Nghiên cứu chế tạo hạt nano bạc và khả năng sát khuẩn của nó

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

Nguyễn Ngọc Hùng

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO HẠT NANO BẠC VÀ KHẢ
NĂNG SÁT KHUẨN CỦA NÓ

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC HỆ CHÍNH QUY
Ngành: Vật lý kỹ thuật

HÀ NỘI - 2011


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

Nguyễn Ngọc Hùng

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO HẠT NANO BẠC VÀ KHẢ
NĂNG SÁT KHUẨN CỦA NÓ

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC HỆ CHÍNH QUY
Ngành: Vật lý kỹ thuật

Cán bộ hướng dẫn: TS. Nguyễn Đức Quang

HÀ NỘI - 2011


Lời cảm ơn

Đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Đức Quang (Khoa
VLKT – ĐHCN – ĐHQGHN) và TS. Lê Anh Tuấn (Viện tiên tiến Khoa học và công
nghệ - ĐH Bách Khoa Hà Nội) đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian
vừa qua.
Em xin gửi lời cám ơn tới các anh chị trong Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh
học – ĐHQG Hà Nội đã chỉ bảo và tạo điều kiện thuận lợi nhất để em hoàn thí nghiệm.
Em cũng xin tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô và các anh chị khoa Vật lý kỹ thuật,
đặc biệt là GS. Lê Trần Bình, TS. Trần Đăng Khoa và TS. Hà Thị Quyến vì đã dạy
bảo và giúp đỡ em những lúc khó khăn.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè, những người luôn ủng
hộ và động viên em trong suốt thời gian vừa qua.

Hà Nội, Ngày 19/5/2011
Nguyễn Ngọc Hùng


Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình do tôi tự làm và nghiên cứu, các trích dẫn tôi
đều đã ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo. Nếu có bất kỳ vấn đề gì xảy ra, tôi xin chịu
hoàn toàn trách nhiệm
Người viết luận văn:
Nguyễn Ngọc Hùng


MỤC LỤC

Tóm tắt nội dung khóa luận ........................................................................................... - 1 Chương 1: TỔNG QUAN VỀ HẠT NANO BẠC VÀ ỨNG DỤNG CỦA CHÚNG
TRONG SINH HỌC....................................................................................................... - 2 1.1 Giới thiệu về công nghệ nano ............................................................................... - 2 1.1.1 Khái niệm và nguồn gốc của công nghệ nano ................................................ - 2 1.1.2 Cơ sở khoa học của công nghệ nano .............................................................. - 2 1.1.3 Ứng dụng của công nghệ nano trong sinh học và y học ................................. - 4 1.2 Hạt nano bạc .......................................................................................................... - 5 1.2.1 Giới thiệu về bạc kim loại............................................................................... - 5 1.2.2 Đặc tính kháng khuẩn của bạc ........................................................................ - 6 1.2.3 Cơ chế kháng khuẩn của bạc .......................................................................... - 6 1.2.4 Các phương pháp chế tạo hạt nano kim loại ................................................... - 8 1.2.5 Giới thiệu về hạt nano bạc .............................................................................. - 9 1.2.5.1 Các phương pháp phân tích hạt nano bạc .................................................... - 9 1.2.5.2 Ứng dụng của nano bạc ............................................................................. - 11 1.3 Sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn .......................................................... - 15 1.3.1 Đường cong sinh trưởng ............................................................................... - 15 1.3.1.1 Giai đoạn Tiềm phát (Lag phase) .............................................................. - 15 1.3.1.2 Giai đoạn logarit (Log Phase) hay Pha Chỉ số (Exponential Phase) ......... - 16 1.3.1.3 Giai đoạn tử vong (Death Phase) ............................................................... - 17 1.3.2 Xác định sự sinh trưởng của vi khuẩn .......................................................... - 17 1.3.2.1 Xác định số lượng tế bào .......................................................................... - 17 -

1.3.2.2 Xác định khối lượng tế bào ........................................................................ - 18 Chương 2: NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM .............................................................. - 20 2.1 Phương pháp chế tạo hạt nano bạc ...................................................................... - 20 2.1.1 Quy trình công nghệ chế tạo dung dịch nano bạc sử dụng kỹ thuật khử hóa học
với bức xạ UV kích thích. ...................................................................................... - 20 2.1.1.1 Hóa chất thí nghiệm sử dụng: .................................................................... - 20 2.1.1.2 Thiết bị sử dụng ......................................................................................... - 20 2.1.1.3 Quy trình tổng hợp ..................................................................................... - 20 2.1.2 Cơ chế hình thành hạt nano bạc .................................................................... - 22 2.2 Ảnh hưởng của nano bạc lên sự phát triển của vi khuẩn .................................... - 23 2.2.1 Phương pháp đo OD ..................................................................................... - 23 2.2.2 Các trang thiết bị ........................................................................................... - 24 2.2.3 Các bước tiến hành thí nghiệm ..................................................................... - 24 2.2.3.1 Chuẩn bị môi trường .................................................................................. - 24 2.2.3.2 Cấy vi khuẩn .............................................................................................. - 25 2.2.3.3 Đo OD ........................................................................................................ - 25 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................... - 26 3.1 Phân tích dung dịch nano bạc.............................................................................. - 26 3.2 Kết quả theo dõi sự phát triển của vi khuẩn khi có mặt của dung dịch nano bạc - 28 3.3 So sánh với phương pháp đo bán kính vòng vô khuẩn ...................................... - 34 Chương 4: KẾT LUẬN ................................................................................................ - 35 -


Tóm tắt nội dung khóa luận
Từ xa xưa, con người đã sử dụng bạc làm các dụng cụ chứa đồ ăn, nước uống để trị bệnh.
Trong chiến tranh thế giới thứ nhất, người ta thậm chí còn sử dụng các sản phẩm từ bạc
để điều trị nhiễm trùng trước khi thuốc kháng sinh ra đời. Ngày nay, cùng với sự ra đời
và phát triển của công nghệ nano, con người đã chế tạo được bạc ở kích thước nano. Điều
này làm tăng đáng kể số ứng dụng của bạc. Ở kích thước nano, bạc thể hiện khả năng
kháng khuẩn mạnh mà không gây ảnh hưởng tới con người và môi trường. Chính vì vậy,
giới khoa học đang đầu tư nghiên cứu bạc để phục vụ cho các ứng dụng trong y học, nhất
là khi hiện tượng vi khuẩn kháng kháng sinh ngày càng phổ biến như ngày nay.
Chính vì vậy, trong khóa luận này, chúng tôi tập trung vào các nhiệm vụ sau:
1. Nghiên cứu quy trình công nghệ và tham gia thử nghiệm chế tạo hạt nano bạc
2. Nghiên cứu ảnh hưởng của hạt nano bạc lên sự phát triển (khả năng ức chế sự phát
triển) của vi khuẩn gây bệnh đường ruột E. coli
3. Đánh giá hiệu quả ức chế của nano bạc với E. coli

-1-


Chương 1: TỔNG QUAN VỀ HẠT NANO BẠC VÀ ỨNG DỤNG CỦA CHÚNG
TRONG SINH HỌC
1.1 Giới thiệu về công nghệ nano
1.1.1 Khái niệm và nguồn gốc của công nghệ nano
Công nghệ nano là ngành công nghệ liên quan đến việc thiết kế, phân tích, chế tạo
và ứng dụng các cấu trúc, thiết bị và hệ thống bằng việc điều khiển hình dáng, kích thước
trên quy mô nanômét (nm, 1 nm = 10-9 m) [3]. Ở kích thước nano, vật liệu sẽ có những

tính năng đặc biệt mà vật liệu truyền thống không có được đó là do sự thu nhỏ kích thước
và việc tăng diện tích mặt ngoài.
Ý tưởng cơ bản về công nghệ nano được đưa ra bởi nhà vật lý học người Mỹ
Richard Feynman vào năm 1959, ông cho rằng khoa học đã đi vào chiều sâu của cấu trúc
vật chất đến từng phân tử, nguyên tử vào sâu hơn nữa. Nhưng thuật ngữ “công nghệ
nano” mới bắt đầu được sử dụng vào năm 1974 do Nario Taniguchi một nhà nghiên cứu
tại trường đại học Tokyo sử dụng để đề cập khả năng chế tạo cấu trúc vi hình của mạch vi
điện tử[4].
1.1.2 Cơ sở khoa học của công nghệ nano
Công nghệ nano dựa trên những cơ sở khoa học chủ yếu sau:
-

-

Chuyển tiếp từ tính chất cổ điển đến tính chất lượng tử: Đối với vật liệu vĩ
mô gồm rất nhiều nguyên tử, các hiệu ứng lượng tử được trung bình hóa với rất
nhiều nguyên tử (1 µm3 có khoảng 1012 nguyên tử) và có thể bỏ qua các thăng
giáng ngẫu nhiên. Nhưng các cấu trúc nano có ít nguyên tử hơn thì các tính
chất lượng tử thể hiện rõ ràng hơn.
Hiệu ứng bề mặt: Khi vật liệu có kích thước nm, các số nguyên tử nằm trên
bề mặt sẽ chiếm tỉ lệ đáng kể so với tổng số nguyên tử. Chính vì vậy các hiệu
ứng có liên quan đến bề mặt, gọi tắt là hiệu ứng bề mặt sẽ trở nên quan trọng
làm cho tính chất của vật liệu có kích thước nanomet khác biệt so với vật liệu ở
dạng khối.

-2-


-

Kích thước tới hạn: Các tính chất vật lý, hóa học của các vật liệu đều có một
giới hạn về kích thước. Nếu vật liệu mà nhỏ hơn kích thước này thì tính chất
của nó hoàn toàn bị thay đổi. Người ta gọi đó là kích thước tới hạn. Vật liệu
nano có tính chất đặc biệt là do kích thước của nó có thể so sánh được với kích
thước tới hạn của các tính chất của vật liệu[3].
Bảng 1: Độ dài tới hạn của một số tính chất của vật liệu[3].

Lĩnh vực

Tính chất

Độ dài tới hạn
(nm)
Tính chất điện Bước sóng điện tử
10-100
Quãng đường tự do trung bình không đàn hồi 1-100
Hiệu ứng đường ngầm
1-10
Tính chất từ
Độ dày vách đômen
10-100
Quãng đường tán xạ spin
1-100
Tính chất
Hố lượng tử
1-100
quang
Độ dài suy giảm
10-100
Độ sâu bề mặt kim loại

10-100
Tính siêu dẫn Độ dài liên kết cặp Cooper
0,1-100
Độ thẩm thấu Meisner
1-100
Tính chất cơ
Tương tác bất định xứ
1-1000
Biên hạt
1-10
Bán kính khởi động đứt vỡ
1-100
Sai hỏng mầm
0,1-10
Độ nhăn bề mặt
1-10
Xúc tác
Hình học topo bề mặt
1-10
Siêu phân tử
Độ dài Kuhn
1-100
Cấu trúc nhị cấp
1-10
Cấu trúc tam cấp
10-1000
Miễn dịch
Nhận biết phân tử
1-10

-3-


1.1.3 Ứng dụng của công nghệ nano trong sinh học và y học
Do có nhiều tính năng độc đáo và kích thước tương đương với các phân tử sinh
học nên hiện nay, công nghệ nano đang được đầu tư nghiên cứu đặc biệt là trong lĩnh vực
y sinh. Các ứng dụng tiêu biểu của công nghệ nano trong lĩnh vực này là:
-

-

Chẩn đoán: Sử dụng các hạt nano (hạt nano vàng, nano từ, chấm lượng tử…)
để đánh dấu các phân tử sinh học, vi sinh vật, phát hiện các chuỗi gen nhờ vào
cơ chế bắt cặp bổ xung của DNA hoặc cơ chế bắt cặp kháng nguyên – kháng
thể.
Vận chuyển thuốc: Cung cấp thuốc cho từng tế bào cụ thể bằng cách sử dụng
các hạt nano nhằm tiết kiệm thuốc và tránh các tác dụng phụ.
Mô kỹ thuật: Công nghệ nano có thể giúp cơ thể tái sản xuất hoặc sửa chữa
các mô bị hư hỏng bằng cách sử dụng “giàn” dựa trên vật liệu nano và các yếu
tố tăng trưởng[7].

Hình 1: Hạt nano vàng sử dụng trong truyền dẫn thuốc.
-4-


1.2 Hạt nano bạc
1.2.1 Giới thiệu về bạc kim loại
Cấu hình electron của bạc: 1s22s22p63s23p63d104s24p64d105s1
Bán kính nguyên tử Ag: 0,288 nm
Bán kính ion bạc: 0,23 nm

Bảng 2: Số nguyên tử bạc trong một đơn vị thể tích[14].

Kích thước của hạt
nano Ag (nm)

Số nguyên tử chứa
trong đó

1

31

5

3900

20

250000

Bạc nano là vật liệu có diện tích bề mặt riêng rất lớn, có những đặc tính độc đáo
sau[14]:
-

Tính khử khuẩn, chống nấm, khử mùi, có khả năng phát xạ tia hồng ngoại đi
xa, chống tĩnh.

-

Không có hại cho sức khỏe con người với liều lượng tương đối cao, không có

phụ gia hóa chất.

-

Có khả năng phân tán ổn định trong các loại dung môi khác nhau (trong các
dung môi phân cực như nước và trong các dung môi không phân cực như
benzene, toluene).

-

Độ bền hóa học cao, không bị biến đổi dưới tác dụng của ánh sáng và các tác
nhân oxy hóa khử thông thường.

-

Chi phí cho quá trình sản xuất thấp.

-

Ổn định ở nhiệt độ cao.
-5-


1.2.2 Đặc tính kháng khuẩn của bạc
Bạc và các hợp chất của bạc thể hiện tính độc đối với vi khuẩn, virus, tảo và nấm .
Tuy nhiên, khác với các kim loại nặng khác (chì, thủy ngân…) bạc không thể hiện tính
độc với con người.
Từ xa xưa, người ta đã sử dụng đặc tính này của bạc để phòng bệnh. Người cổ đại
sử dụng các bình bằng bạc để lưu trữ nước, rượu dấm. Trong thế kỷ 20, người ta thường
đặt một đồng bạc trong chai sữa để kéo dài độ tươi của sữa. Bạc và các hợp chất của bạc

được sử dụng rộng rãi từ đầu thế kỷ XIX đến giữa thế kỷ XX để điều trị các vết bỏng và
khử trùng[10].
Sau khi thuốc kháng sinh được phát minh và đưa vào ứng dụng với hiệu quả cao
người ta không còn quan tâm đến tác dụng kháng khuẩn của bạc nữa. Tuy nhiên, từ
những năm gần đây, do hiện tượng các chủng vi sinh ngày càng trở nên kháng thuốc,
người ta lại quan tâm trở lại đối với việc ứng dụng khả năng diệt khuẩn và các ứng dụng
khác của bạc, đặc biệt là dưới dạng hạt có kích thước nano.
1.2.3 Cơ chế kháng khuẩn của bạc

Hình 2: Tác động của ion bạc lên vi khuẩn.

-6-


Các đặc tính kháng khuẩn của bạc bắt nguồn từ tính chất hóa học của các ion Ag+.
Ion này có khả năng liên kết mạnh với peptidoglican, thành phần cấu tạo nên thành tế
bào của vi khuẩn và ức chế khả năng vận chuyển oxy vào bên trong tế bào dẫn đến làm tê
liệt vi khuẩn. Nếu các ion bạc được lấy ra khỏi tế bào ngay sau đó, khả năng hoặt động
của vi khuẩn lại có thể được phục hồi. Do động vật không có thành tế bào,vì vậy chúng ta
không bị tổn thương khi tiếp xúc với các ion này.
Có một cơ chế tác động của các ion bạc lên vi khuẩn đáng chú ý được mô tả như
sau: Sau khi Ag+ tác động lên lớp màng bảo vệ của tế bào vi khuẩn gây bệnh nó sẽ đi vào
bên trong tế bào và phản ứng với nhóm sunfuahydrin – SH của phân tử enzym chuyển
hóa oxy và vô hiệu hóa men này dẫn đến ức chế quá trình hô hấp của tế bào vi khuẩn[14].

Hình 3: Ion bạc vô hiệu hóa enzym chuyển hóa oxy của vi khuẩn

Ngoài ra các ion bạc còn có khả năng liên kết với các base của DNA và trung hòa
điện tích của gốc phosphate do đó ngăn chặn quá trình sao chép DNA[15].

Hình 4: Ion bạc liên kết với các base của DNA

-7-


1.2.4 Các phương pháp chế tạo hạt nano kim loại
- Phương pháp ăn mòn laze: Phương pháp này sử dụng chùm tia laze với bướ
sóng ngắn bắn lên vật liệu khối đặt trong dung dịch có chứa chất hoạt hóa bề mặt. Các hạt
nano được tạo thành với kích thước khoảng 10 nm và được bao phủ bởi chất hoạt hóa bề
mặt.
- Phương pháp khử hóa học: Phương pháp này sử dụng các tác nhân hóa học để
khử ion kim loại thành kim loại. Để các hạt phân tán tốt trong dung môi mà không bị kết
tụ thành đám, người ta sử dụng phương pháp tĩnh điện để làm cho bề mặt các hạt nano có
cùng điện tích và đẩy nhau hoặc dùng phương pháp bao bọc bằng chất hoạt hóa bề mặt.
Các hạt nano tạo thành bằng phương pháp này có kích thước từ 10 nm đến 100 nm.
- Phương pháp khử vật lý: Phương khử vật lí dùng các tác nhân vật lí như điện
tử, sóng điện từ năng lượng cao như tia gamm, tia tử ngoại, tia laser khử ion kim loại
thành kim loại. Dưới tác dụng của các tác nhân vật lí, có nhiều quá trình biến đổi của
dung môi và các phụ gia trong dung môi để sinh ra các gốc hóa học có tác dụng khử ion
thành kim loại.
- Phương pháp khử hóa lý: Đây là phương pháp trung gian giữa hóa học và vật
lí. Nguyên lí là dùng phương pháp điện phân kết hợp với siêu âm để tạo hạt nano.
Phương pháp điện phân thông thường chỉ có thể tạo được màng mỏng kim loại. Trước
khi xảy ra sự hình thành màng, các nguyên tử kim loại sau khi được điện hóa sẽ tạo các
hạt nano bàm lên điện cực âm. Lúc này người ta tác dụng một xung siêu âm đồng bộ với
xung điện phân thì hạt nano kim loại sẽ rời khỏi điện cực và đi vào dung dịch.
- Phương pháp khử sinh học: Dùng vi khuẩn là tác nhân khử ion kim loại. Người
ta cấy vi khuẩn MKY3 vào trong dung dịch có chứa ion bạc để thu được hạt nano bạc.
Phương pháp này đơn giản, thân thiện với môi trường và có thể tạo hạt với số lượng
lớn[6].

-8-


1.2.5 Giới thiệu về hạt nano bạc
Hạt nano bạc là các hạt bạc có kích thước từ 1 nm đến 100 nm. Do có diện tích bề
mặt lớn nên hạt nano bạc có khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với các vật liệu khối do
khả năng giải phóng nhiều ion Ag+ hơn.
Các hạt nano bạc có hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt. Hiện tượng này tạo
nên màu sắc từ vàng nhạt đến đen cho các dung dịch có chứa hạt nano bạc với các màu
sắc phụ thuộc vào nồng độ và kích thước hạt nano.
1.2.5.1 Các phương pháp phân tích hạt nano bạc
a) Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua
Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) hoạt động trên nguyên tắc giống thấu kính
quang học, chỉ khác là sử dụng sóng điện tử thay cho bước sóng ánh sáng nên có bước
sóng rất ngắn) và sử dụng các thấu kính điện từ - magnetic lens thay cho thấu kính quang
học[5].

Hình 5: Mô hình nguyên lý của TEM so với kính hiển vi quang học
-9-


Ảnh của kính hiển vi điện tử truyền qua cho phép ta quan sát được hình dạng và
xác định được kích thước của các hạt nano.

Hình 6: Ảnh TEM của các hạt nano bạc kích thước 10 nm[11].

b) Phân tích phổ UV-VIS
UV-VIS (Ultraviolet–visible spectroscopy) là phương pháp phân tích sử dụng phổ
hấp thụ hoặc phản xạ trong phạm vi vùng cực tím cho tới vùng ánh sáng nhìn thấy được.

Do các thuộc tính quang học của dung dịch chứa hạt nano phụ thuộc vào hình
dạng, kích thước và nồng độ của hạt, nên ta có thể sử dụng UV-VIS để xác định các
thuộc tính trên.

- 10 -


Hình 7: Ảnh UV-VIS của các hạt nano bạc[10].

Do hạt nao bạc có kích thước nhỏ hơn 20 nm chỉ có một bề mặt plasmon duy nhất
nên trong phổ UV-VIS của chúng chỉ xuất hiện 1 đỉnh duy nhất. Người ta xử dụng tính
chất này để xác định hình dạng của hạt nano bạc[12].
1.2.5.2 Ứng dụng của nano bạc
Do thể hiện tính kháng khuẩn tốt nên nano bạc thường được sử dụng để làm chất
khử trùng, kháng khuẩn, khử mùi… Có thể kể một vài sản phẩm chứa hạt nano bạc như:
-

Các dụng cụ chứa thực phẩm: Những đồ dùng bằng nhựa có pha thêm hạt
nano bạc có tác dụng khử trùng. Qua kiểm tra cho thấy chúng có khả năng diệt
99.9% vi khuẩn.

- 11 -


Hình 8: Bình sữa làm bằng nhựa có pha thêm nano bạc

-

Đồ may mặc: hạt nano bạc được tẩm vào các loại sợi để diệt khuẩn và khử
mùi.

Hình 9: Tất làm bằng sợi nilon có pha nano bạc
- 12 -


-

Các thiết bị điện tử: Điều hòa, tủ lạnh, máy giặt

Hình 10: Điều hòa sử dụng bộ lọc nano bạc

- Y tế:
+ Khẩu trang nano bạc: Được thiết kế với 3-4 lớp gồm 2 lớp vải, một lớp vật liệu
tẩm nano bạc và than hoạt tính ở giữa, loại khẩu trang này có khả năng diệt khuẩn, diệt
virus, lọc không khí rất tốt. Lớp vải tẩm nano bạc có chức năng diệt vi khuẩn, virus, nấm
bị giữ lại trên khẩu trang đồng thời có tác dụng khử mùi.

Hình11: Khẩu trang nano bạc do viện môi trường sản xuất

- 13 -


+ Sản xuất thuốc chữa bệnh

Hình 12: Các dược phẩm sử dụng nano bạc

+ Màng hô hấp: Đó là một tấm màng mỏng có thể cho khí và hơi nước qua nhưng
không thể cho chất lỏng đi qua, có vô số những lỗ khí nhỏ tồn tại trong tấm film. Các hạt
nano bạc gần đây đã được kết hợp với film polyolefin với đặc tính kháng khuẩn rất tốt.

Hình 13: Ảnh SEM của các hạt nano bạc kết hợp với film polyolefin

-

Các sản phẩm khác:

Hình 14: các sản phầm có chứa nano bạc
- 14 -


1.3 Sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn
1.3.1 Đường cong sinh trưởng
Sự sinh trưởng quần thể vi sinh vật được nghiên cứu bằng cách phân tích đường
cong sinh trưởng trong một môi trường nuôi cấy vi sinh vật theo phương pháp nuôi cấy
theo mẻ (batch culture) hoặc trong một hệ thống kín. Có nghĩa là vi sinh vật được nuôi
cấy trong một thiết bị kín, trong quá trình nuôi cấy không thay đổi môi trường và thời
gian nuôi cấy càng kéo dài thì nồng độ chất dinh dưỡng càng giảm sút, các chất phế thải
của trao đổi chất càng tăng lên. Nếu lấy thời gian nuôi cấy là trục hoành và lấy số logarit
của số lượng tế bào sống làm trục tung sẽ có thể vẽ được đường cong sinh trưởng của các
vi sinh vật sinh sản bằng cách phân đôi. Đường cong này có 4 giai đoạn (phases) khác
nhau[8].

Hình 15: Đường cong sinh trưởng trong hệ thống kín

1.3.1.1 Giai đoạn Tiềm phát (Lag phase)
Khi cấy vi sinh vật vào một môi trường mới số lượng thường không tăng lên ngay,
đó là giai đoạn Tiềm phát hay pha Lag. Trong giai đoạn này tế bào chưa phân cắt nhưng
thể tích và khối lượng tăng lên rõ rệt do có sự tăng các thành phần mới của tế bào.

- 15 -

Giai đoạn tiềm phát dài hay ngắn liên quan đến bản thân từng loại vi sinh vật và
tính chất của môi trường. Nếu tính chất hóa học của môi trường mới sai khác nhiều với
môi trường cũ thì giai đoạn tiềm phát sẽ kéo dài. Ngược lại, nếu cấy từ giai đoạn logarit
vào một môi trường có thành phần tương tự thì giai đoạn tiềm phát sẽ rút ngắn lại. Nếu
cấy vi sinh vật từ giai đoạn tiềm phát hay từ giai đoạn tử vong thì giai đoạn tiềm phát sẽ
kéo dài[8].
1.3.1.2 Giai đoạn logarit (Log Phase) hay Pha Chỉ số (Exponential Phase)
Trong giai đoạn này vi sinh vật sinh trưởng và phân cắt với tốc độ tối đa nếu gặp
môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp. Nhịp độ sinh trưởng của chúng là không thay
đổi trong suốt giai đoạn này, các tế bào phân đôi một cách đều đặn. Do các tế bào sinh ra
chỉ khác nhau rất ít cho nên đường cong sinh trưởng là một đường trơn nhẵn chứ không
gấp khúc Hình dáng của đường cong hầu như phản ánh tốc độ hấp thu chất dinh dưỡng
nhờ sự chuyển vận protein của vi sinh vật[8].

Hình 16: Nồng độ chất dinh dưỡng sinh trưởng
(a ) Ảnh hưởng của sự hạn chế chất dinh dưỡng đối với sản lượng chung của vi sinh vật.
Lúc nồng độ đủ cao thì sản lượng chung sẽ đạt tới ổn định.
(b)- Ảnh hưởng của sự hạn chế chất dinh dưỡng tới tốc độ sinh trưởng

- 16 -


1.3.1.3 Giai đoạn tử vong (Death Phase)
Việc tiêu hao chất dinh dưỡng và việc tích lũy các chất thải độc hại sẽ làm tổn thất
đến môi trường sống của vi sinh vật, làm cho số lượng tế bào sống giảm xuống. Đó là đặc
điểm của giai đoạn tử vong.
Giống như giai đoạn logarit, sự tử vong của quần thể vi sinh vật cũng có tính
logarit (tỷ lệ tế bào chết trong mỗi giờ là không đổi). Tổng số tế bào sống và tế bào chết

không thay đổi vì các tế bào chết chưa bị phân hủy. Muốn xác định số lượng tế bào sống
phải pha loãng ra rồi cấy lên thạch đĩa và đưa vào điều kiện thích hợp để xác định số
khuẩn lạc xuất hiện.
Mặc dầu phần lớn vi sinh vật tử vong theo phương thức logarit nhưng sau khi số
lượng tế bào đột nhiên giảm xuống thì tốc độ chết của tế bào chậm lại. Đó là do một số cá
thể sống lại nhờ có tính đề kháng đặc biệt mạnh. Vì điều này và những nguyên nhân khác
làm cho đường cong của giai đoạn tử vong có thể khá phức tạp[8].
1.3.2 Xác định sự sinh trưởng của vi khuẩn
1.3.2.1 Xác định số lượng tế bào
Phương pháp đơn giản nhất để xác định số lượng tế bào là đếm trực tiếp dưới kính
hiển vi. Dùng các phòng đếm để đếm vừa nhanh chóng, dễ dàng, lại rẻ tiền nhất, lại có
thể quan sát thấy kích cỡ và hình dáng tế bào.
Với tế bào vi khuẩn cần nhuộm màu hoặc là dùng kính hiển vi tương phản pha hay
kính hiển vi huỳnh quang (phase-constrast or fluoresence microscope) để dễ quan sát
hơn. Phòng đếm có cấu trúc để có một độ sâu nhất định lại có chia ra thành các ô nhỏ.
Khi đếm số lượng ta đưa dịch pha loãng vào phòng đếm, đậy lá kính (lamelle/ cover
glass) lên trên, sau đó tiến hành đếm số lượng dưới kính hiển vi.
Khuyết điểm của phương pháp này là không xác định được với các mẫu có số
lượng vi khuẩn quá nhỏ, độ chính xác cũng không cao vì không phân biệt được giữa tế
bào sống và tế bào chết[8].

- 17 -


Hình 17: Phòng đếm Petroff-Hauser:
(a)- Mặt nhìn nghiêng của phòng đếm
(b)- Giữa phiến kính có phòng đếm với các ô nhỏ
(c) Ở độ phóng đại khoảng x 400-500 tiến hành đếm số lượng vi
khuẩn trong các ô nhỏ.

1.3.2.2 Xác định khối lượng tế bào
Sự sinh trưởng của vi sinh vật không chỉ biểu hiện ở số lượng tế bào mà còn ở cả
sự tăng trưởng của tổng khối lượng tế bào. Phương pháp trực tiếp nhất là xác định trọng
lượng khô của tế bào. Trước hết cần ly tâm để thu nhận sinh khối tế bào. Sau đó rửa tế
bào rồi làm khô trong lò sấy rồi cân trọng lượng khô. Phương pháp này thích hợp để xác
định sự sinh trưởng của nấm. Phương pháp này tốn thời gian và không thật mẫn cảm. Đối
với vi khuẩn vì trọng lượng từng cá thể là rất nhỏ, thậm chí phải ly tâm tới vài trăm ml
mới đủ số lượng để xác định trọng lượng sinh khối khô.
Phương pháp nhanh hơn, mẫn cảm hơn là dùng phương pháp đo mật độ quang
(OD). Mức độ tán xạ ánh sáng tỷ lệ thuận với nồng độ tế bào. Lúc nồng độ vi khuẩn đạt
đến 107 tế bào/ml thì dịch nuôi cấy sẽ vẩn đục, nồng độ càng tăng thì độ đục cũng tăng
theo và làm cản trở ánh sáng đi qua dịch nuôi. Có thể đo độ tán xạ ánh sáng bằng quang
phổ kế (spectrophotometer). Ở một mức độ hấp thụ ánh sáng thấp, giữa nồng độ tế bào và
giá trị hấp thụ ánh sáng có quan hệ tuyến tính. Chỉ cần nồng độ vi sinh vật đạt tới nồng
độ có thể đo được là đều có thể dùng phương pháp đo OD trên quang phổ kế để xác định
sự sinh trưởng của vi sinh vật. Nếu hàm lượng một số vật chất trong mỗi tế bào là giống
- 18 -


nhau thì tổng lượng chất đó trong tế bào có tương quan trực tiếp với tổng sinh khối vi
sinh vật[8].

Hình18: Phương pháp đo OD

- 19 -