Nghiên cứu xác định các độc tố gây tiêu chảy acid okadaic, dinophysistoxin-1, dinophysistoxin-2 trong một số nhuyễn thể 2 mảnh vỏ ở biển Việt Nam bằng sắc ký lỏng khối phổ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI
DƯỢC
HÀ NỘI
• HỌC
•
•
•

TỐNG THỊ THANH VƯỢNG

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘC
TỐ GÂY TIÊU CHẢY ACID OKADAIC,
DIN OPHYSISTOXIN-1,
DINOPHYSISTOXIN-2 TRONG MỘT
X.

~

Ẵ

9

9

9 .

SỐ NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ Ở

BIỂN VIỆT NAM BẰNG SẮC KÝ LỎNG
KHỐI PHỔ

LUẬN
ÁN TIÉN SĨ DƯỢC
HỌC
•
•
•

HÀ NỘI, NĂM 2018


MỤC LỤC
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN Đ Ề .........................................................................................................

1

CHƯƠNG 1. TỔNG Q U AN ................................................................................

3

1.1. ĐỘC TỐ SINH VẬT BIỂN...............................................................................

3

1.1.1. Nguồn gốc.....................................................................................................

3

1.1.2. Tóm tắt quá trình nghiên cứu một số nhóm độc tố tảo đơnbào gây độc
cho con người......................................................................................

4

1.2. NGUỒN GỐC, CẤU TRÚC HOÁ HỌC, ĐỘC TÍNH VÀ QUY ĐỊNH KIỂM
SOÁT ĐỘC TỐ DSP..................................................................................................

7

1.2.1. Nguồn gốc độc tố D SP.................................................................................

7

1.2.2. Cấu trúc hoá học độc tố D SP.........................................................................

8

1.2.3. Cơ ch ế tác dụng, độc tính độc tố D SP...........................................................

10

1.2.4. Ngộ độc cho người do độc tố D SP...............................................................

11

1.2.5. Quy định kiểm soát độc tố D SP.....................................................................

12

1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ DSP..........................................

16

1.3.1. Các phương pháp xử lý m ẫu để chiết độc tố nhóm acid okadaic...............

16

1.3.1.1. Lựa chọn dung môi để chiết độc tố nhóm OA từ nhuyễn th ể...................

17

1.3.1.2. Các phương pháp làm sạch dịch chiết ban đầu.........................................

18

1.3.1.3. Các phương pháp thuỷ phân mẫu và làm sạch sau thuỷ phân..................

20

1.3.2. Các phương pháp sinh học để phân tích độc tố nhóm acid okadaic..........

21

iii

1.3.2.1. Các phương pháp định lượng sinh học in vivo.........................................

21

1.3.2.2. Các phương pháp định lượng qua gây độc tế bào.....................................

22

1.3.2.3. Các phương pháp hoá sin h .........................................................................

23

1.3.3. Các phương pháp hoá lý để phân tích độc tố nhóm acid okadaic..............

24

1.3.3.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao..........................................................................

24

1.3.3.2. Điện di mao quản........................................................................................

26

1.3.3 3. Sắc ký khí.....................................................................................................

27

1.4. ỨNG DỤNG SẮC KÝ KHỐI PHỔ TRONG PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ NHÓM
ACID OKADAIC........................................................................................................

27

1.4.1. Các đặc trưng khối phổ của độc tố nhóm O A ...............................................

27

1.4.1.1. Khối phổ của OA trong kỹ thuật EI và C I.................................................

27

1.4.1.2. Khối phổ của OA trong kỹ thuật FAB......................................................

28

1.4.1.3. Khối phổ của OA trong kỹ thuật ESI.........................................................

29

1.4.1.4. Khối phổ dạng ester của O A .......................................................................

34

1.4.2. Phân tích định tính, định lượng độc tố nhóm OA bằng LC - MS/M S........

36

1.4.2.1. Kỹ thuật ion hoá..........................................................................................

36

1.4.2.2. Lựa chọn phân tích khối.............................................................................

37

1.4.2.3. Điều kiện sắc k ý ..........................................................................................

38

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, TRANG TH IẾ T BỊ, NỘI DUNG VÀ
PHƯ ƠNG PHÁP NGHIÊN C Ứ U .......................................................................

43

2.1. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ..................................................................

43

2.1.1. Dung môi, hoá chất và chất chuẩn................................................................

43

2.1.1.1. Chất chuẩn...................................................................................................

43

iv


2.1.1.2. Dung môi, hoá chất....................................................................................

43

2.1.2. Thiết bị, dụng cụ phân tích..........................................................................

43

2.1.2.1. Thiết bị phân tích.........................................................................................

43

2.1.2.2. Dụng cụ phân tích........................................................................................

44

2.2.

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU........................................................................

45

2.2.1. Mẫu nhuyễn thể lấy tại các địa phương.........................................................

45

2.2.2. Mẫu thêm chuẩn.............................................................................................

45

2.2.3. Mẫu chuẩn nhuyễn thể có chứa độc tố ..........................................................

45

2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................................

46

2.3.1. Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời OA, DTX1, DTX2 trong
nhuyễn thể..................................................................................................................

46

2.3.1.1. Khảo sát xây dựng điều kiện khối phổ......................................................

46

2.3.1.2. Khảo sát xây dựng điều kiện sắc ký ...........................................................

47

2.3.1.3. Khảo sát điều kiện chiết độc tố từ mẫu nhuyễn thể..................................

48

2.3.1.4. Khảo sát điều kiện thuỷ phân để phân tích độc tố toàn phần...................

48

2.3.1.5. Thẩm định phương pháp.............................................................................

49

2.3.2. Lấy mẫu nhuyễn thể và bảo quản m ẫu.......................................................

51

2.3.2.1. Lựa chọn số lượng cá thể cho mỗi mẫu nhuyễn thể..................................

51

2.3.2.2. Khảo sát điều kiện bảo quản mẫu nhuyễn thể...........................................

51

2.3.3. Phân tích độc tố trong mẫu nhuyễn thể và biện giải kết quả.....................

51

2.3.3.1. Tiến hành phân tích trên mẫu thực.............................................................

51

2.3.3.2. Các tiêu chí đánh giá kết quả phân tích độc tố trong nhuyễn thể.............

52

2.3.3.3. Các hướng biện giải, bàn luận kết quả......................................................

52

v


CHƯƠNG 3. K ẾT QUẢ NGHIÊN C Ứ U ...........................................................

53

3.1. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH OA, DTX1 VÀ DTX2..................

53

3.1.1. Khảo sát thiết lập điều kiện phân tích OA, DTX1 và DTX2 bằng M S......

53

3.1.1.1. Điều kiện của detector M S/M S.................................................................

53

3.1.1.2. Điều kiện sắc k ý ..........................................................................................

59

3.1.2. Khảo sát thiết lập điều kiện xử lý mẫu để chiết OA, DTX1 và DTX2 từ
nhuyễn thể..................................................................................................................

65

3.1.2.1. Đồng nhất m ẫu............................................................................................

65

3.1.2.2. Lựa chọn dung môi chiết độc tố .................................................................

65

3.1.2.3. Lựa chọn thể tích dung môi chiết...............................................................

67

3.1.2.4. Khảo sát điều kiện làm sạch dịch chiết.....................................................

68

3.1.2.5. Điều kiện xử lý m ẫu để phân tích độc tố ở dạng tự do..............................

73

3.1.2.6. Khảo sát thiết lập điều kiện thuỷ phân để phân tích OA, DTX1 và
DTX2 toàn phần trong nhuyễn thể..........................................................................

74

3.1.3. Khảo sát thiết lập điều kiện bảo quản nhuyễn thể.....................................

79

3.1.3.1. Đánh giá độ ổn định của độc tố trong nhuyễn thể ở một số điều kiện
nhiệt độ......................................................................................................................

79

3.1.3.2. Điều kiện bảo quản mẫu nhuyễn thể..........................................................

82

3.2.

THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH OA, DTX1 VÀ DTX2...........

82

3.2.1. Điều kiện của các phương pháp được thẩm định.........................................

82

3.2.1.1. Phương pháp phân tích độc tố tự do trên cột Cortecs...............................

82

3.2.1.2. Phương pháp phân tích độc tố tự do và toàn phần trên cột Zorbax.........

84

3.2.2. Thẩm định phương pháp phân tích độc tố trên cột Cortecs......................

85

vi

3.2.2.1. Độ đặc hiệu.................................................................................................

85

3.2.2.2. Độ thích hợp hệ thống................................................................................

87

3.2.2.3. Độ tuyến tính của khoảng nồng độ làm việc.............................................

88

3.2.2.4. Độ chính xác................................................................................................

88

3.2.2.5. Độ đúng........................................................................................................

91

3.2.2.6. Độ nhậy........................................................................................................

92

3.2.3. Thẩm định phân tích độc tố tự do và toàn phần trên cột Zorbax.................

94

3.2.3.1. Độ đặc hiệu..................................................................................................

94

3.2.3.2. Độ thích hợp hệ thống................................................................................

96

3.2.3.3. Độ tuyến tính của khoảng nồng độ làm việc.............................................

97

3.2.3.4. Độ chính xác khi phân tích độc tố tự do....................................................

98

3.2.3.5. Độ chính xác khi xác định độc tố toàn phần..............................................

101

3.2.3.6. Độ đúng khi phân tích độc tố tự do............................................................

103

3.2.3.7. Độ đúng khi phân tích độc tố toàn phần....................................................

104

3.2.3.8. Độ nhậy........................................................................................................

104

3.3. PHÂN TÍCH OA, DTX1 VÀ DTX2 TRONG MẪU NHUYỄN THỂ..................

107

3.3.1. Lấy mẫu nhuyễn thể và phân tích độc tố ......................................................

107

3.3.2. Kết quả phân tích độc tố trong mẫu nhuyễn thể...........................................

109

3.3.2.1. Kết quả phát hiện độc tố tự do.....................................................................

109

3.3.2.2. Kết quả phát hiện độc tố sau khi thuỷ phân...............................................

111

3.3.3. Sự phân bố các mẫu phát hiện có độc tố ........................................................

113

3.3.3.1. Phân bố các mẫu có độc tố theo loại nhuyễn thể......................................

113

3.3.3.2. Phân bố các mẫu có độc tố theo địa điểm lấy m ẫu....................................

116

vii


3.3.3.3. Phân bố các mẫu có độc tố theo thời điểm lấy m ẫu...................................

119

CHƯƠNG 4. BÀN LU ẬN ......................................................................................

122

4.1. BÀN LUẬN PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐƯỢC XÂY DỰNG....................

122

4.1.1. Điều kiện phân tích độc tố bằng LC - MS/M S.............................................

122

4.1.2. Điều kiện xử lý mẫu nhuyễn thể...................................................................

126

4.1.2.1. Cỡ mẫu nhuyễn thể......................................................................................

126

4.1.2.2. Điều kiện xử lý m ẫu để phân tích độc tố tự do..........................................

126

4.1.2.3. Điều kiện xử lý m ẫu để phân tích độc tố toàn phần..................................

127

4.2. BÀN LUẬN KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ TRONG NHUYỄN THỂ.......... 129
4.2.1. Loại độc tố phát hiện được, tỷ lệ xuất hiện và mức độ hàm lượng trong
nhuyễn thể..................................................................................................................

129

4.2.2. Dao động sự xuất hiện của độc tố trong nhuyễn thể cùng các yếu tố ảnh
hưởng.........................................................................................................................

131

4.3. NGUY CƠ ẢNH HƯỞNG TỚI SỨC KHOẺ VÀ HƯỚNG KIỂM SOÁT ĐỘC
TỐ NHÓM OA TRONG NHUYỄN THỂ TRONG TƯƠNG LAI..............................

140

KÉT LUẬN VÀ KIÉN N G H Ị...............................................................................

142

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ
TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

viii


DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIÉT TẮT
Ký hiệu

Nội dung

ACN

Acetonitril

ADAM

9-anthryldiazomethan

ALP

Alkaline phosphatase

AOAC

Hiệp hội các cộng đồng phân tích (Association Of Analytical
Communities)

ASP

Mất trí nhớ do ngộ độc thuỷ sinh vật vỏ cứng (Amnesic Shellfish

Poisoning)

AZA

Azaspiracid

AZP

Ngộ độc azaspiracid do thuỷ sinh vật vỏ cứng (Azaspiracid
Shellfish Poisoning

BAP

1-bromoacetylpyren

BNNVPTNT Bộ nông nghiệp và phát triên nông thôn
BrDMEQ

3-bromomethyl-6,7-dimethoxy-1-methyl-2(1H)-quinoxalinon

BSA

Huyêt thanh bò (Bovine Serum Albumin)

CA

9-cloromethylanthracen

CI

Ion hoá hoá học (Chemical Ionization)

CE

Năng lượng băn phá ion sơ cấp (Collision Energy)

CEFAS

Trung tâm khoa học môi trường, ngư nghiệp và nuôi trồng hải sản
Anh (Centre for Environtment, Fisheries and Aquaculture Science)

CTX

Ciguatoxin

CXP

Thê khi ra khỏi buồng va chạm (Collision Cell Exit Potential)

1


DP

Thê tách chùm (Declustering Potential)

DSP

Tiêu chảy do ngộ độc thuỷ sinh vật vỏ cứng (Diarrhetic Shellfish
Poisoning)

DTX

Dinophysistoxin

DTX1

Dinophysistoxin-1

DTX2

Dinophysistoxin-2

EC

Uỷ ban châu Au (European Commission)

EI

Ion hoá điện tử (Electron Ionization)

ELISA

Định lượng băng găn miên dịch liên kêt enzym (Enzym - Linked
ImmunoSorbent Assay)

ESI

Ion phun điện tử (Electrospray Ionization)

EU

Liên minh châu Au (European Union)

FAB

Băn phá nhanh nguyên tử (Fast-Atom Bombardment)

GC

Săc ký khí (Gas Chromatography)

HPLC

Săc ký lỏng hiệu năng cao (High Performace Liquid Chromatograph

HRP

Horseradish Peroxidase

IP

Điên định danh (Identification Point)

KB

Tê bào ung thư biêu mô

LC

Săc ký lỏng (Liquid Chromatography)

LC-MS

Săc ký lỏng khối phổ (Liquid Chromatography Mass Spectrometry)

LC-MS/MS

Săc ký lỏng khối phổ hai lần (Liquid Chromatography Tandem
Mass Spectrometry)

11


LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of Quantification)

MBA

Định lượng sinh học trên chuột (Mouse Bioassay)

MEKC

Săc ký điện động mixen (Micellar Electrokinetic Chromatography)

MeOH

Methanol

MRM

Theo dõi đa phản ứng (Multiple Reaction Monitoring)

MU

Đơn vị chuột (Mouse Unit)

NAFIQAD

Cục quản lý chất lượng nông lâm sản và thuỷ sản (National AgroForestry-Fisheries Quality Assurance Department)

NSP

Ngộ độc thần kinh do thuỷ sinh vật vỏ cứng (Neurotoxic Shellfish
Poisoning)

NRCC

Hội đồng nghiên cứu quốc gia Canada (National Research Council
Canada)

NT2MV

Nhuyên thê hai mảnh vỏ

OA

Acid Okadaic

PP

Protein Phosphatase

PSP

Tê liệt do ngộ độc thuỷ sinh vật vỏ cứng (Paralytic Shellfish
Poisoning

PTX

Pectenotoxin

SD

Độ lệch chuân (Standard Deviation)

SDS

Sodium DodecylSulfate

SIM

Chê độ chọn lọc ion (Select Ion Monitoring)

S/N

Tín hiệu trên nhiêu nên (Signal/Noise)

SOP

Quy trình thao tác chuân (Standard Operation Procedure)

iii


SPE

Chiêt pha răn (Solid phase extraction)

TCVN

Tiêu Chuân Việt Nam

TFA

Acid trifluoroacetic

TT

Thông tư

TTX

Tetrodotoxin

UPLC

Săc ký lỏng siêu hiệu năng (Ultra Performace Liquid Chromatograpl

USFDA

Cơ quan quản lý Dược phâm và thực phâm Mỹ (United States Food
Drug Administation)

UV-Vis

Tử ngoại - Khả kiên (Ultra Violet - Visible)

YTX

Yessotoxin

iv


DANH MỤC
CÁC BẢNG,y BIỂU
•
T rang
Bảng 1.1

Quy định kiểm soát độc tố sinh học trong nhuyễn thể theo
Thông tư 33/2015/TT - BNNVPTNT.........................................

Bảng 1.2

15

Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp LC - MS để xác định
độc tố nhóm O A ............................................................................

39

Bảng 2.1

Hàm lượng các độc tố trong mẫu chuân......................................

46

Bảng 3.1

Điêu kiện chạy nguồn ion hoá E SI...............................................

59

Bảng 3.2

Điêu kiện tách chùm ion sơ cấp và tạo ion thứ cấp của độc tố
nhóm D SP......................................................................................

59

Bảng 3.3

Chương trình gradient dung môi cho cột Cortecs.......................

64

Bảng 3.4

Khảo sát thể tích MeOH và số lần chiết.......................................

67

Bảng 3.5

Ảnh hưởng của các điêu kiện tác động lên dịch chiết M eOH....

69

Bảng 3.6

Khảo sát điêu kiện nạp mẫu và khả năng thu hồi độc tố .............

71

Bảng 3.7

Khảo sát thể tích rửa giải...............................................................

72

Bảng 3.8

Kết quả đánh giá khả năng làm sạch dịch chiết bằng ly tâm

Bảng 3.9

lạnh.................................................................................................

73

Đánh giá khả năng bảo tồn độc tố sau khi xử lý dịch thuỷ phân..

76

v


Bảng 3.10 Đánh giá thay đổi hàm lượng độc tố tự do trong các điêu kiện
bảo quản khác nhau.......................................................................
Bảng 3.11

79

Đánh giá thay đổi hàm lượng OA tự do và toàn phần trên mẫu
thực trong các điêu kiện bảo quản khác nhau..............................

80

Bảng 3.12 Đánh giá độ thích hợp hệ thống trên cột Cortecs........................

87

Bảng 3.13 Kết quả đánh giá độ tuyến tính của khoảng nồng độ làm v i ệ c . .

88

Bảng 3.14 Thâm định độ đúng, độ chính xác với độc tố tự do trên cột
Cortecs............................................................................................

89

Bảng 3.15 Thâm định ảnh hưởng của loại nên nhuyễn thể lên độ đúng, độ
chính xác với độc tố tự do..............................................................

91

Bảng 3.16 Kết quả đánh giá LOD, LOQ trên cột Cortecs.............................

92

Bảng 3.17 Đánh giá độ thích hợp hệ thống trên cột Zorbax Eclipse
Plus.................................................................................................
Bảng 3.18 Kết quả đánh giá độ tuyến tính của khoảng nồng độ làm việc....

97
97

Bảng 3.19 Thâm định độ đúng, độ chính xác với độc tố tự do trên cột
Zorbax..........................................................................................

99

Bảng 3.20 Thâm định ảnh hưởng của loại nên nhuyễn thể lên độ đúng, độ

chính xác với độc tố tự do khi phân tích trên cột Zorbax.............
Bảng 3.21

100

Đánh giá độ đúng, độ chính xác trên mẫu chuân.......................... 102

Bảng 3.22 Thâm định độ chính xác với độc tố toàn phần trên mẫu thực.....

103

Bảng 3.23 Kết quả đánh giá LOD, LOQ trên cột Zorbax Eclipse Plus........

105

Bảng 3.24 Kết quả lấy mẫu nhuyễn thể theo thời gian, địa điểm lấy mẫu
và loại m ẫu......................................................................................

108

Bảng 3.25 Tổng hợp kết quả các mẫu phát hiện có độc tố ............................

110

vi


DANH MỤC
CÁC HINH VE,y ĐO THỊ•
•

T rang
Hình 1. 1

Công thức cấu tạo của OA và các D TX ...........................................

Hình 1.2

Phổ khối của OA trong các điêu kiện khác nhau: (a) phổ EI, (b)
phổ CI ion dương, (c) phổ CI ion âm [19]......................................

Hình 1.3

33

Cơ chế phân mảnh ion thứ cấp từ ion [M+Na]+ của OA, DTX1,
DTX2 [24]........................................................................................

Hình 1.8

31

Phổ ion thứ cấp của ion [M+Na]+ của OA (a), DTX2 (b), DTX1
(c) [24]..............................................................................................

Hình 1.7

30

Phổ ion thứ cấp của ion [M-H]" của OA (a), DTX2 (b), DTX1
(c) [24] ..........................................................................................

Hình 1.6

29

Cơ chế phân mảnh ion thứ cấp từ ion [M-H]- của OA, DTX1,
DTX2 [24] .......................................................................................

Hình 1.5

28

Phổ khối FAB của OA: (a) chế độ ion dương, (b) chế độ ion
dương m/z từ 400 đến 1000, (c) chế độ ion âm [19].....................

Hình 1.4

8

34

Phổ ion thứ cấp của ion [M-H]" của OA (m/z 803) (a), OA
palmitat (m/z 1041) (b), DTX1 (m/z 817) (c) và DTX1 palmitat
(m/z 1055) (d) [123]........................................................................

vii

35

Các ion thứ cấp đặc trưng của các 7-O acyl ester có nguồn gốc
từ ion [M-H]- (ion (i) và (ii), và ion [M+Na]+ (các ion I, II, III,
IV) [123]..........................................................................................

35

Một số ester diol và ester hỗn hợp của độc tố nhóm OA, cơ chế
phân mảnh ion [M+Na]+ của các ester này [122]..........................

36

Chuẩn OA, DTX1, DTX2 của N RCC............................................

43

Mẫu chuẩn nhuyễn thể có chứa độc tố của N RCC.......................

46

Phổ ESI - MS của O A .....................................................................

54

Phổ ESI - MS của DTX1................................................................

54

Phổ ESI - MS của DTX2................................................................

54

Kết quả khảo sát DP của O A ...........................................................

55

Kết quả khảo sát DP của DTX1.....................................................

55

Kết quả khảo sát DP của DTX2.....................................................

55

Kết quả ion thứ cấp thu được khi bắn phá ion sơ cấp O A .............

56

Kết quả ion thứ cấp thu được khi bắn phá ion sơ c ấp DTX1........

56

Kết quả ion thứ cấp thu được khi bắn phá ion sơ c ấp D TX2........

56

Kết quả tối ưu hoá CE cho các ion thứ cấp....................................

57

Kết quả tối ưu hoá CXP cho các ion thứ cấp.................................

58

Sắc ký đồ chuẩn độc tố ở cùng tỷ lệ pha động sử dụng dung môi
là ACN (A,B) và MeOH (C,D).......................................................

60

Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ acid formic trong pha động
tới đáp ứng pic của các độc tố .........................................................

vill

61


Hình dạng pic khi phân tích trên cột Cortecs với pha động ACN
- H2O chứa 0,1% acid formic, rửa giải theo chương trình
gradient tại bảng 3.3........................................................................

62

Ảnh hưởng của amoni format tới hình dạng pic khi phân tích
trên cột Zorbax với pha động có tỷ lệ dung môi ACN - H2O
(35:65, tt:tt)......................................................................................

62

Ảnh hưởng của loại dung môi (A) và thể tích dung môi (B) tới
hiệu quả chiết các độc tố từ nhuyễn thể..........................................

66

Đánh giá ảnh hưởng của thời gian tới hiệu quả thuỷ phân dẫn
xuất ester của độc tố .........................................................................

77

Đánh giá độ đặc hiệu trên cột Cortecs............................................

86

Kết quả đáp ứng sắc ký của các độc tố tại LOQ với cột Cortecs...

93

Kết quả đáp ứng sắc ký của các độc tố tại LOD với cột Cortecs...

94

Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu trên cột Zorbax........................

95

Kết quả đáp ứng sắc ký của các độc tố tại LOQ với cột Zorbax...

106

Kết quả đáp ứng sắc ký của các độc tố tại LOD với cột Zorbax...

107

Một số sắc ký đồ khi phân tích bằng M S/M S................................

112

Kết quả phát hiện độc tố trên vẹm xanh.........................................

113

Kết quả phát hiện độc tố trên hàu...................................................

114

Kết quả phát hiện độc tố trên sò lông.............................................

115

Kết quả phát hiện độc tố trên sò huyết............................................

116

Tỷ lệ phát hiện độc tố theo loại nhuyễn th ể...................................

116

Kết quả phát hiện độc tố theo địa phương lấy m ẫ u ......................

118

Hình 3.31

Kếtquả phát hiện độc tố trong nhuyễn thể theo thời gian lấy
m ẫ u ..................................................................................................

Hình 4.1

120

Dao động vê tỷ lệ mẫu phát hiện có độc tố theo thời gian lấy
m ẫu....................................................................................................

x

134


ĐẶT VẤN ĐỀ
•

Vệ sinh an toàn thực phẩm là một trong những vấn đề có tầm quan trọng thường
trực cho việc đảm bảo chất lượng cuộc sống của cả cộng đồng và đang nhận
được sự quan tâm sát sao của toàn xã hội tại Việt Nam hiện nay. Trong lĩnh vực
này, nổi cộm hơn cả là việc thực phẩm bị “nhiễm bẩn” bởi các tác nhân gây hại
tới sức khỏe con người có nguồn gốc rất đa dạng, song tựu chung lại có thể
phân loại thành 2 nhóm lớn: Thứ nhất, đó là những chất độc hại nhiễm vào thực
phẩm do các hoạt động vô ý hay cố ý của con người, như lạm dụng thuốc bảo
vệ thực vật trong canh tác cây lương thực, thực phẩm, cây ăn quả, hay việc lạm
dụng kháng sinh, chất kích thích tăng trưởng trong nuôi trồng thủy sản, chăn

nuôi gia súc, hoặc những chất thải độc hại ngấm vào thực phẩm qua các hoạt
động khác của con người như sản xuất công nghiệp, xả thải công nghiệp, rác
thải sinh hoạt bừa bãi ra khí quyển, nguồn nước... Thứ hai là những độc tố mang
nguồn gốc tự nhiên xâm nhập, tích lũy trong thực phẩm, trong đó điển hình có
thể kể đến các độc tố vi nấm trong các loại hạt ngũ cốc, các độc tố vi tảo [13],
[88] và vi khuẩn trong các loại thủy hải sản, nhất là các loại nhuyễn thể. Trong
số các độc tố tự nhiên có thể tích lũy trong thực phẩm, cho tới nay những nghiên
cứu đã được công bố cho thấy các độc tố do các loài vi tảo hai roi sản xuất là
nguyên nhân gây ra rất nhiều hội chứng ngộ độc cho người. Khả năng gây độc
rất đa dạng, trong đó hay gặp nhất là các triệu chứng trên hệ thần kinh (gây tê
liệt, hôn mê, mất trí n h ớ . , có thể tử vong trong các vụ ngộ độc nghiêm trọng)
và hệ tiêu hóa (đau bụng, tiêu chảy, nôn mửa...), dẫn tới những vụ ngộ độc ở
quy mô khác nhau tại nhiều nơi trên thế giới [33], [133]. Trong các hội chứng
ngộ độc đường tiêu hóa do độc tố của vi tảo hai roi gây ra có hội chứng tiêu
chảy do ngộ độc thuỷ sinh vật vỏ cứng (Diarrhetic Shellfish Poisoning - DSP)
với tác nhân là nhóm độc tố gồm acid okadaic (OA) và các dẫn xuất gọi chung
là dinophysistoxin (DTX) [11].
Hiện tại ở Việt Nam, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã ban hành
Thông tư số 33/2015/TT-BNNVPTNT quy định về giám sát vệ sinh, an toàn
thực phẩm trong thu hoạch nhuyễn thể hai mảnh vỏ trong đó có quy định giới
hạn tổng của OA, các DTX và pectenotoxin (PTX) là 160 ppb [1]. Tuy nhiên,

1


việc đánh giá nguy cơ có mặt của các độc tố nhóm OA trong nhuyễn thể tại
Việt Nam vẫn chưa được thực hiện một cách có hệ thống, ngoại trừ một số
nghiên cứu khoanh vùng ở các khu nuôi thủy sảnnhư nghiên cứu của Viện
Nghiên cứu hải sản tiến hành ở 3 vùng nuôi ngao tập trung vào năm 2003 [5].
Bên cạnh đó, phương pháp chính thức hiện tại của TCVN 8341: 2010 [2] chỉ

cho phép xác định OA, không cho phép xác định các DTX, còn phương pháp
bán định lượng trên chuột (MBA) có thể cho kết quả dương tính cả với các
nhóm hợp chất thân dầu chưa ghi nhận có độc tính trên người như PTX,
yessotoxin (YTX). Do vậy, cần có phương pháp đặc hiệu hơn để xác định chính
xác OA và các DTX, thủ phạm chính gây hội chứng DSP. Để góp phầnđưa ra
các giải pháp phân tích đặc hiệu hơn, cũng như đánh giá toàn diện hơn sự có
mặt của độc tố nhóm OA trong nhuyễn thể tại Việt Nam, luận án: “NGHIÊN
CỨU XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘC TỒ GÂY TIÊU CHẢY ACID OKADAIC,
DINOPHYSISTOXIN-1, DINOPHYSISTOXIN-2 TRONG M Ộ T SỒ NHUYỄN
THỂ HAI M ẢNH VỎ Ở BIỂN VIỆT NAM BẰNG SẮC K Ý LỎNG KHỒI PHỔ "
được thực hiện nghiên cứu với 2 mục tiêu sau:
M ục tiêu 1: Xây dựng phương pháp định lượng các độc tố gây tiêu chảy acid
okadaic, dinophysistoxin-1, dinophysistoxin-2 bằng phương pháp sắc ký lỏng
khối phổ.
M ục tiêu 2: Xác định hàm lượng các độc tố kể trên trong một số nhóm nhuyễn
thể hai mảnh vỏ được lấy tại các vùng biển Việt Nam

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. ĐỘC TỐ SINH VẬT BIỂN
1.1.1. Nguồn gốc
Các loại hải sản đã từ lâu được con người coi là một nguồn thực phẩm lành mạnh
và được tiêu thụ ngày càng nhiều trên phạm vi toàn cầu. Tuy nhiên, cũng từ rất
sớm con người đã ghi nhận những trường hợp ngộ độc [64], thậm chí có thể dẫn
tới tử vong sau khi ăn hải sản. Cho tới nay, nguyên nhân gây ra ngộ độc cho người
đã được xác định là do các độc tố tồn tại trong hải sản mà con người tiêu thụ, còn
gọi là các độc tố sinh vật biển. Các nghiên cứu khoa học đã chứng tỏ rằng bản
thân các loại hải sản chứa độc tố gây ngộ độc cho người không sản xuất ra những

độc tố này mà tích luỹ độc tố do ăn thực vật phù du biển, trong đó có tảo độc. Một
số loài tảo có khả năng sinh độc tố, một số không sinh độc tố nhưng có khả năng
phát triển mạnh gây ra hiện tượng “tảo nở hoa” - algal bloom, có thể làm thay đổi
màu nước biển (hiện tượng “thuỷ triều đỏ”), làm chết hàng loạt sinh vật biển [56].
Những loài tảo mang một hoặc cả hai đặc tính này được gọi chung là tảo độc.
Trong các loài tảo độc, tảo đơn bào hai roi và tảo silic là nhóm tác nhân sản xuất
ra nhiều loại độc tố có khả năng gây ngộ độc cho người nhất. Tảo đơn bào hai roi
chính là tác nhân sản xuất ra độc tố gây tiêu chảy (hay hội chứng DSP) [148], độc
tố gây liệt cơ (hay hội chứng PSP - paralytic shellfish poisoning) [72], độc tố gây
độc thần kinh (hay hội chứng NSP - neurotoxic shellfish poisoning) [26], độc tố
gây hội chứng AZP (azaspiracid shellfish poisoning) [120], độc tố gây ngộ độc
khi ăn cá (hay hội chứng ciguatera) [146], và palytoxin analog [130]. Tảo silic là
tác nhân sản xuất ra độc tố gây mất trí nhớ (hay hội chứng ASP - amnestic shellfish
poisoning) [16]. Vi khuẩn lam là tác nhân gây ra các hội chứng PSP [15], hội
chứng ngộ độc tảo biển (seaweed poisoning) [90] và hội chứng ngộ độc rùa biển
(turtle poisoning) [99]. Một số loài vi khuẩn cũng đã được chứng minh là tác nhân
sản xuất ra tetrodotoxin (TTX) [143], một độc tố thần kinh có độc tính rất mạnh.
Độc tố do các tác nhân này sản xuất ra sẽ theo nhiều con đường khác nhau (chẳng
hạn như qua chuỗi thức ăn, qua phơi nhiễm trong môi trường sống) xâm nhập và
tích lũy vào trong cơ thể các loài hải sản mà con người tiêu thụ, qua đó gây ngộ
độc cho người. Tùy thuộc tính chất của từng nhóm độc tố, sự phân bố của các loại
hải sản theo khu vực địa lý cũng như đặc điểm hoạt động nuôi trồng, đánh bắt,

3


mỗi nhóm độc tố có thể gây phơi nhiễm trên người thông qua những loài hải sản
khác nhau. Ngộ độc TTX đã được ghi nhận khi tiêu thụ cá nóc [143], con so biển
[68]. Các hội chứng DSP [148], PSP [72], ASP [16], NSP [26] và AZP [120] xảy
ra chủ yếu khi tiêu thụ các loài hải sản vỏ cứng không xương sống (NT2MV, giáp

xác, v .v ...). Ngộ độc do hội chứng ciguatera xảy ra chủ yếu khi tiêu thụ một số
loài cá biển vùng nhiệt đới [146]. Hội chứng ngộ độc do tảo biển xuất hiện khi
tiêu thụ rau câu [90], trong khi hội chứng ngộ độc rùa biển xuất hiện khi ăn một
số loài rùa biển [99]. Trên đây mới chỉ là những hội chứng ngộ độc và độc tố gây
ảnh hưởng xấu tới sức khỏe con người nên được nghiên cứu, tìm hiểu kỹ. Ngoài
ra, còn nhiều trường hợp sinh vật biển bị ngộ độc ở quy mô khác nhau đã được
ghi nhận, nhất là trong những đợt “tảo nở hoa” [56]. Hiện tượng “tảo nở hoa” là
hiện tượng tự nhiên đã có từ thời xa xưa, khi con người chưa tác động nhiều đến
các hệ sinh thái ven biển. Khi điều kiện môi trường thuận lợi như ánh sáng, nhiệt
độ, độ mặn của nước b i ể n . , các quần thể tảo phát triển nhanh chóng, chứa hàng
triệu tế bào tảo trong một lít nước biển và có thể đổi màu nước biển. Tuy nhiên
các khảo sát mới đây cho thấy tần suất các đợt nở hoa tảo độc xuất hiện ngày càng
thường xuyên trên khắp thế giới, khả năng phơi nhiễm của con người với độc tố
sinh vật biển qua tiêu thụ hải sản, nhất là độc tố của tảo đơn bào, sẽ ngày càng
tăng lên. Điều này cũng dẫn tới việc kiểm soát độc tố của tảo đơn bào trong hải
sản được cơ quan quản lý các nước trên thế giới quy định ngày càng chặt chẽ.
Cũng vì lý do kể trên, luận án này lựa chọn các độc tố chính thuộc nhóm độc tố
gây tiêu chảy (DSP), một nhóm độc tố của tảo đơn bào, làm đối tượng nghiên cứu.
1.1.2. Tóm tắ t quá trìn h nghiên cứu m ột số nhóm độc tố tảo đơn bào gây độc
cho con người
Tảo đơn bào (có kích thước 20 - 200 |um) là thức ăn chính của một số động vật
nhuyễn thể như hàu, vẹm, trai, sò, ngao, ố c . Cho tới nay đã xác định được nhiều
loại tảo đơn bào là tác nhân sản sinh ra các hợp chất có thể tích lũy trong những
loại hải sản ăn tảo đơn bào và gây độc cho con người theo chuỗi thức ăn. Khi con
người ăn hải sản nhiễm các độc tố này có thể gây nên tình trạng ngộ độc kèm thể
hiện ra bằng các triệu chứng lâm sàng như tiêu chảy, liệt cơ, suy hô hấp, nặng có
thể mất trí nhớ, và có thể dẫn tới tử vong trong những trường hợp ngộ độc cấp
nghiêm trọng.

4

Được biết đến sớm hơn cả trong các chứng ngộ độc do độc tố sinh vật biển là
những tình trạng bệnh lý liên quan tới hệ thần kinh, do mức độ nghiêm trọng và
triệu chứng điển hình của chúng. Nhiều tài liệu đã ghi nhận hội chứng “ciguatera”
- được nhà sinh vật học Antonio Parra đặt tên năm 1787 khi ông nghiên cứu tình
trạng ngộ độc do loài ốc biển Cittarium pica gây ra ở vùng biển Caribe [156] với đặc điểm đặc trưng là các rối loạn về tiêu hóa, thần kinh và tim mạch xảy ra
ở vùng Ân Độ Dương (1601), Nam Thái Bình Dương (1774), Tân Caledonia
(1774) và vùng Polynesia thuộc Pháp (1792). Từ đầu thế kỷ 19, người ta bắt đầu
để ý ghi nhận hiện tượng thủy triều đỏ xuất hiện định kỳ ở vịnh Mexico và bờ
biển phía đông Florida, được biết đến như hiện tượng “thủy triều đỏ Florida”.
Trong thời gian diễn ra hiện tượng này, ăn nhuyễn thể có thể dẫn tới tình trạng
được gọi là chứng ngộ độc thần kinh do thuỷ sinh vật vỏ cứng (NSP) với các triệu
chứng thể hiện trên hệ tiêu hóa, thần kinh, tim mạch, và thậm chí phơi nhiễm với
hơi nước biển cũng có thể gây một hội chứng đường hô hấp. Tại châu Âu, từ năm
1689 đã có những mô tả khoa học về sự xuất hiện của chứng ngộ độc tê liệt do
thuỷ sinh vật vỏ cứng (PSP) [54].
Tuy nhiên, tác nhân thực sự gây ra những hiện tượng ngộ độc đó mới chỉ bắt đầu
được tìm ra và nghiên cứu một cách có hệ thống từ cuối thế kỷ 19, khi Taharain
phát hiện ra TTX, một loại độc tố có quan hệ chặt chẽ với hiện tượng ngộ độc khi
ăn một số loài cá nóc vào năm 1880 [64]. Sau đó, TTX cũng đã lần lượt được
phân lập từ nhiều loài sinh vật biển khác [95]. Hiểu biết của con người về “hội
chứng ciguatera” bắt đầu có những bước tiến đáng kể từ năm 1959, khi Randall
đưa ra giả thiết tác nhân gây ngộ độc được đưa vào chuỗi thức ăn do các loài cá
ăn thực vật đã tiêu thụ các loài vi tảo độc, rồi sau đó lại bị các loài cá ăn thịt lớn
hơn ăn [103]. Những tiến bộ mang tính đột phá đạt được bao gồm việc phát hiện
và phân lập được “ciguatoxin” (CTX) vào năm 1967 từ một loài tảo đơn bào hai
roi Gambierdiscus toxicus [88] tiết ra độc tố, xác định cấu trúc hóa học và các dẫn
xuất của CTX.
Nhóm độc tố là nguyên nhân gây ra bệnh NSP được phân lập vào thập niên 1970,

cấu trúc hóa học của chúng được xác định trong thập niên 1980. Nhóm độc tố này
do các loài tảo Karenia brevis tiết ra và được đặt tên là các “brevetoxin” [13].
Trong trường hợp của bệnh PSP, mối liên hệ chính xác giữa tình trạng ngộ độc

5


với các loài trai chỉ được thiết lập năm 1927, sau khi một đợt bệnh bùng phát ở
bờ biển miền trung California (Mỹ), làm 102 người mắc bệnh và 6 người tử vong.
Những nghiên cứu tiếp theo đã phát hiện ra nguyên nhân gây bệnh là loài tảo đơn
bào hai roi Alexandrium catenella và các độc tố chúng tiết ra. Những độc tố này
sau đó cũng lần lượt được phân lập, xác định cấu trúc, trong đó chất đầu tiên được
xác định là “saxitoxin”.
Gần đây nhất, vào năm 1987, một chứng ngộ độc thần kinh mới được ghi nhận
trên người sau khi ăn trai bị nhiễm acid domoic khai thác từ một khu nuôi ở bờ
biển phía đông đảo Hoàng tử Edward, Canada, làm 150 người ngộ độc, trong đó
có 4 trường hợp tử vong [144]. Căn bệnh này được gọi là mất trí nhớ do ngộ độc
thuỷ sinh vật vỏ cứng (ASP). Acid domoic ban đầu được phân lập từ loài tảo đỏ
Chondria armata ở miền nam Nhật Bản. Sau đợt bùng phát ASP năm 1987,
nghiên cứu cho thấy cả các loài tảo silic thuộc chi Pseudo-nitzschia cũng tiết ra
acid domoic [101].
So với hiểu biết về các độc tố tác động lên hệ thần kinh, việc khám phá ra các độc
tố gây nên triệu chứng tiêu chảy diễn ra gần đây hơn. Trường hợp tiêu chảy do
ngộ độc đầu tiên được ghi nhận liên quan tới tiêu thụ trai có độc xảy ra ở vùng
Easterscheldt tại Hà Lan năm 1961 [70]. Đợt bệnh tiếp theo bùng phát ở
Easterscheldt xảy ra năm 1971 với 100 người mắc bệnh. Ngoài ra, cũng có những
trường hợp tiêu chảy do ăn vẹm xanh lơ xảy ra ở Na Uy năm 1968. Đến năm 1976,
Yasumoto và cộng sự [151] lần đầu tiên mô tả chứng tiêu chảy do ngộ độc thuỷ
sinh vật vỏ cứng (DSP) trong một đợt dịch ngộ độc thức ăn bùng phát do ăn trai
và sò điệp ở vùng đông bắc Nhật Bản. Đồng thời, nhóm nghiên cứu của Yasumoto

cũng thiết lập mối liên hệ giữa căn bệnh DSP với một nhóm độc tố thân lipid, sau
này được gọi chung làđộc tố DSP, bao gồm OA và các dẫn xuất.
Năm 1995, trong một đợt bùng phát bệnh tiêu chảy do ngộ độc tại Hà Lan sau khi
ăn trai Ireland (Mytilus edulis), một nhóm độc tố mới được phát hiện và đặt tên là
azaspriracid (AZA) xuất phát từ cấu trúc hóa học của nhóm hợp chất này có một
dị vòng chứa nitơ và nhóm chức acid [110]. Các AZA gây nên ở người những
triệu chứng ngộ độc đường tiêu hoá rất giống với DSP và được gọi tên là hội
chứng AZP.

6


Trong những thập niên gần đây, sự bùng nổ của hoạt động nuôi trồng khai thác
hải sản, giao thông hàng hải và du lịch đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc lan tỏa
ra toàn cầu các tác nhân sản sinh ra độc tố như các loại tảo hai roi độc. Hiện tượng
sinh trưởng quá mức của các loài tảo (tảo nở hoa) diễn ra thường xuyên hơn, làm
tăng nguy cơ phơi nhiễm của con người với các loại hải sản (cá, nhuyễn thể...) bị
nhiễm độc. Để có cái nhìn cụ thể hơn về ảnh hưởng của các độc tố sinh vật biển,
luận án sẽ đi sâu vào độc tố nhóm DSP là nhóm chưa được nghiên cứu nhiều tại
Việt Nam.
1.2. NGUỒN GỐC, CẤU TRÚC HOÁ HỌC, ĐỘC TÍNH VÀ QUY ĐỊNH KIỂM
SOÁT ĐỘC TỐ DSP
1.2.1. Nguồn gốc độc tố DSP
Độc tố DSP do các loài tảo hai roi thuộc các chi Dinophysis spp. và Prorocentrum
spp. sản xuất ra. Trong các điều kiện môi trường thuận lợi, những loài tảo này có
thể phát triển mạnh về số lượng gây ra các đợt tảo nở hoa. Cho tới nay đã có
khoảng 10 loài tảo thuộc chi Dinophysis được xác nhận là có tạo ra các độc tố
DSP, gồm D.fortii [148], D.acuminata, D.acuta, D.mitra, D.norvegica (ở vùng
Scandinavia), D.rotundata [76], D.tripos [138], D.caudata [60], D.hastata [53]
và D.sacculus [48]. Ngoài ra các loài thuộc chi Prorocentrum gồm P.lima,

P.concavum và P.redfieldi cũng tạo ra độc tố DSP [138]. Việc tạo ra độc tố thay
đổi đáng kể giữa các loài tảo, cũng như giữa các kiểu hình tùy theo vùng và mùa
của cùng một loài. Chẳng hạn, D.fortii ở miền bắc Nhật Bản chứa hàm lượng độc
tố cao vào tháng 3 và tháng 6, nhưng cũng loài tảo này vào tháng 5 và tháng 7 lại
có độc tính rất nhẹ [53]. Một nghiên cứu đã công bố cho thấy mật độ tảo
Dinophysis ở mức 200 tế bào/lít nước biển đã có thể gây nhiễm độc tố trong
nhuyễn thể tới mức ảnh hưởng đến con người [22]. Nhóm độc tố này gây ra hội
chứng tiêu chảy - DSP, một bệnh đường tiêu hóa cấp tính lần đầu tiên được ghi
nhận tại Nhật Bản năm 1978 [147], gồm OA và các chất dẫn xuất được gọi chung
là DTX. OA được phân lập đầu tiên từ loài bọt biển Halichondria okadai vào năm
1981 [118] và được đặt tên theo tên của loài bọt biển này. Các DTX được đặt tên
theo chi Dinophysis gồm dinophysistoxin-1 (DTX1) và dinophysistoxin-2
(DTX2). DTX1 được phân lập năm 1982 [89] và là dẫn xuất của OA (acid 35(R)methyl okadaic), còn DTX2 được phân lập năm 1992 [62] và là đồng phân cấu

7


tạo của OA. Trong luận án sẽ gọi chung 3 độc tố OA, DTX1, DTX2 thành 1 nhóm
độc tố và nhóm có tên theo tên độc tố được phân lập đầu tiên là OA, “nhóm độc
tố OA”.
1.2.2. Cấu trú c hóa học độc tố DSP
Về bản chất, độc tố DSP đều là các polyether bền nhiệt và thân dầu, với 3 độc tố
chính là OA, DTX1 và DTX2. OA và các DTX có chung bộ khung cơ bản là một
polyether của một acid béo 38 carbon. OA được phân lập đầu tiên từ hai loài bọt
biển Halichondria okadai và H.melanodocia, có cấu trúc phân tử chứa 17 tâm
hoạt quang và cấu hình tuyệt đối đã được xác định năm 1981 (hình 1.1).
O H

H 3C

O H

O A

R i = C H 3

D T X i

R i = Ch

D T x

2

r

D T X

3

r

1= H
1, R 2 =

3

R 2 = H

R 3 = H

2= C H 3 (R ) R 3
2= C H (S ) R 3
( c H 3) R
= H (a c y l)
r

r

H

3

3

R

= H

r

= H

r

R

4

= H

4

= H

4=
4=

H
H

(a c y l)

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của OA và các D TX
Tại vị trí C19, OA có một epimer là 19-epi-OA phân cực hơn OA và có những
đặc tính sinh học khác biệt so với OA [30]. DTX1 được phân lập đầu tiên từ loài
M.edulis năm 1982 [89] và được xác định cấu trúc là dẫn xuất của OA có tên
(35(R)-methyl-OA) [150]. Đến năm 1992, DTX2 được phân lập từ trai Ireland và
được xác định cấu trúc là đồng phân cấu tạo của OA [62]. Cả OA, DTX1, DTX2
đều tồn tại ở cả dạng tự do lẫn dạng các dẫn xuất ester hóa, thường gặp nhất là ở
nhóm carboxyl ở đầu tận C1 và nhóm hydroxyl ở vị trí C7. Một nhóm dẫn xuất
ester được gọi là các diol ester của OA do nhóm carboxyl ở đầu tận C1 của OA
được ester hóa với một số diol không bão hòa để tạo các allylic diol ester.
Nhóm dẫn xuất ester thứ hai là hỗn hợp phức tạp của các dẫn xuất 7-O-acyl
ester của OA, DTX1 và DTX2 (các ester này còn được gọi là hỗn hợp “DTX3”).
Các DTX3 có thể là sản phẩm chuyển hóa của OA, DTX1, DTX2 tự do trong cơ

8