Phân lập và tuyển chọn một số chửng vi khuẩn Azotobacter

Tuyển tập Báo cáo “Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học” lần thứ 6 Đại học Đà Nẵng - 2008


300
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI
KHUẨN AZOTOBACTER CÓ HOẠT TÍNH
NITROGENAZA VÀ SINH TỔNG HỢP IAA (INDOL
AXETIC AXIT) TỪ ĐẤT THÔN BÌNH KỲ- HÒA QUÝ- NGŨ
HÀNH SƠN- TP. ĐÀ NẴNG
TO ISOLATE AND TO SELECT NITROGENASES ACTIVE BACTERIAL
GENERA AZOTOBACTER AND SYNTHESIZE AIA FROM HAMLET BINH KY-
HOA QUY- NGU HANH SON LAND

SVTH: NGUYỄN KIM ANH, lớp 04SM
PHẠM THỊ NGỌC ANH, lớp 05CSM1
LÊ THỊ THÚY HOA lớp 05CSM1
NGUYỄN THỊ QUỲNH NHƯ, lớp 05CSM1
ĐẬU THỊ TỈNH, lớp 04SM
GVHD:TS. ĐỖ THU HÀ
Khoa: Sinh- Môi trường, Trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng.

TÓM TẮT
Từ 30 mẫu đất trồng lúa, trồng rau và đất bỏ hoang… tại thôn Bình Kỳ- Hòa Quý- Ngũ Hành
Sơn- TP.Đà Nẵng, đã phân lập và tuyển chọn được 08 chủng vi khuẩn Azotobacter có khả
năng cố định đạm, trong đó có 02 chủng có khả năng sinh tổng hợp IAA. Tuyển chọn được 2
chủng có hoạt tính mạnh nhất: Chủng BK- 6 cố định đạm mạnh nhất, chủng BK- 5 sinh tổng
hợp IAA mạnh nhất. Có thể ứng dụng 2 chủng này làm phân bón vi sinh để kích thích sự sinh
trưởng của thực vật hoặc bổ sung vào các vùng đất bạc màu, nghèo dinh dưỡng để nâng cao
nguồn đạm trong đất, cải thiện sinh thái đất
SUMMARY
Laterfrom 30 soil sample is different: abandonned land rice cultivar, vegetable-raising,.at Binh

Ky hamlet, us have already been isolated and selections to 8 genera have Azotobacter
bacteria capable of nitrogen fixation, among them there iss 2 genera be capable to synthesize
AIA. can apply those active banian make cropped's growth excitation microbiological fertilizer
or additives 2 bacterial genera to ash level of nitrogen exacerbation degraded earth regions
1. Mở đầu
1.1. Đặt vấn đề
Phân bón vi sinh (PBVS) có nhiều ưu điểm nổi trội so với phân bón hóa học, ngoài tác
dụng nâng cao năng xuất và chất lượng cây trồng, tiết kiệm phân vô cơ, giảm chi phí sản xuất
thì PBVS còn góp phần quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và phát triển nền nông
nghiệp bền vững. Tuy nhiên tình hình sản xuất PBVS ở nước ta vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu
thực tiễn sản xuất của nền nông nghiệp do quy mô sản xuất nhỏ, chất lượng sản phẩm chưa
hoàn thiện và ổn định. Do dó, nghiên cứu để hoàn thiện và nâng cao chất lượng PBVS là việc
làm hết sức cần thiết. Trong đó, việc tuyển chọn, đánh giá hoạt tính của các chủng VSV là
khâu đầu tiên và quan trọng trong quy trình tạo ra chế phẩm.
Azotobacter là một loại vi khuẩn (VK) hiếu khí, sống tự do trong đất, chúng có khả năng
cố định đạm cao và không phụ thuộc vào cây chủ. Ngoài đặc điểm trên thì một số chủng thuộc
chi này còn có khả năng sinh tổng hợp nên IAA (chất kích thích sinh trưởng ở thực vật). Chính
nhờ đặc điểm quan trọng đó VK Azotobacter được ứng dụng rộng rãi trong các chế phẩm
PBVS làm tăng năng suất cây trồng.
Tuyển tập Báo cáo “Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học” lần thứ 6 Đại học Đà Nẵng - 2008



301
Xuất phát từ lý do trên chúng tôi chọn đề tài: “Phân lập và tuyển chọn một số chủng VK
Azotobacter có hoạt tính Nitrogenaza và sinh tổng hợp IAA từ đất thôn Bình Kỳ- Hòa Quý-
Ngũ Hành Sơn- TP. Đà Nẵng” nhằm tìm ra các chủng VK Azobacter đa hoạt tính để ứng dụng
cho nền nông nghiệp tại đia phương.
1.2. Mục đích của đề tài
Phân lập và tuyển chọn một số chủng VK Azotobacter có hoạt tính Nitrogenaza và sinh

tổng hợp IAA từ đất thôn Bình Kỳ- Hòa Quý- Ngũ Hành Sơn- TP. Đà Nẵng.
1.3. Nội dung của đề tài
- Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn Azotobacter có hoạt tính nitrogenaza và sinh
tổng hợp IAA (Indol Axetic Axit) từ đất thôn Bình Kỳ- Hoà Quý- Ngũ Hành Sơn- TP Đà
Nẵng.
- Nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy và hình thái của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ nuôi cấy đến sự sinh trưởng, khả năng
cố định nitơ và sinh tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
- Thăm dò ảnh hưởng của dịch nuôi cấy các chủng VK tuyển chọn đến sự nảy mầm của
hạt đậu đen.
1.4 Những đóng góp mới của đề tài
Đề tài đã đi sâu vào nghiên cứu các chủng VK Azotobacter có khả năng cố định đạm và
sinh tổng hợp IAA, có thể ứng dụng trong nông nghiệp làm phân bón vi sinh kích thích sinh
trưởng của thực vật hoặc bổ sung vào các vùng đất bạc màu để nâng cao nguồn đạm trong đất,
cải thiện hệ sinh thái đất.
2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1. Đối tượng
- Các chủng VK Azotobacter được phân lâp từ một số mẫu đất thôn Bình Kỳ- Hòa Quý-
Ngũ Hành Sơn- TP. Đà Nẵng.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp thu mẫu, theo Erogov (1983).
- Phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng VK Azotobacter , Erogov,(1983).
- Phương pháp đếm số lượng tế bào CFU/ml, theo Nguyễn Lân Dũng (1982).
- Phương pháp xác định khả năng cố định đạm của VK Azotobacter:
- Phương pháp so màu với thuốc thử Nessler, theo Lê Văn Khoa (1996).
- Phương pháp xác định hàm lượng IAA theo Miska và Skovski,1983.
- Phương pháp nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy và hình thái của các chủng VK tuyển chọn,
theo Nguyễn Lân Dũng (1988).
- Phương pháp nghiên cứu thử nghiệm dịch nuôi cấy các chủng VK tuyển chọn, Mai Thị
Hằng, (2000).

- Khóa phân loại của Bergey (1989), Gauzse và cộng sự (1983).
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng VK cố định nitơ và sinh tổng hợp IAA
3.1.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng VK Azotobacter cố định nitơ
Từ 30 mẫu đất khác nhau (trồng lúa, trồng màu, đất bỏ hoang) tại thôn Bình Kỳ- Hòa
Quý- Ngũ Hành Sơn- TP.Đà Nẵng. Chúng tôi phân lập được 08 chủng VK có khả năng cố
định nitơ, trên MT AT. Qua nghiên cứu chúng tôi nhận thấy cả 08 chủng VK phân lập được
đều thuộc chi Azotobacter.
Bảng 3.1. Hàm lượng NH
4
+
trong dịch nuôi cấy của các chủng VK Azotobacter tuyển chọn
Tuyển tập Báo cáo “Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học” lần thứ 6 Đại học Đà Nẵng - 2008


302









Hình 3.1: Hình ảnh ống giống và phản ứng màu của 08 chủng VK tuyển chọn với thuốc thử
Nessler

3.1.2. Tuyển chọn các chủng VK cố định nitơ mạnh
Sau khi sơ tuyển được 08 chủng VK Azotobacter cố định nitơ, chúng tôi tiếp tục tuyển

chọn các chủng có khả năng cố định nitơ mạnh dựa vào phản ứng màu với thuốc thử Nessler.
Kết quả có 3 chủng mạnh, 2 chủng trung bình và 3 chủng yếu. Trong đó chủng BK- 6 có khả
năng cố định đạm mạnh nhất (3,28mg/ml), chúng tôi chọn chủng này làm đối tượng cho các
nghiên cứu sau.







Hình 3.2: Hình ảnh ống giống và phản ứng màu của chủng BK- 6 với thuốc thử Nessler

3.1.3. Tuyển chọn các chủng VK Azotobacter sinh tổng hợp IAA
Từ 8 chủng VK phân lập được, chúng tôi tiếp tục tuyển chọn các chủng có khả năng sinh
tổng hợp IAA, dựa vào phản ứng màu với thuốc thử Salkowski. Kết quả, xác định được 2
chủng có khả năng sinh tổng hợp IAA. Trong đó chủng BK- 5 có khả năng sinh tổng hợp IAA
mạnh (4,313 μg/ml). Chúng tôi chọn chủng này làm đối tượng cho các nghiên cứu tiếp theo.




STT Chủng VK Hàm lượng NH
4
+
(mg/ml) Mức độ cố đinh nitơ
1 BK-1 3,10 Mạnh
2
BK-2 2,76 Trung bình
3

BK-3 2,98 Trung bình
4 BK- 4 3,14 Mạnh
5
BK-5 1,34 Yếu
6 BK-6 3,28 Mạnh
7
BK-7 1,65 Yếu
8
BK-8 1,74 Yếu
Tuyển tập Báo cáo “Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học” lần thứ 6 Đại học Đà Nẵng - 2008



303


Hình 3.3: Hình dạng ống giống và phản ứng màu của chủng BK- 5 với thuốc thử Salkowski
3.2. Đặc điểm sinh học của các chủng VK tuyển chọn
3.2.1. Đặc điểm nuôi cấy và hình thái của các chủng VK tuyển chọn

Bảng 3.3: Đặc điểm nuôi cấy và hình thái của chủng VK tuyển chọn.

Chủng
VK
Đặc điểm nuôi cấy và hình thái

Ngày xuất
hiện KL
Màu sắc KL Hình dạng KL
Nhuộm

Gram
Hình
dạng tế
bào.
BK- 5
2
- Non: Trắng trong
- Già: Trắng đục
- Bề mặt nhẵn nhầy
nhớt, khi già thì
nhăn nheo, tròn
đều.
- Gram
âm
- Hình cầu
BK- 6
5
- Non màu trắng
đục, khi già chuyển
màu vàng.
- KL lồi, bề mặt
nhẵn, nhầy nhớt
- Gram
âm
- Hình que
ngắn

Hình 3.4: Hình ảnh khuẩn lạc và hình dạng tế bào của chủng BK- 5 và BK- 6
Trên MT lỏng, dịch nuôi cấy của cả 2 chủng đều có màu trắng đục đều đặn, có cặn. Khi
già chuyển sang màu nâu đen, độ sánh cao.

3.3. Ảnh hưởng của một số yếu tố MT tới sự sinh trưởng và hoạt tính của các chủng VK
tuyển chọn
- Chủng BK- 6 có khả năng sinh trưởng và cố định nitơ mạnh (4,52mg NH
4
+
/ml) trên
MT AT sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ từ 28-30
0
C.
- Chủng BK- 5 có khả năng sinh tổng hợp IAA cao( 6,24µg/ml) trên MT nước mắm-
pepton có bổ sung 0,1% tryptophan sau 5 ngày nuôi cấy lắc ở nhiệt độ 30
0
C.

3.4. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng VK BK-5 tới sự nảy mầm của hạt đậu đen
Sau 24 h, hạt đậu đen được xử lý bằng dịch nuôi cấy của chủng BK- 5 ở nồng độ pha
loãng 10
-2
và 10
-3

. Sau 72h, tỷ lệ nảy mầm ở nồng độ pha loãng 10
-2
vượt 23% so với đối
chứng. Như vậy dịch nuôi cấy của chủng BK- 5 đã kích thích và rút ngắn thời gian nảy mầm
của hạt giống. Vì vậy, có thể ứng dụng chủng này để xử lý hạt giống trước khi gieo.
Tuyển tập Báo cáo “Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học” lần thứ 6 Đại học Đà Nẵng - 2008


304












Hình 3.5: Hình ảnh hạt đậu đen nảy mầm trong đĩa petri sau 72h

3. Kết luận:
+ Từ 30 mẫu đất tại thôn Bình Kỳ- Hòa Quý- Ngũ Hành Sơn- TP Đà Nẵng, chúng tôi
phân lập và tuyển chọn được 08 chủng VK thuộc chi Azotobacter có khả năng cố định đạm,
trong đó chủng BK- 6 có khả năng cố định đạm mạnh nhất (4,52mg NH
4
+
). Chủng BK- 5 và

BK- 6 vừa có khả năng cố định đạm, vừa có khả năng sinh tổng hợp IAA, trong đó chủng BK-
5 sinh tổng hợp IAA mạnh hơn (4,313µg/ml).
+ Từ 08 chủng VK Azotobacter trên, chúng tôi chọn được 02 chủng đầu dòng:
- Chủng BK- 6 có khả năng sinh trưởng và cố định nitơ mạnh (4,52mg NH
4
+
/ml) trên
MT AT sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ từ 28-30
0
C. KL non màu trắng đục, nhày nhớt, khi già
chuyển màu vàng nâu, TB hình que ngắn, bắt màu Gram âm.
- Chủng BK- 5 có khả năng sinh tổng hợp IAA cao( 6,24µg/ml) trên MT 5 sau 5 ngày
nuôi cấy lắc ở nhiệt độ 30
0
C. KL màu trắng đục, nhày nhớt, TB hình cầu, bắt màu Gram âm.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Muộn, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1972), Một số
phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập 1. NXB KH-KT Hà Nội.
[2] Nguyễn Thành Đạt, Mai Thị Hằng (2000), Sinh học vi sinh vật. NXB GD, Hà Nội.
[3] Egorov N.X. (1983) , Thực hành VSV ( Nguyễn Lân Dũng dịch). NXB MirMatcơva,
NXB KH-KT Hà Nội.
[4] Bergey’s Manual systermatic Baderiology, vol.4(1989).
[5] G.F. Gause T.P Preobrazenskai, M.A.Srensnicora, P.P. Terekhova, T. S. Macsimova “
Opredelitels actinomycetes”, Nauka, M.1983.
Đối chứng
Xử lý bằng dịch ở
nồng độ 10
-2