Phân lập và tuyển chọn dòng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose 20 1 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TIỀN GIANG
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KHOA HỌC CÂY TRỒNG

ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG
VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY
CELLULOSE TỪ RÁC THẢI HỮU CƠ

Tiền Giang, tháng 12 năm 2016
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TIỀN GIANG


KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KHOA HỌC CÂY TRỒNG

ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG
VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY
CELLULOSE TỪ RÁC THẢI HỮU CƠ

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
VÕ THỊ NGỌC BÍCH

SINH VIÊN THỰC HIỆN
ĐẶNG THỊ MỸ DUYÊN
MSSV: 013142089

NGUYỄN DUY PHƯƠNG
MSSV: 013142049
LỚP DHCNSH13

Tiền Giang, tháng 12 năm 2016


MỤC LỤC
PHẦN KÝ DUYỆT
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

Võ Thị Ngọc Bích

Đặng Thị Mỹ Duyên

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ KHÓA LUẬN

………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
Tiền Giang, ngày tháng năm 2017
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU.......................................................................................1
1.1 Đặt vấn đề.........................................................................................................1
1.2. Mục tiêu đề tài.................................................................................................2
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................................................................3
2.1. Sơ lược về vấn đề môi trường.........................................................................3
2.2. Sơ lược về các biện pháp xử lý rác thải..........................................................3
2.3. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước............................................4
2.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước...............................................................4
2.3.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước..............................................................5
2.4 Giới thiệu về cellulose......................................................................................6
2.5. Tổng quan về phức hệ enzyme cellulase.........................................................7
2.6. Một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose..................................8
2.6.1. Vi khuẩn Bacillus sp..................................................................................8
2.6.2. Vi khuẩn Pseudomonas sp.........................................................................9
2.6.3. Vi khuẩn Cellulomonas sp.......................................................................10
2.6.4. Vi khuẩn Cytophara.................................................................................11
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................12
3.1.Phương tiện....................................................................................................12
3.1.1.Đối tượng nghiên cứu: Vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose...........12
3.1.2. Giả thuyết nghiên cứu.............................................................................12
3.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu...........................................................12
3.1.4. Vật liệu và hóa chất.................................................................................12
3.2. Phương pháp nghiên cứu...............................................................................13
3.2.1.Thí nghiệm 1: Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose.
...........................................................................................................................13


3.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh

phức hệ enzyme cellulase cao...........................................................................15
3.2.3.Thí nghiệm 3: Khảo sát thời gian nuôi ủ và pH môi trường ảnh hưởng
đến khả năng phân hủy cellulose của vi khuẩn.................................................16
3.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng phân hủy giấy photocopy của các
dòng vi khuẩn....................................................................................................17
3.2.5. Thí nghiệm 5: Nhận diện một số chủng vi khuẩn bằng phương pháp giải
trình tự...............................................................................................................17
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ DỰ KIẾN........................................................................18
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................20


DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1. Vi khuẩn Bacillus subitilis......................................................................9
Hình 2.2. Vi khuẩn Pseudomonas sp......................................................................10
Hình 2.3. Vi khuẩn Cellumonas sp.........................................................................10
Hình 2.4. Vi khuẩn Cytophaga sp...........................................................................11
Hình 3.1. Quy trình phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose................12


DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1: Môi trường phân lập và nuôi cấy vi khuẩn (Han và Srinivasan, 1968)....13



Luận văn tốt nghiệp ĐH

Trường ĐH Tiền Giang

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề

Ô nhiễm môi trường đã và đang trở thành một trong những vấn đề
cấp thiết và được quan tâm hàng đầu trên toàn thế giới nói chung và Việt
Nam nói riêng. Hằng ngày, một lượng lớn rác thải từ các nhà máy rác thải, xí
nghiệp, nông nghiệp, sinh hoạt gia đình không ngừng thải ra môi trường.
Đến năm 2015 Việt Nam thải ra hơn 40 triệu tấn rác thải (Bộ Tài Nguyên và
Môi trường). Rác thải là một trong những nguyên nhân chính gây ra biến
đổi khí hậu, dịch bệnh, thủng tầng ozon… và đặc biệt ảnh hưởng trực tiếp
đến nền kinh tế nước nhà và đời sống xã hội.
Một trong những thành phần chủ yếu hiện diện trong phần lớn
nguồn rác thải là Cellulose. Cellulose thường có mặt ở các dạng như: phụ
phẩm nông nghiệp (rơm, rạ, lá cây, vỏ lạc, vỏ trấu, vỏ thân ngô, xác các loại
cây lương thực,…), phụ phế phẩm công nghiệp thực phẩm (vỏ và xơ quả, bã
mía, bã cà phê, bã sắn, hạt sơ ri,…), phụ phế phẩm trong công nghiệp chế
biến gỗ (rễ cây, mùn cưa, gỗ vụn, vỏ cây,…) và các chất thải gia đình (vải,
giấy vụn, các loại thùng giấy,…).
Cellulose là một hợp chất cao phân tử được cấu tạo từ các liên kết
các mắt xích -D- Glucose, thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực
vật, khó phân hủy, việc xử lý cellulose từ rác thải hữu cơ gặp nhiều khó
khăn. Các nhà khoa học đã và đang không ngừng tìm cách xử lý tối ưu
lượng cellulose bằng các biên pháp vật lý, hóa học, sinh học nhằm giảm
thiểu ô nhiễm môi trường.
Hiện nay, để xử lý rác thải hữu cơ dùng nhiều phương pháp: chôn
lấp, ủ phân compost, đổ đống tự nhiên…. Những phương pháp này còn
nhiều hạn chế và tốn thời gian, không đạt hiệu quả cao.
Vì thế việc xử lý cellulose bằng biện pháp sinh học đang được
quan tâm và nghiên cứu nhiều nhất, phương pháp này sử dụng các vi sinh
vật và các hệ enzyme trong vai trò là chất phân hủy rác thải thành các hợp
chất đơn giản, ít độc hại, dễ xử lý, an toàn hơn. Đồng thời có thể ứng dụng
các vi sinh vật để sản xuất phân bón hữu co. Xuất phát từ thực tế này, chúng
GVHD: Võ Thị Ngọc Bích

Trang 1


Luận văn tốt nghiệp ĐH

Trường ĐH Tiền Giang

tôi thực hiện đề tài “ Phân lập và tuyển chọn 1 số chủng vi khuẩn có khả
năng phân hủy cellulose từ rác thải hữu cơ”.
1.2. Mục tiêu đề tài
Phân lập được 1 số chủng vi khuẩn phân hủy cellulose từ rác thải
hữu cơ.
Tuyển chọn được các chủng vi khuẩn có khả năng sinh phức hệ
enzyme cellulase cao.
Nhận diện một số vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose từ rác
thải hữu cơ.

GVHD: Võ Thị Ngọc Bích

Trang 2


Luận văn tốt nghiệp ĐH

Trường ĐH Tiền Giang

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về vấn đề môi trường
Một vấn đề nóng bỏng trên toàn thể giới hiện nay là tình trạng ô

nhiễm môi trường sinh thái. Nguyên nhân chính là do các hoạt động sản xuất
và sinh hoạt của con người gây ra. Ô nhiễm môi trường ngày càng trầm
trọng, đe dọa trực tiếp đến sự phát triển kinh tế - xã hội, sự tồn tại của các
thế hệ hiện tại và tương lai. Đối tượng gây ô nhiễm môi trường chủ yếu là
các hoạt động sản xuất của nhà máy trong các khu công nghiệp, hoạt động
làng nghề và sinh hoạt tại các đô thị lớn.
Tại thành phố Hà Nội, khối lượng rác sinh hoạt tăng trung bình
15% một năm, tổng lượng rác thải ra ngoài môi trường lên tới 5.000
tấn/ngày. Thành phố Hồ Chí Minh mỗi ngày có trên 7.000 tấn rác thải sinh
hoạt, mỗi năm cần tới 235 tỉ đồng để xử lý.
Ô nhiễm môi trường bao gồm 3 loại chính là: ô nhiễm đất, ô nhiễm
nước và ô nhiễm không khí. Giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường trong
thời kỳ đẩy mạnh công nghiệp hóa - hiện đại hóa hiện nay không chỉ đòi hỏi
sự cấp thiết đối với các cấp quản lý, các doanh nghiệp mà đó còn là trách
nhiệm của cả hệ thống chính trị và toàn xã hội.
Để bảo vệ môi trường thoát khỏi các hiểm họa: thủng tầng ôzon,
hiệu ứng nhà kính, ô nhiễm nguồn nước sạch, không khí, đất đai,…con
người cần phải nâng cao nhận thức gìn giữ vệ sinh môi trường và hiểu rõ vai
trò, vị trí của mình và xã hội trong hệ thống tự nhiên con người- xã hội. Xây
dựng ý thức và phát triển mọi phương pháp vật lý, hóa học, sinh học để xử
lý rác thải, nước thải môi trường. Đồng thời kết hợp việc sử dụng, bảo vệ
cùng với việc tái chế nguồn tài nguyên thiên nhiên.
2.2. Sơ lược về các biện pháp xử lý rác thải
Rác là hiểm họa của môi trường, nhưng rác cũng là vàng nếu
chúng ta biết tận dụng, khai thác và tái sử dụng. Trên thực tế, nhiều công ty
trên thế giới đã và đang thu được những khoản lợi nhuận khổng lồ từ rác.
Các nhà nghiên cứu khoa học hiện nay cũng như các trung tâm bảo vệ môi
trường đã và đang không ngừng tìm hiểu, đưa ra các biện pháp xử lý và tái
GVHD: Võ Thị Ngọc Bích

Trang 3


Luận văn tốt nghiệp ĐH

Trường ĐH Tiền Giang

chế nguồn rác thải một cách có hiệu quả nhất dựa trên cơ sở thực tế. Tất cả
ứng dụng trong sinh học, hóa học, vật lý đến các kỹ thuật máy móc thô sơ
hay hiện đại đều được sử dụng để xử lý rác thải, bảo vệ môi trường xanh
sạch đẹp.
Tại Việt Nam, từ việc xử lý rác bằng biện pháp đơn giản là chôn
lấp rác, ủ thành phân trộn đến những biện pháp khoa học: lên men phụ phẩm
rác thải thành cồn, tạo sinh khối nấm men…. Những loại rác hữu cơ cũng
được sử dụng làm phân bón. Các loại rác như nylon, bìa giấy, chai nhựa,…
sẽ được tái chế để dùng làm nguyên liệu. Còn các loại rác vô cơ khác được
tái chế thành vật liệu xây dựng nhẹ cấp thấp được dùng cho các công trình
cảnh quan đô thị.
Trên thế giới, việc xử lý rác thải đều được các nước quan tâm và
thực hiện một cách nghiêm ngặt các tiêu chuẩn đối với môi trường. Ở Đan
Mạch và Mỹ đang ngày đêm xây dựng các nhà máy lớn với mục đích xử lý
chất thải thành điện năng. Ngoài ra, ở một số nước như: Anh, Mỹ, Nhật
Bản,… đưa ra các biện pháp tối ưu, áp dụng nhiều kỹ thuật khoa học tiên
tiến để tái chể các loại rác thải thành sản phẩm có giá trị sử dụng thực tế
().
Ngày nay, với sự phát triển ngày một nâng cao của ngành công
nghệ sinh học, đặc biệt là chuyên ngành vi sinh vật, các nhà nghiên cứu khoa
học đã ứng dụng thành công một số vi sinh vật trong việc xử lý môi trường.
Các loại vi sinh vật được biết đến với khả năng tạo ra các hệ enzyme có thể
xử lý rác thải. Các chất độc hại trong môi trường bao gồm các chất có vòng

thơm như hợp chất phenol, các amin vòng, hợp chất phospho hữu cơ,... Các
hệ enzyme có thể hoạt động trên các chất ô nhiễm đặc biệt khó xử lý để loại
bỏ chúng bằng cách kết tủa hoặc chuyển chúng thành dạng khác ít độc hại.
Hơn thế nữa, chúng có thể làm thay đổi các đặc tính của chất thải về dạng dễ
xử lý hoặc chuyển thành sản phẩm có giá trị hơn. Ví dụ: enzyme protease,
lipase, cellulase,....
2.3. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước.
2.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Bacillus sp là đối tượng có khả năng sản xuất enzyme cellulase có
hoạt tính cao, sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm, phân bón,
GVHD: Võ Thị Ngọc Bích

Trang 4


Luận văn tốt nghiệp ĐH

Trường ĐH Tiền Giang

xử lý môi trường và y học. Trong khảo sát các điều kiện nuôi cấy và tách
chiết enzyme cellulase từ Bacillus subtilis, kết quả cho thấy ở 40 oC, pH=7,0
và thời gian nuôi là 30 giờ thì lượng enzyme sinh ra là lớn nhất và có thể
thủy phân mạnh mẽ nguồn cellulose (Trần Thị Ánh Tuyết và Trương Quốc
Huy, 2010).
Theo Trần Cẩm Vân (2001), cellulose được phân hủy bởi các
enzyme ngoại bào cellulase. Các nhóm vi khuẩn có khả năng phân hủy
cellulose là: Cytophaga, Cellulomonas, Clostridium, Pseudomonas. Các
giống vi khuẩn này được nghiên cứu và ứng dụng khá phổ biến trong các
quá trình làm sạch sinh học. Ngoài ra, chúng còn có khả năng tái khoáng hóa
nhiều chất bẩn hữu cơ (Kiều Hữu Anh và Ngô Tự Thành, 1985).

Cellulose là cơ chất khó bị phân hủy vì có cấu trúc rất bền và hoàn
hoàn không tan trong cả nước nóng lẫn nước lạnh. Vi khuẩn có khả năng
phân hủy cellulose vì chúng có thể tạo ra được 3 loại enzyme phân hủy được
cellulose. Tuy nhiên không phải tất cả các vi khuẩn đều có khả năng cùng
một lúc tổng hợp ra 3 loại enzyme. Có loài tổng hợp ra enzyme này nhiều,
loài khác lại tổng hợp ra enzyme khác nhiều hơn. Chính vì thế, sự phân hủy
các hợp chất cellulose trong thiên nhiên đòi hỏi rất nhiều loài vi khuẩn khác
nhau, thay phiên nhau phân hủy từng giai đoạn trong toàn bộ chuỗi chuyển
hóa các chất chứa cellulose (Nguyễn Đức Lượng và Nguyễn Thị Thùy
Dương, 2003).
Các chủng vi sinh vật phân hủy cellulose được phân lập từ đất, bùn
mía. Các chủng nấm phân lập trên môi trường Czaper-Dox có bổ sung bột
giấy, các chủng vi khuẩn được phân lập trên môi trường Lemberk và Colmer
với giấy lọc. Bằng phương pháp xác định hoạt tính cellulase ngoại bào bằng
khuếch tán trên thạch và phương pháp xác định hoạt tính cellulase theo
Nelson- Somogyi, Nguyễn Thị Kim Cúc (2001) đã phân lập được 6 chủng
nấm và 15 chủng vi khuẩn có hoạt tính cellulose.
2.3.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Cellulase, đặc biệt là EGIII và CBHI thường được dùng làm sạch
vải sợi (Clarksonet et al., 2000). Những cellulase thu nhận từ những chủng
nấm mốc: Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Trichoderma harzianum,
Humicola insolens,… hoạt động trong môi trường kiềm nhẹ thường được
GVHD: Võ Thị Ngọc Bích

Trang 5


Luận văn tốt nghiệp ĐH

Trường ĐH Tiền Giang

ứng dụng trong công nghiệp tẩy rửa (Kottwitz và Schambil, 2005). Chúng
thường được dùng kết hợp với bột giặt và chất tẩy (Uhlig, 1998).
Bakare et al. (2005) đã phân lập và định tính enzyme cellulase từ
một chủng hoang dại và hai chủng đã được gây đột biến của Pseudomonas
fluorescens. Động lực học enzyme của ba loại enzyme trên ở pH 6,5-7,0,
35oC lần lượt là 3,6; 3,1 và 5,3 mg/mL. Othman et al. (2011) đã tiến hành
thủy phân vỏ trái ca cao thành ethanol nhiên liệu. Kết quả thủy phân cao
nhất khi thủy phân vỏ trái ca cao bằng acid HCl ở 75oC trong 4 giờ. Lượng
đường sinh ra sau quá trình thủy phân được lên men bằng nấm men
Saccharomyces cerevisiae ở 30oC. Lượng ethanol thu được là 17,3% sau thời
gian lên men là 26 giờ.
Clostridium papyrosolvens cũng được phát hiện có khả năng tổng
hợp cellulase. Clostridium papyrosolvens được nuôi cấy 48 giờ trong điều
kiện kỵ khí ở 35oC cho dịch trích có hoạt tính CMCase cao. CMCase có
nhiệt độ tối thích là 35oC và pH tối thích là 6,5 đến 7,5 (Rani.D.Swaroopa,
2004).
2.4. Giới thiệu về cellulose
Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật. Ngoài ra người ta
còn thấy chúng có mặt nhiều ở một số tế bào của một số loài vi sinh vật.
Ở tế bào thực vật và ở tế bào một số loài vi sinh vật chúng tồn tại ở dạng
sợi. Cellulose không có trong tế bào động vật, chúng là một homopolymer
mạch thẳng được cấu tạo bởi các đơn vị

-D Glucose –Pyranose. Các

thành phần này liên kết với nhau bởi các glucose không phân nhánh, các
glucose này liên kết bởi β-1,4glucosidases (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Cellulose thường chứa 10.000-14.000 đơn vị glucose/phân tử và
có trọng lượng phân tử khoảng 50.000- 2.500.000 Dalton. Các phân tử

cellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút Van Der War và liên kết hydro
(Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Cellulose không tan trong nước. Khi đun nóng với acid sulfuric,
celluolose bị thủy phân thành cellubiose rồi thành - Glucose.

GVHD: Võ Thị Ngọc Bích

Trang 6


Luận văn tốt nghiệp ĐH

Trường ĐH Tiền Giang

Các phân tử glucose tạo nên sợi sơ cấp có đường kính khoảng
3nm. Các sợi sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành vi sợi (microfibrin), các vi
sợi thường tồn tại 2 vùng:
+Vùng kết tinh: Celllose có cấu trúc trật tự rất cao và rất bền
vững. Enzyme cellulase chỉ có tác dụng trên bề mặt hệ sợi này.
+Vùng vô định hình: cellulose có cấu trúc không chặt và dễ bị
tác động bởi các yếu tố bên ngoài. Enzyme cellulase có thể thủy phân vùng
này dễ dàng và làm thay đổi toàn bộ cấu trúc của chúng. Chiều dài phân tử
cellulose trong vùng này thường lớn gấp hàng chục lần so với vùng kết tinh
(Nguyễn Đức Lượng, 2004).
2.5. Tổng quan về phức hệ enzyme cellulase
Cellulose là định nghĩa chung để chỉ tất cả những enzyme có hoạt
tính thủy phân cellulose thành các đơn vị monomeric. Một số nghiên cứu đã
chỉ ra rằng hệ enzyme có khả năng thủy phân cellulose thì cũng có hoạt tính
tương tự như đối với hemicellulose (Howard et al., 2003; Lynd et al., 2002).
Cellulase phân cắt các liên kết β-1,4glucosidases của mạng lưới cellulose

theo cơ chế thủy phân acid (cho và nhận proton). Hệ thống enzyme cellulase
được chấp nhận rộng rãi hiện nay là sự đồng hoạt động của các loại enzyme
sau: endoglucanase (EC 3.2.1.4), exoglucanase hoặc cellobiohydrolase (EC
3.2.1.91), β-glucosidase (EC 3.2.1.21), oxidative cellulose và cellulose
Phosphorylase.
Các loại enzyme trong hệ enzyme cellulase thay phiên nhau phân
hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose. Mỗi một loại
enzyme chỉ tham gia thủy phân một phần phân tử cellulose.
Endoglucanases : Các nhà khoa học chia chúng thành 2 loại EgI I
và EgI II. EGI I chứa 418 amino acid , trọng lượng phân tử 48.212k Da. Các
enzyme này có thể hoạt động ở nhiệt độ khá cao và tham gia phân hủy liên
kết . β-1,4- glycosidic trong cellulose, trong lichenin β-D-glucanase. Tên gọi
khác và thủy phân các liên kết β-glucosidases của mạng lưới cellulose một
cách ngẫu nhiên để sản xuất chuỗi mới. Exoglucanases phân cắt những phân
tử cellulose được tổng hợp từ enzyme endoglucanases tại các vị trí đầu chuỗi
giải phóng ra những phân tử glucose hoặc cellobiose. β- glucosidases thủy
phân các phân tửcellodextrins và cellobiose thành glucose (Lynd et al., 2002;
GVHD: Võ Thị Ngọc Bích

Trang 7


Luận văn tốt nghiệp ĐH

Trường ĐH Tiền Giang

Howard et al., 2003; Miyamoto, 1997). Oxidative cellulose cắt phân tử
cellulose bằng những phản ứng tạo ra các gốc tự do.
Cellulose phosphorylase phân cắt các phân tử cellulose thành các
monomer bằng cách sử dụng phosphate thay vì sử dụng nước.

Hệ enzyme ngoại bào gồm 3 nhóm chính (Nguyễn Đức Lượng,
2004): Cellobiohydrolase (Cbh) gồm hai loại: Cbh I và Cbh II. Enzyme này
còn có tên khoa học khác như: 1,4β-D-glucan cellobiohydrolase,
exoglucanase, exocellulase, cellobiosidase hay avicelase. Enzyme cắt đầu
không khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose và giải phóng từng
đơn vị glucose (glucanohydrolases) hoặc cellulobiose (cellobiohydrolase).
+ Cbh I có trọng lượng phân tử là 65k Da, điểm đẳng điện là 4,4
(PI= 4,4) chứa khoảng 496 amino acid. Enzyme này tác động lên cellulose
vô định hình và cellulose kết tinh. Nhưng lại không tác động lên cellulose
biến tính như carboxymethyl-cellulose (CMC) hay hydroxyethycellulose,
cellohexaose -nitrophenyl, -glucosidie hay -glucan.
+Cbh II có trọng lượng phân tử là 53kDa, PI= 5,0, chứa khoảng
471 amino acid. Enzyme này cũng không tác động đến CMC, và có khả
năng tác động đến cellulose hòa tan và cả cellulose không hòa tan.
Endoglucanase (Egl): Các nhà khoa học chia chúng làm 2 loại Egl
I và Egl II. Egl I chứa 418 amino acid, trọng lượng phân tử 48212kDa. Egl II
chứa 418 amino acid, trọng lượng phân tử 42,2kDa. Các enzyme này có thể
hoạt động ở nhiệt độ khá cao và tham gia phân hủy liên kết -1,4-glycosidic
trong cellulose, trong và

-D-glucanase. Tên gọi khác 1,4-D-glucan-4-

glucanohydrolase, endo 1,4- -glucanase, C-cellulase, CMCase.
-glucosidase là nhóm enzyme khá phức tạp, chúng có khả năng
hoạt động ở pH rất rộng (pH 4,4-4,8), trọng lượng phân tử 50-98kDa. pI 8,4
và có thể hoạt động ở nhiệt độ cao. Tên gọi khác

GVHD: Võ Thị Ngọc Bích

Trang 8

-D-glucoside


Luận văn tốt nghiệp ĐH

Trường ĐH Tiền Giang

glucohydrolase, cellobiase. Enzyme này tham gia phân hủy cellobiose tạo
thành glucose, không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy.
2.6. Một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose.
2.6.1. Vi khuẩn Bacillus sp.
Đa số các dòng vi khuẩn Bacillus sp. đều có khả năng sinh nội bào
tử hiếu khí, Gram dương. Đặc biệt Bacillus subtlis là vi khuẩn không gây
bệnh, có sức sống cao, dễ nuôi cấy và có khả năng hình bào tử chịu nhiệt
cao. Ở điều kiện thích hợp, chúng có khả năng sản xuất một lượng lớn
enzyme cellulase. Bacillus subtilis còn có khả năng phân hủy chất hữu cơ
lắng động ở đáy ao, tác động làm giảm đáng kể lớp bùn và nhớt trong ao.
(Trần Thị Ánh Tuyết và Trương Quốc Huy, 2010)

Hình 2.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis
(Nguồn: />
2.6.2. Vi khuẩn Pseudomonas sp.
Dòng vi khuẩn Pseudomonas sp. là vi khuẩn Gram âm, đa số hình
que, có thể chuyển động bằng roi, không sinh bào tử, hô hấp hiếu khí, có
sinh độc tố toxin và có khả năng tổng hợp enzyme cellulase trong môi
trường thích hợp. Một số loài thường gặp là: Pseudomonas aeruginosa, P.
putida, P. fluorescens, P. syringae,…

GVHD: Võ Thị Ngọc Bích

Trang 9


Luận văn tốt nghiệp ĐH

Trường ĐH Tiền Giang

Hình 2.2. Vi khuẩn Pseudomonas sp.
(Nguồn: />
2.6.3. Vi khuẩn Cellulomonas sp.
Là vi khuẩn Gram dương, hình que. Chúng thường phân hủy
cellulose bằng cách tiết ra enzyme endoglucanase và exoglucanase. Quá
trình trao đổi chất của chúng là hô hấp, Cellulomonas thường sử dụng
glucose và cellulase để làm nguồn dinh dưỡng sản sinh ra acid
(Nguồn: />
Hình 2.3.Vi khuẩn Cellulomonas sp.
(Nguồn: />GVHD: Võ Thị Ngọc Bích

Trang 10


Luận văn tốt nghiệp ĐH

Trường ĐH Tiền Giang

2.6.4. Vi khuẩn Cytophara.
Các giống vi khuẩn Cytophaga có tế bào đầu nhọn, không sinh vi
kén, sống trong đất ít acid, trung tính và ít kiềm. Cytophaga là vi khuẩn
Gram âm, hình que , sinh trưởng ở điều kiện hiếu khí, có khả năng phân hủy

cellulose cao và nhanh. Vi khuẩn này thường được tìm thấy trong đất.
(Nguồn: )

Hình 2.4. Vi khuẩn Cytophaga sp.
(Nguồn: />
GVHD: Võ Thị Ngọc Bích

Trang 11


Luận văn tốt nghiệp ĐH

Trường ĐH Tiền Giang

CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1.Phương tiện.
3.1.1.Đối tượng nghiên cứu: Vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose
3.1.2. Giả thuyết nghiên cứu
Nếu đề tài thành công sẽ phân lập được chủng vi khuẩn có khả
năng phân hủy cellulose từ rác thải hữu cơ và xác định được mật độ vi khuẩn
thích hợp có thể phân hủy cellulose trong điều kiện thí nghiệm.
3.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.
-Thời gian thực hiện: 1/2017 – 5/2017
-Địa điểm thực hiện: Tại phòng thí nghiệm khoa NN&CNTP.
3.1.4. Vật liệu và hóa chất.
-Vật liệu:
+Rác thải hữu cơ (rau, củ) tại 3 huyện khác nhau của tỉnh Tiền Giang.
-Thiết bị, vật liệu, hóa chất
+Thiết bị: Tủ cấy vi sinh vật vô trùng, tủ ủ vi sinh vật, nồi khử
trùng nhiệt ướt, máy lắc mẫu, máy đo quang phổ, máy đo pH, cân điện tử,

máy ly tâm, micropipette, ống nghiệm, đĩa petri….
Một số dụng cụ khác như: que cấy, bình tam giác, que trải thủy
tinh, ống đong, đèn cồn. …

GVHD: Võ Thị Ngọc Bích

Trang 12


Luận văn tốt nghiệp ĐH

Trường ĐH Tiền Giang

*Môi trường:
Bảng 1: Môi trường phân lập và nuôi cấy vi khuẩn (Han và
Srinivasan, 1968).
Thành phần

Khối lượng (g)

CaCl2

0,05

MgSO4

0,1

KH2PO4

0,5

K2HPO4

0,5

(NH4)SO4

1,0

NaCl

6,0

CMC (Carbon Mymethyl Cellulose)

20

Agar

20

Nước cất

1 lít

+Hóa chất:
 Thuốc thử Congo Red.
 Hóa chất nhuộm gram: Crystal Violet, Cồn 70o, Iod, Fushin.
 Hóa chất chạy PCR, chạy điện di.

3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1.Thí nghiệm 1: Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy
cellulose.

 Mục tiêu: Chọn lọc những dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy nguồn
cellulose có trong dịch rác thải.
 Các bước tiến hành:
- Chuẩn bị môi trường phân lập: Môi trường phân lập vi khuẩn
(Han và Srinivasan, 1968) sau khi được pha theo thành phần và khối lượng
các chất khử trùng nhiệt ướt ở 121oC, áp suất 1 atm trong 20 phút. Sau khi

GVHD: Võ Thị Ngọc Bích

Trang 13


Luận văn tốt nghiệp ĐH

Trường ĐH Tiền Giang

khử trùng, tiến hành phân phối môi trường vào đĩa petri đã khử trùng chiếu
xạ bằng tia UV(10 phút).Trữ mẫu vào tủ lạnh khi chưa sử dụng.
- Trải mẫu và cấy chuyển: Sau khi lấy mẫu trực tiếp từ các bãi rác.
Tiến hành pha loãng mẫu. Mẫu được phân lập theo quy trình:
Thu mẫu
Trộn đều

Pha loãng mẫu 10-0-10-4
Hút 100

l

Cấy trãi trên môi trường CMC

Ủ 48 giờ, 30oC ở điều kiện hiếu khí và
kỵ khí

Chọn khuẩn lạc rời

Cấy chuyển đến vi khuẩn lạc thuần.
Kiểm tra độ thuần
Trữ mẫu
Hình 3.1. Quy trình phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose

Mỗi nồng độ pha loãng cấy trải trên 4 đĩa, hai đĩa ủ ở điều kiện
hiếu khí (một đĩa ở 30oC, một đĩa ở 55oC), hai đĩa còn lại ủ ở điều kiện kỵ
khí (một đĩa ở 30oC, một đĩa ở 55oC). Chọn khuẩn lạc đặc trưng, cấy chuyền
và khi vi khuẩn đã ròng thì được cấy sang ống nghiệm môi trường đặc tương
ứng để trữ mẫu 4oC và được xem như là một chủng.
Sau khi phân lập ta tiến hành quan sát hình thái, màu sắc khuẩn
lạc, đo kích thước khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi cấy. Đồng thời quan sát hình
dạng tế bào dưới kính hiển vi và khả năng chuyển động của vi khuẩn.
* Các bước nhuộm Gram vi khuẩn:
(Nguồn: Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2009).
Chuẩn bị tiêu bản :
GVHD: Võ Thị Ngọc Bích

Trang 14

Luận văn tốt nghiệp ĐH

Trường ĐH Tiền Giang

- Nhỏ 1 giọt nước cất đã khử trùng lên giữa lame.
- Dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn rồi cho vào giọt nước.
- Hơ nóng mặt dưới của lame trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vi
khuẩn.
Nhuộm tiêu bản:
-

Nhỏ 1-2 giọt Crystal Violet từ mẫu đã cố định, để 2 phút.
Rửa nước từ 2-3 giây, chậm nhẹ cho khô bớt nước.
Nhỏ dung dịch Iod, để 1 phút.
Rửa bằng nước cất, chậm nhẹ
Rửa bằng cồn 70° thật nhanh để tẩy màu cho đến khi giọt cồn cuối
cùng không còn màu tím.
Rửa bằng nước vài giây, chậm nhẹ bằng giấy thấm.
Nhỏ 1-2 giọt Fushin, để 1 phút.
Rửa bằng nước vài giây, chậm nhẹ bằng giấy thấm.
Quan sát dưới kính hiển vi
Quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 40 lần và ghi nhận Gram
của vi khuẩn. Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của Crystal violet
là mẫu Gram dương, có màu hồng đỏ của Fushin là mẫu Gram âm.

* Thử nghiệm catalase:
- Lấy khuẩn lạc 18-24h tuổi đặt lên lam kính sạch. Nhỏ 1 giọt
H2O2 3% phủ lên vi khuẩn và quan sát sự tạo thành bọt khí.
- Kết quả Bọt khí sủi mạnh và nhanh là catalase (+). Một số vi khuẩn
không có catalase nhưng có khả năng phân hủy H2O2 tạo thành bọt

khí nhỏ và chậm 30 giây, thì không phải là catalase (+)
3.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng
sinh phức hệ enzyme cellulase cao
 Mục tiêu: Bước đầu đánh giá về khả năng phân hủy cellulose của các
chủng vi khuẩn được phân lập từ dịch rác thải. Chọn ra một số chủng có hoạt
tính enzyme cellulase cao làm cơ sở khảo sát cho các thí nghiệm sau.

 Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí một cách ngẫu nhiên, một nhân tố là các chủng vi
khuẩn, 3 lần lặp lại.
 Các bước tiến hành: Sử dụng phương pháp đục lỗ thạch trên đĩa môi
trường thử hoạt tính enzyme cellulase (Hendrick et.al. 1995). Dùng dụng cụ
GVHD: Võ Thị Ngọc Bích

Trang 15


Luận văn tốt nghiệp ĐH

Trường ĐH Tiền Giang

đục lỗ thạch đã khử trùng có đường kính trong 5mm đục lỗ môi trường, mỗi
đĩa 3 lỗ. Sau 48 giờ được nuôi tăng sinh trong 10 ml môi trường lỏng ( Han
và Srinivasan) đối với vi khuẩn hiếu khí trên máy lắc, 150 vòng/ phút và gần
20ml đối với các dòng vi khuẩn ở điều kiện kỵ khí, ở 2 mức nhiệt độ 30oC
và 55oC, tiến hành đếm mật số tế bào vi khuẩn.
* Kiểm tra hoạt tính của enzyme cellulase
Song song với quá trình đếm mật số, tiến hành thử hoạt tính
enzyme cellulase bằng phương pháp đục lỗ và thử với thuốc thử Congo Red.
Hút 40μl dung dịch môi trường nuôi vi khuẩn, nhỏ vào đĩa thạch đã được

đục lỗ. Ủ khoảng 24 giờ ở 30oC và 55oC tương ứng với các chủng đã phân
lập trong cùng điều kiện ở thí nghiệm 1; các mẫu kỵ khí được ủ trong bình
kỵ khí. Sau đó nhuộm bằng thuốc thử Congo Red và đo đường kính vòng
tròn thủy phân. (Trần Thị Ánh Tuyết và Trương Quốc Huy, 2010).
Quan sát và ghi nhận đường kính vòng tròn thủy phân, chọn ra 8
chủng có hoạt tính enzyme cellulase cao nhất :4 chủng vi khuẩn hiếu khí (2
chủng bình nhiệt và 2 chủng ưa nhiệt), 4 chủng kỵ khí (2 chủng bình nhiệt
và 2 chủng ưa nhiệt). Các chủng được chọn để tiến hành các thí nghiệm tiếp
theo.Chỉ tiêu quan sát: đường kính vòng tròn thủy phân sau khi nhuộm với
Congo Red.
3.2.3.Thí nghiệm 3: Khảo sát thời gian nuôi ủ và pH môi trường ảnh hưởng
đến khả năng phân hủy cellulose của vi khuẩn
 Mục tiêu: Xác định thời gian nuôi ủ và pH môi trường thích hợp cho sự
sinh enzyem cellulase cao nhất.
 Bố trí thí nghiệm.
- Thời gian: Thí nghiệm được bố trí một cách ngẫu nhiên, theo thể
thức 2 nhân tố là 8 dòng vi khuẩn và 4 thời điểm 24; 36; 48; 60 giờ, 3 lần lặp
lại.
Tiến hành: Chọn ra 8 chủng vi khuẩn có hoạt tính enzyme
cellulase cao nhất qua thí nghiệm 2 và 3 để khảo sát thời gian, pH tối ưu.
Cấy mẫu vào các đĩa chứa môi trường CMC. Ủ mẫu ở điều kiện thích hợp (2
mẫu hiếu khí bình nhiệt, 2 mẫu hiếu khí ưa nhiệt, mẫu kỵ khí làm tương tự)
Sau 24; 36; 48; 60 giờ ta tiến hành thử hoạt tính enzyme cellulase.Thí
GVHD: Võ Thị Ngọc Bích

Trang 16


Luận văn tốt nghiệp ĐH

Trường ĐH Tiền Giang

nghiệm được tiến hành theo phương pháp khuếch tán trên giếng thạch tương
tự như thí nghiệm 2, tương ứng với các nghiệm thức thời gian nuôi ủ.
- pH: Thí nghiệm được bố trí một cách ngẫu nhiên, theo thể thức 2
nhân tố là 8 dòng vi khuẩn và pH với 4 mức độ 6,5; 7; 7,5; 8; 3 lần lặp lại.
Tiến hành:Chọn ra 8 dòng vi khuẩn có hoạt tính enzyme cellulase
cao nhất qua thí nghiệm 2 và 3 để khảo sát pH tối ưu. Tương tự với thí
nghiệm khảo sát thời gian. Ta điều chỉnh pH môi trường tương ứng 4 mức
độ: 6,5; 7; 7,5; 8. Ủ ở điều kiện thích hợp trong 36 giờ.
Sau khi khảo sát các điều kiện thời gian và pH nuôi cấy ta chọn ra
4 chủng vi khuẩn để làm thí nghiệm tiếp theo.
3.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng phân hủy giấy photocopy của các
dòng vi khuẩn.
 Mục tiêu:Đánh giá khả năng phân hủy của các chủng vi khuẩn với co chất
là giấy photocopy.
 Tiến hành: Chọn 4 chủng nuôi trong 50ml môi trường Mfp lỏng (0,1g
giấy photocopy đã xay mịn/ 50ml môi trường M). Nguồn giống chủng được
nuôi trong môi trường CMC lỏng trong 3 ngày, chủng với tỉ lệ 1%. Sau 7
ngày đánh giá khả năng phân giải dựa trên khối lượng khô mất đi của giấy
photocopy. Công thức tính khả năng phân giải:
(Khối lượng ban đầu – Khối lượng lúc sau)/Khối lượng ban đầu x 100
3.2.5. Thí nghiệm 5: Nhận diện một số chủng vi khuẩn bằng phương pháp
giải trình tự.
Sau khi đánh giá khả năng phân hủy của 4 chủng vi khuẩn ta chòn
2 chủng để giải trình tự và nhận diện.

 Mục tiêu: Nhận diện được một số chủng vi khuẩn có khả năng sinh
enzyme cenllulase cao.
 Tiến hành:

Chọn 2 dòng vi khuẩn,tiến hành ly trích DNA của các dòng vi
khuẩn được tuyển chọn và khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi:
27f: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’;
GVHD: Võ Thị Ngọc Bích

Trang 17