chất điện hóa của vật
liệu polyme đã tổng hợp, khảo sát hoạt động của cảm biến enzyme glucose và cảm
biến miễn dịch.
- Phương pháp phổ tổng trở (EIS) được sử dụng để khảo sát đặc tính của bề mặt cảm
biến sau mỗi bước biến tính, khảo sát hoạt động của các cảm biến đã chế tạo.
- Phương pháp chụp ảnh hiển vi điện tử quét SEM sử dụng nghiên cứu hình thái cấu
trúc bề mặt điện cực sau mỗi bước công nghệ.
- Phổ tán xạ năng lượng tia X (EDS), phổ tán xạ Raman nghiên cứu tính chất của vật
liệu tiên tiến sử dụng trong chế tạo cảm biến.
➢ Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án:
Luận án có tính liên ngành cao bao gồm hóa học, sinh học, vật lý và khoa học vật liệu.
Các định hướng nghiên cứu và kết quả thu được của luận án có ý nghĩa khoa học và khả
năng ứng dụng thực tiễn cao.

- Về lý luận khoa học: các kết quả thu được của luận án đã góp phần làm sáng tỏ cơ chế
hoạt động cảm biến sinh học phổ tổng trở điện hóa sử dụng đầu thu sinh học tự nhiên
(kháng thể) và đầu thu sinh học bán tổng hợp (aptamer).
- Về thực tiễn: các kết quả nghiên cứu của luận án hướng tới phát triển cảm biến sinh
học có cấu trúc đơn giản, độ nhạy và độ chọn lọc cao, cho phép phát hiện chỉ dấu khối
u trong giai đoạn sớm của bệnh ung thư. Cảm biến sinh học đã chế tạo có định hướng
ứng dụng trong các thiết bị cầm tay đáp ứng yêu cầu xét nghiệm tại chỗ.

2


➢ Những đóng góp mới của luận án:
- Luận án đã đóng góp các kết quả mới về công nghệ chế tạo hạt nano vàng phân tán
đều trên bề mặt điện cực in lưới mực in các bon nhằm thay thế điện cực in lưới mực
in vàng. Hơn thế nữa giải pháp công nghệ này giúp phân tán đều đầu thu sinh học trên
bề mặt điện cực, nhờ đó nâng cao hiệu suất bắt cặp giữa đầu thu và chỉ dấu sinh học
cần phân tích.
- Luận án đóng góp ba giải pháp biến tính bề mặt điện cực in lưới mực in các bon bằng
hệ vật liệu mới nhằm nâng cao hiệu suất cố định đầu thu sinh học và đáp ứng tín hiệu
đối với cảm biến phổ tổng trở điện hóa. Hệ vật liệu bao gồm: (i) Polyme dẫn đồng
trùng hợp polypyrrole-polypyrrole cacboxyl (PPy-PPa); (ii) Vật liệu lai cấu trúc nano
hai chiều giữa polyme đồng trùng hợp PPy-PPa và ôxít graphene dạng khử điện hóa
(erGO); (iii) Vật liệu lai giữa poly(para-aminothiophenol) và hạt nano vàng.
- Ứng dụng thành công đầu thu sinh học bán tổng hợp aptamer trong chế tạo cảm biến
phổ tổng trở điện hóa xác định chỉ dấu ung thư tiền liệt tuyến. Kết quả nghiên cứu này
là tiền đề cho định hướng nghiên cứu về cảm biến phổ tổng trở điện hóa phát hiện chỉ
dấu sinh học với chi phí thấp, không yêu cầu điều kiện bảo quản nghiêm ngặt.
- Ứng dụng thành công cấu trúc đa lớp giữa vật liệu polyme ôxy hóa-khử Osmium và
enzyme trong cảm biến cảm biến điện hóa enzyme thế hệ thứ 2. Kết quả nghiên cứu
này là tiền đề cho định hướng nghiên cứu về cảm biến điện hóa đo dòng phát hiện chỉ

dấu sinh học trên cơ sở tác nhân sinh học enzyme.
- Xây dựng quy trình chế tạo quy mô phòng thí nghiệm 06 cảm biến điện hóa sử dụng
điện cực in lưới mực in các bon cho phép xác định nồng độ chỉ dấu khối u trong ngưỡng
phát hiện sớm các bệnh ung thư (ung thư u tế bào mầm tinh, ung thư tiền liệt tuyến và
ung thư gan). Các cảm biến đã chế tạo có độ nhạy và độ chọn lọc cao, yêu cầu lượng
mẫu phân tích nhỏ (cỡ 3µL), thời gian phân tích nhanh (khoảng 30 phút), thao tác đơn
giản, có khả năng tích hợp với thiết bị cầm tay.
➢ Bố cục của luận án:
CHƯƠNG 1.

CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HÓA ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN BỆNH SỚM

Chương 1 trình bày ngắn gọn tổng quan lý thuyết về cảm biến sinh học nói chung và cảm
biến sinh học điện hóa nói riêng. Khái niệm chung về chỉ dấu khối u và vai trò trong chẩn
đoán sớm đối với bệnh ung thư. Ba loại chỉ dấu khối u (α-hCG, PSA, AFP) là đối tượng
nghiên cứu của luận án cũng được trình bầy chi tiết. Tình hình nghiên cứu cảm biến sinh
học điện hóa ứng dụng phát hiện chỉ dấu khối u trong cộng đồng khoa học trong nước và
quốc tế.
CHƯƠNG 2.

THỰC NGHIỆM VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 trình bày hai phương pháp điện hóa chính sử dụng trong nội dung của luận án
là phương pháp phổ tổng trở điện hóa (EIS) và phương pháp quét thế tuần hoàn (CV). Các
phương pháp khảo sát tính chất và hình thái học vật liệu biến tính bề mặt điện cực như
chụp ảnh hiển vi điện tử quét (SEM), phổ tán xạ năng lượng tia X (EDS), phổ tán xạ
Raman. Quy trình thực nghiệm chế tạo cảm biến cũng như quy hoạch số liệu thực nghiệm.

3

Kỹ thuật vi lưu ly tâm tích hợp với điện cực in lưới ứng dụng trong cảm biến sinh học điện
hóa cũng sẽ được trình bày chi tiết.
CHƯƠNG 3.

CẢM BIẾN MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN CHỈ DẤU α-hCG ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN U
TẾ BÀO MẦM TINH

Chương 3 trình bày các kết quả nghiên cứu chế tạo cảm biến nhạy khối lượng sử dụng
linh kiện vi cân tinh thể thạch anh (QCM) và cảm biến phổ tổng trở điện hóa sử dụng điện
cực in lưới mực in vàng (SPAuE). Kháng thể đơn dòng α-hCG được cố định lên điện cực
vàng cảm biến thông qua liên kết cộng hóa trị giữa nhóm amin của kháng thể với nhóm
cacboxyl của màng đơn lớp tự lắp ghép (MHDA). Hiệu suất cố định đầu thu kháng thể
được đánh giá thông qua khảo sát sự thay đổi tần số dao động của QCM sau mỗi bước
công nghệ chế tạo cảm biến. Bên cạnh đó, tác giả cũng tiến hành nghiên cứu cảm biến
điện hóa sử dụng điện cực SPAuE với ưu điểm như giá thành rẻ, yêu cầu một lượng nhỏ
dung dịch mẫu, dễ tích hợp với các thiết bị cầm tay. Kết quả nghiên cứu cho thấy cảm
biến điện hóa có dải làm việc tuyến tính trong vùng nồng độ kháng nguyên α-hCG từ 4
đến 100 ng/mL với giới hạn phát hiện là 9,35 ng/mL, đáp ứng yêu cầu phát hiện chỉ dấu
α-hCG trong chẩn đoán sớm ung thư tế bào mầm tinh.
CHƯƠNG 4.

CẢM BIẾN APTAMER PHÁT HIỆN CHỈ DẤU PSA ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN UNG
THƯ TIỀN LIỆT TUYẾN

Chương 4 trình bày các kết quả nghiên cứu chế tạo cảm biến phổ tổng trở điện hóa trên
cơ sở điện cực in lưới mực in vàng (SPAuE) và điện cực in lưới mực in các bon (SPCE)
được biến tính bởi lớp hạt nano vàng. Trong nghiên cứu này, đầu thu sinh học aptamer
được thay thế cho đầu thu kháng thể trong cảm biến miễn dịch. Điểm nổi bật của kết quả
là đầu thu aptamer được cố định phân tán trên điện cực mực in các bon biến tính bởi lớp

hạt nano vàng có kích thước từ 10 ÷ 20 nm. Các kết quả thực nghiệm thu được đã giải thích
một cách khoa học và trọn vẹn cơ chế tín hiệu của cảm biến phổ tổng trở điện hóa sử dụng
đầu thu aptamer. Cảm biến đã chế tạo có tính chọn lọc cao và độ tuyến tính cao trong dải
nồng độ kháng nguyên PSA từ 2 ÷ 10 ng/mL, hoàn toàn đáp ứng được yêu cầu phát hiện
chỉ dấu PSA trong chẩn đoán ung thư tiền liệt tuyến.
CHƯƠNG 5.

CẢM BIẾN MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN CHỈ DẤU AFP ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN UNG
THƯ GAN

Chương 5 trình bày các kết quả nghiên cứu chế tạo cảm biến miễn dịch xác định chỉ dấu
AFP trên cơ sở điện cực in lưới mực in các bon được biến tính bởi vật liệu nano. Đầu thu
kháng thể AFP được cố định trên bề mặt điện cực thông qua liên kết cộng hóa trị giữa
nhóm chức -COOH (hoặc -NH2) trên kháng thể với nhóm chức -NH2 (hoặc -COOH) biến
tính trên bề mặt điện cực. Bề mặt điện cực SPCE được biến tính bởi bốn loại vật liệu khác
nhau: polyme dẫn đồng trùng hợp PPy-PPa, vật liệu lai cấu trúc nano hai chiều giữa
polyme PPy-PPa và ôxít graphene dạng khử điện hóa (erGO), màng đơn lớp tự lắp ghép
SAM(p-ATP), vật liệu lai giữa poly(p-ATP) và hạt nano vàng. Các giải pháp biến tính bề
mặt điện cực giúp nâng cao hiệu suất cố định đầu thu kháng thể cũng như cải thiện đáp
ứng tín hiệu đối với cảm biến phổ tổng trở điện hóa. Kết quả nghiên cứu cho thấy bốn loại
4