Nghiên cứu điều chế, phân bố sinh học và khả năng gắn với tế bào ung thư của phức hợp miễn dịch phóng xạ 131i rituximab

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------------

Nguyễn Thị Thu

“NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ, PHÂN BỐ SINH HỌC
VÀ KHẢ NĂNG GẮN VỚI TẾ BÀO UNG THƯ CỦA
131
PHỨC HỢP MIỄN DỊCH PHÓNG XẠ I-RITUXIMAB”

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2018


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------------

Nguyễn Thị Thu

“NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ, PHÂN BỐ SINH HỌC
VÀ KHẢ NĂNG GẮN VỚI TẾ BÀO UNG THƯ CỦA
131
PHỨC HỢP MIỄN DỊCH PHÓNG XẠ I-RITUXIMAB”
Chuyên ngành:
Mã số:

Mô - phôi và tế bào học
62420117

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. GS.TS. MAI TRỌNG KHOA
2. PGS.TS. VÕ THỊ THƯƠNG LAN
XÁC NHẬN NCS ĐÃ CHỈNH SỬA THEO QUYẾT NGHỊ
CỦA HỘI ĐỒNG ĐÁNH GIÁ LUẬN ÁN
Người hướng dẫn khoa học

Chủ tịch hội đồng đánh giá
Luận án Tiến sĩ

GS.TS. Mai Trọng Khoa

GS.TS. Phan Văn Chi

Hà Nội - 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận án tiến sĩ “Nghiên cứu điều chế, phân bố sinh học
131

và khả năng gắn với tế bào ung thư củaphức hợp miễn dịch phóng xạ Irituximab” là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và tài liệu trong luận
án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào. Tất
cả những tham khảo và kế thừa đều được trích dẫn và tham chiếu đầy đủ.
Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Thu

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện luận án, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ từ
quý thầy cô, các bạn đồng nghiệp, gia đình và bạn bè. Tôi xinbày tỏ lòng cảm ơn
sâu sắc đến:
- GS.TS. Mai Trọng Khoa, PGS.TS. Võ Thị Thương Lan, đã nhiệt tình hướng
dẫn chuyên môn, truyền cho tôi kiến thức, và là tấm gương sáng cho tôi noi theo
trên con đường nghiên cứu khoa học.
- Các thầy cô trong bộ môn Mô Phôi và Tế bào học, khoa Sinh học, trường
Đại học khoa học tự nhiên đã luôn động viên, giúp đỡ chuyên môn và nhắc nhở kịp
thời để tôi hoàn thành luận án.
- Các bạn đồng nghiệp tại Trung Tâm Nghiên cứu và điều chế đồng vị phóng
xạ, Viện Nghiên cứu hạt nhân đã tham gia thực nghiệm, giúp đỡ, và đồng hành
cùng tôi trong thời gian dài tìm tòi, nghiên cứu gắn và điều chế dược chất phóng
xạ trong luận án.
- Các bác sỹ Tại Trung Tâm Y học hạt nhân và Ung bướu, bệnh viện Bạch
Mai, các bạn đồng nghiệp tại Học Viện Quân Y đã giúp đỡ tôi thực hiện các nghiên
cứu đánh giá tiền lâm sàng trong luận án này.
- Cuối cùng xin chân thành cảm ơn gia đình tôi đã luôn dành cho tôi những
yêu thương và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập.
Xin chân thành cảm ơn mọi người đã giúp tôi hoàn thành luận án này!
Nghiên cứu sinh
Nguyễn Thị Thu


MỤC LỤC
Lời cam đoan
Lời cảm ơn

1

Mục lục...................................................................................................................... 1
Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt........................................................................3
Danh mục các bảng.................................................................................................... 5
Danh mục các hình ảnh, đồ thị.................................................................................. 7
MỞ ĐẦU.................................................................................................................. 9
Chương 1: TỔNG QUAN...................................................................................... 11
1.1. Bệnh u lympho ác tính không Hodgkin............................................................ 11
1.2. Các phương pháp điều trị bệnh ULAKH và điều trị RIT..................................13
1.3. Dược chất phóng xạ dùng trong điều trị RIT....................................................20
1.4. Đồng vị phóng xạ và các phương pháp gắn kháng thể với

131

I......................... 26

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................... 33
2.1. Nguyên vật liệu, hóa chất, thiết bị.................................................................... 33
2.2. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................. 34
2.2.1. Nghiên cứu điều chế phức miễn dịch phóng xạ
2.2.2. Kiểm tra chất lượng phức hợp

131

131

I-rituximab................34

I-rituximab..........................................38

2.2.3. Đánh giá khả năng gắn với tế bào ung thư..............................................44
2.2.4. Đánh giá phân bố, đào thải và an toàn trên động vật thực nghiệm..........47
2.2.5. Xử lý kết quả........................................................................................... 51
2.2.6. Xây dựng tiêu chuẩn Cơ sở của

131

I-rituximab........................................ 51

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN................................................................ 53
3.1. Kết quả khảo sát các điều kiện gắn phóng xạ để điều chế phức hợp

131

I-

rituximab..................................................................................................................53
3.1.1. Kết quả khảo sát nồng độ chloramin T tham gia trong phản ứng tạo phức
hợp

131

I-rituximab.................................................................................................... 53

3.1.2. Kết quả khảo sát nồng độ kháng thể tạo phức hợp

131

3.1.3. Kết quả khảo sát thời gian phản ứng tạo phức hợp

131

3.1.4. Kết quả khảo sát pH phản ứng tạo phức
3.1.5. Kết quả điều chế phức hợp

131

3.1.6. Kết quả tinh chế phức hợp

131

131

I-rituximab............55
I-rituximab...........56

I-rituximab...........................58

I-rituximab theo hoạt độ riêng..................60

I-rituximab và theo dõi độ ổn định............63

2


3.1.7. Kết quả đánh giá tính ổn định của phức hợp
3.2. Kết quả kiểm tra chất lượng phức hợp

131

131

I-rituximab.....................65

I-rituximab.......................................67

3.2.1. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết hoá phóng xạ ......................................... 68
3.2.2. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết hạt nhân phóng xạ...................................71
3.2.3. Kết quả thử vô khuẩn và nội độc tố vi khuẩn.......................................... 73
3.2.4. Kết quả kiểm tra tính ổn định..................................................................75
3.2.5. Kết quả gắn với tế bào ung thư................................................................80
3.2.6. Kết quả đánh giá phân bố, đào thải và an toàn của

131

I-rituximab trên

động vật thực nghiệm.............................................................................................. 88
3.2.7. Chứng minh sự thành công của việc điều chế phức hợp miễn dịch phóng
xạ

131

I-rituximab có thể sử dụng trong điều trị lâm sàng........................................ 106

KẾT LUẬN.......................................................................................................... 109
KIẾN NGHỊ......................................................................................................... 110
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ
LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN.............................................................................111

TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................... 112

3


PHỤ LỤC

4


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADCC
ALL

Độc tính với tế bào phụ thuộc kháng thể (Antibody
Dependent Cellular Cytotoxicity)
Ung thư nguyên bào tủy cấp (Acute Lymphoblastic Leukemia)

AML

Ung thư bạch cầu dạng tủy (Acute Myeloid Leukemia)

BET

Thử nội độc tố vi khuẩn (Bacterial Endotoxins Test)

Bq

Becquerel

CD

Cụm biệt hoá (cluster differentiation)

CD20

Cụm biệt hóa CD20 (Clusters differentiation 20)

CDC

DĐVN

Độc tính với tế bào phụ thuộc bổ thể (Complement Dependent
Cytotoxicity)
Độc tính với tế bào phụ thuộc bổ thể (Complement Dependent
Cellular Cytotoxicity)
Dược điển Việt Nam

DNA

Deoxyribonucleic acid

EGFR

Epidermal Growth Factor Receptor

EU

Endotoxin Unit

FDA

Cục quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ

CDCC

(Food and Drug Administration)
FPLC

Fast Protein Liquid Chromatography

FTM

Fluid Thyoglicolate Medium

GBq

Giga Becquerel

IgG

Globulin miễn dịch (Immunoglobulin)

KDa, Da

Kilo Dalton, Dalton

KeV

Kiloelectron volt

Mab, MAb

Kháng thể đơn dòng (monoclonal

antibody) MeV Mega electron volt
NHL

U lympho ác tính không Hogdkin (non-Hodgkin’s lymphoma)

NSB

Phần gắn không đặc hiệu (Non Specific Binding)

5


NTA

Nitroacetic axit

PBS

Phosphat Buffer Saline

PC

Sắc ký giấy (Paper chromatography)

PET-CT

Máy chụp cắt lớp bằng đồng vị phát positron (Positron Emission
Tomography)

PTS-100

Máy kiểm tra nội độc tố (Endosafe® Portable Test System)

RBC

Tế bào hồng cầu (Red Blood Cell)

RCP

Radiochemical purity

Rf

Hệ số lưu giữ (Retardation factor, Retention factor)

RIA

Định lượng phóng xạ miễn dịch (radioimmunoassay)

RIT

Điều trị miễn dịch phóng xạ (radioimmunotherapy)

SCD

Casein Soyabean Digest

SE

Standard Error

SGOT

Huyết thanh Glutamic Oxaloacetic Transaminase

SGPT

Huyết thanh Glutamic Pyruvic Transaminase

SPECT

Thiết bị chụp cắt lớp điện toán bằng bức xạ đơn photon
(Single Photon Emission Computed Tomography)

TCC

Sắc ký kiểm tra (Tec-Control Chromatography)

TCCS-DPPX

Tiêu chuẩn Cơ sở Dược phẩm phóng xạ

TLC

Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

ULAKH

U lympho ác tính không Hodgkin (non-Hodgkin’s lymphoma)

ULKH

U lympho không Hodgkin (Hodgkin’s lymphoma)

VEGF

Yếu tố tăng sinh mạch (Vascular Endothelial Growth Factor)

WBC

Tế bào bạch cầu (White Blood Cell)

6


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Hiệu quả điều trị NHL bằng RIT của một số tác giả................................17
Bảng 1.2. Các kháng thể gắn phóng xạ đang được nghiên cứu................................25
Bảng 1.3. Các đồng vị phóng xạ dùng trong điều trị đích........................................28
Bảng 2.1. Khảo sát nồng độchloramin T..................................................................35
Bảng 2.2. Thứ tự thực hiện gắn kháng thể với

131

I..................................................36

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát thời gian phản ứng........................................................55
Bảng 3.2. Bảng số liệu hiệu suất gắn và tỉ lệ mol...................................................58
Bảng 3.3. Hiệu suất gắn phóng xạ theo pH.............................................................59
Bảng 3.4. Kết quả so sánh kiểm tra RCP của
Bảng 3.5. Kết quả đo phổ gamma

131

131

I-rituximab....................................70

I-rituximab.....................................................72

Bàng 3.6. Tính chất vật lý phóng xạ của

131

I-rituximab...........................................73

Bảng 3.7. Kết quả theo dõi thử vô khuẩn.................................................................74
Bảng 3.8. Kết quả kiểm tra nội độc tố vi khuẩn.......................................................74
Bảng 3.9. Tổng hợp hiệu suất gắn và độ sạch hóa phóng xạ của phức kháng thể với
phóng xạ

131

I............................................................................................................79

Bảng 3.10. Tóm tắt chỉ tiêu chất lượng của

131

I-rituximab.......................................80

Bảng 3.11. Kết quả thu tế bào bạch cầu từ các mẫu máu bệnh nhân NHL, CD20(+)85
Bảng 3.12. Tỷ lệ gắn của

131

I-rituximab gắn với CD20 trên bạch cầu máu ngoại vi

bệnh nhân NHL.......................................................................................................85
Bảng 3.13. Phân bố thuốc phóng xạ

131

I-rituximab trên chuột.................................88

Bảng 3.14. Phân bố

131

I-rituximab trên thỏ, liều tiêm 500 Ci................................89

Bảng 3.15. Phân bố

131

I-rituximab trên thỏ, liều tiêm 1000 Ci..............................91

Bảng 3.16. Phân bố

131

I-rituximab trên thỏ, liều tiêm 1500 Ci..............................93

Bảng 3.17. Phân bố

131

I-rituximab trên thỏ, liều tiêm 2000 Ci..............................94

Bảng 3.18. Phân bố

131

I-rituximab trên thỏ, liều tiêm 5000 Ci..............................96

Bảng 3.19. Diễn biến cân nặng của thỏ trong quá trình nghiên cứu.........................98
Bảng 3.20. Diễn biến nhiệt độ của thỏ trong quá trình nghiên cứu..........................99
Bảng 3.21. Số lượng hồng cầu trong máu ngoại vi của thỏ......................................99
7


Bảng 3.22. Nồng độ Hemoglobin trong máu ngoại vi của thỏ...............................100
Bảng 3.23. Số lượng bạch cầu trong máu ngoại vi của các nhóm thỏ....................100
Bảng 3.24. Số lượng tiểu cầu trong máu ngoại vi của các nhóm...........................101
Bảng 3.25. Nồng độ ure trong máu ngoại vi của các nhóm thỏ.............................102

Bảng 3.26. Nồng độ creatinin trong máu ngoại vi của các nhóm thỏ.....................102
Bảng 3.27. Nồng độ glucose trong máu ngoại vi của các nhóm thỏ......................103
Bảng 3.28. Nồng độ SGOT trong máu ngoại vi của các nhóm thỏ........................103
Bảng 3.29. Nồng độ SGPT trong máu ngoại vi của các nhóm thỏ.........................104

8


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Tế bào B ung thư có biểu hiện kháng nguyên CD20................................16
Hình 1.2. Kháng nguyên CD20 xuyên màng tế bào 4 lần........................................18
Hình 1.3. Cấu trúc của kháng thể rituximab............................................................20
Hình 1.4. Cơ chế tiêu diệt ung thư bằng bức xạ.......................................................27
Hình 1.5. Sơ đồ phân rã của

131

I..............................................................................29

Hình 2.1. Hình ảnh bệnh ULKH..............................................................................46
Hình 2.2. Cho thỏ uống lugol , đo nhiệt độ thỏ........................................................51
Hình 2.3. Sơ đồ chung quá trình nghiên cứu điều chế

131

I-rituximab.......................52

Hình 3.1. Hiệu suất gắn theo nồng độ chloramin T.................................................53
Hình 3.2. Hiệu suất gắn điều chế phức hợp

131

I-rituximab......................................55

Hình 3.3. Hiệu suất gắn theo nồng độkháng thể......................................................56
Hình 3.4. Đồ thị hiệu suất gắn kháng thể rituximab với

131

I....................................61

Hình 3.5. Tách sản phẩm theo các hoạt độ riêng.....................................................62
Hình 3.6. Đồ thị kiểm tra độ tinh khiết hóa phóng xạ của
Hình 3.7. Tách

131

131

I-rituximab.................63

I-rituximab qua cột sephadex dùng dung dịch rửa giải là phosphat

và nước muối sinh lý 0,9%......................................................................................64
Hình 3.8. Đồ thị đánh giá tính bền vững của

131

I-rituximab trước và sau khi

tách qua cột sephadex..............................................................................................65
Hình 3.9. Đồ thị độ tinh khiết hóa phóng xạ của

131

I-rituximab sau khi điều chế,

TCC, autoradiography.............................................................................................66
Hình 3.10. Đồ thị độ tinh khiết hóa phóng xạ của

131

I-rituximab sau khi bảo quản

22 ngày, TCC, autoradiography...............................................................................66
Hình 3.11. Đồ thị độ tinh khiết hóa phóng xạ của

131

I-rituximab, điện di, 20 x

200mm, 60 phút, Bioscan........................................................................................68
Hình 3.12. Độ tinh khiết hóa phóng xạ của

131

I-rituximab, TLC, Bioscan...............69

Hình 3.13. Độ tinh khiết hóa phóng xạ của

131

I-rituximab, TCC.............................69

Hình 3.14. Độ tinh khiết hóa phóng xạ của

131

I-rituximab, FPLC............................71

Hình 3.15. Phổ gamma của

131

I-rituximab...............................................................72
9


Hình 3.16. Đồ thị sắc ký điện di

131

I........................................................................75

Hình 3.17. Đồ thị sắc ký điện di phức hợp

131

I-rituximab sau 1 ngày......................76

Hình 3.18. Đồ thị sắc ký điện di phức hợp

131

I-rituximab sau 10 ngày....................76

Hình 3.19. Đánh giá tính ổn định của

131

I-rituximab bảo quản -20 C......................77

Hình 3.20. Đánh giá tính ổn định của

131

I-rituximab bảo quản 4 C.........................78

Hình 3.21. Ổn định của

131

0

0

0

I-rituximab ủ trong huyết thanh ở 37 C.........................78

Hình 3.22. Hình chụp tế bào ung thư Raji và nguyên bào sợi..................................81
Hình 3.23. Đồ thị kiểm tra hoạt tính miễn dịch của
Hình 3.24. Đồ thị gắn bão hòa

131

131

I-rituximab..........................82

I-rituximab với tế bào ung thư Raji.....................83

Hình 3.25. Hình tế bào bạch cầu lympho ở máu ngoại vi và mô bệnh học..............84
Hình 3.26. Hoạt tính gắn của

131

I-rituximab với kháng nguyên CD20.....................86

Hình 3.27. Kháng nguyên CD20-histaggắn lên agarose trên cột sắc ký...................87
Hình 3.28. Chụp xạ hình thỏ thí nghiệm trên máy SPECT......................................90
Hình 3.29. Hình chụp SPECT phân bố

131

Hình 3.30. Hình chụp SPECT phân bố

131

I-rituximab trên thỏ................................93

Hình 3.31. Hình chụp SPECT phân bố

131

I-rituximab trên thỏ................................95

Hình 3.32. Hình chụp SPECT phân bố

131

I-rituximab trên thỏ................................96

I-rituximab trên thỏ thí nghiệm..............92

Hình 3.33. Đồ thị đào thải sinh học và vật lý trên thỏ tiêm
Hình 3.34. Hình ảnh đại thể gan thận thỏ tiêm

131

I-rituximab...............97

I-rituximab................................105

Hình 3.35. Hình ảnh mô học tổ chức gan và thận thỏ tiêm

10

131

131

I-rituximab.............105


MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển và ngày càng hiện đại
củakỹ thuật chụp cắt lớp điện toán bằng bức xạ đơn photon (SPECT) và chụp cắt
lớp bằng đồng vị phát positron (PET-CT), nhiều thế hệ thuốc phóng xạ mớicũng đã
được phát triển và ứng dụng. Sự phát triển đồng bộ này đã làm đổi mới bộ mặt của
y học hạt nhân bởi chất lượng chẩn đoán và hiệu quả điều trị được nâng cao. Một
trong những nổi bật hiện nay của y học hạt nhân trong trị liệu là việc sử dụng kháng
thể đơn dòng đánh dấu với đồng vị phóng xạ dùng trong điều trị ung thư.
U lympho ác tính là bệnh ung thư phát sinh từ các tế bào bạch cầu lympho
trong các tổ chức của cơ thể người. Bệnh phát sinh và biểu hiện chủ yếu ở hệ thống
bạch huyết, tuy nhiên bệnh cũng có thể phát sinh, phát triển ở ngoài hệ thống hạch
bạch huyết và ngoài tổ chức bạch huyết như ở xương, ống tiêu hóa, não... U lympho
ác tính được chia thành hai nhóm chính là bệnh Hodgkin và u lympho ác tính không
Hodgkin. U lympho ác tính không Hodgkin có tỷ lệ mắc bệnh cao và có xu hướng
ngày càng gia tăng trên thế giới cũng như ở Việt Nam, đứng hàng thứ 5 trong các
bệnh ung thư ở nước ta. Các phương pháp điều trị u lympho ác tính không Hodgkin
hiện có là hóa trị, xạ trị và phẫu thuật nhưng kết quả chưa được như mong muốn và
tỷ lệ tử vong vẫn còn cao. Việc nghiên cứu tìm kiếm những phương thức điều trị
hữu hiệu để đẩy lùi căn bệnh ung thư nói chung cũng như bệnh u lympho ác tính
không Hodgkin nói riêng vẫn là thách thức đối với các nhà khoa học hiện nay. Nhờ
những tiến bộ của công nghệ sinh học và những hiểu biết về sinh học phân tử và
sinh học tế bào, các nhà khoa học đã tìm thấy những tổn thương ở mức độ phân tử tế bào, từ đó đưa ra những nghiên cứu ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị đặc
hiệu. Do đó, hiên nay điều trị đích đem lại hiệu quả cao trong việc tiêu diệt tế bào
ung thư, giảm thiểu ảnh hưởng có hại cho tổ chức lành. Trong bệnh u lympho ác
tính không Hodgkin, tế bào lympho B có biểu hiện quá mức kháng nguyên CD20

trên bề mặt tế bào. Trên cơ sở này, các kháng thể đơn dòng thế hệ mới được sản
xuất để điều trị bệnh và khắc phục các nhược điểm từ việc sử dụng kháng thể lấy từ
huyết thanh chuột. Kháng thể đơn dòng kháng CD20 thế hệ mới có bản chất nhân

11


hóa là Rituximab, được sản xuất và ứng dụng để điều trị bệnhu lympho ác tính
không Hodgkin típ tế bào lympho B cho kết quả tốt.Kháng thể này được gắn với
đồng vị phóng xạ

131

I bằng phương pháp đánh dấu phóng xạ sử dụng chloramin T

làm chất oxy hóa. Kháng thể gắn phóng xạ được tinh chế và kiểm tra chất lượng
theo tiêu chuẩn của thuốc phóng xạ để sử dụng lâm sàng. Đây là dược chất phóng
xạ dùng trong điều trị ung thư bằng kỹ thuật miễn dịch phóng xạ. Với thời gian bán
rã 8 ngày, phát tia gamma với năng lượng là 364 keV, tia beta với năng lượng trung
bình là 192 keV,

131

I là đồng vị phóng xạ lý tưởng cho việc chụp hình và điều trị

bệnh khi gắn với phân tử kháng thể. Phức hợp kháng thể đơn dòng gắn đồng vị
phóng xạ

131

I-rituximab khi vào máu kết hợp với kháng nguyên CD20 trên bề mặt tế

bào ung thư, phát huy tác dụng điều trị bằng cơ chế bức xạ ion hóa và cơ chế miễn
dịch mà ít ảnh hưởng tới tổ chức lành xung quanh.
Để nâng cao hiệu quả trong điều trị bệnh u lympho ác tính không Hodgkin và
với mong muốn điều chế thuốc phóng xạ

131

I-rituximab đạt các tiêu chí dược chất

phóng xạ dùng trong lâm sàng, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu điều chế,
phân bố sinh học và khả năng gắn với tế bào ung thư của phức hợp miễn dịch phóng
xạ

131

I-rituximab” nhằm các mục tiêu sau:

(1) Điều chế được dược chất phóng xạ

131

I-rituximab.
131

(2) Đánh giá chất lượng, tính đặc hiệu miễn dịch và tính an toàn của Irituximab trên động vật thực nghiệmbằng các phương pháp vật lý, hóa học và sinh
học.

12

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Bệnh u lympho ác tính không Hodgkin
Bệnh u lympho ác tính không Hodgkin là dạng ung thư các tế bào lympho B
trong hệ miễn dịch. U lympho là nhóm bệnh lý ác tính rất phổ biến. Theo các thống
kê dịch tễ học các bệnh lý ác tính, u lympho luôn nằm trong danh sách 10 loại ung
thư thường gặp nhất. Giống như các loại ung thư khác, tỷ lệ mắc u lympho liên
quan với nhiều yếu tố như tuổi tác, giới tính, chủng tộc, địa lý...v.v. Mọi lứa tuổi
đều có thể mắc bệnh này, nhưng nói chung tuổi càng cao thì nguy cơ càng lớn. Ở
Hoa Kỳ,theo thống kê của Viện Nghiên cứu ung thư Quốc gia năm 2017, bệnh u
lympho ác tính không Hodgkin có 72.2400 người mắc mới và 20.140người chết do
bệnh này, tỷ lệ mắc bệnh chuẩn là 19,5/100.000 dân. Ở Việt Nam, bệnh u lympho
ác tính không Hodgkin đứng hàng thứ 5 trong các bệnh ung thư, tỷ lệ mắc chuẩn
theo tuổi là 5,2/100.000 dân [Howlader N., 2017]. Hiện nay, cơ chế bệnh sinh u
lympho ác tính chủ yếu được thừa nhận, đó là biến đổi cấu trúc di truyền, nhiễm các
virus gây ung thư và suy giảm miễn dịch.
Biến đổi cấu trúc di truyền: Trong các tế bào của cơ thể có 2 hệ thống gen
duy trì và kiểm soát sự phát triển bình thường của tế bào, đó là hệ thống gen tiền
ung thư và gen chống ung thư. U lympho là hậu quả của sự rối loạn hoạt động một
trong hai hệ thống trên, hoặc hoạt hóa các gen tiền ung thư thành các gen ung thư,
hoặc bất hoạt các gen chống ung thư dẫn đến tình trạng tăng sinh không kiểm soát
được của tế bào lympho tạo thành u.
Về hoạt hóa hệ gen tiền ung thư, cơ chế chủ yếu là quá trình chuyển đoạn
hay hoán vị gen. Một gen bình thường gồm hai thành phần chuỗi mã hóa quyết định
việc tổng hợp protein và chuỗi điều hòa có nhiệm vụ kiểm soát hoạt động của chuỗi
mã hóa. Hoán vị gen xảy ra làm cho chuỗi mã hóa của gen tiền ung thư mất trung
tâm điều hòa và biến thành gen ung thư. Trong các gen ung thư, chuỗi mã hóa thoát
ức chế tự do sản xuất ra các oncoprotein làm cho tế bào phát triển ác tính. Một ví dụ
minh họa cho cơ chế này là sự chuyển đoạn giữa nhiễm sắc thể số 8 và nhiễm sắc

thể số 14 làm hoạt hóa gen ung thư c-myc nằm trên nhiễm sắc thể số 8. Bất thường

13


này được phát hiện thấy ở 90% các trường hợp u lympho Burkitt [Faramarz Naeim,
2013].Ngoài ra, một cơ chế khác tuy không phổ biến nhưng cũng có vai trò trong
bệnh sinh u lympho ác tính đó là đột biến gen. Đột biến gen có thể xảy ra ở gen điều
hòa hay gen mã hóa, nhưng kết quả cuối cùng là làm thay đổi cấu trúc di truyền tạo
ra các clon tế bào có nguy cơ chuyển dạng ác tính cao.
Bất hoạt hệ gen chống ung thư: Hiện tượng này cũng xảy ra thông qua các cơ
chế chuyển đoạn, hoán vị, đột biến gen...v.v. Hậu quả của các quá trình này là làm
bất hoạt các gen chống ung thư khiến chúng mất khả năng ngăn chặn sự tăng sinh
ác tính của các tế bào. Gen chống ung thư thường gặp nhất có vai trò trong cơ chế
bệnh sinh u lympho ác tính là p53. Gen này mã hóa cho việc sản xuất một
phosphoprotein kiểm soát sự tăng sinh và chết theo chương trình của tế bào. Khi
p53 bị đột biến sẽ làm thay đổi hoạt tính của protein tương ứng dẫn đến tế bào tăng
sinh không kìm hãm [Vose JM., 2017].
Nhiễm các virus gây ung thư:Người ta đã thừa nhận 3 virus có vai trò trực
tiếp trong quá trình phát sinh u lympho ác tính là Epstein-Barr virus (EBV), HHV8
và HTLV1 [Cord C., 2010]. Khi nhiễm các virus này, bộ gen của chúng tích hợp
vào DNA (deoxynucleic acid) của tế bào lympho và làm biến đổi nó, từ đó gây
chuyển dạng ác tính. Vai trò nổi bật nhất gây ác tính hóa các tế bào lympho có lẽ
thuộc về EBV. Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy những người có tiền sử mắc bệnh
tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm khuẩn hoặc có tăng hàm lượng kháng thể kháng EBV
trong máu đều có nguy cơ cao mắc bệnh u lympho [Vose JM., 2017]. Hơn nữa, DNA
của EBV được phát hiện ở gần 50% tế bào Sternberg và trên 90% trong các tổ
chức u lympho Burkitt [Claire Shannon-Lowe, 2017]. Trên thực nghiệm, EBV có
khả năng kích thích sự phát triển của lympho B cả in vitro và in vivo. Tất cả những
bằng chứng trên đã cho thấy vai trò trực tiếp của EBV trong bệnh sinh của u lympho

ác tính.Gần đây người ta phát hiện vai trò bệnh nguyên của vi khuẩn Helicobacter
pyroli đối với u lympho thể MALT (mucosa – associated lymphoid tissue: mô
lympho liên quan với niêm mạc) ở dạ dày [Vose JM., 2017]. Do vậy điều trị loại
trừ H.pylori đã đem lại hiệu quả trong điều trị u lympho thể này.

14


Vai trò của suy giảm miễn dịch:Giữa suy giảm miễn dịch và u lympho ác
tính có mối quan hệ mật thiết. Giả thuyết này được đề cập khi người ta nhận thấy tỷ
lệ mắc bệnh u lympho cao ở những đối tượng suy giảm miễn dịch, cho dù là suy
giảm miễn dịch bẩm sinh hay mắc phải. Cơ chế của hiện tượng này còn phức tạp và
chưa được hiểu biết đầy đủ. Gianluca và Ricardo (2000) cho rằng trong điều kiện hệ
thống miễn dịch của cơ thể bị suy yếu thì nguy cơ nhiễm EBV rất cao và việc xuất
hiện u lympho một phần được giải thích là do cơ thể giảm khả năng tiêu diệt các tế
bào lympho nhiễm EBV [Cord C., 2010]. Nhận định này được chứng minh khi
người ta thấy rằng số lượng lympho B nhiễm EBV tăng lên trong máu của những
đối tượng bị AIDS[Birx DL, 1986]. Giảm khả năng đáp ứng tại chỗ của tế bào
lympho T có lẽ cũng đóng vai trò quan trọng của quá trình phát sinh u lympho bởi
trên thực tế sự xâm nhập của các lympho T vào khối u giảm một cách rõ rệt ở
những người bị suy giảm miễn dịch so với các đối tượng khác.
1.2. Các phương pháp điều trị ULAKH và điều trị RIT
1.2.1. Các phương pháp điều trị U lympho ác tính không Hodgkin
Để điều trị bệnh điều trị U lympho ác tính không Hodgkin, ngoài các phương
pháp điều trị truyền thống như phẫu thuật hóa trị và xạ trị, còn có những phương
pháp điều trị mới. Các phương pháp điều trị điều trị U lympho ác tính không
Hodgkin bao gồm:
Phẫu thuật: Hiện nay, phương pháp cắt bỏ triệt để vùng hạch bị tổn thương
đã được chứng minh là ít có hiệu quả trong điều trị u lympho ác tính. Chính vì vậy,
phẫu thuật hầu như chỉ còn giới hạn trong việc giải quyết các biến chứng do hạch

phát triển to và chèn ép tại chỗ, chẳng hạn gây tắc ruột hay liệt tủy. [Nguyễn Bá
Đức, 2007].
Tia xạ:U lympho ác tính không Hodgkin được coi là bệnh mang tính chất hệ
thống, vì vậy xạ trị có vai trò tương đối hạn chế. Tuy nhiên khi áp dụng phương
pháp này ở giai đoạn sớm và mở rộng diện chiếu xạ cả ở ngoài nhóm hạch bị tổn
thương thì vẫn mang lại hiệu quả nhất định.

15


Hóa trị liệu:Hóa trị liệu đóng vai trò hàng đầu trong điều trị u lympho ác tính
bởi vì hóa trị có thể áp dụng hiệu quả ở tất cả các giai đoạn của tất cả các thể bệnh,
tỷ lệ đáp ứng và thời gian sống trung bình cao; có rất nhiều phác đồ phù hợp với các
thể bệnh khác nhau để lựa chọn, áp dụng điều trị tương đối đơn giản. Có rất nhiều
hóa chất chống ung thư đã được sử dụng trong điều trị u lympho ác tính. Tuy nhiện,
hóa trị còn gây nhiều tác dụng phụ không mong muốn.
Điều trị hóa chất liều cao:Ý tưởng hóa chất liều cao dựa trên lý thuyết cho
rằng khi tăng độ mạnh của hóa chất bằng cách dùng liều cao hơn trong một đơn vị
thời gian sẽ làm tăng khả năng diệt tế bào ung thư, từ đó sẽ cải thiện tỷ lệ đáp ứng
và kéo dài thời gian sống của bệnh nhân.Phương pháp được ứng dụng hiện nay là
sử dụng các hóa chất với liều có tác dụng điều trị mà độc tính có thể chấp nhận
được, người ta gọi là liều chuẩn. Tuy vậy, khi điều trị với liều chuẩn một số bệnh
nhân không đáp ứng hoặc tái phát sớm[Nguyễn Bá Đức, 2007].
Interferon alpha:Interferon alpha là một tác nhân sinh học có thể áp dụng
trong điều trị ULATKH độ ác tính thấp, đặc biệt là u lympho thể nang. Tác dụng
điều biến miễn dịch của interferon alpha bao gồm hoạt hóa tế bào giết tự nhiên, tăng
cường sản xuất kháng thể từ lympho B, làm cho các tế bào ung thư nhạy cảm hơn
với việc tiêu diệt theo cơ chế miễn dịch qua trung gian tế bào, ngoài ra interferon
alpha còn có tác dụng trực tiếp chống tăng sinh khối u. Interferon alpha thường
được kết hợp với hóa chất, nhưng cũng có thể được dùng đơn độc như một thuốc

củng cố sau khi bệnh đã ổn định dưới tác dụng của hóa trị liệu. Dù được sử dụng
dưới hình thức nào thì interferon alpha cũng chứng tỏ được vai trò của mình trong
việc cải thiện tỷ lệ sống sót.
Sử dụng các yếu tố tăng trưởng tạo máu:Điều trị u lympho ác tính bằng hóa
chất hay tia xạ đều có thể dẫn đến hội chứng ức chế tủy. Vì vậy, bệnh nhân phải đối
mặt với biến chứng thiếu máu, nhiễm khuẩn, xuất huyết do tình trạng giảm các
dòng tế bào máu ngoại vi. Khi sử dụng những cytokin này sẽ kích thích quá trình
phân chia, biệt hóa, trưởng thành của các tế bào gốc và các tế bào đầu dòng tạo
máu, giúp tủy xương nhanh chóng hồi phục. Chúng có thể được dùng trước, trong
hay sau quá trình trị liệu nhằm mục đích phòng ngừa và khắc phục tình trạng ức chế

16


tủy. Sự ra đời của những yếu tố tăng trưởng tạo máu như EPO (erythropoietin),
TPO (thrombopoietin), G-CSF, GM-CSF chẳng những giúp giảm nguy cơ biến
chứng trong điều trị mà còn mở ra khả năng mới cho các phương pháp điều trị hiện
đại như hóa chất liều cao hay ghép tế bào gốc tạo máu.
Ghép tế bào gốc tạo máu:Những bệnh nhân u lympho ác tính kháng thuốc
hoặc tái phát sớm sau các phương pháp điều trị kinh điển thường có tiên lượng xấu.
Tuy nhiên, những bệnh nhân này vẫn có thể được điều trị đạt lui bệnh hoàn toàn
nhờ hóa trị liệu liều cao kết hợp hoặc không kết hợp với tia xạ toàn thân (TBI: Total
body irradiation). Phương pháp này sẽ dẫn đến tình trạng ức chế tủy xương và kéo
dài, mất khả năng tự hồi phục, trong những trường hợp đó ghép tế bào gốc là một
giải pháp. Trong điều trị u lympho ác tính, ghép tế bào gốc tự thân là chủ yếu. Khi
tiến hành ghép tế bào gốc tự thân, vấn đề hòa hợp tổ chức không cần phải đặt ra
nhưng có bất lợi là nguồn ghép thường bị ô nhiễm bởi các các tế bào ung thư khiến
cho bệnh nhân có thể bị tái phát sớm[Nguyễn Bá Đức, 1995].
1.2.2. Điều trị miễn dịch phóng xạ bệnh u lympho ác tính không Hodgkin
Kháng thể đơn dòng và điều trị miễn dịch phóng xạ:Kháng thể đơn dòng gắn

với các kháng nguyên đặc hiệu trên bề mặt tế bào ung thư và phá hủy các tế bào ung
thư qua cơ chế hoạt hóa bổ thể và gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể. Hiệu lực này
không phụ thuộc vào chu kỳ phân bào, vì vậy tác dụng của kháng thể đơn dòng
không bị giới hạn ở những tế bào đang phân chia. Đặc biệt là, nếu gắn kháng thể đơn
dòng với đồng vị phóng xạ I-131 hoặc một số chất gây độc tế bào như Ricin, độc tố
bạch hầu hoặc độc tố trực khuẩn mủ xanh đã qua xử lý thì hiệu quả điều trị sẽ
tăng lên rất nhiều.Cho tới nay, kháng thể đơn dòng kháng CD20+ (Rituximab) đã
được chứng minh là có hiệu quả trong điều trị ULATKH bởi kháng nguyên
CD20+ hiện diện ở 95% u lympho tế bào B [Dong-Yeop Shin, 2016]. Rituximab
thường được dùng kết hợp với hóa chất, nhất là phác đồ CHOP tạo nên phác đồ
CHOP-R. Có thể nói sự ra đời của kháng thể đơn dòng là bước đột phá mới trong
lĩnh vực điều trị u lympho ác tính.Các tế bào ung thư trong bệnh ULATKH mang
những dấu hiệu đặc trưng bất thường, đó là kháng nguyên CD20. Kháng nguyên
CD20 đặc biệt biểu hiện trên từ
50.000 - 200.000 vị trítrên phân tử lympho bào B ác tính [Ginaldi, L., 1998], hình 1.1:
17


Hình 1.1.Tế bào B ung thư có biểu hiện kháng nguyên CD20
Do vậy, kháng thể đơn dòng kháng CD20 là thuốc lý tưởng để nhận biết
những kháng nguyên trên những tế bào ác tính đó và tiêu diệt [Grillo-Lopez, 1999],
[Gianluca C., Ricardo DF., 2000]. Năm 1979, Nadler và cộng sự đã điều trị bệnh
nhân u lymphô ác tính đầu tiên bằng kháng thể đơn dòng và đến năm 2006, Gerald
DeNardo, Sally DeNardo, David trường đại học California năm 2006 đã điều trị
thành công ca bệnh đầu tiên bằng dược chất kháng thể gắn phóng xạ [Robert M.,
David M. Goldern Berg, 2006].
Oliver Press, đã tiên phong trong việc dùng phóng xạ liều cao của

131

Igắn

kháng thể kháng CD20, để điều trị NHL [Press, O. W., 1995]. Nhưng từ khi phát
triển kỹ thuật kháng thể kháng CD20 khảm (chimeric) giữa người và chuột, gọi là
rituximab, đã tạo ra một cuộc cách mạng trong điều trị NHL và làm nền tảng cho
những nghiên cứu xa hơn trong việc dùng kháng thể đơn dòng để điều trị các ung
thư khác [Kaminski MS, 2005].
Ytrium 90 gắn ibritumomab (Zevalin) điều trị NHLđã cho phép sử dụng ở
Mỹ và sau đó là Châu Âu. Năm 2004 Iode-131 gắn tositumomab (Bexxar) [Ansell
S.M., Armitage J., 2005] và sau đó I-131 gắn rituximab cũng đã được sử dụng trong
lâm sàng. Bảng 1.2 tóm tắt hiệu quả điều trị NHL của một số tác giả [Witzig, T. E.,
Richard, L. Wahl, MD., 2005].

18


Bảng 1.1.Hiệu quả điều trị NHL bằng RIT của một số tác giả
Y-90

I-131

I-131

Rituximab

Ibritumomab

Tositumomab

Rituximab

(a)

(a)

(b)

(c)

Số bệnh nhân

70

73

60

45

Đáp ứng chung (%)

56

80

65

71

Đáp ứng hoàn toàn

16

30

20

54

12,1

14,2

6,5

#

Tỷ lệ đáp ứng

(%)
Thời gian đáp ứng
(tháng)
a: Witzig, et al. J Clin Oncol 20; 2453-63, 2002
b: Kaminski, et al. J Clin Oncol 19; 3918-28, 2001
c: Turmer, et al. Cancer Biother Radiopharm 18; 513-24,2003
Đánh giá kết quả điều trị sau hơn 5 năm ứng dụng trên lâm sàng điều trị
NHL bằng

131

I-rituximab đã có những công bố về liều lượng (1 and 4,5 GBq) và an

toàn cho bệnh nhân cũng như người thân xung quanh [Robert K.,2008], [M. F.
Leahy, 2008], [Kang HJ., 2013].
Việc nghiên cứu điều chế

131

I-rituximab và các nghiên cứu đánh giá tiền lâm

sàng dùng trong điều trị miễn dịch phóng xạ có liên quan đến kháng nguyên CD20,
kháng thể đơn dòng và đồng vị phóng xạ [Mather, S., 2000], [Kassis, A.I., 2005].
Sau đây là các tính chất cơ bản của các thành phần trong phức hợp:
Kháng nguyên CD20: Kháng nguyên CD20, còn có tên khác là B1, là một
kháng nguyên đặc hiệu đơn dòng tế bào lympho B, biểu hiện trên tế bào lympho B
ở một số giai đoạn nhất định. CD20 là một protein không glycosyl hoá có khối
lượng phân tử khoảng 33-35 kDa. Gene mã hoá CD20 nằm trên nhiễm sắc thể số
11, cánh dài, locus 12-13.CD20 là một protein có 4 vùng xoắn xuyên màng, cả 2
đầu tận NH2 và COOH đều nằm trong bào tương. Hai vòng ngoại bào của CD20 rất
19


khác nhau về kích thước. Vòng nhỏ hầu như không lộ ra khỏi màng, vòng lớn có độ
dài khoảng 46 axit amin, từ axit amin số 140 đến axit amin số 185. Trên vòng lớn
có cầu disulfid giữa axit amin số 167 và 183. Vòng này chứa đa số các epitope của
các kháng thể đơn dòng [Polyak, M. J., 1998], [Popoff, I. J., 1998]. Đến nay, chức
năng của CD20 vẫn chưa được biết một cách rõ ràng [Dillman, R. O., 2001],
[Maloney, D. G., 2001], [Deans, J. P., 2002]. Nghiên cứu trên những con chuột
có tế bào B không biểu hiện CD20 không thấy có sự suy giảm chức năng tế bào
B rõ rệt. Cấu trúc và vị trí của CD20 đã được mô tả [Ginaldi, L., 1998],

[Einfeld, D. A., 1988], (Hình1.2):

Hình 1.2. Kháng nguyên CD20 xuyên màng tế bào 4 lần
Tuy nhiên, một số nghiên cứu đã chứng minh CD20 có vai trò trung gian
trong nhiều hoạt động sinh học của tế bào B thông qua sự gắn kháng thể như: Đối
với sự di chuyển của dòng canxi vào tế bào, sự chuyển vị trí và gắn đặc hiệu
CD20 vào các “mảng” lipid sau khi CD20 gắn kháng thể là điều kiện tiên quyết
đối với sự khởi đầu quá trình dẫn truyền tín hiệu và/hoặc sự tạo thành các kênh
canxi [Kanzaki M., 1997]. Trên thực tế, khi kháng thể đơn dòng gắn với CD20, nó
khóa các chức năng này của CD20 và dẫn đến sự chết có chương trình của tế bào
(apoptosis) [Deans J. P., 2002], [Ansell S.M., 2005], [Fisher R. I., 2003]. Đối với
chu kì tế bào, kháng nguyên CD20 có vai trò quan trọng trong điều hoà sự phát

20


triển chu kì tế bào (cell cycle progression), ít nhất là ở tế bào B bình thường. Bằng
chứng là các kháng thể đơn dòng hướng đích CD20 đều gây thay đổi chu kì tế bào,
làm đẩy nhanh sự chuyển tế bào B từ pha G0 sang G1, các kháng thể đơn dòng
cùng nhóm với B1 lại ức chế sự chuyển tế bào B từ pha G1 sang pha S/G2 và pha
M [Deans J. P., 2002]. CD20 là một phân tử đích tiềm năng trong y học bởi kháng
nguyên này chỉ biểu hiện trên tế bào B; mức biểu hiện cao (khoảng 100.000 phân
tử/tế bào); không biến dạng hay đồng hóa khi gắn với kháng thể; và thường không
phát hiện ở dạng hòa tan[Dillman, R. O., 2001], [Popoff, I. J., 1998], [Einfeld, D.
A., 1998]. Ở chuột bình thường và chuột chuyển gen CD20 của người đều cho
thấy CD20 là đích hiệu quả cho sự làm giảm tế bào B. Ngoài ra, do CD20 không
biểu hiện trong các tế bào gốc tạo máu, không dễ dàng bị đồng hóa và không bị
tách rời khi gắn với kháng thể gắn phóng xạ nên là một đích hấp dẫn cho liệu
pháp miễn dịch phóng xạ [Fisher, R. I., 2003].
Kháng thể kháng CD20:Kháng thể kháng CD20 đầu tiên được FDA phê chuẩn

sử dụng trên người vào năm 1997 [McLaughlin P., 1999]. Rituximab được tạo
thành bằng kỹ thuật di truyền, dung hợp vùng biến đổi chuỗi nặng và nhẹ của chuột
với vùng hằng định IgG1/κ của người. (Hình 1.3). Kháng thể lai tạo thành có khả
năng tiêu diệt các tế bào B in vitro và làm giảm lượng tế bào B trong máu ngoại vi
in vivo. Sự giảm tế bào B trong tủy xương, lách và các hạch lympho trong đã được
nghiên cứu kỹ sau nhiều năm điều trị trên lâm sàng[ Press O. W., 1995],
[McLaughlin P., 1999].FDA phê chuẩn rituximab phần lớn dựa trên các

thử

nghiệm đối với u lympho tế bào B không Hodgkin tái phát nhẹ. Tỷ lệ đáp ứng
trong nhóm khó chữa này là khoảng 50% khi chỉ sử dụng rituximab. Sau đó, trên
380.000 trường hợp đã được kiểm chứng cho thấy độ an toàn tốt.Một số khối u ác
tính khác với đặc trưng CD20+ trên tế bào B như bệnh Hodgkin, u lympho không
Hodgkin, hội chứng Waldenstrom, cũng được điều trị bằng rituximab mang lại
hiệu quả cao [Silverman, G. J., 2003], [Plosker G. L., 2003].Kết hợp rituximab với
methotrexate hoặc cyclophosphamide có hiệu quả đặc biệt[Maloney D. G., 2001],
[Willman R. O. 1999].

21