Phương pháp đo các gốc oxi hóa tự do

Trương đai hoc sư pham ky thuât tp.hcm
Khoa điên – điên tư
Bô môn : SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

PHƯƠNG PHÁP ĐO CÁC GỐC OXI HÓA TỰ DO
TRONG HỆ THỐNG SINH HỌC



Nguyễn Lê Gia Bách

Pham Thị Diễm My

16129008

16129039

Phan Thị My Loan 16129034

Dương Thanh Toàn
16129073

Dương Thị Kiêu Oanh
16129050


I. Gốc tự do


I.1 Định nghĩa

Gốc tự do là các nguyên tử, phân tử hoặc ion có các điện tử lẻ đôi ở vòng ngoài nên mang điện tích âm và có khả năng
ôxy hóa các tế bào, các phân tử, nguyên tử khác.

Do bị mất điện tử nên gốc tự do rất không ổn định và luôn có xu hướng chiếm đoạt điện tử từ các cấu trúc lân cận,
tạo ra hàng loạt gốc tự do mới. Hậu quả là xuất hiện những biến đổi làm tổn hại, rối loạn chức năng, thậm chí gây
chết tế bào.


I.2 Nguyên nhân

Nội sinh
Ngoại sinh
(phát: sinh do các tác động từ môi trường sống):
- Từ
chuỗi
chuyền
điện
trongsinh
ty thể
(cáctựphản
ứng
hóa
của mitochondria):
superoxide
anion
Các
yếu
tố môi
trường
táctửđộng

ra gốc
do: có
rấtphosphoryl
nhiều như oxy
tia tử
ngoại
(UV), các loại bụi
kim loại, khói
(O2●),
peroxynitrate
(ONO-),
hydrogen
peroxide
(H2O2),
gốcđường
hydroxyl
Các
gốcnghiệp
tự do
luôn
hình
thành
nhiều
con
nhau,phụ
được
2 thực phẩm,
thuốc lá,
bụi, khói
công

(khóiđược
thải từ
nhà
máy,từ
xe,…),
thuốc
trừ
sâu,khác
các(●OH).
chất
gia,chia
chấtthành
bảo quản
Từ hoạt
động
hô
hấp
leucocyte,
gốc
tự docác
hình
thành
để giết
vi khuẩn.
thức ăn -nước
uống
cónội
chứa
nấm
mốc,

độc tố vi
khuẩn,
chất
phóng
xạ, các
hành vi, thói quen cá nhân như hút
loại:
sinh
vàcủa
ngoại
sinh.
  Từrượu,
quá trình
tự chết
củaloại
tế bào
(apoptosis):
bằng in vitro, người ta thấy chất oxy hóa nội sinh AXO có thể
thuốc,  uống
ăn uống
nhiều
đồ ăn
sinh axit, v.v….
ngăn trở apoptosis.


I.3 Cấu trúc

Phân tử gồm một số nguyên tử dính với nhau do tác dụng của các cặp đôi điện tử (electron). Vì một lý do nào đó, một điện tử
bị tách rời khỏi nhóm nên phân tử có số điện tử lẻ và khi đó được coi là một gốc tự do.

I.4 Đặc điểm

•

Tính bất ổn: do bị thiếu một điện tử (electron) nên gốc tự do thường rất bất ổn, dễ dàng tạo ra các

phản ứng hóa học.

•

Tính dễ chiếm đoạt: xu hướng luôn tìm mọi cách để “chiếm đoạt” điện tử từ các phân tử khác để bù

đắp vào sự thiếu hụt của mình.

•

Có xu hướng đạt tới sự ổn định: luôn có khuynh hướng đạt tới sự ổn định và có thời gian tồn tại rất

ngắn, hoạt tính rất mạnh. Gốc tự do tồn tại càng ngắn thì độc tính càng cao.


I.5 Tác hại

Lượng mỗi tế bào trong cơ thể chúng ta phải hứng chịu khoảng 10.000 gốc tự do tấn công mỗi
ngày. Trải qua 70 năm cuộc đời, cơ thể hình thành ước chừng đến 17 tấn gốc tự do

Các chất cấu tạo và các cơ quan trong cơ thể bị ảnh hưởng bởi gốc tự do :

•
•
•

Màng tế bào, protein và mỡ
Mô mỡ
Các acid nucleic cơ bản (adenine, thymine, guanine và cytosine)


I.6.1 ROS ngoại sinh

ROS ngoại sinh có thể được tạo ra từ chất ô nhiễm, thuốc lá, khói bụi, các chất độc hóa học hoặc
phóng xạ.

Các phóng xạ ion hóa có thể phản ứng với nước và gây nên tổn thương ngay lập tức cho sinh vật,
một quá trình được gọi là sự phân ly do phóng xạ. Vì nước chiếm tới 55-60% cơ thể nên khả năng
xảy ra sự phân ly do phóng xạ là rất cao trong trường hợp có sự hiện diện của các phóng xạ ion hóa.
Trong quá trình này, nước bị mất một electron và trở nên rất hoạt động.


I.6.1 ROS nôi sinh

ROS nội bào được sản xuất từ nhiều nguồn khác nhau, các nguồn chính gồm có ti thể, peroxisome,
hệ võng nội bào và phức hợp NADPH oxidase (NOX) ở màng tế bào.


I.7 Vai trò của ROS

Không chỉ liên quan đến sự chết theo chương trình của tế bào mà còn tạo ra các kháng thể
trong cơ thể và khởi động các bơm ion. Điều này làm ROS trở thành 1 chất kiểm soát chức năng của

tế bào. Đặc biệt, các tiểu cầu tham gia vào việc làm lành vết thương và duy trì cân bằng của máu
tiết ra ROS để tạo thêm các tiểu cầu mới tại vị trí vết thương. Chúng cũng nói lên sự liên quan đến
các đáp ứng miễn dịch thông qua việc tạo mới thêm các bạch cầu.


I.7 Vai trò của ROS

ROS cũng liên quan đến các hoạt động của tế bào trước mỗi đáp ứng viêm khác nhau.


•

Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH

•

Phương pháp thu hoạt tính ức chế gốc tự do NO

•

Phương pháp đo MDA

II. Phương pháp xác định
hoat tính chống oxi hóa


II.1 DPPH

Nguyên tắc:
Các chất có khả năng kháng oxy hoá sẽ trung hoà gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm

độ hấp thụ tại bước sóng cự đại và màu của dung dịnh phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang
vàng nhạt.

Phương trình phản ứng :


II.1 DPPH

Hạn
chế:
Ưu điểm

••
•

Ưu điểm, han chế và tính ổn định

Do DPPH
tương
tácphản
cơ bản
các bộ
gốc
khác
vàthời
đường
congđịnh
đáptrong
ứngphương
thời gian.

DPPH được
phép
ứng với
với toàn
mẫu
và đủ
gian nhất

của
phương
pháp
DPPH
Phương
pháp
DPPH
cóđểnhững
hạn
chếngay
trong
việc
phản
ánh
pháp này cho
phép
DPPH
phản ứng
chậm
cả với
chất
chống

oxycác
hóaphân
yếu . vùng của
chất
oxy sử
hóa
trong
các
thống
nhũcơ
tương
vàdịch
không
làphân
hữu cực
íchvà
để
DPPH chống
có thể được
dụng
trong
cáchệ
dung
môi hữu
và dung
nướcphải
không
đo lường các hoạt động chống oxy hóa của huyết tươngDPPH là nhạy cảm với
có thể được sử dụng để kiểm tra cả hai chất chống oxy hóa ưa nước và ưa mỡ.

•
•

một số căn cứ Lewis và các loại dung môi cũng như oxy.
Có độ chính xác cao , dễ dàng và kinh tế.
Độ hấp thụ của DPPH trong methanol và acetone giảm dưới ánh sáng


II.2 Ức chế gốc tự do NO
Hóa chất – dụng cụ:
Dung dịch natri nitroprussid 10 mM: pha trong đệm phosphat pH 7.4 (20 mM) trước khi tiến hành thí nghiệm và được
bảo quản trong chai tối màu.
Thuốc thử Greiss :bao gồm 2 dung dịch A và B:
+ Dung dịch A: sulfanilamide 2% trong acid phosphoric (H3PO4) 4%.
+ Dung dịch B: N-(1-napthyl)-ethylendiamin 0.2% trong nước cất.
Hai dung dịch này được trộn với cùng tỉ lệ thể tích trước khi thí nghiệm.
Quercetin và các hợp chất thử nghiệm được cô lập từ hoa cúc trắng, độ tinh khiết của các chất này được xác định
theo phương pháp HPLC.
Máy UV-Vis.


II.2 Ức chế gốc tự do NO

Cơ sở phương pháp
Natrinăng
Khả
nitroprussid
ức chế gốc
bị phân
tự dohủy

NO dưới
đượcánh
xác sáng
định sinh
dựa ra
trên
gốcphần
tự do
trăm
NO.ức
Trong
chế Idung
(%). Từ
dịchđó,
nước,
ta tính
NOđược
sinh ra
giásẽtrị
phản ứng
IC50,
đại lượng
với oxy
đánh
tạo giá
thành
khảsản
năng
phẩm
ức chế

bềnmạnh
vững hay
là nitrit
yếu và
củanitrat.
các hoạt
Khi mẫu
chất,có
IC50
hoạt
(Inhibitory
chất ức chế
concentration)
NO, thì hoạtđược
chất sẽ
định
nghĩa
phản
là ứng
nồngcạnh
độ của
tranh
một
vớimẫu
oxy,mà
kếttại
quả
đólàm
nó có
giảm

thểnồng
ức chế
độ được
nitrit 50%
tạo thành
gốc tựtrong
do NO.
dung
Đểdịch.
có cơDựa
sở đánh
trên sự
giá
giảm tính
hoạt
hàmcủa
lượng
những
nitritmẫu
tạo chất
thành
khảo
củasát,
mẫuchúng
có hoạt
ta sử
chất
dụng
ức chế
quercetin

NO so và
vớiacid
mẫucaffeic
khônglàm
có hoạt
chất đối
chấtchứng
ức chếđểNO
so
(mẫu control),
sánh,
vì đây là những
ta tính chất
đượccókhả
hoạt
năng
tínhứcmạnh
chế gốc
đốitự
vớido
gốc
NOtựcủa
do hoạt
NO được
chất.sử
Hàm
dụng
lượng
làmnitrit
chất đối

tạo chứng
thành được
trong xác
các
định
tài
liệu
dựa
tham
trênkhảo.
phản ứng lên màu với thuốc thử Greiss tại bước sóng 540 nm.


II.3 Do MDA

MDA Phương
(Malonyl dialdehyde)
là ứng
sản phẩm
trình phản
: cuối cùng của quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào nên
được áp dụng rộng rãi trong thực tế để nghiên cứu quá trình peroxy hóa lipid của màng tế bào. Nguyên
tắc MDA được sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, khi cho phản ứng với acid
thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử acid thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu
cực đại ở bước sóng 532 nm, phản ứng được thực hiện ở môi trường pH bằng 2-3, nhiệt độ là 90-100 độ C
trong thời gian từ 10 đến 15 phút. Dựa trên sự giảm cường độ hấp thu của phức ta tính được khả năng
kháng oxy hóa của chất cần nghiên cứu.


•

Phương pháp xác định trực tiếp

•

Các phương pháp dấu vân tay

•

Đo các tổn thương của AND

III. Các phương pháp xác định gốc tự do


III.1.1 ESR và bẫy Spin
Quang
Bẫy spin
: phổ cộng hưởng ESR là kỹ thuật duy nhất xác định các gốc tự do, còn gọi là cộng hưởng thuận từ electron (ESP).
ESR đặc hiệu với các gốc tự do vì phương pháp này phát hiện sự có mặt của các electron độc thân.

DVPO (5,5-DimethVipyrroline-Noxide)

PBN ( [alpha]-phenyl-t-butyl nitrone)


III.1.2 Phát hiên gốc hydroxyl

3.1.2.1- Hydroxyl hóa các hợp chất thơm
Sản phẩm ban đầu của sự tấn công OH’ trên các hợp chất thơm là các gốc tự do và cuối cùng tạo ra các sản phẩm
hydroxyl hóa. Phản ứng hydroxyl hóa các “hợp chất thơm” đã được sử dụng để phát hiện OH’ bằng cách đo các sản phẩm

hydroxyl tạo thành. Chúng có thể được đo bằng các thiết bị đo màu, nhưng các phản ứng tạo màu thường không thể phát
hiện tất cả các dạng đồng phân hydroxyl và do đó là phương pháp bán định lượng.

Phương pháp sắc ký khí (GC)

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)


III.1.2 Phát hiên gốc hydroxyl

3.1.2.2- Phương pháp deoxyribose

Sự tấn công của OH’ vào phần tử dương 2-deoxyribose tạo ra rất nhiều sản phẩm khác nhau. Một số mảnh sản
phẩm khi bị đun nóng ở nhiệt độ cao sẽ bị phân hủy tạo thành dạng


III.1.3Phát hiên gốc Superoxide

Tuy nhiên, nhiều chất khác cũng có thể khử cytochrom c (đặc biệt ascorbate và các thiol) cản trở việc phát hiện
Ngoài bẫy spin, DMPO kết hợp với ESR là một phương pháp phát hiện Oxi hiệu quả (mục 2.1.1), các bẫy spin
O2. Khắc phục bằng việc sử dụng một điện cực *O~2 để đo sự khử cytochrom c. Thông thường thêm SOD để thấy
khác cũng được sử dụng. Những chất phát hiện có khả năng huỳnh quang như lucigenin được sử dụng rộng rãi để
dự khử gián tiếp của *O~2. Sự khử NBT diễn ra phức tạp hơn, và *O~2 có thể được sinh ra trong quá trình khử. Do
phát hiện sự tạo thành *cr2 bởi các thực bào, nhưng dễ tạo ra sự giả mạo.
vậy, việc thêm NBT vào một hệ sinh học không tạo ra *O~2 nhưng có thể khử NBT có thể tạo ra sự phát sinh *O~2.
Thông thường, *cr2 được phát hiện bởi khả năng khử cytochrome c hoặc nitrobirtue tetretojium (NBT). Về mặt hóa
Một số phương pháp dễ phát hiện *O~2 trong mô: ví dụ làm ngập mô với muối tetrazolium có thể dẫn tới tạo kết
học, phản ứng khử cytochrome c đơn giản hơn phản ứng khử NBT.
tủa formazan quan sát được dưới kính hiển vi tại vị trí mô sinh ra *O~2.

III.1.4Phát hiên nitric oxide NO’