Nghiên cứu xác định hàm lượng một số nitrosamin trong các sản phẩm thịt bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ hai lần
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.04 MB, 67 trang )
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
Bùi Cao Tiến
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ
NITROSAMIN TRONG CÁC SẢN PHẨM THỊT BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ HAI LẦN
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội – 2018
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
Bùi Cao Tiến
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ
NITROSAMIN TRONG CÁC SẢN PHẨM THỊT BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ HAI LẦN
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60440118
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
Hướng dẫn 1: PGS. TS. Lê Thị Hồng Hảo
Hướng dẫn 2: TS. Trần Cao Sơn
Hà Nội – 2018
LỜI CẢM ƠN
Đề tài được thực hiện và hoàn thành tại Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh
thực phẩm Quốc Gia, 65 Phạm Thận Duật, Mai Dịch, Cầu Giấy, Hà Nội.
Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Lê Thị Hồng
Hảo, TS. Trần Cao Sơn đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong quá
trình thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa phân tích, trường
Đại học Khoa học tự nhiên đã nhiệt tình dạy dỗ, cung cấp cho em những kiến thức
cần thiết, quan trọng và bổ ích.
Đồng thời, xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực
phẩm Quốc gia, các đồng nghiệp trong Viện đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi hoàn
thành đề tài.
Cuối cùng, con xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, gia đình và
người thân đã luôn ở bên quan tâm, động viên con trong suốt thời gian qua.
Trong quá trình thực hiện đề tài, do trình độ lý luận cũng như kinh nghiệm
thực tiễn còn hạn chế nên đề tài không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong
nhận được sự góp ý của quý thầy cô và các bạn đồng nghiệp.
Xin chân thành cảm ơn !
Mục lục
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................................2
1.1. Giới thiệu về nitrosamin ..................................................................................2
1.1.1. Công thức cấu tạo của nitrosamin ............................................................2
1.1.2. Sự tạo thành nitrosamin ............................................................................3
1.1.3. Tính chất hóa lý của nitrosamin ...............................................................3
1.1.4. Độc tính ....................................................................................................3
1.1.5. Nguồn nitrosamin từ thực phẩm ...............................................................4
1.1.6. Quy định hiện hành về nitrosamin............................................................5
1.2. Phương pháp xác định các nitrosamin trong thực phẩm .................................5
1.2.1. Các phương pháp xử lý mẫu .....................................................................6
Error! Bookmark not defined.
. ..........................................
1.2.1.1. Chưng cất .......................................................................................... 6
1.2.1.2. Chiết lỏng - lỏng................................................................................ 6
1.2.1.3. Vi chiết pha rắn ................................................................................. 7
1.2.1.4. Chiết pha rắn ..................................................................................... 7
1.2.1.5. Kỹ thuật QuEChERS......................................................................... 8
1.2.1.6. Các kỹ thuật chiết khác ..................................................................... 9
1.2.2. Phương pháp phân tích .............................................................................9
1.2.2.1. Sắc ký lỏng khối phổ ......................................................................... 9
1.2.2.2. Sắc ký khí ........................................................................................ 10
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..13
2.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................13
2.2. Nội dung nghiên cứu......................................................................................13
2.2.1. Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời một số nitrosamin trong
các sản phẩm thịt nướng ...................................................................................13
2.2.1.1. Khảo sát các điều kiện xác định nitrosamin bằng GC-MS/MS ...... 13
2.2.1.2. Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu ................................................... 13
2.2.2. Thẩm định phương pháp xác định đồng thời một số nitrosamin trong các
sản phẩm thịt nướng .........................................................................................14
2.2.3. Sơ bộ đánh giá hàm lượng nitrosamin trong một số sản phẩm thịt nướng
trên địa bàn Hà Nội ...........................................................................................14
2.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất .............................................................................14
2.3.1. Thiết bị ....................................................................................................14
2.3.2. Dụng cụ...................................................................................................14
2.3.3. Hóa chất, chất chuẩn...............................................................................15
2.3.4. Pha dung dịch chuẩn ...............................................................................15
2.3.4.1. Dung dịch chuẩn hỗn hợp nitrosamin 10 µg/mL và 1 µg/mL ........ 15
2.3.4.2. Dung dịch nội chuẩn gốc 1000 µg/mL............................................ 15
2.3.4.3. Dung dịch nội chuẩn 10 µg/mL và 1 µg/mL................................... 16
2.3.4.4. Dung dịch chuẩn làm việc ............................................................... 16
2.4. Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................16
2.4.1. Quy trình xử lý mẫu ...............................................................................16
2.4.2. Phương pháp phân tích bằng GC-MS/MS..............................................17
2.4.3. Phương pháp thẩm định ..........................................................................17
2.4.3.1. Tính chọn lọc ................................................................................... 17
2.4.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) ................. 18
2.4.3.3. Khoảng làm việc và đường chuẩn ................................................... 18
2.4.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi ................................................................... 18
2.4.4. Phương pháp xử lý kết quả .....................................................................19
2.4.5. Phương pháp lấy mẫu .............................................................................19
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN...............................................................20
3.1. Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời một số nitrosamin trong thịt
nướng ....................................................................................................................20
3.1.1. Khảo sát điều kiện GC-MS/MS ..............................................................20
3.1.1.1. Điều kiện MS/MS ........................................................................... 20
3.1.1.2. Điều kiện GC ................................................................................... 21
3.1.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu................................................................23
3.1.2.1. Lựa chọn phương pháp xử lý mẫu .................................................. 23
3.1.2.2. Khảo sát muối chiết ......................................................................... 25
3.1.2.3. Khảo sát phương pháp chiết ............................................................ 26
3.1.2.4. Khảo sát thời gian chiết ................................................................... 27
3.1.2.5. Khảo sát bột làm sạch ..................................................................... 29
3.1.2.6. Khảo sát lượng C18 sử dụng ........................................................... 30
3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng nền .........................................................................32
3.2. Thẩm định phương pháp ................................................................................33
3.2.1. Độ đặc hiệu .............................................................................................33
3.2.1.1. Tính số điểm IP ............................................................................... 33
3.2.1.2. Tỷ lệ ion .......................................................................................... 33
3.2.1.3. Phân tích mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn ..................... 35
3.2.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) .....................35
3.2.3. Khoảng làm việc .....................................................................................36
3.2.4. Độ lặp lại và độ thu hồi ..........................................................................38
3.2.5. Độ lặp lại khác ngày ...............................................................................40
3.3. Ứng dụng phương pháp để sơ bộ xác định hàm lượng nitrosamin trong thịt
nướng lấy ở địa bàn Hà Nội ..................................................................................41
3.3.1. Kết quả xác định hàm lượng nitrosamin trong mẫu thực tế ...................41
3.3.2. So sánh các cách chế biến khác nhau ảnh hưởng đến lượng nitrosamin
tạo thành ...........................................................................................................42
KẾT LUẬN ...............................................................................................................43
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................44
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt
Giải nghĩa
ACN
Acetonitril
AOAC
Association of Official Analytical Communities (Hiệp hội các
cộng đồng phân tích chính thức)
CE
Collision energy (Năng lượng va chạm)
CI
Chemical ionization (Ion hóa hóa học)
DCM
Dichloromethan
d-SPE
Dispersive solid phase extraction (Chiết pha rắn phân tán)
EI
Electron impact (va chạm electron)
ESI
Electrospray inonization (ion hóa bằng nguồn phun điện tử)
GC-MS/MS
LC-MS/MS
Gas chromatography tandem mass spectrometry (Sắc ký khí khối
phổ hai lần)
Liquid chromatography tandem mass spectrometry (Sắc ký lỏng
khối phổ hai lần)
LOD
Limit of Detection (Giới hạn phát hiện)
LOQ
Limit of Qualification (Giới hạn định lượng)
ME
Matrix effect (Ảnh hưởng nền)
NDBA
N-Nitroso di-n-butyl amine
NDEA
N-Nitroso diethyl amine
NDMA
N-Nitroso dimethyl amine
NDPA
N-Nitroso dipropyl amine
NDPhA
N-nitroso diphenyl amine
NPYR
N-Nitroso pyrollidine
NPD
Nitrogen-phosphorus detector (detector nitơ –photpho)
IP
Identification point (Điểm nhận dạng)
PSA
Primary secondary amine (amin bậc 1 2)
QuEChERS
Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe (Nhanh, dễ, rẻ,
hiệu quả, ổn định, an toàn)
SPE
Solid phase extraction (Chiết pha rắn)
SPME
Solid phase microextraction (Vi chiết pha rắn)
TEA
Thermal energy analyser (Bộ phân tích năng lượng nhiệt)
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Một số nitrosamin thường gặp ....................................................................2
Bảng 1.2. Một số thực phẩm thường có chứa nitrosamin ...........................................4
Bảng 1.3. Quy định về hàm lượng các nitrosamin trong nước uống ..........................5
Bảng 1.4. So sánh một số nghiên cứu chiết nitrosamin bằng kỹ thuật QuEChERS ...8
Bảng 1.5. Tóm tắt một số nghiên cứu xác định nitrosamin bằng GC-MS/MS .........11
Bảng 2.1. Các nitrosamin được sử dụng trong nghiên cứu .......................................13
Bảng 2.2. Pha dung dịch chuẩn làm việc ..................................................................16
Bảng 3.1. Các điều kiện MS/MS phân tích nitrosamin .............................................20
Bảng 3.2. Chương trình nhiệt độ xác định nitrosamin ..............................................22
Bảng 3.3. Tỷ lệ ion và sai số cho phép .....................................................................34
Bảng 3.4. Khoảng làm việc và độ chệch ...................................................................38
Bảng 3.5. Độ lặp lại và độ thu hồi của NDMA .........................................................38
Bảng 3.6. Độ lặp lại và độ thu hồi của NDPA ..........................................................39
Bảng 3.7. Độ lặp lại và độ thu hồi của NDPhA ........................................................40
Bảng 3.8. Độ lặp lại khác ngày của các nitrosamin nghiên cứu ...............................41
Bảng 3.9. Kết quả phân tích mẫu thực tế ..................................................................41
Bảng 3.10. So sánh các cách chế biến khác nhau .....................................................42
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Công thức cấu tạo chung của nitrosamin ....................................................2
Hình 3.1. Sắc ký đồ khi phân tích nitrosamin với cột DB5-MS và cột DB1701 ......21
Hình 3.2. Sắc ký đồ tổng ion (TIC) của các nitrosamin nghiên cứu .........................22
Hình 3.3. Sắc ký đồ các nitrosamin trong dung môi ACN và ACN:DCM (1:1/v:v) 23
Hình 3.4. Tóm tắt quy trình xử lý mẫu dự kiến ........................................................24
Hình 3.5. Sắc ký đồ ảnh hưởng của muối chiết ........................................................26
Hình 3.6. Sắc ký đồ ảnh hưởng của phương pháp chiết ...........................................27
Hình 3.7. Sắc ký đồ ảnh hưởng của thời gian chiết ..................................................28
Hình 3.8. Sắc ký đồ ảnh hưởng của bột làm sạch .....................................................29
Hình 3.9. Sắc ký đồ ảnh hưởng của lượng bột làm sạch ...........................................30
Hình 3.10. Quy trình xử lý mẫu tối ưu ......................................................................31
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nền mẫu .........................................................................33
Hình 3.12. Tỷ lệ ion của các nitrosamin (mẫu thêm chuẩn và mẫu chuẩn) ..............34
Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn ...................35
Hình 3.14. Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn tại mức nồng độ LOQ = 0,5 ng/g ................36
Hình 3.15. Đường chuẩn các nitrosamin nghiên cứu ................................................37
Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN
MỞ ĐẦU
Cùng với sự phát triển của xã hội hiện đại, việc sử dụng thực phẩm chế biến
sẵn, trong đó có các sản phẩm từ thịt như thịt nướng, thịt hun khói, xúc xích, ngày
càng phổ biến. Những sản phẩm này, một mặt mang lại sự thuận tiện cũng như sự
ngon miệng, mặt khác có thể gây ra những hậu quả lâu dài. Các nghiên cứu đã chỉ
ra nhiều hóa chất độc hại có thể sinh ra từ quá trình chế biến thực phẩm bằng cách
nướng hoặc rán.
Nitrosamin là một nhóm hóa chất độc hại có thể sinh ra do quá trình chế biến
thực phẩm đặc biệt là nhóm sản phẩm thịt. Thịt gia súc, gia cầm vốn có chứa hàm
lượng acid amin cao, nếu được tẩm ướp các phụ gia có chứa nitrat, nitrit và dưới tác
động của điều kiện pH, nhiệt độ thích hợp có thể tạo thành nitrosamin. Một số hợp
chất thuộc nhóm nitrosamin được tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế (IARC) phân
loại là nhóm chất có thể gây ung thư trên người. Do đó, việc kiểm soát hàm lượng
nitrosamin trong các sản phẩm chế biến từ thịt, đặc biệt là thịt nướng có đóng góp
quan trọng, giúp phòng ngừa nguy cơ mắc ung thư, góp phần bảo vệ sức khỏe người
tiêu dùng.
Hiện nay, trên thế giới đã có một số nghiên cứu về các phương pháp xác định
nitrosamin trong thực phẩm. Tuy nhiên, ở Việt Nam lĩnh vực này mới chỉ được
quan tâm trong thời gian gần đây. Đặc biệt chưa có một phương pháp tiêu chuẩn
nào đã và đang được áp dụng. Do đó, đề tài “Nghiên cứu xác định hàm lượng một
số nitrosamin trong các sản phẩm thịt bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ hai
lần” được thực hiện không chỉ có ý nghĩa về mặt khoa học mà còn có ý nghĩa thực
tiễn lớn. Mục tiêu của đề tài như sau:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định đồng thời một số
nitrosamin trong các sản phẩm thịt.
2. Ứng dụng phương pháp để sơ bộ đánh giá hàm lượng nitrosamin trong
một số sản phẩm thịt trên địa bàn Hà Nội.
1
Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN
1. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về nitrosamin
1.1.1. Công thức cấu tạo của nitrosamin
Nitrosamin là hợp chất hóa học có cấu trúc R1-N(-R2)-N=O, trong đó một
nhóm nitroso liên kết với một amin bậc 2 hoặc muối amoni bậc 4. Công thức cấu
tạo chung của nitrosamin và công thức cấu tạo của một số nitrosamin thường gặp
được giới thiệu ở hình 1.1 và bảng 1.1 [3].
Hình 1.1. Công thức cấu tạo chung của nitrosamin
Bảng 1.1. Một số nitrosamin thường gặp
TT
Công thức cấ u ta ̣o
Nitrosamin
N N O
Khố i lươ ̣ng
phân tử
1.
N-Nitrosodimethyl amine (NDMA)
2.
N-Nitrosodiethyl amine (NDEA)
N N O
102
3.
N-Nitrosopyrollidine (NPYR)
N N O
100
4.
N-Nitrosodipropyl amine (NDPA)
5.
N-Nitrosodi-n-butyl amine (NDBA)
6.
N-nitroso diphenyl amine (NDPhA)
N N O
N N O
N N O
2
74
130
158
198
Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN
1.1.2. Sự tạo thành nitrosamin
Nitrosamin được tạo thành từ phản ứng giữa tác nhân nitroso hóa và nhóm
amin bậc 2 hoặc muối amoni bậc 4. Các amin bậc nhất khi phản ứng với tác nhân
nitroso hóa sẽ tạo thành sản phẩm không bền và bị phân hủy thành olefin hoặc alcol
[3].
Các tác nhân nitroso hóa gồm các oxit của nitơ (NOx), trong đó tác nhân chủ
yếu là N2O3. Các nitrit cũng là tác nhân tạo thành nitrosamin qua các phản ứng:
Có thể thấy rằng, sự tạo thành nitrosamin phụ thuộc vào pH, nồng độ của
nitrit và của amin. Theo các nghiên cứu, khoảng pH từ 2,5-3,5 là pH tối ưu cho sự
tạo thành nitrosamin từ nitrit. Mặc dù nhiều loại thực phẩm ít có tính acid như trên,
nitrosamin vẫn có thể tạo thành trong điều kiện acid của dạ dày khi có mặt đồng
thời nitrit và các amin. Ngoài ra, tác động của nhiệt độ cũng làm quá trình sinh
nitrosamin diễn ra nhanh hơn [5].
1.1.3. Tính chất hóa lý của nitrosamin
Các nitrosamin thường tồn tại ở dạng lỏng, màu vàng nhạt. Các nitrosamin
có thể phân thành 2 loại: dễ bay hơi và khó bay hơi, phụ thuộc vào các nhóm thế
(R1 và R2). Các nitrosamin dễ bay hơi thường được nghiên cứu nhiều hơn do nguy
cơ gây ung thư cao hơn. Nhiệt độ bay hơi của các nitrosamin nhóm này dao động
trong khoảng 120-180oC ở điều kiện thường. Các nitrosamin dễ bay hơi thường là
các chất có tính phân cực trung bình, có thể tan được trong nước và một số dung
môi phân cực như methanol, ethanol, acetonitril.
Các nitrosamin thể hiện tính chất chung của nhóm N-nitroso (-N-N=O). Đây
là nhóm chất có hoạt tính cao và là tác nhân có thể gây ung thư hoặc phá hủy tế bào
trên người [14].
1.1.4. Độc tính
Các nitrosamin có ảnh hưởng xấ u đế n sức khỏe của người và đô ̣ng vâ ̣t.
Chúng là một trong những nguyên nhân gây ung thư gồm nhiều loại ung thư khác
nhau như ung thư dạ dày, ung thư thực quản, ung thư tuyến tụy, ung thư phổi.
3
Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN
Ngoài ra, nitrosamin có thể gây tổn thương DNA, gây chết tế bào, thoái hóa não,
các bệnh về gan và béo phì [3].
Các nitrosamin đã được nhiều tổ chức phân loại là các chất có thể gây ung
thư. Hiện nay, NDMA và NDEA đã được tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế
(IARC) xếp vào nhóm 2A, còn NDPA được xếp vào nhóm 2B là nhóm có nguy cơ
gây ung thư trên người [3].
1.1.5. Nguồn nitrosamin từ thực phẩm
Bên cạnh những nguồn chứa nitrosamin từ môi trường, khói thuốc lá, nước
uống, một số sản phẩm thực phẩm cũng có nguy cơ lớn có chứa nitrosamin. Nếu
trong sản phẩm thực phẩm đồng thời tồn tại nhóm amin và nitrit, sản phẩm đó có
nguy cơ chứa nitrosamin cao. Bảng 1.2 tóm tắt một số đối tượng thực phẩm thường
có chứa nitrosamin [21],[22].
Bảng 1.2. Một số thực phẩm thường có chứa nitrosamin
Thực phẩm
Loại nitrosamin
Khoảng nồng độ (µg/kg)
Thịt hun khói
NDMA, NPYR, NDPA, NDPhA
1-100
Thịt cà ri
NDMA, NPYR, NPIP
KPH -50
Cá muối
NDMA, NDEA
KPH -1000
Cá kho
NDMA, NDEA
KPH -50
NDMA
KPH-5
Bia
Ghi chú: KPH là Không phát hiện
Sự tạo thành nitrosamin phụ thuộc đáng kể vào lượng nitrat/nitrit, phương
pháp chế biến, nhiệt độ và thời gian chế biến cũng như điều kiện bảo quản thực
phẩm. Trong nhóm đối tượng sản phẩm chế biến từ thịt, hiện chưa có các thông tin
về hàm lượng nitrosamin trong thịt nướng đặc biệt là thịt nướng có tẩm ướp gia vị
vì nhóm này có chứa hàm lượng nitrit khá cao. Với tác động của nhiệt độ, nguy cơ
tạo thành nitrosamin trong các đối tượng này khá rõ rệt.
Các nghiên cứu thực hiện vào năm 1981 đã cho thấy trung bình mỗi ngày
chúng ta hấp thụ khoảng 1 µg nitrosamin từ thực phẩm. Qua 20 năm, lượng hấp thụ
trung bình nitrosamin đã thấp hơn do hiệu quả của việc cắt giảm sự hình thành
nitrosamin trong thực phẩm và đồ uống, nhưng lượng nitrosamin đang có nguy cơ
4
Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN
gia tăng trở lại bởi xu hướng ưa chuộng sản phẩm đồ ăn nhanh với nhiều loại thịt
hun khói, thịt nướng như hiện nay.
Để giảm sự tạo thành nitrosamin trong thực phẩm, nhiều giải pháp đã được
nghiên cứu. Việc loại bỏ hoàn toàn nitrat và nitrit trong chế biến thực phẩm không
phải là giải pháp hữu hiệu do các chất này giúp bảo quản thực phẩm trước sự phát
triển của một số vi sinh vật gây bệnh như Clostridium botulinum. Người ta có thể sử
dụng acid ascorbic hoặc α-tocopheral trong chế biến thực phẩm do các chất này
phản ứng với N2O3. Tuy nhiên, cho đến nay việc loại trừ hoàn toàn nguy cơ tạo
thành nitrosamin vẫn chưa thể thực hiện được. Do đó, nitrosamin vẫn tiếp tục được
tìm thấy trong nhiều sản phẩm thực phẩm [22].
1.1.6. Quy định hiện hành về nitrosamin
Hiện nay, mới chỉ có các quy định về hàm lượng tối đa của nitrosamin trong
nước ăn uống, chưa có quy định cho đối tượng thực phẩm.
Bảng 1.3. Quy định về hàm lượng các nitrosamin trong nước uống[7]
TT Quố c gia, khu vực
Mức tối đa trong nước uống
1
Mỹ
100 ng/L (NDEA), 300 ng/L (NDMA), và 500 ng/L
(NDPA)
2
Canada
0,04 μg/L (tổ ng nitrosamin)
3
Châu Âu
Âm tính
4
Đức
10 ng/L (tổ ng nitrosamin)
5
Việt Nam
Chưa quy định
Bô ̣ Nông nghiê ̣p Mỹ gầ n đây đã có những nghiên cứu về nguy cơ của các
nitrosamin trong thiṭ hun khói và khuyế n cáo hàm lươ ̣ng tố i đa trong thiṭ hun khói
đố i với NPYR (chất có hàm lượng cao nhất) là 10 µg/kg. Đối với các nitrosamin
khác, mặc dù hàm lượng khuyến cáo đến nay chưa được đưa ra nhưng đối với nhiều
nghiên cứu đánh giá nguy cơ hiện nay đòi hỏi phương pháp phân tích phải đạt được
mức LOQ đến 0,5 µg/kg [7],[25].
1.2. Phương pháp xác định các nitrosamin trong thực phẩm
Có nhiều nghiên cứu xác định các nitrosamin trong thực phẩm nói chung và
sản phẩm thịt nói riêng đã được công bố trong những năm gần đây. Về nguyên tắc,
5
Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN
đầu tiên các nitrosamin được tách ra khỏi nền mẫu vào một dịch chiết thích hợp.
Sau đó, một kỹ thuật phân tích phù hợp được sử dụng để xác định hàm lượng
nitrosamin trong dịch chiết từ đó tính được hàm lượng trong mẫu ban đầu.
1.2.1. Các phương pháp xử lý mẫu
Xác định các nitrosamin trong các nền mẫu thịt và sản phẩm thịt gặp phải
nhiều khó khăn do hàm lượng nitrosamin thường rất thấp (vài ppb) và do ảnh hưởng
của nhiều các hợp chất sinh học trong nền mẫu có thể gây nên ảnh hưởng nền lớn.
Vì thế, mục tiêu của quá trình xử lý mẫu ngoài việc đạt được tối đa hiệu suất chiết
nitrosamin, còn phải làm giảm được càng nhiều tạp chất càng tốt. Nhiều kỹ thuật xử
lý mẫu đã được sử dụng bao gồm chưng cất, chiết bằng dung môi, chiết với sự hỗ
trợ vi sóng, chiết pha rắn, và QuEChERS.
1.2.1.1. Chưng cất
Theo kết quả của Sen và Seaman, mẫu thịt hun khói được kiềm hóa và chưng
cất với dầu khoáng trong thiết bị chưng cất chân không và thu nitrosamin vào một
thiết bị bẫy hơi, sau đó bẫy được chiết lại bằng DCM. DCM sau đó được cô để làm
giàu và phân tích bằng sắc ký khí [20]. Kỹ thuật chưng cất này có hiệu quả tốt đối
với nitrosamin đặc biệt là NDMA là chất có nhiệt độ bay hơi thấp. Phương pháp
này sau đó đã được AOAC chấp nhận và trở thành phương pháp chuẩn AOAC
982.22 [5].
Al-Kaseem và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật chưng cất hơi nước để cất các
nitrosamin. Mẫu thịt được đồng nhất trong nước sau đó chưng cất nitrosamin vào
pha nước. Mẫu sau chưng cất được chiết lại bằng DCM và làm sạch bằng SPE [15].
Tuy nhiên, hiện nay phương pháp này ít được áp dụng do sự phức tạp của hệ
thống chưng cất (yêu cầu hệ thống chưng cất đặc biệt và cần có N 2 để làm mát).
Việc sử dụng sắc ký khí với bộ phân tích TEA cũng ít phổ biến ngày nay.
1.2.1.2. Chiết lỏng - lỏng
Đối với một số mẫu dạng lỏng như bia, nước uống, kỹ thuật chiết lỏng lỏng
có thể được áp dụng để chiết nitrosamin. Ngày nay, kỹ thuật chiết lỏng lỏng với
chất nhồi Celite hay Extrelut có thể được sử dụng. Nitrosamin được hấp phụ vào
lớp nước bao quanh các hạt nhồi, sau đó được chiết lại bằng dung môi hữu cơ thích
6
Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN
hợp như DCM hay hỗn hợp DCM và n-hexan. Phương pháp này có thể đạt độ thu
hồi từ 74-85% với giới hạn phát hiện 0,5 µg/L. Một trong những phương pháp này
sau đó đã trở thành phương pháp chính thức của AOAC, áp dụng cho nền mẫu bia
[6].
Kỹ thuật chiết lỏng lỏng này cũng đã được nghiên cứu trên những nền mẫu
thực phẩm khác như thịt và dầu ăn. Theo Yurchenko và cộng sự, bột Extrelut
(diatomaceous earth) được nhồi vào cột thủy tinh và thực hiện chiết lỏng lỏng vào
hỗn hợp n-hexan:DCM (4:6). Tuy nhiên, độ thu hồi của các nitrosamin thu được rất
khác nhau, tốt nhất là NPYR (90%) nhưng chỉ thu được 27% đối với NDEA [29],
[30].
Kỹ thuật chiết lỏng lỏng này tuy có nhiều ưu điểm so với chiết lỏng lỏng
truyền thống, nhưng vẫn sử dụng lượng lớn dung môi và không đạt hiệu quả cho tất
cả các nitrosamin.
1.2.1.3. Vi chiết pha rắn (SPME)
Kỹ thuật SPME cũng được một số tác giả nghiên cứu để xác định nitrosamin
trên nền mẫu thực phẩm như bia, xúc xích [9], [23]. Một loại pha tĩnh được phủ lên
bề mặt của sợi hấp phụ, sau đó được nhúng trực tiếp vào mẫu để hấp phụ
nitrosamin. Tiếp theo, các nitrosamin được giải hấp và phân tích bằng sắc ký khí.
Nhiều loại chất hấp phụ khác nhau đã được nghiên cứu như polydimethylsiloxane–
divinylbenzene (PDMS–DVB), và divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane
(DVB/CAR/PDMS). Perez và cộng sự đã sử dụng SPME với GC-MS để xác định
NDMA trong bia[9]. Andrale và cộng sự đã ứng dụng SMPE để chiết NDMA,
NDEA, NPIP và NPYR từ xúc xích[23].
Kỹ thuật SPME đòi hỏi cần tối ưu tất cả các điều kiện để đảm bảo độ lặp lại
cần thiết, bao gồm điều kiện về thời gian hấp phụ, giải hấp, nhiệt độ và loại muối
tạo cân bằng giữa các pha. Thực tế, hiệu quả ứng dụng của kỹ thuật này để xác định
nitrosamin không đáp ứng được yêu cầu phân tích hiện đại ngày nay.
1.2.1.4. Chiết pha rắn
Chiết pha rắn (SPE) là kỹ thuật được ứng dụng rất phổ biến ngày nay trong
phân tích hàm lượng vết do khả năng làm giàu và làm sạch mẫu rất tốt. Kỹ thuật
7
Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN
này có thể phối hợp với các kỹ thuật chiết khác như chiết lỏng hoặc chưng cất trong
quá trình chuẩn bị mẫu để xác định nitrosamin.
Nhiều loại pha rắn đã được sử dụng để chiết và làm sạch mẫu khi xác định
nitrosamin. Yurchenko và cộng sự nghiên cứu nhiều loại cột khác nhau như florisil,
cyano, silicagel, aminopropyl, alumina cho thấy florisil cho hiệu quả tốt nhất khi
phối hợp với chiết lỏng lỏng bằng cột extrelut. Phương pháp này sau đó được nhiều
tác giả sử dụng trên các nền mẫu khác nhau như thịt cừu, rau, xúc xích và các sản
phẩm thịt khác [8], [9], [26],[29], [30].
1.2.1.5. Kỹ thuật QuEChERS
Năm 2015, Lehotay và cộng sự sử dụng kỹ thuật QuEChERS để xác định các
nitrosamin trong thịt hun khói. Các tác giả sử dụng acetonitril để chiết nitrosamin từ
nền mẫu thịt có bổ sung nước. Lớp acetonitril được tách khỏi nước bằng phân bố
lỏng lỏng nhờ sự có mặt của MgSO4 và HCO2NH4. Dịch chiết acetonitril sau đó
được làm sạch bằng chiết phân tán pha rắn (d-SPE) với hỗn hợp chất hấp phụ gồm
MgSO4, PSA, C18 và bột Z-Sep [25].
Kỹ thuật chiết QuEChERS ngày càng được nhiều tác giả nghiên cứu để xác
định nitrosamin trong các nền mẫu thực phẩm khác nhau [32], [33], [34]. Một số
nghiên cứu chính được tóm tắt ở bảng 1.4.
Bảng 1.4. So sánh một số nghiên cứu chiết nitrosamin bằng kỹ thuật QuEChERS
Tác giả,
Nền mẫu
Dung môi
Lehotay,
Thịt hun
H2O:ACN
2015 [9]
khói
(10:10)
Zheng, 2016
Nước
[21]
tương
năm
Qui, 2017
[22]
Zhao, 2017
[23]
Cá muối
Thịt chua
Muối chiết
HCO2NH4
d-SPE
MgSO4, PSA,
C18, Z-Sep
PSA, C18,
EtOAc
-
H2O:ACN
MgSO4:NaCl
Na2SO4, C18,
(10:15)
(4:1)
PSA
ACN
-
C18, PSA
8
GCB
Độ thu
hồi
81-109%
80-112%
87-113%
80-115%
Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN
Ứng dụng của QuEChERS để xác định nitrosamin hiện nay mới chỉ bắt đầu
được nghiên cứu nhưng đã thu được nhiều hiệu quả tốt. Việc kết hợp giữa
QuEChERS với các phương pháp khối phổ hiện đại là xu hướng tương lai của việc
xác định nitrosamin trong nền mẫu thực phẩm.
1.2.1.6. Các kỹ thuật chiết khác
Một số kỹ thuật khác cũng đã được nghiên cứu để chiết nitrosamin trong
thực phẩm.
Campillo và Huang cùng sử dụng kỹ thuật chiết với sự hỗ trợ của vi sóng để
xác định nitrosamin trong các sản phẩm thịt với độ thu hồi có thể đạt được từ 82102% [18], [19].
Một số tác giả sử dụng kỹ thuật chiết siêu tới hạn với ưu điểm là không sử
dụng dung môi độc hại [13], [31]. Tuy nhiên, kỹ thuật này đòi hỏi hệ thống chiết
với chi phí cao và không phù hợp cho tất cả các loại nitrosamin do tính chất phân
cực khá khác nhau.
1.2.2. Phương pháp phân tích
Sau khi đã chiết nitrosamin ra khỏi nền mẫu, cần phải sử dụng các phương
pháp phân tích phù hợp để có thể xác định và định lượng được chính xác hàm lượng
của chúng. Với tính chất dễ bay hơi, sắc ký khí là kỹ thuật được sử dụng phổ biến
để xác định các nitrosamin. Ngoài ra, sắc ký lỏng kết nối với khối phổ hai lần cũng
được sử dụng do ưu điểm về độ nhạy và tính chọn lọc.
1.2.2.1. Sắc ký lỏng khối phổ
Sắc ký lỏng với các detector thông thường ít được sử dụng để xác định
nitrosamin do khó đáp ứng được yêu cầu về độ nhạy. Theo một nghiên cứu của
Cardenes và cộng sự, nitrosamin được dẫn xuất dansyl hóa và xác định bằng sắc ký
lỏng với detector huỳnh quang. Phương pháp đã được ứng dụng để xác định
nitrosamin trong bia và khói thuốc lá, nhưng chỉ có thể xác định ở nồng độ khoảng
từ 2,5 µg/kg trở lên.
Một số nghiên cứu gần đây sử dụng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) để xác
định nitrosamin trong nước, bia, và sản phẩm thịt [16], [24], [27]. Bản thân các
nitrosamin không đáp ứng tốt với nguồn ESI cũng là yếu tố tạo nên sự khó khăn khi
9
Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN
ứng dụng LC-MS hoặc LC-MS/MS. Các nghiên cứu đều sử dụng nguồn APCI để
ion hóa. Aerola xác định 4 nitrosamin trong xúc xích sử dụng kỹ thuật LC-APCIMS để tạo các ion có số khối [M+H]+ với LOD khá thấp dao động từ 0,2 đến 1,0
µg/kg tùy từng nitrosamin [24]. Herrmann cũng sử dụng LC-APCI-MS/MS để xác
định đồng thời 14 nitrosamin trong sản phẩm thịt thu được kết quả khá tốt với LOD
từ 0,2 đến 1,0 µg/kg. Các kết quả cũng cho thấy LOD có sự khác biệt trên nhiều đối
tượng mẫu khác nhau, cho thấy ảnh hưởng của nền mẫu tới tín hiệu phân tích rất
đáng kể.
Mặc dù, phương pháp LC-MS/MS cũng thu được một số kết quả khá khả
quan trong việc xác định nitrosamin nhưng việc sử dụng nguồn APCI tạo nên sự
không thuận lợi cho các phòng thí nghiệm khi áp dụng trong thực tế do đòi hỏi về
thiết bị cũng như kinh nghiệm sử dụng loại nguồn này. Ảnh hưởng nền khá lớn
cũng là một yếu tố cần cân nhắc khi sử dụng phương pháp LC-MS/MS.
1.2.2.2. Sắc ký khí
Do các nitrosamin có thành phần N nên có thể sử dụng GC-NPD để xác định
các nitrosamin. Grebel đã thực hiện so sánh việc sử dụng GC-NPD với GC-MS để
xác định nitrosamin cho thấy không có sự khác biệt quá lớn về độ chính xác của kết
quả. Giới hạn phát hiện của NDMA có thể đạt đến 4 µg/L (trên dịch bơm mẫu).
Phương pháp này cho thấy có thể được áp dụng, tuy nhiên cần bước làm giàu mẫu
để đạt được độ nhạy yêu cầu [12].
GC-TEA là kỹ thuật rất được ưa thích trước đây để xác định nitrosamin do
có độ nhạy và độ chọn lọc rất tốt. Thiết bị TEA gồm một lò đốt hoạt động ở nhiệt
độ thích hợp để giải phóng gốc –NO trong khi vẫn duy trì cấu tạo còn lại của các
nitrosamin. Gốc –NO được chuyển đến bộ phản ứng, tại đây được xử lý với O3 và
tạo thành NO2. NO2 khi qua detector quang hóa sẽ phát năng lượng dưới dạng ánh
sáng ở bước sóng đặc trưng. Ánh sáng này được đo, khuếch đại để phát hiện và định
lượng nitrosamin. Phương pháp này được chấp nhận bởi AOAC [3] và USDA trong
nghiên cứu đánh giá nguy cơ với nitrosamin [25]. Một số tác giả cũng sử dụng GCTEA để xác định nitrosamin trong thực phẩm như nghiên cứu của Andrade kết hợp
SPME và GC-TEA thu được LOD là 3 µg/kg [23]. TCVN 10069:2013 và TCVN
10
Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN
11602:2016 cũng sử dụng GC-TEA để xác định nitrosamin trong cao su [1] và thịt
[2]. Ngày nay, phương pháp này ít được sử dụng do những ưu điểm của phương
pháp GC-MS/MS.
GC-MS và GC-MS/MS là nhóm các phương pháp được sử dụng phổ biến để
xác định nitrosamin trong thực phẩm. Chất đầu tiên và quan trọng nhất trong nhóm
nitrosamin là NDMA có khối lượng phân tử rất thấp (M=74) và các ion sản phẩm
(m/z 42 và m/z 44) thường được tạo ra bởi nhiều chất khác. Kỹ thuật CI đã được
EPA chấp nhận để xác định nitrosamin trong nước uống [10]. Kỹ thuật EI đã không
được EPA chấp nhận do độ nhạy không đáp ứng để xác định nitrosamin trong nước.
Ngoài yêu cầu về nguồn ion, EPA còn yêu cầu sử dụng bộ bơm mẫu thể tích lớn ví
dụ như PTV để tăng giới hạn phát hiện của phương pháp [10].
Rất nhiều nghiên cứu đã sử dụng CI để xác định nitrosamin trong nhiều đối
tượng thực phẩm khác nhau. Gần đây, nhiều nghiên cứu cố gắng cải thiện hiệu quả
của nguồn EI trong việc xác định nitrosamin và cũng đã thu được một số kết quả
tốt. Một số nghiên cứu sử dụng GC-MS(/MS) để xác nitrosamin trong thực phẩm
được tóm tắt ở bảng 1.5. Giới hạn phát hiện của NDMA là tiêu chí quan trọng để
đánh giá phương pháp do đây là chất quan trọng nhất trong nhóm nitrosamin và là
chất kém nhạy nhất.
Bảng 1.5. Tóm tắt một số nghiên cứu xác định nitrosamin bằng GC-MS/MS
Tác giả,
năm
Nền mẫu
Campillo,
Sản phẩm
2011 [19]
thịt
McDonald,
Nước
2012 [11]
uống
Huang,
Sản phẩm
2013 [18]
thịt
Sannino,
Sản phẩm
2013 [4]
thịt
Kỹ thuật bơm
Cột sắc
Nguồn ion
LODNDMA
mẫu
ký
hóa
(µg/kg)
EI, 70 eV
0,56
EI, 70 eV
0,9
SSL, 3 µL
HP5-MS
UI
DB1701
SSL, 1 µL
P
PTV, 10 µL
DB5-MS
CI, methan
0,12
PTV, 9 µL
ZB-5MSi
PCI, amoniac
0,1
11
Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN
Tác giả,
năm
Nền mẫu
Lehotay,
Thịt hun
2015 [25]
khói
Zheng,
Nước
2016 [32]
tương
Qui, 2017
[33]
Cá muối
Kỹ thuật bơm
Cột sắc
Nguồn ion
LODNDMA
mẫu
ký
hóa
(µg/kg)
Rtx-624
EI, 70 eV
0,1
EI, 70 eV
0,4
EI, 70 eV
0,03
SSL, 3 µL, kỹ
thuật thổi
ngược
SSL, 1 µL, kỹ
thuật thổi
ngược
HPInnowax
DB-
SSL, 2 µL
Waxetr
Kết luận: Các số liệu nêu trên cho thấy, việc sử dụng nguồn EI với phương
pháp GC-MS/MS, kết hợp kỹ thuật QuEChERS hoàn toàn có thể thu được hiệu quả
tốt nếu chọn được điều kiện thích hợp. Sỡ dĩ nguồn EI được ưu tiên hơn vì sự phổ
biến của nó so với nguồn CI.
12
Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN
2. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng của nghiên cứu này là 3 nitrosamin (thường phát hiện trong mẫu
thực phẩm) được trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các nitrosamin được sử dụng trong nghiên cứu
Công thức
Khối lượng
phân tử
phân tử
NDMA
C2H6N2O
74
N-Nitroso dipropyl amine
NDPA
C6H14N2O
130
N-nitroso diphenyl amine
NDPhA
C12H10N2O
198
TT
Nitrosamin
Ký hiệu
1
N-Nitroso dimethyl amine
2
3
Đối tượng mẫu được lựa chọn để xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp
và ứng dụng phương pháp bao gồm một số nền mẫu thịt nướng gồm có thịt lợn
nướng, thịt bò nướng và thịt gia cầm nướng.
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời một số nitrosamin trong các
sản phẩm thịt nướng
2.2.1.1. Khảo sát các điều kiện xác định nitrosamin bằng GC-MS/MS
-
Khảo sát điều kiện sắc ký khí: tìm các điều kiện tách sắc ký bao gồm cột sắc
ký, điều kiện nhiệt độ.
-
Khảo sát điều kiện khối phổ: tìm các điều kiện tối ưu của MS và MS/MS để
xác định ion mẹ; lựa chọn các ion con phù hợp để định tính và định lượng.
2.2.1.2. Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu
Trên cơ sở tham khảo các nghiên cứu trước đây và thực hiện các khảo sát
thực tế sử dụng phương pháp QuEChERS:
-
Khảo sát và lựa chọn phương pháp xử lý mẫu gồm:
o Khảo sát muối chiết
13
Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN
o Khảo sát cách thức và thời gian chiết
o Khảo sát bước làm sạch d-SPE
-
Khảo sát ảnh hưởng nền khi áp dụng cho các nền mẫu thịt nướng.
2.2.2. Thẩm định phương pháp xác định đồng thời một số nitrosamin trong các
sản phẩm thịt nướng
Đánh giá các thông số cơ bản của phương pháp gồm có:
-
Tính chọn lọc.
-
Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ.
-
Khoảng làm việc.
-
Độ chụm (độ lặp lại).
-
Độ đúng (độ thu hồi).
2.2.3. Sơ bộ đánh giá hàm lượng nitrosamin trong một số sản phẩm thịt nướng
trên địa bàn Hà Nội
▪ Lấy mẫu tại một số chợ và cửa hàng ở Hà Nội.
-Thịt lợn nướng: 10 mẫu, 1 kg/mẫu.
-Thịt bò nướng: 10 mẫu, 1 kg/mẫu.
-Thịt gia cầm nướng: 10 mẫu, 1 kg/mẫu.
▪ Ứng dụng phương pháp để phân tích và đánh giá hàm lượng nitrosamin theo
một số kiểu chế biến thịt khác nhau.
2.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất
2.3.1. Thiết bị
• Hệ thống sắc ký khí khối phổ hai lần gồm máy GC 7890 và MS 7000B của
Agilent
• Máy ly tâm Mikro 200R, Hettich
• Máy rung siêu âm S100H, Elma
• Máy lắc ngang HS260, IKA
• Cân phân tích (có độ chính xác 0,1 mg) XS105, Metter Toledo.
2.3.2. Dụng cụ
• Micropipet có thể tích điều chỉnh được 20-200 µL, 100-1000 µL và 10005000 µL.
14
Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN
• Ống ly tâm loại 15 mL, 50 mL
• Vial 1,8 mL
2.3.3. Hóa chất, chất chuẩn
• Chuẩn hỗn hợp nitrosamin 2000 µg/mL mỗi chất trong methanol (Dr.
Ehrenstorfer): N-Nitroso-dimethylamine (NDMA), N-Nitriso-diphenylamine
(NDPhA), N-Nitroso-di-n-propylamine (NDPA) (Lot: 40930ME).
• Nội chuẩn NDMA-d6 (Dr. Ehrenstorfer) (Lot: D-2937).
• Acetonitril (ACN) (Merck).
• Primary secondary amin (PSA) (Agilent)
• Octadecylsilan (C18) (Agilent)
• Dichloromethan (DCM) (Merck)
• N-hexan (Merck)
• MgSO4 khan (tinh khiết phân tích): có thể dùng muối ngậm nước nhưng phải
nung ở 450oC trong 2h để loại nước.
• NaCl (tinh khiết phân tích)
• (NH4)2CO3 (tinh khiết phân tích)
• NH4Cl (tinh khiết phân tích)
2.3.4. Pha dung dịch chuẩn
2.3.4.1. Dung dịch chuẩn hỗn hợp nitrosamin 10 µg/mL và 1 µg/mL
Dùng pipet hút chính xác 100 µL dung dịch chuẩn gốc 2000 µg/mL vào bình
định mức 20 mL, định mức bằng ACN, thu được dung dịch chuẩn hỗn hợp 10
µg/mL. Bảo quản ở nhiệt độ -18oC, sử dụng trong 6 tháng.
Dùng pipet hút chính xác 100 µL dung dịch chuẩn hỗn hợp 10 µg/mL vào
vial, thêm 900 µL ACN, lắc đều, thu được dung dịch chuẩn hỗn hợp 1 µg/mL. Pha
mới khi sử dụng.
2.3.4.2. Dung dịch nội chuẩn gốc 1000 µg/mL
Cân chính xác 10 mg nội chuẩn NDMA-d6 vào bình định mức 10 mL, định
mức tới vạch bằng ACN, thu được dung dịch nội chuẩn gốc 1000 µg/mL. Bảo quản
ở nhiệt độ -18oC, sử dụng trong 3 năm.
15
