Ứng dụng công nghệ sinh học xử lý rác hữu cơ phục vụ sản xuất nông nghiệp, tỉnh sóc trăng (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC
Mã ngành: 62 42 01 07

MAI THI

ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC XỬ LÝ RÁC
HỮU CƠ PHỤC VỤ SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP
TỈNH SÓC TRĂNG

Cần Thơ, 2018


CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN HỮU HIỆP
Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường
Họp tại: ……………………………………, Trường Đại học Cần Thơ
Vào lúc …. giờ …. ngày …. tháng …. năm ….

Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:


DANH MỤC LIỆT KÊ CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ
1. Mai Thi, Nguyễn Hữu Hiệp, (2013). "Phân lập vi khuẩn phân hủy
cellulose từ con sùng (Holotrichia paralella)". Kỷ yếu Khoa học

Hội thảo Công nghệ Sinh học vùng Đồng bằng sông Cửu Long, Đại
Học Cần Thơ, 2013.
2. Mai Thi va Nguyen Huu Hiep, (2015). "Isolation and
characterization of cellulose bacteria in organic waste in Soc
Trang province, Vietnam". The 6th International Conference on
Fermentation Technology for Value Added Agricultural Products
(The 6th FerVAAP Conference), Khon Kaen, Thailand".
3. Mai Thi, Nguyễn Hữu Hiệp và Nguyễn Diệp Minh Tân, (2016).
"Phân lập và nhận diện vi khuẩn phân giải cellulose trong rác
hữu cơ ở tỉnh Sóc Trăng". Tạp chí Tài Nguyên và Môi trường
(ISSN 1859-1477), số 21. Trang 129-131.
4. Mai Thi, Nguyễn Hữu Hiệp, Diệp Tuấn Anh, Lê Minh Hiếu và
Huỳnh Tấn Thanh. (2016). "Ứng dụng chế phẩm sinh học
STBacilli trong xử lý rác hữu cơ". Tạp chí Tài Nguyên và Môi
trường (ISSN 1859-1477), số 21. Trang 125-128.
5. Mai Thi, Nguyễn Hữu Hiệp. (2017). "Phân lập và nhận diện vi
khuẩn phân giải protein từ sùng và trùn đất" Tạp chí Tài Nguyên
và Môi trường ISSN 1859-1477 số 16. Trang 40-42.
6.

Mai Thi, Nguyễn Hữu Hiệp và Dương Ngọc Thúy. (2017). "Phân
lập vi khuẩn phân hủy cellulose từ con sùng (Holotrichia
paralella) và Trùn đất (Lubricus terrestris)". Tạp chí Đại Học Cần
Thơ ISSN 1859-2333; Tập 50, phần B. Trang 81-90.


Chương I. GIỚI THIỆU
1.1 Tính cấp thiết của luận án
Cùng với sự gia tăng số lượng và quy mô các ngành nghề sản xuất,
sự hình thành các khu dân cư tập trung, nhu cầu tiêu dùng hàng hoá,

nguyên vật liệu và năng lượng ngày càng tăng. Những sự gia tăng đó đã tạo
điều kiện kích thích các ngành sản xuất, kinh doanh và dịch vụ mở rộng và
phát triển nhanh chóng, đóng góp tích cực cho sự phát triển kinh tế - xã hội
của đất nước. Tuy nhiên, song song với sự phát triển mạnh mẽ là sự phóng
thích một lượng lớn chất thải vào môi trường, đặc biệt là chất thải rắn như
chất thải sinh hoạt, chất thải công nghiệp, chất thải y tế, chất thải nông
nghiệp, chất thải xây dựng, chất thải nguy hại… Hiện nay, ô nhiễm môi
trường đang là vấn đề cấp bách trên mỗi quốc gia và có rất nhiều phương
án để khắc phục, giảm thiểu hậu quả của ô nhiễm môi trường. Rác thải sinh
hoạt tại Việt Nam, nhất là tại các thành phố lớn chủ yếu được xử lý thô sơ
bằng cách vùi tại các bãi chôn lấp, có nguy cơ gây ô nhiễm không khí và
nguồn nước ngầm. Tỉnh Sóc Trăng hàng ngày có hơn 248,2 tấn rác thải;
hiện nay tỉnh chưa có quy trình công nghệ xử lý rác đạt yêu cầu mà chủ
yếu chỉ đổ vào bãi rác hở chờ phân hủy tự nhiên, vừa chiếm diện tích lớn
vừa mất vệ sinh tạo nên những điểm nóng ô nhiễm môi trường nghiêm
trọng. Chính điều này tác động lớn đến môi trường xung quanh, là nguy cơ
tiềm ẩn những dịch bệnh cho con người và làm cho môi trường ngày càng
ô nhiễm. Từ những lý do trên, đề tài nghiên cứu “Ứng dụng công nghệ sinh
học xử lý rác hữu cơ phục vụ sản xuất nông nghiệp, tỉnh Sóc Trăng” góp
phần bảo vệ môi trường hướng đến phát triển bền vững kinh tế - xã hội đi
đôi với bảo vệ môi trường đã được thực hiện.
1.2 Mục tiêu của đề tài
Phân lập và chọn lọc các dòng vi khuẩn bản địa để xử lý rác hữu
cơ và ứng dụng phân hữu cơ vi sinh trong sản xuất nông nghiệp tỉnh Sóc
Trăng.

1


Chương II. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Luận án được thực hiện từ tháng 08/2013 đến tháng 12/2016 tại
Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học và phòng thí
nghiệm chuyên sâu của trường Đại học Cần Thơ; phòng thí nghiệm Hóa
Sinh thuộc Trung tâm Quan trắc Tài nguyên và Môi trường tỉnh Sóc
Trăng; các bãi rác trên địa bàn tỉnh Sóc Trăng như bãi rác thị trấn Đại
Ngãi (huyện Long Phú), bãi rác thị trấn Trần Đề (huyện Trần Đề), bãi
rác thị trấn Kế Sách (huyện Kế Sách) và bãi rác xã Tân Long (huyện
Ngã Năm) và trang trại của Ông Phạm Hữu Lai (ấp Thạnh An 3, xã
Thạnh Thới Thuận, huyện Trần Đề, tỉnh Sóc Trăng).
2.2. Phương tiện nghiên cứu
2.2.1 Vật liệu
Ba mẫu rác hữu cơ và ba mẫu nước rỉ rác được thu từ mỗi bãi rác
ở các huyện Trần Đề, Kế Sách và Ngã Năm thuộc tỉnh Sóc Trăng. Mẫu
được lưu trữ trong chai thủy tinh vô trùng, trữ ở 4ºC đến khi sử dụng.
Các mẫu sùng gồm 12 con có trọng lượng từ 2,5 g đến 15 g và các
mẫu trùn đất gồm 12 con có trọng lượng từ 3 g đến 11 g được thu thập
từ những đóng rơm đang hoai mục ở huyện Ngã Năm, tỉnh Sóc Trăng.
Những mẫu sùng đất và trùn đất được trữ trong thùng có chứa đất mùn
hơi ẩm và rơm hoai mục làm thức ăn cho đến khi sử dụng.
2.2.2 Thiết bị và dụng cụ
Luận án sử dụng các thiết bị và dụng cụ hiện có tại Viện Nghiên
cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học và phòng thí nghiệm Chuyên sâu
thuộc trường Đại học Cần Thơ và Trung tâm Quan trắc Tài nguyên và
Môi trường tỉnh Sóc Trăng.

2

2.2.3 Hóa chất và môi trường
Hóa chất khử trùng bề mặt mẫu sùng đất và trùn đất; chất kháng
nấm cycloheximide; thuốc thử lugol; thuốc thử Methyl red; hóa chất
nhuộm Gram, hóa chất nhuộm bào tử; ...
Môi trường sử dụng trong luận án gồm có môi trường phân lập
các dòng vi khuẩn phân hủy cellulose, tinh bột và protein; môi trường
LB (Luria Broth); môi trường xác định hoạt tính enzyme cellulase, ...
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phân lập vi khuẩn
Mẫu rác và nước rỉ rác được pha loãng mẫu với các độ pha loãng
10 , 10-2, 10-3, 10-4 và 10-5. Sau đó trải đều 0,1 mL mẫu ở các nồng độ
lên môi trường phân lập vi khuẩn bằng que trải thủy tinh. Sau đó đậy
nắp, úp ngược và ủ hiếu khí ở 30oC trong 72 giờ. Đối với sùng và trùn
đất, mẫu được rửa sạch bằng nước cất, khử trùng bề mặt bằng cồn 70o
trong 5 phút sau đó bằng H2O2 3% trong 5 phút, mổ lấy ít ruột (khoảng
một vòng que cấy) trải đều lên môi trường phân lập bằng que trải thủy
tinh, ủ ở 30ºC trong 72 giờ ở điều kiện hiếu khí (Shengwei et al., 2012;
Kumar et al., 2012). Khi khuẩn lạc phát triển, chọn những khuẩn lạc rời
rạc để tách ròng bằng phương pháp cấy ria trên môi trường phân lập.
-1

2.3.2 Quan sát đặc điểm hình thái và sinh hóa của vi khuẩn
Các đặc điểm của khuẩn lạc vi khuẩn (hình dạng, độ nổi, dạng bìa,
màu sắc và kích thước) được ghi nhận trong suốt quá trình phân lập.
Phương pháp nhuộm Gram và đo kích thước tế bào vi khuẩn dựa theo
Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp (2002). Phương pháp xác định
khả năng di động và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn dựa theo Nguyễn
Lân Dũng (2006).
Phương pháp xác định khả năng sinh acid của vi khuẩn trong môi
trường có sự hiện diện của glucose và khả năng sinh catalase của vi

khuẩn dựa theo Nguyễn Lân Dũng (2006).
3


2.3.3 Khảo sát khả năng phân hủy cellulose, tinh bột và protein
Phương pháp giếng thạch được dùng để chọn ra những dòng vi
khuẩn có khả năng phân hủy cellulose, tinh bột và protein dựa vào
đường kính vòng sáng phân hủy cơ chất xung quanh khuẩn lạc trên môi
trường phân lập (môi trường CMC, tinh bột và skim milk). Khả năng
phân hủy cơ chất (E) được đánh giá qua hiệu số giữa đường kính vòng
sáng phân hủy (D) và đường kính khuẩn lạc (d) phát triển từ giếng
(E=D-d). Giá trị E càng lớn thì vi khuẩn phân hủy cơ chất càng mạnh
(Saini et al., 2012; Alariya et al., 2013 and Kazanas, 1968).
2.3.4 Xác định hoạt tính cellulase
Cellulase phân hủy CMC (hoặc cellulose) giải phóng đường khử.
Hoạt tính của enzyme cellulase là lượng đường khử sinh ra (µmol) trong
1 phút dưới hoạt động xúc tác của 1 mL enzyme này ở pH 5 và nhiệt độ
phòng (Nelson, 1944). Hoạt tính endoglucanase được xác định khi cho
enzyme phản ứng với cơ chất CMC trong khi hoạt tính exoglucanase
được xác định khi cho enzyme phản ứng với cơ chất bột cellulose (LiJung et al., 2010).
2.3.5. Xác định hoạt tính amylase
Amylase phân hủy tinh bột tạo đường khử. Hoạt tính enzyme
amylase được xác định dựa vào nồng độ đường khử sinh ra thông qua
phản ứng trung gian với thuốc thử đồng và asenomolybdate. Một đơn vị
hoạt tính amylase là ượng đường khử (µmol) tạo ra trong 1 phút dưới sự
xúc tác của 1 mL enzyme amylase ở pH 5,0 và nhiệt độ phòng (Nelson,
1944).
2.3.6 Xác định hoạt tính protease
Sản phẩm của quá trình phân hủy protein bởi protease của vi
khuẩn có phản ứng màu với thuốc thử Folin. Hàm lượng của sản phẩm

phân hủy được định lượng dựa vào đồ thị đường chuẩn tyrosine; từ đó
xác định được hoạt tính của enzyme protease. Một đơn vị hoạt tính
protease là lượng sản phẩm hòa tan tạo thành (µmol) trong một phút với
4


sự xúc tác của 1 mL enzyme protease ở pH 7,5 và nhiệt độ 37ºC (CuppEnyard, 2008).
2.3.7 Khuếch đại đoạn gene 16S rRNA
Chọn những dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose, tinh
bột và protein triển vọng để khuếch đại đoạn gen 16Sr RNA bằng kỹ
thuật PCR với cặp mồi 27F-1492R (Lane, 1991):
27F- 5’-AGAGTTTAGTCCTTGGCTCAG- 3’
1492R- 5’-GGCTACCTTGTTACGACTT- 3’
Sản phẩm PCR được diện di trên gel agarose 2%.
2.3.8 Giải trình tự đoạn gen 16S rRNA
Sản phẩm PCR được tinh sạch và kiểm tra nồng độ DNA sau khi
tinh sạch. Sau đó thực hiện phản ứng PCR gắn huỳnh quang với thuốc
nhuộm Big.Dye Terminater v3.1. Đoạn gen 16S rRNA được giải trình
tự bằng máy giải trình tự ABI PRISM 3130.
2.3.9 Ứng dụng vi khuẩn xử lý rác hữu cơ
Thí nghiệm được bố trí theo thể thức khối đầy đủ hoàn toàn ngẫu
nhiên với 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là một mẻ ủ với khối lượng 100
kg rác hữu cơ đã được phân bố vào một chậu gốm. Thí nghiệm gồm có
5 nghiệm thức được ký hiệu là NT1, NT2, NT3, NT4 và NT5. Trong đó,
NT1 không được bổ sung vi khuẩn; NT2 sử dụng chế phẩm sinh học
SEM 09; NT3 sử dụng chế phẩm EM; NT4 sử dụng chế phẩm EcoClean
và NT5 sử dụng những dòng vi khuẩn đã được định danh của luận án.
2.3.10 Phương pháp xác định mật số vi khuẩn hiếu khí
Mật số vi khuẩn hiếu khí được xác định theo phương pháp của
Jackson (2000). Mật số tổng vi khuẩn hiếu khí trong 1 mL hoặc 1g mẫu

(CFU/mL hoặc CFU/g) bằng tổng số khuẩn lạc đếm được ở đĩa chia cho
thể tích cấy trên mỗi đĩa (mL) và độ pha loãng (Jackson, 2000).

5


2.3.11 Phương pháp xác định C, N, P, K trong phân hữu cơ
Đo hàm lượng C, N, P, K vào ngày 0, 1, 7, 14, 21, 28, 35 sau khi ủ
để đánh giá chất lượng phân hữu cơ vi sinh ủ từ rác.
2.3.12 Ứng dụng phân hữu cơ trồng dưa leo
Thí nghiệm được bố theo thể thức khối đầy đủ hoàn toàn ngẫu
nhiên với 4 nghiệm thức và 4 lần lặp lại. Bốn nghiệm thức của thí
nghiệm gồm nghiệm thức đối chứng không sử dụng phân bón (NT1);
nghiệm thức sử dụng 100% phân bón hóa học tại địa phương (NT2);
nghiệm thức sử dụng 100% phân bón hữu cơ vi sinh từ luận án (NT3)
và nghiệm thức sử dụng 50% phân bón hóa học và 50% phân hữu cơ vi
sinh từ luận án (NT4). Các chi tiêu như chiều dài trái, đường kính trái,
trọng lượng trái, số lượng trái/cây, ngày nở hoa và ngày thu hoạch được
theo dõi trong suốt quá trình thí nghiệm.
2.3.13 Xử lý kết quả thí nghiệm
Kết quả thí nghiệm được biên tập bằng phần mềm Microsoft
Excel 2010 và phân tích thống kê bằng phần mềm Minitab 17. Phân tích
thống kê bao gồm phân tích phương sai và so sánh sự khác biệt giữa các
nghiệm thức được bằng kiểm định Fisher (LSD) với độ tin cậy 95%.

6


CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Vi khuẩn phân hủy cellulose từ rác và nước rỉ rác

3.1.1 Kết quả phân lập
Hai mươi sáu dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose đã
được phân lập từ 3 mẫu rác và 3 mẫu nước rỉ rác (được thu ở các huyện
Trần Đề, huyện Kế Sách và thị xã Ngã Năm, tỉnh Sóc Trăng) và được
ký hiệu là RC1, RC2, ...RC26.
3.1.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa
Khuẩn lạc của vi khuẩn phân hủy cellulose từ rác và nước rỉ rác
khác nhau ở một hoặc nhiều các đặc điểm bao gồm màu sắc, hình dạng,
dạng bìa, đường kính và độ nổi. Hình dạng tế bào vi khuẩn gồm que dài
(15,40%), que ngắn (61,50%) và cầu (23,10%). Chiều dài của tế bào vi
khuẩn dao động trong khoảng 0,52-4,09 µm và chiều rộng dao động
trong khoảng 0,52-1,5 µm. Tất cả 26 dòng vi khuẩn đều có khả năng di
động. Số tế bào vi khuẩn có Gram dương là 19 dòng và số tế bào Gram
âm là 7 dòng. Có 17 dòng có khả năng tạo nội bào tử và những dòng
này đều có tế bào dạng que và Gram dương.
Khả năng sinh catalase được ghi nhận ở cả 26 dòng vi khuẩn cho
thấy chúng đều có khả năng khử độc H2O2 và sử dụng khí O2 trong quá
trình sinh trưởng (Acharya, 2013). Kết quả kiểm tra Methylred cho thấy
có 5 dòng sinh acid mạnh khi đổi màu Methyl red sang đỏ, 8 dòng sinh
acid trung bình khi đổi màu Methyl red sang màu cam và 13 dòng
không sinh acid.
3.1.3 Khả năng phân hủy CMC của các dòng vi khuẩn
Hai mươi hai dòng vi khuẩn có năng phân hủy CMC và giá trị E
dao động từ 1 đến 22 mm. Dòng RC22 và RC20 phân hủy CMC mạnh
nhất với giá trị E tương ứng là 22 và 19 mm (Hình 3.1). Giá trị E của
dòng RC22 cao hơn giá trị E của dòng RC20 trong khi hoạt tính enzyme
7


endoglucanase của dòng RC20 (0,173 UI/mL) cao hơn hoạt tính

endoglucanase của dòng RC22 (0,059 UI/mL). Sự khác biệt đó có thể
do thành phần dinh dưỡng của môi trường xác định khả năng phân hủy
cơ chất và môi trường xác định hoạt tính enzyme khác nhau.

Hình 3.1: Vòng sáng phân hủy CMC
Vòng sáng thể hiện khả năng phân hủy CMC của dòng vi khuẩn RC20 (b) và
dòng RC22 (c). Dòng RC18 (a) không có khả năng phân hủy CMC.

3.1.4 Kết quả định danh
Dòng RC20 tương đồng với vi khuẩn Bacillus cereus strain BDU9
16S với mức độ đồng hình là 96%. Kết quả này phù hợp với các đặc
điểm hình thái và sinh hóa của dòng RC20 như Gram dương, hiếu khí,
que dài, di động và tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957). Khả năng phân
hủy cellulose của loài vi khuẩn Bacillus cereus đã được tìm thấy ở
nhiều nghiên cứu chẳng hạn như nghiên cứu của Kumar et al. (2012)
Afzal et al. (2012) và Saleem et al. (2014).
Dòng RC22 tương đồng với vi khuẩn Bacillus subtilis strain
HCST9 với mức độ đồng hình là 93%. Kết quả này phù hợp với các đặc
điểm hình thái và sinh hóa của dòng RC22 như Gram dương, hiếu khí,
que dài, di động và tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957). Nhiều nghiên
cứu cho thấy loài vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng phân hủy cơ
chất celluose như nghiên cứu của Kim et al. (2012), Joseph et al. (2016)
và Ajay et al. (2016).

8


3.2 Vi khuẩn phân hủy cellulose từ ruột sùng đất và trùn đất
3.2.1 Kết quả phân lập
Hai mươi chín dòng vi khuẩn được phân lập từ ruột sùng đất

(Holotrichia parallela) với ký hiệu tương ứng là SC1, SC2, ...SC29 và
hai mươi mốt dòng vi khuẩn được phân lập từ ruột trùn đất (Lubricus
terrestris ) với ký hiệu tương ứng là TC30, TC31,...TC50.
3.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa
Khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân hủy cellulose từ ruột sùng
đất và trùn đất khác nhau về màu sắc, hình dạng, dạng bìa, đường kính
hoặc độ nổi. Tế bào vi khuẩn có dạng que ngắn (72%), dạng cầu (26%)
và que dài (2%). Chiều dài tế bào vi khuẩn dao động trong khoảng 0,52
- 3,22 µm và chiều dài ngang dao động trong khoảng 0,52 - 1,74 µm.
Tất cả 26 dòng vi khuẩn đều có khả năng di động. Số tế bào Gram
dương và Gram âm tương ứng là 30 và 20 dòng. Có 24 dòng có khả
năng tạo nội bào tử và những dòng này đều có tế bào dạng que, Gram
dương.
Tất cả 50 dòng vi khuẩn đều có khả năng sinh catalase tức đều có
thể sống trong điều kiện có khí oxy. Mười chín dòng sinh acid mạnh khi
đổi màu Methyl red sang đỏ, 14 dòng sinh acid trung bình khi đổi màu
Methyl red sang cam và 17 dòng không sinh acid.
3.2.3 Khả năng phân hủy CMC của các dòng vi khuẩn
Hai mươi lăm dòng có khả năng phân hủy CMC với giá trị E dao
động từ 3 đến 23,8 mm. Bốn dòng triển vọng là SC12 (23,8 mm), SC5
(22,6 mm), TC42 (18,7 mm) và TC36 (17,9 mm) (Hình 3.2). Khi thay
cơ chất CMC bằng cơ chất bột giấy, bốn dòng SC12, SC5, TC42 và
TC36 vẫn thể hiện khả năng phân hủy cao nhất với giá trị E tương ứng
là 24,3; 23,0; 18,3 và 15,3 mm.

9


Hình 3.2: Vòng sáng phân hủy CMC
Vòng sáng thể hiện khả năng phân hủy CMC (E) của các dòng vi khuẩn SC5

(a); SC12 (b), TC42 (a1), TC36 (b1). Hai dòng SC3 (c) và TC33 (c1) không có
khả năng phân hủy CMC.

Bốn dòng SC12, SC5, TC42 và TC36 có hoạt tính exoglucanase
va endolucanase đứng đầu. Cụ thể, hoạt tính endoglucanase của SC12,
SC5, TC42 và TC36 lần lượt là 0,043 UI/mL, 0,037 UI/mL, 0,029
UI/mL và 0,023 UI/mL và hoạt tính enzyme exoglucanase tương ứng là
0,041 UI/mL, 0,036 UI/mL, 0,028 UI/mL và 0,025 UI/mL. Bốn dòng
này được chọn để giải trình tự đoạn gen 16S rRNA.
3.2.4 Kết quả định danh
Dòng SC12 tương đồng với Bacillus subtilis strain GX S-15 16S
với độ đồng hình là 97% và dòng SC5 tương đồng với Bacillus subtilis
strain CMST 03/13COR5 với độ đồng hình là 98%. Kết quả này phù
hợp với các đặc điểm hình thái và sinh hóa của chi Bacillus như Gram
dương, hiếu khí, que dài, di động và tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957).
Loài vi khuẩn B. subtilis có khả năng phân hủy cellulose như đã thảo
luận ở mục 3.1.4.
Dòng TC42 tương đồng với vi khuẩn Bacillus megaterium strain
F3-1-10-16s với độ đồng hình là 96% và TC36 tương đồng với vi khuẩn
Bacillus megaterim strain AU03-16s với độ đồng hình là 98%. Kết quả
này phù hợp với các đặc điểm hình thái và sinh hóa của chi Bacillus như
Gram dương, hiếu khí, que dài, di động và tạo nội bào tử (Bergey et al.,
1957). Một số nghiên cứu trên thế giới gần đây như nghiên cứu của

10


Aftab (2013), Ferbiyanto et al. (2015) và Ribeiro et al., (2016) chứng
minh B. megaterium có khả năng phân hủy cellulose.
3.3 Vi khuẩn phân hủy tinh bột từ rác và nước rỉ rác

3.3.1 Kết quả phân lập
Từ 3 mẫu rác và 3 mẫu nước rỉ rác, 30 dòng vi khuẩn có khả năng
phân hủy tinh bột đã được phân lập và được ký hiệu là RB1, RB2,
...RB30.
3.3.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa
Khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột từ rác và nước
rỉ rác khác nhau về hình dạng, độ nổi, dạng bìa, màu sắc hoặc đường
kính khuẩn lạc. Tế bào vi khuẩn có dạng que ngắn (86,70%) và dạng
que dài (13,30%). Tất cả 30 dòng vi khuẩn đều có khả năng di động.
Chiều dài của tế bào vi khuẩn dao động trong khoảng 0,87 - 3,74 µm và
chiều rộng dao động trong khoảng 0,52 - 1,39 µm. Số tế bào vi khuẩn
có Gram dương là 21 dòng và số tế bào Gram âm là 20. Có 21 dòng có
khả năng tạo nội bào tử và những dòng này đều có tế bào dạng que,
Gram dương.
Tất cả 30 dòng vi khuẩn đều có khả năng sinh catalase cho thấy
chúng đều có khả năng sử dụng khí oxy. Mười hai dòng sinh acid mạnh
khi đổi màu Methyl red sang đỏ, 10 dòng sinh acid trung bình khi đổi
màu Methyl red sang cam và 8 dòng không sinh acid.
3.3.3 Khả năng phân hủy tinh bột của các dòng vi khuẩn
Tất cả 30 dòng vi khuẩn đều có khả năng phân hủy tinh bột và giá
trị E dao động trong khoảng 1,57 đến 23,5 mm. Dòng RB8 phân hủy
tinh bột mạnh nhất với giá trị E 23,5 mm; kế đến là dòng RB17 (E =
21,47 mm). Hoạt tính enzyme amylase của RB8 và RB17 tương ứng là
22,2 và 15,6 UI/mL. Dựa theo khả năng phân hủy tinh bột, hai dòng này
đã được chọn để giải trình tự đoạn gene 16S rRNA.

11


3.3.4 Kết quả định danh

Dòng RB8 có độ tương đồng 96% với vi khuẩn Bacillus flexus
gene 16S rRNA khi so sánh trình tự gen 16S rRNA của dòng này với
trình tự gene 16S rRNA trên ngân hàng dữ liệu NCBI. Theo (Zhao et
al., 2008) và Pal et al. (2014) thì Bacillus flexus là một loài vi khuẩn
Gram (+), hình que, di động, sử dụng được O2 và có khả năng tạo nội
bào tử và đều phù hợp với đặc điểm hình thái, sinh hóa của dòng RB8.
Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy Bacillus flexus là vi khuẩn có khả
năng phân hủy tinh bột và có tiềm năng ứng dụng như nghiên cứu của
Zhao et al. (2008) và Chen et al. (2013).
Dòng RB17 có độ tương đồng 99% với vi khuẩn Bacillus subtilis
strain NG3-5 16S. Kết quả này phù hợp với các đặc điểm hình thái và
sinh hóa của dòng RB17 như Gram dương, hiếu khí, que dài, di động và
tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957). Khả năng phân hủy tinh bột của
loài vi khuẩn Bacillus subtilis đã được tìm thấy ở nghiên cứu của
Panneerselvam và Elavarasi (2015) và Vijayalakshmi et al. (2012).
3.4 Vi khuẩn phân hủy tinh bột từ ruột sùng và trùn đất
3.4.1 Kết quả phân lập
Từ ruột 3 mẫu con sùng và 3 mẫu con trùn, 28 dòng vi khuẩn phân
hủy tinh bột đã được phân lập; trong đó 14 dòng vi phân lập từ ruột con
sùng đất được ký hiệu là SB15, SB16, …SB28 và 14 dòng vi khuẩn
phân lập từ ruột con trùn đất được ký hiệu là TB1, TB2,…TB14.
3.4.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa
Khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột từ ruột sùng
và trùn đất khác nhau ở màu sắc, hình dạng, dạng bìa, đường kính hoặc
độ nổi. Tất cả 28 dòng vi khuẩn đều có khả năng di động và tế bào dạng
que; trong đó que ngắn là 26 dòng và que dài là 2 dòng. Số dòng vi
khuẩn Gram dương là 15 trong khi số vi khuẩn Gram âm là 13 dòng.
Tất cả những dòng vi khuẩn Gram dương đều có khả năng tạo nội bào

12

tử. Chiều dài của tế bào dao động từ 1,2 đến 3 µm và chiều rộng dao
động từ 0,8 đến 1,5 µm.
Tất cả 28 dòng vi khuẩn đều sinh catalase chứng tỏ chúng đều có
khả năng sử dụng khí oxy trong quá trình sinh trưởng. Bảy dòng sinh
acid mạnh khi đổi màu Methyl red sang đỏ, 12 dòng sinh acid trung
bình khi đổi màu Methyl red sang màu cam và 9 dòng không sinh acid.
3.4.3 Khả năng phân hủy tinh bột của các dòng vi khuẩn
Hai mươi bảy dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột với
giá trị E dao động từ 5,7 mm đến 23,4 mm. Ba dòng SB25, TB6 và
SB16 có vòng sáng phân hủy tinh bột lớn nhất với giá trị E tương ứng là
23,4 mm, 21,7 mm và 21,57 mm (Hình 3.3). Mặc dù dòng SB25 có
vòng sáng phân hủy tinh bột lớn nhất nhưng hoạt tính enzyme amylase
lại thấp nhất với 13,64 UI/mL, trong khi hoạt tính amylase cao nhất
được ghi nhận ở dòng TB6 (33,71 UI/mL). Sự khác biệt đó có thể do
thành phần dinh dưỡng của môi trường xác định khả năng phân hủy cơ
chất và môi trường xác định hoạt tính enzyme khác nhau.

Hình 3.3: Vòng sáng phân hủy tinh bột
Vòng sáng phân hủy tinh bột dòng vi khuẩn SB16 (a) và TB6 (b)

3.4.4 Kết quả định danh
Dòng TB6 tương đồng với Bacillus megaterium (gene for 16S
rRNA) với độ đồng hình là 97%. Kết quả này phù hợp với các đặc điểm
hình thái và sinh hóa của dòng TB6 như Gram dương, hiếu khí, que dài,
di động và tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957). Nhiều nghiên cứu cho

13

thấy Bacillus megaterium là một loài vi khuẩn có khả năng phân hủy
tinh bột và có tiềm năng ứng dụng trong đời sống (David et al., 1987;
Brumm et al., 1991 và Mary et al., 1980).
Dòng SB16 tương đồng với Bacillus cereus strain FORC 024 với
độ đồng hình là 95%. Kết quả này phù hợp với các đặc điểm hình thái
và sinh hóa của dòng SB16 như Gram dương, hiếu khí, que dài, di động
và tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957). Bacillus cereus là loài vi khuẩn
có khả năng phân hủy tinh bột (Sanjoy et al., 2009) và còn được dùng
để sản xuất amylase sử dụng trong công nghiệp (Sivakumar et al.,
2012).
Dòng SB25 có độ tương đồng 96% với vi khuẩn Bacillus flexus
gene 16S rRNA. Theo (Zhao et al., 2008) và Pal et al. (2014) thì
Bacillus flexus là một loài vi khuẩn Gram (+), hình que, di động, sử
dụng được O2 và có khả năng tạo nội bào tử. Quá trình khảo sát của
luận án cũng cho thấy dòng SB25 là vi khuẩn Gram (+), hình que (dài),
di động và có thể sống trong môi trường hiếu khí. Khả năng phân hủy
tinh bột của loài Bacillus flexus đã được thảo luận ở mục 3.3.4.
3.5 Vi khuẩn phân hủy protein từ rác và nước rỉ rác
3.5.1 Kết quả phân lập
Từ 3 mẫu rác và nước rỉ rác, 29 dòng vi khuẩn phân hủy protein
đã được phân lập và được ký hiệu tương ứng là RPp, RPs và RPg.
3.5.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa
Khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn khác nhau ở một hoặc nhiều các
đặc điểm bao gồm màu sắc, hình dạng, dạng bìa, đường kính và độ nổi.
Tất cả 29 dòng vi khuẩn đều có khả năng di động và tế bào đều dạng
que; trong đó que ngắn là 20 dòng (69%) và que dài là 9 dòng (31%).
Số dòng vi khuẩn Gram dương là 20 dòng và số vi khuẩn Gram âm là 9
dòng. Tất cả những dòng vi khuẩn Gram dương đều có khả năng tạo nội
bào tử. Chiều dài của tế bào dao động từ 0,87 đến 4,22 µm và chiều

rộng dao động từ 0,52 đến 2,33 µm.

14


Tất cả 30 dòng vi khuẩn đều có khả năng sinh catalase chứng tỏ
chúng đều có khả năng sử dụng khí oxy. Mười hai dòng sinh acid mạnh
khi đổi màu Methyl red sang đỏ, 11 dòng sinh acid trung bình khi đổi
màu Methyl red sang màu cam và 6 dòng không sinh acid.
3.5.3 Khả năng phân hủy protein của các dòng vi khuẩn
Tất cả 29 dòng vi khuẩn đều có khả năng phân hủy protein và giá
trị E dao động từ 5,67 đến 28,77 mm. Ba dòng có vòng sáng phân hủy
lớn nhất là RPs19 (28,77 mm), RPp9 (28,57 mm) và RPg15 (27,57 mm)
(Hình 3.4) có hoạt tính enzyme protease tương ứng là 50, 65 và 45
UI/mL. Mặc dù dòng RPs19 có vòng sáng phân hủy skim milk lớn nhất
nhưng hoạt tính enzyme cao nhất lại được ghi nhận ở dòng RPp9. Sự
khác biệt đó có thể do thành phần dinh dưỡng của môi trường xác định
khả năng phân hủy cơ chất và môi trường xác định hoạt tính enzyme
khác nhau.

Hình 3.4: Vòng sáng phân hủy skim milk
Vòng sáng phân hủy skim milk của dòng RPs19 (a) và RPp9 (b)

3.5.4 Kết quả định danh
Dòng RPp9 tương đồng với vi khuẩn Bacillus aquimaris strain
HNS62 16S với mức độ đồng hình là 99%. Kết quả này phù hợp với các
đặc điểm hình thái và sinh hóa của dòng RPp9 như Gram dương, hiếu
khí, que dài, di động và tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957). Nhiều
nghiên cứu đã chứng minh Bacillus aquimaris có khả năng phân hủy
protein (Abhijit et al., 2012; Amutha and Priva, 2011; Chandrashekhar,

2012; Shivanand and Jayaraman, 2009).

15


Dòng RPs19 tương đồng với Bacillus aryabhattai strain rif
200898 16S với độ đồng hình là 96%. Kết quả này phù hợp với các đặc
điểm hình thái và sinh hóa của dòng RPs19 như Gram dương, hiếu khí,
que dài, di động và tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957). Sự phân hủy
protein của loài Bacillus aryabhattai đã được ghi nhận trong nghiên cứu
của Sharma et al. (2014) rằng dòng Bacillus aryabhattai K3 tạo vòng
sáng phân hủy lớn trên môi trường skim milk và hoạt tính protease của
dòng này lên đến 952 UI/mL.
Dòng RPg15 được xác định thuộc chi Bacillus và tương đồng
với dòng Bacillus sp. S42 16s với độ đồng hình 84%. Những đặc điểm
hình thái và sinh hóa của dòng RPg15 như Gram dương, hiếu khí, que
dài, di động và tạo nội bào tử cho thấy dòng RPg15 thuộc chi Bacillus là
hợp lý (Bergey et al., 1957). Tuy nhiên, vì chưa định danh được đến
loài nên khả năng phân hủy protein của vi khuẩn RPg15 chỉ được ghi
nhận trong phạm vi của luận án này.
3.6 Vi khuẩn phân hủy protein từ ruột sùng và trùn đất
3.6.1 Kết quả phân lập
Từ ruột sùng và trùn đất, 50 dòng vi khuẩn phân hủy protein đã
được phân lập; trong đó có 17 dòng phân lập từ ruột sùng với ký hiệu là
SPp, SPs hoặc SPc và 33 dòng phân lập từ ruột trùn đất với ký hiệu là
TPp, TPc, TPs hoặc TPt.
3.6.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa
Khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân hủy protein từ ruột sùng và
trùn đất khác nhau về một hoặc nhiều các đặc điểm gồm hình dạng,
dạng bìa, độ nổi, màu sắc và đường kính. Những dòng vi khuẩn này đều

có khả năng di động và có tế bào dạng que ngắn (70%), dạng que dài
(8%) hoặc dạng hình cầu (22%). Số dòng vi khuẩn Gram dương và
Gram âm tương ứng là 31 và 19 dòng. Chiều dài của tế bào biến động từ
0,52 - 4,29 µm trong khi chiều rộng nằm trong khoảng 0,52 - 5,17 mm.
Những dòng vi khuẩn Gram dương đều có khả năng tạo nội bào tử.

16


Tất cả 50 dòng vi khuẩn từ ruột sùng và trùn đất đều có khả năng
sử dụng O2 vì đều sinh catalase. Hai mươi dòng vi khuẩn có khả năng
sinh acid mạnh khi đổi màu Methyl red sang đỏ, 21 dòng có khả năng
sinh acid trung bình khi đổi màu Methyl red sang cam và 9 dòng không
sinh acid.
3.6.3 Khả năng phân hủy protein của các dòng vi khuẩn
Tất cả 50 dòng vi khuẩn đều có khả năng phân hủy protein với E
dao động từ 6,57 đến 33,80 mm. Ba dòng tạo vòng sáng lớn nhất là
SPp5 (33,80 mm), TPt35 (31,93 mm) và TPs45 (31,50 mm) (Hình 3.5)
với hoạt tính protease tương ứng bằng 80, 80 và 100 UI/mL. Mặc dù
dòng SPp5 có vòng sáng phân hủy skim milk lớn nhất nhưng hoạt tính
enzyme cao nhất lại được ghi nhận ở dòng TPs45. Sự khác biệt đó có
thể do thành phần dinh dưỡng của môi trường xác định khả năng phân
hủy cơ chất và môi trường xác định hoạt tính enzyme khác nhau.

Hình 3.5: Vòng sáng phân hủy skim milk
Vòng sáng phân hủy skim milk của các dòng SPp5 (a) và TPc18 (b)

3.6.4 Kết quả định danh
Dòng TPs45 tương đồng với Bacillus megaterium strain rif200898
16S với độ đồng hình 99% và dòng TPc18 tương đồng với Bacillus

megaterium strain YKA3 16S với độ đồng hình 92%. Hai dòng TPs45
và TPc18 đều là vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, có tế bào dạng que và
có khả năng tạo bào tử. Đó cũng là những đặc điểm của loài B.
megaterium theo mô tả của Bergey et al. (1957). Khả năng phân hủy

17


protein của Bacillus megaterium được ghi nhận qua nhiều nghiên cứu
như nghiên cứu của Mrudula and Shyam (2012) và Liang et al. (2016).
Dòng TPt35 tương đồng với Bacillus licheniformis strain
CCMMB838 16S với độ đồng hình 99%. Kết quả này phù hợp với các
đặc điểm hình thái và sinh hóa của dòng TPt35 như Gram dương, hiếu
khí, que dài, di động và tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957). Nhiều
nghiên cứu cho thấy loài Bacillus licheniformis có khả năng phân hủy
protein và có tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực (Shehri et al.,
2004; Nejad et al., 2009 và Haddar et al., 2011).
Dòng SPp5 tương đồng với Bacillus aquimaris strain L12 16S với
độ đồng hình 99%. Kết quả này phù hợp với các đặc điểm hình thái và
sinh hóa của dòng SPp5 như Gram dương, hiếu khí, que dài, di động và
tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957). Khả năng phân hủy protein của loài
B. aquimaris đã được thảo luận ở mục 3.5.4.
Dòng TPp27 tương đồng với Bacillus subtilis strain OSS 516S với
độ đồng hình 99% và dòng SPs12 tương đồng với Bacillus subtilis
strain T2-Shier5-16S với độ đồng hình 92%. Hai dòng TPp27 và SPs12
đều là vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, có tế bào dạng que và có khả
năng tạo bào tử. Đó cũng là những đặc điểm của loài B. subtilis theo mô
tả của Bergey et al. (1957). Khả năng phân hủy protein của Bacillus
subtilis được bết đến qua nghiên cứu của Chantawannakula et al. (2002)
và Geethanjali and Subash (2011).

3.7 Đánh giá khả năng phân hủy rác thải của các chế phẩm sinh học
Qua quá trình ủ rác thải, các chỉ tiêu theo dõi có có sự biến động
theo chiều hướng tốt. Trong đó bốn nghiệm thức có sử dụng chế phẩm
sinh học đạt yêu cầu về mật số vi khuẩn; hàm lượng C; N; C/N; K (%)
đối với phân hữu cơ vi sinh theo tiêu chuẩn TCVN 7185: 2002. Tuy
nhiên hàm lượng P (%) của tất cả các nghiệm thức chưa đạt yêu cầu.

18


3.8 Thảo luận chung
Hai trăm mười ba dòng vi khuẩn đã được phân lập từ các bãi rác,
con sùng đất và trùn đất ở Tỉnh Sóc Trăng. Trong đó, 20 dòng có hoạt
tính enzyme cellulase, amylase và protease mạnh được chọn để ly trích
DNA, khuếch đại đoạn gen 16S rRNA, giải trình tự và định danh. Tất cả
20 dòng đã giải trình tự đều thuộc chi Bacillus.
Đột biến gen ở các vi khuẩn phân lập từ rác nhiều hơn các dòng vi
khuẩn được phân lập từ sùng đất và trùn đất có thể do cơ chế thích nghi
của vi khuẩn đối với nguồn dinh dưỡng luôn biến động trong rác.
3.9 Kết quả ứng dụng phân hữu cơ vi sinh trồng dưa leo
Khi sử dụng phân hữu cơ vi sinh từ luận án kết hợp bón phân
đạm hóa học giúp giảm 50% lượng phân đạm hóa học. Cây dưa leo đã
có các chỉ tiêu như chiều dài trái, đường kính trái, trọng lượng trái, số
trái mỗi cây tương đương với bón 100N. Như vậy, khi trồng dưa leo có
sử dụng phân hữu cơ vi sinh giúp giảm 50% lượng phân hoa học, đồng
thời góp phần giảm ô nhiễm môi trường.

19

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1 Kết luận
Hai trăm mười ba dòng vi khuẩn hiếu khí đã được phân lập từ các
bãi rác, con sùng và trùn đất ở tỉnh Sóc Trăng. Tất cả các dòng vi khuẩn
đều có khả năng di động và khác nhau về đặc điểm hình thái và đặc
điểm sinh hóa. Hai mươi dòng vi khuẩn triển vọng gồm 6 dòng phân
hủy cellulose, 5 dòng phân hủy tinh bột và 9 dòng phân hủy protein đã
được chọn để giải trình tự đoạn gen 16S rRNA. Dựa theo đặc điểm hình
thái, sinh hóa và kết quả so sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA với dữ
liệu NCBI, tất cả 20 dòng vi khuẩn này đều thuộc chi Bacillus. Đột biến
gen ở các vi khuẩn phân lập từ rác nhiều hơn các dòng vi khuẩn được
phân lập từ sùng đất và trùn đất.
Ứng dụng vi khuẩn của đề tài để xử lý rác thải hữu cơ được thu
gom trên địa bàn tỉnh Sóc Trăng cho kết quả phân hủy rác hữu cơ không
thua kém so với các chế phẩm ngoại nhập. Sản phẩm sau khi ủ phân
hữu cơ bón cho dưa leo giúp tăng năng suất và chất lượng trái. Nghiệm
thức 50% phân hữu cơ vi sinh và 50% phân hóa học cho kết quả vượt
trội về năng suất so với chỉ bón phân hóa học. Điều đó giúp tiết kiệm
được 50% phân bón hóa học và góp phần giảm ô nhiễm môi trường.
4.2 Kiến nghị
Nghiên cứu phân lập thêm nguồn vi khuẩn phân hủy cơ chất
cellulose, tinh bột và protein trên các đối tượng côn trùng khác như mối,
đuông, tằm ăn dâu nhằm làm phong phú nguồn vi khuẩn bản địa phục
vụ xử lý rác thải.
Tiếp tục nghiên cứu thành phần chất mang, tỷ lệ phối trộn các
dòng vi khuẩn và điều kiện tồn trữ thích hợp để sản xuất chế phẩm sinh
học phục vụ xử lý ô nhiễm hữu cơ.

20

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Abhijit, P., G. Ratan and C.J. Subhas, 2012. Optimization of physicochemical condition for improved production of hyperthermostable
β-amylase from Bacillus subtilis DJ5. Journal of Biochemistry
Technology, 3(4): 370-374.
Aftab, S., 2013. Characterization of cellulose degrading bacterium,
Bacillus megaterium S3, isolated from indigenous environment.
Pakistan Journal of Zoology, 45: 1655-1662.
Afzal I., A.A. Shah, Z. Makhdum, A. Hameed and F. Hasan, 2012.
Isolation and characterization of cellulase producing Bacillus
cereus MRLB1 from soil. Minerva Biotecnologica, 24: 101-109.
Ajay, K., Manhar, Y. Bashir, D. Saikia, D. Nath, K. Gupta, B.K.
Konwar, R. Kumar, N.D. Namsa and M. Mandal, 2016.
Cellulolytic potential of probiotic Bacillus subtilis AMS6 isolated
from traditional fermented soybean (Churpi): an in-vitro study
with regards to application as an animal feed additive.
Microbiological Research, 186: 62-70.
Alariya, S.S., S. Sethi, S. Gupta and B.L. Gupta, 2013. Amylase activity
of a starch degrading bacteria isolated from soil. Scholars
Research Library, 5: 15-24.
Amutha, K. and K. Priya, 2011. Effect of pH, temperature and metal
ions on amylase activity from Bacillus subtilis Kcx 006.
International Journal of Pharma and Bio Sciences, 2: 40-413.
Bergey, D. H., R.E. Buchanan and N.E. Gibbons, 1957. American
Society for Microbiology. Bergey's manual of determinative
bacteriology. Baltimore: Williams & Wilkins. Pp 613- 653.
Brumm, P.J., R.E. Hebeda and W.M. Teague, 1991. Purification and
characterization of the commercialized, cloned Bacillus
megaterium α-Amylase. Biosynthesis Nutrion Biomedical, 43:
315-319.

Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp. 2002. Giáo trình thực tập Vi sinh
vật đại cương. Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh
học, Trường Đại học Cần Thơ, trang 11-45.

21


Chandrashekhar, U., R. I. Kallur and B. B. Kaliwal, 2012. Production of
α-amylase using banana waste by Bacillus subitis under solid state
fermentation. European Journal of Experimental Biology, 2(4):
1044-1052.
Chantawannakula, P., A. Oncharoena, K. Klanbuta, E. Chukeatiroteb
and L. Saisamorn, 2002. Characterization of proteases of Bacillus
subtilis strain 38 isolated from traditionally fermented soybean in
Northern Thailand, Science Asia 28: 241-245.
Chen, K., J. Yang and H. Zhao, 2013. Isolation and characterization of a
Bacillus strain for alkaline wastewater treatment. Academic
Journals, 7(44): 5119-5125.
Cupp-Enyard, C., 2008. Sigma’s non-specific protease activity assay casein as a substrate. Journal of Visualized Experiments, 19: 899901.
David, M.H., H. Günther and H.H. Röper, 1987. Catalytic properties of
Bacillus megaterium amylase, Biosynthesis Nutrient Biomedical,
39: 436-440.
Ferbiyanto, A., I. Rusmana and R. Raffiudin, 2015. Characterization
and identification of cellulolytic bacteria from gut of
worker Macrotermes gilvus, Hayati. Journal of Biosciences, 22:
197-200.
Geethanjali, S. and A. Subash, 2011. Optimization of protease
production by Bacillus subtilis isolated from mid gut of fresh
water fish Labeo rohita. World Journal of Fish and Marine
Sciences, 3: 88-95.

Haddar, H.O., G.M. Aziz and M.H.A. Gelawi, 2007. Optimization of
bacitracin production by Bacillus licheniformis B5. Pakistan
Journal of Biological Sciences, 10: 972-976.
Jackson, R.W., K. Osborne, G. Barnes, C. Jolliff, D. Zaman, B. Roll, A.
Stillings, D. Herzog, S. Cannon and S. Loveland, 2000.
Multiregional evaluation of the simplate heterotrophic plate count
method compared to the standard plate count agar pour plate
method in water. Applied and Environmental Microbiology, 66:
453-454.

22