Khuếch đại in vitro DNA bằng phản ứng chuỗi polymerase

Các phương pháp cơ bản của việc xây
dựng DNA tái tổ hợp in vitro



1. Phương pháp sử dụng các đầu dính
Bất kỳ đoạn DNA nào nếu được cắt bởi
cùng một loại enzyme giới hạn (ví dụ,
EcoRI) cho các đầu dính thì có thể dính
líp lại với nhau và được nối bởi DNA
ligase (hình 1). Phương pháp thành lập
phân tử DNA tái tổ hợp kiểu này lần đầu
tiên được đưa ra bởi J.Mert và R.Davis
năm 1972 bằng thực nghiệm trên các
virus. Và sau đó, lần đầu tiên năm 1973,
H.Boyer và nhóm nghiên cứu của
S.Cohen đã tạo ra được phân tử DNA tái
tổ hợp gồm vector là plasmid nhỏ
pSC101 của E. coli và DNA ''ngoại lai''
là một plasmid khác. Chính sự kiện này
đã đặt nền móng và mở ra triển vọng to
lớn cho kỹ thuật DNA tái tổ hợp sau này.

Hình 1 Hai phân tử DNA khác nhau
được cắt bởi cùng một enzyme giới hạn
EcoRI tạo ra các đầu dính bổ sung nhau,
bằng cách đó có thể khâu nối thành phân
tử DNA tái tổ hợp in vitro nhờ xử lý với
DNA ligase.
2. Phương pháp nối trực tiếp hoặc tổng
hợp các đầu bổ sung
Đối với các đoạn DNA được tạo ra bằng
cách xử lý enzyme giới hạn cắt thẳng
như HindII chẳnghạn, thì việc nối các
đoạn DNA có đầu bằng được tạo ra có
thể thực hiện theo hai cách sau: Nối trực
tiếp bằng DNA ligase của phage T4 hoặc
tổng hợp thêm các đầu dính vào các đầu
3' một số nucleotide bổ sung bằng cách
sử dụng các enzyme end-transferase, rồi
sau đó các đoạn DNA như thế sẽ được
nối với nhau bởi DNA ligase của vi
khuẩn. Cơ sở của phương pháp kết hợp
DNA này được thực hiện lần đầu tiên
giữa DNA của virus SV40 với DNA của
phage l bởi L.Lobban và D.Kaiser
(1972), và D.Jackson và P.Berg (1972)