Nghiên cứu kỹ thuật tách chiết silymarin từ hạt kế sữa và axit amin từ đậu tương làm nguyên liệu cho thực phẩm chức năng tăng cường chức năng gan

1

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VA CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VA TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THI QUY

NGHIÊN CƯU KY THUẬT TÁCH CHIẾT SILYMARIN TƯ HAT KÊ
SỮA VA AXIT AMIN TƯ ĐÂU TƯƠNG LAM NGUYÊN LIÊU CHO
THỰC PHẨM CHỨC NĂNG TĂNG CƯỜNG CHỨC NĂNG GAN .
Ngành

: Sinh hoc

Chuyên nganh

: Đông vật học

Ma số

: 60420103

LUẬN VĂN THẠC SI KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS. PHẠM VIỆT CƯỜNG

Ha nội 2014


2

LỜI CẢM ƠN
Để có thể hoàn thành luận văn thạc sĩ một cách hoàn chỉnh, bên cạnh sự
nỗ lực cố gắng của bản thân còn có sự hướng dẫn nhiệt tình của quý Thầy Cô,
cũng như sự động viên ủng hô của gia đình và bạn bè trong suốt thời gian học
tập nghiên cứu và thực hiện luận văn thạc sĩ.
Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Phạm Việt

Cường- Phòng Công nghệ sinh học - Viện Hóa sinh Biển, người đa hết lòng
giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn này.
Đồng thời, tôi xin được gửi lời cảm ơn tới TS. Lê Thi Hồng Minh cùng
các anh chị em trong phòng Công nghệ sinh học - Viện Hóa sinh Biển đa tận
tình giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu để hoàn thành đề tài luận văn.
Xin chân thành biết ơn đến toàn thể quý Thầy Cô trong bô môn Vi sinh
vật học đa tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu cũng như tạo mọi điều
kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập nghiên cứu và cho đến
khi thực hiện đề tài luận văn.
Cuối cùng xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè,
những người đa không ngừng động viên, hỗ trợ và tạo mọi điều kiện tốt nhất
cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn.

Hà Nội, Ngày 21 tháng11năm 2014
Học viên

Nguyễn Thị Quy


3

MỤC LỤC
DANH MUC CAC KY HIÊU, CHƯ VIÊT TĂT ............................................. 5
DANH MUC CAC BANG................................................................................ 6
DANH MUC HINH ANH ................................................................................ 7

MƠ ĐÂU ........................................................................................................... 8
CHƯƠNG 1: TÔNG QUAN........................................................................... 10
1.1. Tông quan về silymarin............................................................................ 10
1.1.1. Cây kế sưa ............................................................................................. 10
1.1.2. Thanh phần hoa hoc cua qua kế sua...................................................... 10
1.1.3. Đặc điểm và tinh chất của flavonoid..................................................... 11
1.1.4. Tác dụng sinh học của cây kế sưa. ........................................................ 15
1.1.4.1. Sơ lược về lịch sử sử dụng cây kế sưa làm thuốc. ............................. 15
1.1.4.2. Tac dung dươc ly của silymarin và ứng dụng .................................... 16
1.1.5. Môt số nghiên cưu về tach chiết silymarin...........................................18

1.1.6. Những thành tựu trong nghiên cứu chế phẩm silymarin ...................... 19

1.2. Tông quan về protein đâu tương .............................................................. 21
1.2.1. Cây đậu tương ....................................................................................... 21
1.2.2. Thanh phần hoa hoc trong qua đâu tương............................................. 21
1.2.3. Protein đâu tương .................................................................................. 21
1.2.3.1. Thành phần Protein đậu tương ........................................................... 22
1.2.3.2. Tính chất của Protein đậu tương ........................................................ 22
1.2.4. Tac dung dươc ly cua Protein hydrolysate đậu tương .......................... 24
CHƯƠNG 2: VÂT LIÊU VA PHƯƠN PHAP ............................................... 26
2.1. Vật liệu ..................................................................................................... 26
2.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................... 26
2.1.2. Hoá chất va thiết bi ............................................................................... 26
2.2. Phương pháp............................................................................................ 27

4

2.2.1. Phương pháp chiết silymarinbằng dung môi hưu cơ ............................ 27
2.2.2. Phương pháp Sắc ký HPLC .................................................................. 28
2.2.3. Phương phap xac đinh ham lương nhom amin tư do ............................ 29
2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng axit amin tự do ............................... 30
2.2.5. Xac đinh đô đôc va hoat tinh cua chế phâm ......................................... 30
2.2.5.1. Nghiên cưu tac dung sinh hoc ........................................................... 30
2.2.5.2. Thư đôc tinh cấp ................................................................................. 30
2.2.5.3. Thư tac dung bao vê gan ................................................................... 31

2.2.5.4. Thư tac dung lơi mât .......................................................................... 31
2.2.6. Phương phap xư ly số liêu..................................................................... 32
CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ ................................................................................ 33
3.1. Xây dưng quy trinh chiết xuất silymarin ................................................. 33
3.1.1. Nghiên cưu khao sat dung môi đê chiết xuất silymarin....................... 33
3.1.2. Kết qua sắc kí HPLC............................................................................ 37
3.2. Nghiên cưu khả năng thuy phân protein bằng chế phâm enzyme ........... 40
3.3. Nghiên cưu quy trình thuy phân thu nhận axit amin tự do tư protein đâu
tương................................................................................................................ 43
3.4. Một số đặc tính sinh học của chế phẩm chứa sylimarin .......................... 48
3.4.1. Xac đinh đôc tinh cấp............................................................................ 49
3.4.2. Tac dung bao vê gan.............................................................................. 50

3.4.3. Tac dung lơi mât.................................................................................... 53
3.4.3.1. Tác dụng trên lưu lượng mật .............................................................. 53
3.4.3.2. Tác dụng trên hàm lượng cắn khô và bilirubin trong dịch mật.......... 54
CHƯƠNG 4: KÊT LUÂN VA KIÊN NGHI .................................................. 56
4.1. Kết luận .................................................................................................... 56
4.2. Kiến nghi .................................................................................................. 57
TAI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 57


5

DANH MUC CAC KY HIÊU, CHƯ VIÊT TĂT

ADN

Acid Deoxyribo Nucleic

ARN

Acid Ribonucleic

ALT

Alanine Aminotransaminase

AST

Aspartate Aminotransaminase

CCI4

Cacbon Tetrachlorid

EtOH

Ethanol

MeOH

Methanol

NaCl

Muối Natriclorua

cAMP

Cyclic Adenosine Monophosphat- Chất truyền tin

TFN-α

Tumor Necrosis Factor- Chất trung gian chinh cua phan
ưng viêm cấp

LD50

Lethal Dose- Liều lương gây ra cai chết 50% cua môt
nhom đông vật dung thử nghiêm

HPLC

Sắc ki long hiêu năng cao

SKLM

Sắc ki lơp mong

Cs

Công sư

CN

Công nguyên

TPCN

Thưc phẩm chưc năng

WHO

World Health Organization- Tô chức y tế thế giới

UV

Ultravioler- Phô tư ngoại


6

DANH MUC CAC BANG

Bảng 3.1. Kết qua khảo sát dung môi để chiết xuất silymarin ...................... 34
Bảng 3.2. Kết qua chiết xuất silymarin bằng các phương pháp khác nhau ... 35
Bang 3.3: Ham lương axit amin trong cac dich thuy phân ............................. 40
Bang 3.4: ảnh hưởng của thời gian thủy phân bột đậu tương bằng protease lên

hàm lương amin tư do ..................................................................................... 45
Bang 3.5: Kết qua kiêm tra lương amin tư do ơ bươc 3 ................................. 45
Bang 3.6: Hàm lượng axit amin tự do cua dich thủy phân đâu tương ........... 46
Bang 3.7: Hàm lượng axit amin tự do cua dich thủy phân đâu tương sau cô
đăc ................................................................................................................... 47
Bảng 3.8: Liều uống chế phẩm silymarin trong các lô chuột thực nghiệm thử
độc tính cấp ..................................................................................................... 49
Bảng 3.9: Tác dụng của chế phẩm silymarin trên hoạt đô enzym ALT huyết
thanh chuột thực nghiệm ................................................................................. 52
Bảng 3.10: Tác dụng của chế phẩm silymarin trên bilirubin huyết thanh chuột
thực nghiệm. .................................................................................................... 53
Bảng 3.11: Lưu lượng mật ở các lô chuột thí nghiệm .................................... 54

Bảng 3.12: Hàm lượng cắn khô trong dịch mật của chuột thực nghiệm ........ 54
Bảng 3.13: Hàm lượng bilirubin trong dịch mật của chuột thực nghiệm ....... 55


7

DANH MUC HINH ANH

Hinh 1.1: Môt số chất chinh trong silymarin...................................................10
Hinh 3.1: Sơ đồ quy trinh chiết suất silymarin quy mô phong thí nghiêm.....37
Hinh 3.2: Sắc ký đồ mẫu silymarinthu được sau khi tách chiết theo quy trình ở
quy mô phong thí nghiêm................................................................................38

Hinh 3.3: Sắc ký đồ mẫu silybin chuẩn...........................................................38
Hinh 3.4:Sơ đồ thuy phân protein đâu tương..................................................40
Hinh 3.5: Sơ đồ quy trinh thuy phân protein đâu tương..................................44


8

MƠ ĐÂU

Viêc dùng thuốc có nguồn gốc từ thảo dược hoặc phối hợp sử dụng thuốc
đông dược và tân dược hiện đang đươc cộng đồng rất coi trong. Do các loại
thuốc thảo dược và sự kết hợp đông –tây y không những chữa được bệnh mà

ít có tác dụng phụ. Vì vậy, thuốc có nguồn gốc thao dươc, đặc biệt là những
cây thuốc đa được dùng rộng rai theo kinh nghiệm cô truyền để chữa bệnh
được các nhà khoa học trên thế giới và Việt Nam quan tâm nghiên cứu.
Gan la môt trong nhưng cơ quan quan trọng về mặt chuyển hoa các chất
cua cơ thể con người. Một trong những chức năng quan trong cua gan la tham
gia vào quá trình giải đôc cac chất nội sinh va ngoai sinh. Trong cac trương
hơp bênh ly hay sư quá tai các chất đôc trong gan, các tế bao gan se bi huy
hoại, dẫn đến các tôn thương trên gan, dần dần làm cac tôn thương không hồi
phuc làm cho gan bị xơ, và mất chưc năng giải đôc. Bệnh gan la môt trong
nhưng bệnh phô biến trong công đồng. Co nhiều loai bênh gan trong đo
thương găp là viêm gan siêu vi, đo là một trong những bệnh truyền nhiễm phô
biến nhất trên thế giới, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng trong thập niên

này. Hiện có 6 loại virus gây viêm gan : A, B, C, D, E và G, trong đó phô biến
và nguy hiểm nhất là siêu vi B và C. Khoảng 2 tỷ người trên thế giới đa hoặc
đang nhiễm virus viêm gan B, tâp trung chu yếu ơ châu A va châu Phi. Theo
báo cáo của tô chưc y tế thế giới, viêm gan B la môt trong mươi nguyên nhân
gây tử vong nhiều nhất, khoang 1 triêu ca tư vong môi năm do bênh nay va
hơn 350 triêu ngươi mang virus nay man tinh. Có khoảng 3% dân số thế giới
nhiễm virus viêm gan C và trên 170 triệu người mang virus này man tính. Viêt
Nam la môt trong nhưng nươc co ty lê viêm gan B cao nhất trên thế giơi.
Ngươi bi viêm gan man tính có nguy cơ ung thư gan cao gấp 20 lần so với
ngươi binh thương va 40% trong số họ se tư vong vì ung thư gan [62], [63].

9

Đa có những bằng chứng cho thấy silymarin trong cây kế sưa có tác
dụng chữa bệnh xơ gan do rượu. Một trong những hoạt tính triển vọng của
silymarin là chống ung thư, vì vậy có thể sử dụng silymarin kết hợp với
phương pháp hóa trị liệu. Silymarin hoạt động như chất chống oxy hóa, bảo
vệ mô và loại bỏ chất gây độc cho gan [5], [10].
Protein đậu tương được sử dụng rộng rãi như một thành phần chức năng
trong rất nhiều loại thực phẩm chế biến bởi khả năng tạo gel và các tính chất
hóa lý, cảm quan và dinh dưỡng cao. Việc thủy phân protein các hạt họ đậu
cải thiện các đặc tính dinh dưỡng của chúng như làm chậm quá trình hư hỏng,
cải thiện cấu trúc, tăng hoặc giảm đô hòa tan, ngăn cản những tương tác

không mong muốn, loại mùi khó chịu và các thành phần độc. [27], [57].
Vi vây, để có thể sản xuất một số loại sản phẩm tăng cường chức năng
gan cũng như hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan đến gan tại Việt Nam, thay thế
các sản phẩm nhập ngoại, chinh là cơ sở để chúng tôi thực hiện đề tài:
“Nghiên cưu ky thuât tach chiết silymarin tư hat kế sưa va axit amin tư đâu
tương làm nguyên liêu cho thưc phâm chức năng tăng cương chưc năng gan.”
Muc tiêu cua đê tai
1. Nghiên cứu quy trình tách chiết Sylimarin từ hạt kế sữa.
2. Nghiên cứu quy trình thuỷ phân thu nhận axit amin tư do tư đâu tương
Nôi dung nghiên cưu
 Xây dưng quy trinh tach chiết silymarin tư hat kế sưa.
 Xây dựng quy trinh thuy phân thu nhân axit amin tư do tư đâu tương.

 Thư đô độc tính cấp cua chế phâm thu đươc.
 Chưng minh được môt số đăc tính sinh hoc cua chế phẩm.


10

CHƯƠNG 1: TÔNG QUAN

1.1. Tông quan vê silymarin
1.1.1. Cây kê sưa
Kế sưa (Sylibum marianum (L.) Gaernt) la môt loai thưc vật co hoa
thuôc ho cúc, la loai cây thảo sống môt hoăc hai năm, cao 30-150cm. Thân

thẳng và phân nhánh. Lá xanh, không có lá kèm, bóng láng, thường có nhiều
đốm trắng dọc theo các gân, mép có răng dạng gai, gai màu vàng và rất nhọn;
các lá phía trên và ở giữa ôm lấy thân; các lá ở dưới rất to, có phiến chia thuỳ
và có cuống. Cụm hoa đầu đơn độc, rộng 3-10cm. Lá bắc ngoài và giữa có
một phần phụ hình tam giác màu lục thu lại thành một gai to, ở gốc có 4-6 gai
nhỏ, ngắn hơn, ở mỗi bên. Hoa màu tím, hiếm gặp màu trắng, hơi giống nhau,
đều có 5 cánh hoa, 5 nhị và bầu 1 ô với 2 lá noan và 2 vòi nhuỵ phình ở gốc.
Qua bế hình bầu dục thuôn, dài 7-8mm, màu đen bóng có vân vàng nhiều
hoặc ít, tùy thuộc vào nguồn giống S.marianum va điều kiên canh tac [15],
[24], [26]. Ra hoa vào tháng 5 đến tháng 8 của năm thứ hai.
Cây có nguồn gốc ở Địa Trung Hải và mọc hoang dại ở nhiều nơi trên
thế giới như miền Nam và Trung Âu, Bắc Phi, Trung Đông, Ấn Độ, Trung

Quốc, Bắc và Nam Mỹ [26].
1.1.2. Thanh phân hoa hoc cua hat kê sưa
Thành phần hoa hoc chính của hat kế sưa la silymarin. Silymarin
flavonolignan la phenol tư nhiên gồm môt phần flavonoid va môt phần lignan.
Dịch chiết của hạt cây chứa khoảng 70-80% silymarin flavonolignans và
khoảng 20-30% thành phần không xác định, chủ yếu là các hợp chất
polyphenol oxy hóa và trùng hợp. Thành phần chính của tô hợp silymarin là
silybin, đồng nghĩa với silybinin. Ngoài silybin là hỗn hợp của 2
diastereomers A và B với tỉ lệ khoảng 1:1, một lượng lớn các flavonolygnants


khác có trong silymarin, đó là iosilybin, dehydrosilybin, silychristin,

silydanin, và một số flavonoids, chủ yếu là taxifolin (hình 1.1) [28].
Những tài liệu dược lý, y học và quang hóa, tranh luận rất nhiều về hiệu
qua của silymarin/silybin. Nguyên nhân chính của sự không thống nhất và
không chắc chắn về hiệu qua của silymarin/silybin là thành phần khác nhau
của chế phẩm silymarin được sử dụng trong phần lớn nghiên cứu. Các dẫn
chứng tài liệu cho thấy tỉ lệ của từng chất trong các loại silymarin khác nhau
phụ thuộc rất lớn vào nguồn S.marianum (giống cây và điều kiện trồng) và
quá trình tách chiết, xử lý. Gần đây, silymarin/silybin nhận được sự quan tâm
do các hoạt tính có lợi của nó không liên quan trực tiếp đến hiệu qua bảo vệ
gan và chống oxy hóa [28], [39], [42], [53], [54].

Hinh 1.1: Môt số chất chinh trong silymarin

1.1.3. Đặc điểm va tinh chât của flavonoid
Flavonoid là một trong những nhóm chất polyphenol thường gặp trong
thực vật, là những sắc tố phần lớn có màu vàng, tan trong nước nên có tên là


“flavonoid”. Tuy nhiên, một số sắc tố có màu xanh, đỏ, tím hoặc không màu
nhưng cũng được sắp xếp vào nhóm flavonoid vì nó cũng có đặc điểm về cấu
trúc giống nhau [2], [10].
 Tính chất lý học
Flavonoid là một hợp chất phenol có một số tính chất sau:
Flavonoid tinh khiết có dạng tinh thể hoặc dạng vô định hình, có nhiệt đô
nóng chảy nhất định, có màu vàng như flavon, chalcon hoặc không màu như

isoflavonoid, catechin, hay có màu sắc thay đổi tùy thuộc pH môi trường như
antoxyanidin (ở môi trường acidcó màu đỏ, ở môi trường kiềm có màu xanh).
Các aglycon (nhân phenol) của flavonoid hòa tan trong dung môi hữu cơ
như ether, cồn etylic, aceton và hầu như không tan trong nước.
Flavonoid ơ dạng liên kết (glycosid) hòa tan được trong nước nhưng
không tan trong ether và chloroform. Flavonoid có hương thơm và vị đắng.
Có khả năng hấp thụ tia tử ngoại nhờ hai vòng benzen A và B. Có hai dải hấp
thụ cực đại: Dải I ở bước sóng 320-380nm, dải II ở bước sóng 220-280nm.
 Tính chất hóa học
Do đặc điểm cấu tạo của flavonoid có các nhóm hydroxyl phenolic,
nhóm carbonyl, vòng thơm benzen nên chúng có khả năng phản ứng rất lớn.
Tính chất hóa học của flavonoid còn phụ thuộc vào vị trí nhóm OH, hệ nối

đôi liên hợp và các nhóm thế.
Sau đây la cac phản ứng hóa học đặc trưng của flavonoid:
*Phản ứng của nhóm hydroxyl (OH)
Tính oxy hóa: Dưới tác dụng của các chất oxy hóa ( nitrat bạc,
ferricyanit, persulfate, các gốc tự do…) hay enzym polyphenoloxydase
,flavonoid sẽ bị oxy hóa thành các gốc phenoxy ArO* (gốc tự do bền). Các
gốc này có thể dimer hóa hay phản ứng oxy hóa và các phản ứng làm bẻ gay
vòng.


Tính axit: Các flavonoid có tính acidyếu nên dễ dàng phản ứng với dung
dịch kiềm để tạo thành muối tan trong nước khi đun nóng, cho màu vàng cam

hay đỏ thắm. Antoxyan trong dung dịch amoniac hay natri cacbonate cho màu
xanh hoặc tím.
Sự tạo thành liên kết hydro: Khi không có trở ngại gì về mặt cấu trúc
không gian liên kết hydro được hình thành giữa các nhóm OH trong cùng
phân tử hoặc giữa các phân tử với nhau.
Đặc điểm này làm ảnh hưởng đến tính chất hóa học như: Điểm sôi, điểm
nóng chảy, đô hòa tan, đặc tính phô tử ngoại, cấu trúc phân tử và khả năng
phản ứng.
Phản ứng ether hóa: Ether thiên nhiên của phenol thường gặp trong thực
vật, đặc biệt là những ether etylic. Những nhóm OH phenol dễ dàng tham gia
phản ứng ether hóa.
*Phản ứng của nhóm cacbonyl

Phản ứng này đặc trưng cho các chất flavonoid có nhóm cacbonyl ở vị trí
C4 và có nối đôi ở giữa C2 và C3, điển hình là flanonol, flavon không có OH
ở C3 nên phản ứng khó hơn và cho màu nhạt nên đôi khi khó phát hiện.
Phản ứng tạo phức với kim loại: Khả năng tạo chelat với kim loại nặng
là một trong những tính chất quan trọng của flavonoid, liên quan đến hoạt tính
sinh học của chúng. Các phức màu xanh đen với molipden và sắt. Các
flavonoid có nhóm cacbonyl ở vị trí C4 và hydroxyl ở vị trí C3-C5 dễ tạo
phức với kim loại, đặc biệt với nhôm cho màu vàng hoặc vàng xanh, phát
quang ở bước sóng 365nm.


Tác dụng dươc ly của

flavonoid

Flavonoid có nhiều ứng dụng quan trọng trong y học. Những flavonoid
có hoạt tính sinh học gọi là bioflavonoid phụ thuộc vào cấu trúc của chúng.
Khi đưa flavonoid vào cơ thể sẽ sinh ra các gốc tự do bền vững hơn các gốc


tự do hình thành trong quá trình viêm nhiễm bệnh lý. Chúng có khả năng giải
tỏa các điện tử tự do trên mạch vòng của nhân thơm và hệ thống nối đôi liên
hợp, làm triệt tiêu các nguồn gốc tự do sinh ra trong quá trình viêm nhiễm, do
tính bền vững về mặt hoa học nên chúng không tham gia vào dây chuyền
phản ứng oxy hóa [23].

Flavonoid còn có tác dụng bảo vệ cho adrenalin hoạt động một cách bình
thường do chúng có khả năng tạo phức với Cu2+, có tác dụng là chất xúc tác
cho phản ứng oxy hóa adrenalin, leucholamin [23].
Flavonoid ảnh hưởng đến hệ thống nội tiết, làm tăng sức đề kháng của
cơ thể đối với tác dụng gây độc bất kể loại nào, tăng chức năng thải độc của
gan, tăng trao đổi glucose, tăng tổng hợp glucogene, ảnh hưởng đến quá trình
tổng hợp prothrombin của gan [25].
Các chất thuộc nhóm flavonoid có tác dụng làm giảm sức thấm của mạch
mao như sinh tố P, một trong những chất quan trọng đó là rutin. Rutin có tác
dụng chữa các bệnh xuất huyết mao qua n, làm cho thành mạch được bền
vững, chữa cao huyết áp tăng, cường công hiệu vitamin khỏi bị oxy hóa. Nó
còn ảnh hưởng tốt đến chuyển hóa canxi và còn chống được tia phóng xạ.

Về mặt dược lý, các bioflavonoid có tác dụng chống viêm, gian cơ trơn,
chống dị ứng, ức chế sự phát triển của ung thư, làm giảm các tổn thương xuất
huyết nhỏ trong bệnh đái đường.
Về mặt miễn dịch học, nhiều bioflavonoid có tác dụng kích thích lympho
bào, sản xuất interferol, ức chế hiện tượng thoát bọng chứa các amin hoạt
mạch từ tế bào mastocyte, ức chế sụ nhân lên của virus.
Việc nghiên cứu và ứng dụng các chế phẩm flavonoid trên thế giới ngày
càng phát triển. Ở Việt Nam đa có những nghiên cứu mà kết qua được ứng
dụng vào thực tiễn, tạo môt số thuốc chữa bệnh có hiệu qua .


1.1.4. Tác dụng sinh học của cây kê sưa.

1.1.4.1. Sơ lược về lịch sử sử dụng cây kê sưa làm thuốc.
Cao chiết kế sưa đa được sử dụng làm thuốc từ thời Hy Lạp cô đại.
Dioscorides, một nhà dược thảo học Hy Lạp thế kỷ thứ I đa viết rằng, hat kế
sua pha thành trà uống có thể chữa được rắn độc cắn. Pliney The Elder (năm
23-79 sau CN) ghi lại rằng, nước ép cây kế sưa trộn với mật ong làm thuốc lợi
mật rất tốt. Đây có thể là ghi nhận đầu tiên về tác dụng của cây kế sưa liên
quan đến gan [20].
Nhiều thế kỷ sau, kế sưa đa trở thành một cây thuốc quen thuộc ở Đức
và đa được nhắc đến trong một bản thảo tiếng Đức cô “Physica” của
Hildegarde viết năm 1150 và được xuất bản vào năm 1533. Tác giả đa viết về
công dụng của rễ, toàn cây và lá kế sưa. Một số tác giả khác như Otto
Brunfels (1534), Hieronimus Bock (1595), Jacobus Theodorus (1664) và

Adam Lonicerus (1679) đa giới thiệu dùng kế sưa để trị bệnh về gan [24] .
Vào cuối thế kỷ XVIII, Culpepper (1787) cho rằng kế sưa là thứ thuốc
tuyệt vời làm thông tắc gan, lách và vì vậy dùng rất tốt để chữa bệnh vàng da.
Giữa những năm 1772 đến 1850, một chế phẩm có tên gọi là “Cồn thuốc của
Rademacher”, cao chiết cồn hạt kế sưa đa được dùng phô biến để trị các rối
loạn về gan, lách. Tương tự, cuối thế kỷ XIX đầu thế kỷ XX, một trường đào
tạo các nhà dược thảo học tên là “Eclectic” đa dùng cao chiết kế sưa để điều
trị sung huyết gan, gian tĩnh mạch, rối loạn kinh nguyệt và các bất thường của
lá lách và thận [20], [21].
Năm 1958, các nhà khoa học người Đức bắt đầu chú ý nghiên cứu cây kế
sưa. Các nghiên cứu về tác dụng bảo vệ gan, thành phần hoạt chất và cơ chế
tác dụng đa được thực hiện. Thành phần hoạt chất trong qua kế sưa đa được

xác định là silymarin, một hỗn hợp các flavonolignan mà các chất chính là
silybin, silychristin và silydianin. Từ năm 1969, chế phẩm silymarin chiết


xuất từ hat kế sưa bắt đầu được sử dụng rộng rãi trong điều trị ở Đức và sau
đó là trên khắp thế giới. Vào những năm 1990, doanh số bán chế phẩm này ở
Đức lên tới trên 180 triệu đôla/năm. 31% số bệnh nhân mắc bệnh về gan ở
Mỹ đa dùng dược thảo mà chủ yếu là dùng kế sưa [20] .
1.1.4.2. Tac dung dươc ly của silymarin va ứng dụng
Hạt của cây kế sưa (Sylibum marianum (L.) Gaernt.) đa được sử dụng
hơn 2000 năm nay để chữa các bệnh rối loạn gan và túi mật như viêm gan, xơ
gan, vàng da và bảo vệ gan khỏi tác động có hại của hóa chất và các chất độc

ngoài môi trường như nọc rắn, côn trùng, ngô độc nấm hoặc rượu [43], [52].
 Hiệu qua bảo vệ gan: Tac dung bao vê gan cua kế sưa la do nhom
chất
mơi co hoat tinh sinh hoc đó la cac silymarin flavonolignans ma thanh phần
chinh la silymarin. Đa có những bằng chứng cho thấy silymarin có tác dụng
chữa bệnh xơ gan do rượu. Cơ chế của quá trình này do silymarin phục hồi
alanin transaminase, aspartate transaminase và bilirubin huyết thanh về mức
bình thường, giảm γ-glutamyl transpeptidase, làm tăng đáng kể vận tốc biến
đổi của lymphhoccytes và giảm rõ ràng lượng tế bào CD8+. Có thể thấy cơ
chế này dựa trên hoạt tính điều biến miễn dịch của silymarin. Silymarin cũng
được dùng để chữa xơ gan do biến chứng tiểu đường và viêm gan C man tính
cùng với các chất khác, gan nhiễm mỡ và đều cho kết qua khả quan [18].

Các cơ chế bảo vệ chống bệnh gan
- Chống oxy hóa: Khả năng chống oxy hoa của silymarin đa được chứng
minh bởi nhiều thử nghiệm. Các kết qua nhận được chỉ ra rằng silymarin là
dạng chống oxy hóa bẻ chuỗi (chain-breaking) và loại gốc tự do. Cơ chế phân
tử của hoạt tính chống oxy hóa có thể suy ra từ cấu trúc các sản phẩm nhị
trùng nhận được từ các phản ứng của silybin.


- Ức chế tạo NO: Trường hợp gan nhiễm mỡ, NO dư thừa sẽ cảm ứng sự
thiếu oxy máu và tăng độc tính đối với mononuclear macrophage hoạt tính.
Silymarin ức chế tế bào Kupffer của gan tạo NO và giảm tương tác với O2.
- Giảm hoạt tính của phospholipase và bảo vệ màng gan bằng cách

chống lại thromboxane A, làm cho mạch máu chắc, ngăn phản ứng độc của tế
bào T và tăng lượng cAMP nội bào.
- Bảo vệ màng tế bào: Thông qua phản ứng chống oxy hóa lipid.
Silymarin điều chỉnh tính lưu động của microsome gan và màng mitochondria
và giữ cho tính lưu động của màng ở trạng thái chuyển động hoàn hảo.
- Màng tế bào ổn định và trao đổi năng lượng thuận tiện: Sử dụng
silymarin làm giảm đáng kể chức năng dị thường và quá trình xơ hóa.
- Đẩy mạnh hepatic cytothesis: Silymarin có thể kết hợp với estradiol
receptor và hoạt hóa nó trong tế bào gan và kết qua là tăng hoạt tính của RNA
polymerase nội bào.
- Cytokine và chức năng miễn dịch: Hiệu qua kháng viêm và kháng xơ
hóa là do silymarin hoạt hóa tế bào hình sao (stellate) của gan và ổn định tế

bào lớn (mast). Silymarin có thể làm giảm lượng và hoạt tính cytotoxic
lymphocytes và các tế bào natural killer trong máu, điều đó cho thấy
silymarin có chức năng điều biến miễn dịch.
 Chất bảo vệ và chống ung thư : Silymarin/silybin ức chế tác dụng
gây
ung thư của nhiều loại hóa chất. Một số khối u phụ thuộc hormone steroid
cũng bị ức chế. Những kết qua nhận được khi thử nghiệm với các dòng tế
bào ung thư tuyến tiền liệt, buồng trứng…cho rằng điều chỉnh xuống thụ thể
phát triển màng trong mạch (vascular endothelial growth recptor 4 – VEGR)
và điều chỉnh lên angiopoietin-2 là các cơ chế tiềm năng chịu trách nhiệm cho
hoạt tính của các chất này [28], [45], [58].

Chất hỗ trợ trong liệu pháp chống ung thư: Một trong những hoạt tính
triển vọng của silybin là chống ung thư, vì vậy có thế sử dụng kết hợp với
phương pháp hóa trị liệu. Silybin hoạt động như chất chống oxy hóa và bảo
vệ mô và loại bỏ chất độc cho gan.
 Bảo vệ thần kinh: Nhờ hoạt tính chống oxy hóa của chất
này.
Silymarin ức chế sựu tạo thành các chất trung gian gây viêm như TFN-α và
nitric oxide và như vậy làm giảm hư tổn cho thần kinh dopaminergic. Dịch
chiết kế sưa bảo vệ thần kinh cá ngựa khỏi stress oxy hóa [40].
 Chữa và phòng chống các vấn đề dạ dày – ruột: Hiệu qua
phòng

bệnh đái đường của silymarin là do hoạt tính chống oxy hóa hoặc tăng nồng
đô glutathione tuyến tụy và huyết tương, hoặc cả hai. Silymarin là một khả
năng mới trong chữa bệnh đái tháo đường do khả năng tăng lượng insulin và
phục hồi chức năng tuyến tụy. Silymarin cũng hoạt động trong ruột kết như
các chất ức chế đặc biệt β-glucoronidase vi khuẩn đường ruột [40].
 Phòng và chữa bệnh thận: Cũng như đối với các bô phận
khác,
silymarin bảo vệ thận và chống oxy hóa.
 Phòng và chữa bệnh tim phổi: Silymarin tăng hiệu qua chữa bệnh
tim phổi khi được sử dụng kết hợp với các loại thuốc. Hiệu qua chữa bệnh
của silymarin có thể giải thích bởi tác dụng sinh học khác nhau của chất này,
đó là

ổn định màng tế bào, chống viêm và ức chế con đường arachiddonic axit.
Hiệu qua phòng bệnh của silymarin có lẽ do cơ chế gián tiếp làm giảm đáp
ứng đến histamine và kết qua là đáp ứng quá mẫn tức thì [40].
 Bảo vệ da: Cả silymarin và silybin đều biểu hiện hiêu qua bảo
vệ


chống ung thư do ánh sáng gây ra trên mô hình chuột. Cơ chế bảo vệ da được
chứng minh do khả năng làm giảm và ức chế tác dụng có hại của tia UV mặt
trời như stress oxy hóa, viêm, đáp ứng miễn dịch và tổn thương DNA cũng
như cảm ứng chương trình tự chết của tế bào [40].

 Tương tác với các thụ thể hormone steroid: Cả silymarin và
silybin
đều biểu hiên hoạt tính antiandrogenic trong dòng tế bào ung thư tuyến tiền
liệt, chúng ức chế sựu tăng sinh của tế bào ung thư phụ thuộc thụ thể
homonee steroid.
 Điều biến sự vận chuyển thuốc: Một cơ chế nhờn thuốc quan trọng
là
do protein màng, ví dụ Pgp trong tế bào động vật. Silymarin ức chế protein
này và làm tăng sự tích tụ của thuốc trong tế bào.


Điều khiển chương trình tự chết tế bào (apoptosis) và quá trình

viêm: Silybin biết đươc cảm ứng chương trình tự chết của tế bào màng
trong (endothelial) và ức chế hình thành mạch, là quá trình quan trọng để
khối u phát triển và di căn. Slymarin có hoạt tính chống xơ vữa động mạch,
có thể là
do bảo vệ lipoprotein vận chuyển cholesterol khỏi bị oxy hóa.
1.1.5. Môt sô nghiên cưu vê tach chiêt silymarin
Viêc nghiên cưu chiết xuất silymarin tư hạt kế sưa được Wagner, nha
nghiên cưu người Đưc thực hiện lần đầu tiên vào năm 1958 va chưng minh
silymarin la hôn hơp cua flavonolignans gồm silyibin, silychristin, silydianin
va các thành phần có tac dung bao vệ gan, chống xơ gan trong hat kế sưa. Tư

đo đến nay, nhiều nươc châu Âu co cây kế sưa đều đa nghiên cứu quy trinh
chiết xuất silymarin. Điểm chung của các quy trinh này la dung môt lượng rất
lớn dung môi đắt tiền và dê gây chay nô như dầu ether, aceton, methanol,
clorofom [35], [55].
Wang Xin va cs (2008) sử dung phương pháp chiết bằng dung môi EtOH
ơ cac nồng đô 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% kết hơp vơi vi song công
suất 500w trong thời gian 40, 50, 60, 70 va 80 phut, ở cac nhiêt đô khac nhau


la 70, 90, 110, 130 và 1500 C, ty lệ rắn-long lần lươt la 1:10, 1:20, 1:30, 1:40
va 1:50 đê chiết silymarin [56].

Trên thế giới cung co vai nghiên cưu được đưa ra như cua Madaus 1980
đa chiết thanh công flavonolignan bằng acetat ethyl [35]. Năm 1977 Ba Lan
công bố môt công trinh dung methanol đê chiết [29]. Trung Quốc dung cồn đê
chiết [61].
1.1.6. Những thành tựu trong nghiên cứu chế phẩm silymarin
Các chế phẩm chủ yếu của slymarin là viên nang, viên rắn, thể nhũ,
muối silymarin tiêm, hoặc phối trộn với một số tá dược khác như PEG, PVP,
cyclodextrin…[18].
Thuốc viên: Nature,s Bounty Milk Thistl, 175 mg. San xuất tai My bơi
Nature,s Bounty.
Trunature Liver Helth Complex viên nén 250mg chứa 200mg silymarin

va cac thành phần khac như bồ công anh, bôt nghê tây, N- Acetyl Cysteine.
Đươc san xuất tai Mỹ bơi Costo Wholesale Inc.
Viên nang: Hiên nay trên thi trương co rất nhiều loai như: Viên nang
Silymarin Milk Thistle 1000mg trong đó môi viên nang chưa 250 mg
silymarin va cac thanh phần khác là dầu đâu nanh, lecithin tư đâu nanh,
caramel, titanim Dioxid. San xuất tai My bơi công ty US Trusted LLC.
Viên Esteem Liver Detox 300mg san xuất tai My bơi Bio Nutrition, Inc
Bột: Hepatis B Xintai của Qua ng Châu, Trung Quốc có 5 loại thảo
dược khác nhau: Dành dành (gardenia); rễ hòe (sophora), cành cây
amoorcom, rễ danshen và silymarin.
Thuốc tiêm: Muối meglumine là sản phẩm của phản ứng giữa silibin và
amine hữu cơ. Muối Di-meta-succinate sodium có chức năng bảo vệ gan

mạnh.
Các sản phẩm khác: Hỗn hợp β-cyclodextrin (β-CD) với silymarin; chất
phân bố silymarin rắn là PVP hoặc PEG; liposome; hỗn hợp phospholipid; các
hạt nano.


Có nhiều phương pháp để chiết silymarin như ép lạnh và chiết bằng các
loại dung môi khác nhau [51] hoặc sử dụng n-hexane [52]. Mỗi phương pháp
có những lợi thế và những bất lợi khác nhau.
1.2. Tông quan vê protein đâu tương

1.2.1. Cây đậu tương

Đâu tương hay đỗ tương (tên khoa hoc Glycine max) là cây ho đâu
(Fabaceae), la loại ban đia cua Đông Á. Loai nay giàu ham lương chất đam
protein, đươc trồng đê lam thưc ăn cho ngươi va gia suc. Trên thế giới có trên
1000 loại đậu tương với nhiều đặc điểm khác nhau, hạt đậu tương có kích
thước nhỏ nhất như hạt đậu Hà lan (pea) cho tới lớn nhất giống trái anh đào
(cherry), hạt đậu có nhiều màu sắc như đỏ, vàng, xanh, nâu và màu đen [12],
[13].
Cây đâu tương là cây thưc phâm co hiêu qua kinh tế cao lai dê trồng. San phâm từ cây đâu tương đươc
sư dung rất đa dang như dung trực tiếp qua thô hoặc chế biến thanh đâu phu, ep thanh dầu đâu tương, nươc
tương, lam banh keo, sưa đâu tương...đap ưng nhu cầu đạm trong khâu phần ăn hang ngay cua ngươi cung
như gia suc [41].
Ngoai ra , cây đâu tương còn có tác dụng cai tạo đất, tăng năng suất cac cây trồng khac. Điều nay co

đươc là nhơ hoạt đông cố định N2 cua loai vi khuẩn Rhizobium công sinh trên rê cây ho đâu [12], [13].
1.2.2. Thanh phân hoa hoc trong qua đậu tương
Trong qua đâu tương co thanh phần hoa hoc chu yếu la protein , lipid, glucid, cac muối khoang Ca,
Fe, Mg, K, Na, S; cac vitamin A, B1, B2, D, E, F; cac enzyme, sap, nhưa, cellulose vơi thanh phần cu thê la:
Đô ẩm 8-10%, Protein 35-45%, Lipid 15-20%, Hydratecarbon 15-16%, Cellulose 4-6%, Vitamin A 710 UI,
Vitamin B1 300 UI, Vitamin B2 90 UI, Vitamin C 11 UI, Muối khoáng 4,6%. Hàm lượng axit amin không
thay thế trong protein đâu tương la: Tryptophan 1,1%, Leucine 8,4%, Isoleucine 5,8%, Valine 5,8%,
Threonine 4,8%, Lysine 6,0%, Methionine 1,4%, Phenylalanine 3,8%. Co chưa các acidbéo không thay thế
có giá trị dinh dưỡng cao, cu thê như acidkhông no: linoleic 52-65%, oleic 25-36%, linolenoic 2-3%, cac
aciddang no: Acidpanmitic 6-8%, stearic 3-5%, arachidoic 0,1-1,0% [7], [12], [13].

Carbohydrates trong đâu tương thường có : Các polysaccharide không

hòa tan như hemicellulose, các peptin, cellulose và các oligosaccharide như
hexose, rafinose, stachiose, verbascose. Tro của đâu tương rất giàu sắt và kẽm
[7], [12], [13].
1.2.3. Protein đâu tương


1.2.3.1. Thành phần Protein đậu tương
Sau khi hoà tan trong nước hoặc ở pH kiềm nhẹ, các protein của đâu
tương có thể tách ra nhiều đoạn bằng các sắc kí thấm gel, bằng điện di, bằng
siên li tâm…..Với phương pháp siên li tâm người ta tách ra được 4 đoạn ứng
với các hệ số sa lắng S20,W là 2S, 7S, 11S, 15S. Trong đo thanh phần chinh la
globulin 7S và 11 S, hay con gọi la -conglixinin va glixinin chiếm trên 70%

tổng lượng protein của hạt. Lương glixinin chiếm 60% trong tông lương
protein chiếm giư va -conglixinin chiếm 40% con lai. Glixinin gồm năm
tiêu đơn vi có nồng đô acid amino 3-4,5%, ngươc lai -conglixinin gồm ba
tiêu đơn vi chưa it hơn 1% axit amin S [34].
Trong thực phẩm có PH trung tính và không gia nhiệt thì các globulin 7S
và 11S nói chung đều ở trạng thái hoạt động, không bị biến tính, phân tử ở
dạng dime (7S) và oligome (11S) vì lực ion yếu. Các xử lí nhiệt và thay đổi
PH se lam cho protein bi biến tinh va cac cấu truc bâc cao bi pha huy.
1.2.3.2. Tính chất của Protein đậu tương
 Sự phân li va sự tập hợp của protein đậu tương
Khi đun nóng dung dịch -conglixinin loang ở pH=7-8 và lực ion yếu,
đến 1000C thì các phân tử của chúng sẽ phân li thành các dưới đơn vị mà

không kèm theo các hiện tượng tập hợp phân tử.
Khi gia nhiệt đến 1000C dung dịch glixinin có nồng đô loang(<1%P/V(
số gam chất tan trên 100ml thê tich cua dung dịch) ), ở pH=7-7,6 và lực ion
0,2-0,4 thì các phân tử cũng phân li thành các dưới đơn vị và sau đó thì tập
hợp lại.
Khi đun nóng đến 800C một dung dịch vừa chứa glixinin và conglixinin có nồng đô loang (<1%P/V) ở PH =8 thì các phản ứng phân li và
tập hợp sẽ xảy ra.


 Sự tạo gel của protein đậu tương
Khi dung dịch protein đâu tương có nồng đô đậm đặc (>5% P/V) được
đun nóng ở PH gần trung tính thì sẽ tao gel. Dung dịch đầu tiên qua một trạng

thái lỏng có đô nhớt tăng cao, giai đoạn tiền gel. Khi lực ion còn yếu thì trạng
thái này sẽ xảy ra từ 700C là thời điểm mà -conglixinin được gian mạch hoàn
toàn. Khi lực ion cao thì việc tăng đô nhớt chỉ xảy ra ở nhiệt đô cao hơn. Việc
tạo thành gel protein sẽ phụ thuộc vào cân bằng giữa liên kết protein – nước
và liên kết protein – protein.
Đô cứng của gel protein đậu nành sẽ giảm cùng nồng đô NaCl và khi ơ
nhiêt đô qua cao.
Axit hoá dung dịch protein đâu tương đến pH =5,5 hoặc thêm ion Ca2+sẽ
làm đông tụ protein thành từng cục tương đối đàn hồi. Nếu đun nóng các cục
đa thu được bằng kết tủa đẳng điện hoặc bằng canxi sẽ làm các chuỗi
polypeptide bị gian mạch và tạo nên một mạng lưới protein ba chiều có kết
cấu của một gel thực thụ.

 Một vài tính chất khác
Protein đâu tương cực kỳ bền nhiệt, có thể chịu nhiệt đến 77oC. Tuy
nhiên ở nhiệt đô đó protein không thể tan trở lại. Protein đâu tương có thể bền
nhiệt đến 100oC khi thêm vào các yếu tố làm tăng lực ion.
Trong phần lớn các ứng dụng của đâu tương, việc gia nhiệt thấp để vô
hoạt các enzym là cần thiết.Tuy nhiên trong một vài ứng dụng, khi protein
đâu tương gia nhiệt ở nhiệt đô thấp va thêm vào đo các chất có chứa
lipoxygenase hoạt động thi xảy ra sự oxy hóa. Sự ôxy hóa này có thể gây ra
sự phá hủy màu sắc và vì thế se dân đến mất mau sản phẩm. Nó cũng có thể
gây ra sự oxy hóa những nhóm sunfit tự do từ liên kết disunfua. Cả 2 chức
năng này đều quan trọng trong việc chuẩn bị bột nguyên liệu cho công nghiệp
làm bánh.