Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon lên sự sinh trưởng, phát triển của lan vũ nữ oncidium kozumit delight in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG
ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM KHOA
CNSH – TP – MT

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN CARBON
LÊN SỰ SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN CỦA LAN
VŨ NỮ ONCIDIUM KOZUMIT DELIGHT IN VITRO

Ngành

:

Công nghệ sinh học

Chuyên ngành:

Công nghệ sinh học

GVHD :

Th.S. Trịnh Thị Lan Anh

SVTH :

Phan Hồng Nhung

Lớp

15HSH01

:

TP. HCM, 08/2016


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan nội dung trong đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên
cứu thực sự của tôi dưới sự hướng dẫn của ThS. Trịnh Thị Lan Anh – giảng viên
Trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Đề tài được thực hiện trên
cơ sở nghiên cứu lý thuyết và tiến hành nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí
nghiệm Công Nghệ Sinh Học Thực Vật, khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm
– Môi Trường, thuộc Trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Các
số liệu và bảng trong bài là hoàn toàn trung thực.
Đồ án không sao chép dưới bất kỳ hình thức nào, nếu phát hiện có bất kì
gian lận nào tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.

TP.HCM, ngày tháng năm 2016
Sinh viên thực hiện

Phan Hồng Nhung

i


LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến Quý Thầy Cô ở Khoa Công
Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường của trường Đại học Công nghệ
Thành Phố Hồ Chí Minh đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình đã truyền
đạt vốn kiến thức quý báu cho em trong suốt thời gian học tập tại trường. Với

vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá
trình nghiên cứu đồ án mà còn là hành trang quí báu để em bước vào đời một
cách vững chắc và tự tin.
Đặc biệt cho phép em bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS. Trịnh Thị Lan
Anh – người đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu và
cung cấp những tư liệu quý giá cho em thực hiện tốt bài đồ án tốt nghiệp này.
Cảm ơn cô đã tiếp thêm cho em niềm tin và nghị lực để định hướng cho tương
lai.
Qua bài đồ án này, em cũng xin chân thành cảm ơn ban giám hiệu trường
Đại học Công nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho em tiếp cận và
học hỏi nhiều kinh nghiệm trong quá trình làm đồ án. giúp em nắm vững những
kiến thức đã học. Bên cạnh đó, em cũng xin cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành và
thầy Nguyễn Trung Dũng cán bộ phòng thí nghiệm đã giúp đỡ em trong suốt thời
gian làm đồ án. Cảm ơn các bạn phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đã giúp
đỡ, hỗ trợ mình trong suốt quá trình làm đồ án.
Cuối cùng em kính chúc Quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành công
trong sự nghiệp trồng người.
TP.Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2016
Sinh viên thực hiện đồ án

Phan Hồng Nhung

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN………………………………………………………………...i
LỜI CÁM ƠN……………………………………………………………………ii
MỤC LỤC……………………………………………………………………….iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT………………………………………………...vi

DANH MỤC BẢNG……………………………………………………………vii
DANH MỤC HÌNH…………………………………………………………......ix
DANH MỤC BIỂU ĐỒ………………………………………………………...xi
MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………1
1. Đặt vấn đề……………………………………………………………………..1
2. Mục đích nghiên cứu………………………………………………………….3
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu………………………………………..…...3
4. Phương pháp nghiên cứu……………………………………………………...3
5. Kết quả đạt được……………………………………………………………....3
6. Kết cấu của đề tài……………………………………………………………...4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………………..5
1.1. Khái niệm nhân giống in vitro………………………………………………..5
1.2. Nguồn carbon…………………………………………………………….......5
1.3. Giới thiệu một vài nguồn carbon…………………………………………….6
1.3.1. Glucose…………………………………………………………………….6
1.3.2. Fructose……………………………………………………………………8
1.3.3. Lactose……………………………………………………………………9
1.3.4. Manitol…………………………………………………………………...11
1.3.5. Sorbitol…………………………………………………………………...12
1.4. Vai trò của nguồn carbon cho sự tăng trưởng và phát triển của cây trong
nuôi cấy in vitro…………………………………………………………...14
3


1.4.1. Giới thiệu vai trò của nguồn carbon trong nuôi cấy in vitro………………13
1.4.2. Vai trò của nguồn carbon cho sự tăng trưởng và phát triển của cây
trong nuôi cấy in vitro……………………………………………………..16
1.5. Ảnh hưởng của nguồn carbon trong nuôi cấy in vitro………………………18
1.6. Tình hình sản xuất, giá trị kinh tế hoa lan trên thế giới và Việt Nam………20
1.6.1. Tình hình sản xuất lan trên thế giới……………………………………….20

1. 6.2. Tình hình sản xuất lan ở Việt Nam………………………………………21
1.6.3. Tình hình sản xuất lan Vũ nữ……………………………………………..23
1.7. Giới thiệu về lan Vũ nữ……………………………………………………..23
1.7.1. Phân loại khoa học………………………………………………………..23
1.7.2. Nguồn gốc và sự phân bố…………………………………………………24
1.7.3. Đặc điểm hình thái sinh học………………………………………………25
1.7.4. Điều kiện sinh thái của lan Vũ nữ………………………………………...27
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP……………………………..30
2.1. Địa điểm tiến hành đề tài……………………………………………………30
2.2. Vật liệu nghiên cứu…………………………………………………………30
2.2.1. Vật liệu……………………………………………………………………30
2.2.2. Môi trường nuôi cấy………………………………………………………30
2.2.3. Điều kiện thí nghiệm……………………………………………………...30
2.3. Phương pháp………………………………………………………………...31
2.3.1. Cách pha môi trường……………………………………………………...31
2.3.2. Hấp khử trùng……………………………………………………………..31
2.4. Bố trí thí nghiệm…………………………………………………………….32
2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của glucose lên khả năng tăng trưởng
và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)….32
2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của fructose lên khả năng tăng trưởng
và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight…..33
2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của lactose lên khả năng sinh trưởng
và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)….33
4


2.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của manitol lên khả năng tăng trưởng
và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)…34
2.4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của sorbitol lên khả năng sinh trưởng
và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)….35

2.5. Chỉ tiêu theo dõi…………………………………………………………….36
2.6. Thống kê và xử lý số liệu…………………………………………………...36
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………………………………….37
3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo
cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)………….37
3.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo
cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)………….44
3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo
cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)…………..51
3.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo
cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)………….58
3.5. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của sorbitol lên khả năng tăng trưởng và tạo
cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)………….64
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………….73
4.1. Kết luận……………………………………………………………………..73
4.2. Kiến nghị……………………………………………………………………73
TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................75

5


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
EU

European Union

Tp. HCM

Thành phố Hồ Chí Minh

DNA

Deoxyribonucleic acid

P

Phường

Q

Quận

MS

Murashige và Skoog (1962)

NAA

Naphthyl acetic acid

BA

6-benzylaminopurine

2,4-D

2,4-dichlopophenoxyacetic acid

6

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo
cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)……..32
Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo
cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)……..33
Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo
cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)…….34
Bảng 2.4. Khảo sát ảnh hưởng của manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo
cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)……..35
Bảng 2.5. Khảo sát ảnh hưởng của sorbitol lên khả năng tăng trưởng và tạo
cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)…….35
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của đường glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo
cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight
sau 12 tuần nuôi cấy…………………………………………………..38
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của đường fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo
cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight
sau 12 tuần nuôi………………………………………………………45
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của đường lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo
cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight
sau 12 tuần nuôi cấy…………………………………………………53
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của đường manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo
cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight
sau 12 tuần nuôi cấy…………………………………………………59

vii


Bảng 3.5. Ảnh hưởng của đường sorbitol lên khả năng tăng trưởng và tạo

cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight
sau 12 tuần nuôi cấy…………………………………………………..66

8


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Lan Vũ nữ……………………………………………………………..24
Hình 1.2. Rễ của lan Vũ nữ……………………………………………………...25
Hình 1.3. Thân của lan Vũ nữ…………………………………………………...26
Hình 1.4. Hoa lan Vũ nữ………………………………………………………...27
Hình 3.1. Ảnh hưởng của đường glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo
cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight.
Sau 12 tuần nuôi cấy (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với
nồng độ đường glucose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)……………………40
Hình 3.2. Ảnh hưởng của đường glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo
cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight.
Sau 12 tuần nuôi cấy (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với
nồng độ đường glucose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)…………………..41
Hình 3.3. Ảnh hưởng của đường fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo
cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight.
Sau 12 tuần nuôi cấy (B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với
nồng độ đường fructose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)…………………47
Hình 3.4. Ảnh hưởng của đường fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo
cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight.
Sau 12 tuần nuôi cấy (B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với
nồng độ đường fructose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)…………………48
Hình 3.5. Ảnh hưởng của đường lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo
cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight.

Sau 12 tuần nuôi cấy (C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với
9


nồng độ đường lactose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)……………………55
Hình 3.6. Ảnh hưởng của đường lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo
cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight.
Sau 12 tuần nuôi cấy (C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với
nồng độ đường lactose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)……………………..56
Hình 3.7. Ảnh hưởng của đường manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo
cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight.
Sau 12 tuần nuôi cấy (D0; D1; D2; D3; D4; D5 tương ứng với
nồng độ đường manitol là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)……………………61
Hình 3.8. Ảnh hưởng của đường manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo
cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight.
Sau 12 tuần nuôi cấy (D0; D1; D2; D3; D4; D5 tương ứng với
nồng độ đường manitol là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)……………………62
Hình 3.9. Ảnh hưởng của đường sorbitol lên khả năng tăng trưởng và tạo
cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight.
Sau 12 tuần nuôi cấy (E0; E1; E2; E3; E4; E5 tương ứng với
nồng độ đường sorbitol là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)……………………68
Hình 3.10. Ảnh hưởng của đường sorbitol lên khả năng tăng trưởng và tạo
cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight.
Sau 12 tuần nuôi cấy (E0; E1; E2; E3; E4; E5 tương ứng với
nồng độ đường sorbitol là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)…………………...69

1
0

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của đường glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo
cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight.
Sau 12 tuần nuôi cấy (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với
nồng độ đường glucose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)…………………39
Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của đường fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo
cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight.
Sau 12 tuần nuôi cấy (B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với
nồng độ đường fructose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)………………..46
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của đường lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo
cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight.
Sau 12 tuần nuôi cấy (C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với
nồng độ đường lactose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)………………..54
Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của đường manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo
cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight.
Sau 12 tuần nuôi cấy (D0; D1; D2; D3; D4; D5 tương ứng với
nồng độ đường manitol là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)…………………60
Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của đường sorbitol lên khả năng tăng trưởng và tạo
cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight.
Sau 12 tuần nuôi cấy (E0; E1; E2; E3; E4; E5 tương ứng với
nồng độ đường sorbitol là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)…………………67

1
1


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Tình hình kinh tế trên thế giới trong những năm gần đây biến động khá
phức tạp. Nền kinh tế của Việt Nam cũng chịu nhiều ảnh hưởng. Đến năm 2015,

nền kinh tế nước ta mới có sự chuyển biến. Trong đó, ngành nông nghiệp là
ngành phát triển mạnh mẽ. Trong đầu năm 2015, ngành nông nghiệp đã tăng
đáng kể và chiếm tỷ trọng lớn nhất (71%) trong nền kinh tế Việt Nam. Cùng với
những thành tựu đạt được trong nền sản xuất nông nghiệp, ngành sản xuất hoa
lan cũng có những bước tiến đáng kể. Hiện nay lan Vũ nữ nói chung và các loại
lan khác nói riêng đang được xem là cây trồng mang lại hiệu quả kinh tế cao.
Hoa lan là loại cây mang lại nhiều lợi nhuận cho các trung tâm, doanh
nghiệp cũng như nhiều hộ gia đình nhờ việc cung cấp trong nước và xuất khẩu
ra nước ngoài. Nhiều nước trên thế giới kinh doanh xuất khẩu hoa lan như: Đài
Loan, Nhật Bản, Hà Lan, Mỹ, Singapore, Thái Lan, Malaysia, Philippin,
Indonesia,… Trong đó, Thái Lan là nước điển hình về trồng và xuất khẩu hoa
lan. Diện tích trồng Lan lên đến 3,718 ha, đứng đầu bảng là 2 loại Derobium và
Mokara; kế đến là Oncidium, Aranda, Arachinis, Vanda, Ascodenda, Catteya,...
Trong đó, Thái Lan là nước điển hình về trồng và xuất khẩu hoa lan. Diện tích
trồng Lan lên đến 3,718 ha, đứng đầu bảng là 2 loại Derobium và Mokara; kế
đến là Oncidium, Aranda, Arachinis, Vanda, Ascodenda, Catteya,... Ở Việt
Nam, các vùng trồng hoa lan phổ biến như Tây Nguyên, Đà Lạt, Yên Bái, Sa
Đéc, Tp. Hồ Chí Minh,… nhưng tập trung chủ yếu ở Đà Lạt (Địa Lan), Tp. Hồ
Chí Minh (Denrobium, Mokara, Vanda, Oncidium,…) với diện tích khá khiêm
tốn khoảng 200 ha chỉ bằng 5,4% so với Thái Lan. Thái Lan xuất khẩu đến 38
nước trên thế giới trong đó có Việt Nam, đạt giá trị 104 triệu USD (2009).
Trong khi đó Tp. Hồ Chí Minh với 168 ha Lan, sản lượng hàng năm mới chỉ
giải quyết được khoảng 30% nhu cầu tại chỗ. Một vài công ty cũng xuất khẩu
đến Mỹ, Nhật với Mokara cắt cành, tuy chất lượng đạt yêu cầu nhưng giá thành
khá cao nên khó có thể cạnh tranh với Thái Lan. Nếu phải xuất một lượng lớn
trong thời gian dài theo hợp đồng thì nước ta không thể đáp ứng được.

1

Nhân giống in vitro đã được chứng minh là một công nghệ tiềm năng cho
sản xuất quy mô lớn các loài thực vật (Wawrosch et al., 2001; Martin, 2003;
Azad et al., 2005; Hassan và Roy, 2005; Hassan et al., 2009).
Lan Vũ nữ là loại lan có hoa nhỏ mọc thành từng chùm, đẹp, bền với nhiều
màu sắc và hoa văn phong phú, nhưng lại là loài sinh trưởng chậm và là loài rất
khó nhân giống, thường cho hệ số nhân giống thấp trong vườn ươm và rất dễ
nhiễm bệnh. Để có số lượng lớn cây giống đồng đều, chất lượng tốt đáp ứng nhu
cầu thị trường còn gặp nhiều khó khăn. Trong những năm gần đây, công nghệ
lai giống kết hợp gieo hạt trong ống nghiệm nhằm đem đến sự đa dạng về màu
sắc, cấu trúc, kích thước hoa sau mỗi thế hệ lai. Tuy nhiên, việc nhân giống
bằng phương pháp gieo hạt này mang tính ngẫu nhiên, thu được cây có tính
trạng không yêu thích và gần như không thể có được cây con cho hoa đẹp như
cây mẹ. Vì vậy, hiện nay các nhà nuôi cấy mô trong nước cũng như trên thế giới
sử dụng phương pháp nuôi cấy mô in vitro cho tỷ lệ thành công cao mà vẫn tạo
được dòng cây ổn định về mặt di truyền.
Trong nuôi cấy in vitro, đường là nguồn carbon quan trọng đối với quá trình
nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Mô và tế bào thực vật sống chủ yếu theo phương
thức dị dưỡng do không quang hợp đầy đủ trong điều kiện thiếu sự trao đổi khí
với bên ngoài và kích thước mô cấy nhỏ vì vậy việc đưa vào môi trường nuôi
cấy nguồn carbon hữu cơ là điều bắt buộc cho các hoạt động biến dưỡng của tế
bào, để giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp các chất hữu cơ, giúp tế bào phân
chia, tăng sinh khối. Nó đã được chứng minh rằng nồng độ đường ban đầu có
thể ảnh hưởng đến các thông số khác nhau trong quá trình nuôi cấy tế bào thực
vật, như tỷ số tăng trưởng, năng suất của sự trao đổi chất thứ cấp. Mô thực vật
có khả năng hấp thụ một số đường khác nhau như đường sucrose, glucose,
fructose, malnose, galatose, lactose, manitol, sorbitol, thậm chí tinh bột cũng
được bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy mô.
Vì vậy tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của nguồn
carbon lên sự sinh trưởng, phát triển của lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight
in vitro” nhằm tìm ra nguồn carbon và nồng độ thích hợp cho việc nhân chồi,

tạo cây hoàn chỉnh và gia tăng chất lượng cây giống.
2


2. Mục đích nghiên cứu
Khảo sát ảnh hưởng của đường đơn (glucose, fructose), đường đôi (lactose)
và đường đa (manitol, sorbitol) lên sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi
lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) trong nhân giống in vitro.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight).
Phạm vi nghiên cứu: bố trí thí nghiệm với các nồng độ khác nhau của các
nguồn carbon (glucose, fructose, lactose, manitol và sorbitol) nhằm tìm ra nồng
độ thích hợp nhất cho sự tăng trưởng của lan Vũ nữ.
4. Phương pháp nghiên cứu
Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố. Các
nghiệm thức thí nghiệm được lặp lại 3 lần, ghi nhận kết quả trung bình. Các số
liệu thu thập được xử lý thống kê bằng phần mềm SAS 9.0 và chương trình
Microsoft Excel 2010®.
5. Kết quả đạt được
- Xác định được nồng độ đường glucose thích hợp cho khả năng tăng trưởng
và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) sau 12 tuần
nuôi cấy.
- Xác định được nồng độ đường fructose thích hợp cho khả năng tăng trưởng
và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) sau 12 tuần
nuôi cấy.
- Xác định được nồng độ đường lactose thích hợp cho khả năng tăng trưởng
và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) sau 12 tuần
nuôi cấy.
- Xác định được nồng độ đường manitol thích hợp cho khả năng tăng trưởng
và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) sau 12 tuần

nuôi cấy.
- Xác định được nồng độ đường sorbitol thích hợp cho khả năng tăng trưởng
và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) sau 12 tuần
nuôi cấy.
3


6. Kết cấu của đề tài
Đề tài bao gồm các chương sau:
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương 2: Vật liệu và phương pháp
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Chương 4: Kết luận và kiến nghị

4


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái niệm nhân giống in vitro
Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật
ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ
quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối
khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện
vô trùng.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật hay còn gọi là nuôi cấy in vitro là công cụ cần
thiết trong nhiều lĩnh nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành công nghệ khoa
học. Nhờ áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản
nhanh hơn gấp nhiều lần so với tự nhiên. Do đó tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ
nguyên tính trạng duy truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa giống
mới vào sản xuất. Hơn nữa dựa vào kỹ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo

quản nhiều giống cây trồng quý hiếm để phục hồi giống cây trồng.
Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật vô trùng được đặt trong môi
trường dinh dưỡng thích hợp. Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này sinh ra bằng
sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền để nhân giống.
1.2. Nguồn carbon
Nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật thường được cung
cấp dưới dạng carbonhydrate, với những loại đường phổ biến như saccharose và
glucose. Chất nền carbon vừa tham gia tổng hợp các thành phần của tế bào vừa
cung cấp năng lượng đòi hỏi cho quá trình sinh trưởng và tồn tại của tế bào. Nó
cũng cung cấp carbon cần thiết cho sự hình thành sản phẩm thông qua trao đổi
trung gian
Sự chuyển hóa của carbonhydrate bởi tế bào thực vật bao gồm con đường
pentose phosphate, glycolysis và chu trình acid citric, mà cuối cùng sản xuất các
tiền thân của các hợp chất thứ cấp.
Nguồn carbon thông dụng nhất là saccharose, nồng độ thích hợp 2 – 3%.
Gautheret (1959) cho rằng đối với phần lớn các mô và tế bào nuôi cấy, đường

5


saccharose và glucose là nguồn carbon tốt nhất, ở một số trường hợp đặc biệt
cũng có thể dùng fructose, galactose và maltose để thay thế.
Trong nuôi cấy dịch treo tế bào dừa cạn (C. roseus), khi thay đổi hàm lượng
đường sucrose cho thấy có hiệu quả kích thích tích lũy alkaloid ở các nồng độ
khác nhau
Nguồn carbon được xem là yếu tố quan trọng trong sự trao đổi chất của tế
bào thực vật, ảnh hưởng đến sự tích lũy alkaloid ở nuôi cấy tế bào huyền phù cây
mộc hoa trắng (Holarrhena antidysenterica), anthocyanin từ tế bào huyền phù
cây nho (V. vinifera), và shikonin khi nuôi cấy tế bào L. erythrorhizon. Khi nuôi
cấy tế bào huyền phù nhân sâm (Panax spp) để sản xuất đồng thời ginseng

saponin và ginseng polysaccharide, cả hai chất này đều có khả năng chống ung
thư và có hoạt tính miễn dịch, sự thay đổi saccharose trong môi trường nuôi cấy
cho thấy có ảnh hưởng lớn đến việc cải thiện hiệu suất của quá trình nuôi cấy.
1.3. Giới thiệu một vài nguồn carbon
1.3.1. Glucose
Glucose là một monosaccharide có nhiều trong các loại trái cây chín.
Glucose được Andreas Marggraf trích ly đầu tiên từ trái nho khô vào năm 1747.
Tên glucose được Jean Dumas đặt vào năm 1838, tên glucose xuất phát từ tiếng
Hy Lạp Glycos có nghĩa là đường hay ngọt. Cấu tạo của glucose được Emil
Fisher khám phá vào khoảng thời gian cuối thế kỉ 19 đầu thế kỉ 20.
Được tạo ra nhờ quá trình quang hợp của cây xanh dưới tác dụng của ánh
sáng mặt trời.
Là thành phần quan trọng cố định trong máu (0,1 g/l), cung cấp năng
lượng. Cơ thể dự trữ ở gan dưới dạng glycogen, nếu dư còn có thể tích trữ ở da
dưới dạng mỡ nhờ chuyển hóa của insulin. Khi cơ thể hoạt động, dạng dự trữ sẽ
chuyển hóa ngược lại thành glucose đồng thời phóng năng lượng.
➢ Tính chất vật lý
- Khả năng kết tinh khó hơn saccharose
- Tỉ trọng 1,54 g/cm3

6


- Dạng nóng chảy 146 – 150 độ C
- Tinh thể không màu
- Cấu trúc tinh thể
- Hút ẩm mạnh hất thu 15% nước
- Tồn tại chủ yếu ở dạng vòng pyran do sự nối vòng xảy ra giữa nhóm CHO
(C1) và OH (C6). Do sự nối vòng này làm xuất hiện 1 trung tâm chiral nên tạo
thêm 2 đồng phân quang học mới. 2 đồng phân này có thể chuyển đổi qua lại với

nhau và thực tế trong không gian chúng không phẳng nên Haworth đã đề nghị
không gian dang ghế và dạng thuyền cho glucose, trong đó thường gặp nhất là
dạng ghê.
- Trong dung dịch nước, glucose có thể tồn tại và chuyển hóa qua lại giữa 3
dạng (một dạng thẳng và 2 dạng vòng). Trong đó dạng vòng chiếm nhiều hơn.
➢ Tính chất hóa học
a. Phản ứng oxi hóa khử
Các tác nhân oxi hóa thường gặp: HIO4 dung dịch thuốc thử fehling, dung
dịch brom, acid nitric
b. Tham gia phản ứng khử
Glucose có khả năng tham gia phản ứng khử tạo sorbitol hay acid glucose
c. Phản ứng thế
Glucose có thể tác dụng với 3 phân tử phenyl hydrazine tạo osazone
Dựa vào hình dạng tinh thể oaone có thể xác định có mặt của glucose
d. Phản ứng tạo liên kết glycoside
Nhóm OH của glucose dễ dàng tham gia tạo liên kết với nhóm OH của các
rượu khác nên được gọi là nhóm OH glycoside và liên kết tạo thành được gọi là
liên kết glycoside.
Ngoài ra các phân tử đường đơn còn có thể tạo ra liên kết dạng S-glycoside,
O-glycoside, N-glycoside. Điều này giúp tạo các chất có hoạt tính hóa học khác
nhau như protein, cellulose…

7


e. Phản ứng lên men
f. Phản ứng caramel
g. Phản ứng với nito
➢ Nguồn gốc
Có trong hoa quả chín và đặc biệt là nho chính nên đặc biệt được gọi là

đường nho
Phổ biến ở cả động vật lẫn thực vật.
1.3.2. Fructose
➢ Giới thiệu về fructose
- Có cùng công thức phân tử với glucose nhưng khác về công thức cấu tạo
- Là loại đường có nhiều trong trái cây
- Khi ăn nhiều fructose và không có mặt glucose, fructose sẽ gây hiện
tượng thẩm thấu (hút nước qua thành ruột non), vì thế fructose có tác dụng như
một loại thuốc xổ.
- Fructose có thể hấp thu trực tiếp qua cơ thể mà không cần đến insulin
như glucose
➢ Tính chất vật lý fructose
- Kết tinh trong H2O thì fructose có hình kim, tinh thể 2C6H12O6.H2O
- Dễ tan trong nước
- Quay mặt phẳng ánh sáng phân cực sang trái, D-Fructose = -92 và beta
D- Fructose = -133.5
- Tỉ trọng 1.047 g/cm3
- Tnc = 102 – 104oC
-

Là gluxit có độ ngọt cao nhất

-

Hút ẩm rất mạnh hấp thu 30% nước.

➢ Tính chất hóa học
- Cũng là đường khử như glucose nên tính chất hóa học giống nhau
-

Fructose dễ bị caramel hóa hơn glucose

8


-

Một phân tử fructose có thể kết hợp với một phân tử glucose để tạo một

phân tử saccharose và loại phân tử H2O
➢ Nguồn gốc
- Hình thành do sự thủy phân của saccharose dưới tác dụng của enzyme
invertase
- Hình thành do sự chuyển hóa glucose
- Có trong mật hoa, quả
1.3.3. Lactose
➢ Giới thiệu
Lactose được tìm thấy trong sữa, các sản phẩm từ sữa như phomat, sữa
chua.
Lactose là một dạng đường có trong sữa động vật. Lactose khi vào đến ruột
sẽ chia ra thành đường glucose và galactose nhờ vào một yếu tố có tên là Lactose
(tên khoa học là Beta-D-galactosidase hay Lactase-phlorizin hydrolase), yếu
tố này thường có tại thành của ruột non.
➢ Cấu tạo
Lactose là một disacaride bao gồm một β-D-galactose và một β-Dglucose được liên kết với nhau qua liên kết β 1-4 glicozide. Lactose chiếm
khoảng 2-8% về khối lượng.
Công thức phân tử: C12H22O11
Tên hệ thống của nó là β-D-galactopiranozyl-(1↔4) β-D-glucopiranose.
Dạng bền nhất của lactose là : C12H22O11.H2O (α-lactose monohydrate)
Lactose tồn tại ở 2 dạng α và β. Ở 20oC, α-lactose chiếm 40% và βlactose chiếm 60%.

Lactose tồn tại ở 2 dạng tự do và liên kết với các gluxit và protein khác.
Tỷ lệ lactose tự do/lactose liên kết là 8/1.
➢ Tính chất vật lý
• Độ hòa tan

9


Ở nhiệt độ thường, lactose hòa tan trong nước ít hơn saccarose 10 lần,
nhưng ở 100oC thì độ hòa tan của nó xấp xỉ saccarose
Lactose có độ hòa tan là 1/4,63 tức là 0,216 g lactose tan hoàn toàn trong 1
ml nước.
Độ tan trong nước là 18,9049 ở 25oC, 25,1484 ở 40oC và 37,2149 ở 60oC
trong 100 g dung dịch
Độ tan của lactose trong etanol là 0,0111g ở 40oC và 0,0270 ở 60oC trong
100g dung dịch.
• Nhiệt độ nóng chảy
α-lactose: 201,6oC
β-lactose: 252,2oC
• Độ quay cực
α-lactose: 89,4oC
β-lactose: 35oC
• Độ kết tinh
Lactose kết tinh chậm, tinh thể cứng và có nhiều dạng tinh thể. Vitamin
B2 có thể ức chế sự kết tinh của lactose.
• Độ ngọt
Độ ngọt của lactose chỉ bằng 1/6 saccarose
➢ Tính chất hóa học
• Phản ứng thủy phân
Khi thủy phân cho 2 phân tử đường đơn là galactose và glucose

• Sự biến tính của lactose
Gia nhiệt đến 100oC không làm thay đổi lactose. Ở nhiệt độ cao hơn, xảy
ra sự biến màu do sự xuất hiện các melanoide tạo thành khi các acid amin của sữa
tác dụng với lactose. Ngoài ra, khi ở nhiệt độ cao hơn 100oC, lactose bị phân giải
một phần, tạo thành các acid lactide, acid formide,…mà kết quả làm tăng độ chua
của sữa lên 1 - 2o T.
10


Khi gia nhiệt trên 100oC thì lactose sẽ bị biến đổi. Đầu tiên là tạo thành
lactulose, sau đó là sự phân giải đường tạo ra một loạt các sản phẩm của sự phân
giải này, kết quả làm cho sữa có màu nâu. Sự biến tính này là do phản ứng giữa
lactose với protein, với các acid amin tạo thành hợp chất không bền melanoit.
Người ta cho rằng, đầu tiên sự tạo thành phức đường-amin. Sau đó có sự chuyển
nhóm trong phân tử này, kết quả làm xuất hiện các lactulose. Các chất này không
có màu. Tiếp đó phức bị phân giải tạo thành các hợp chất cacbonyl, cuối cùng là
các hợp chất cacbonyl này ngưng tụ với các acid amin polypeptide và protein tạo
thành hợp chất có màu nâu-melanoide.
Sự tạo thành melanoide còn có thể xảy ra khi bảo quản sữa bột thời gian
dài ở nơi có độ ẩm cao. Đó là do các nhóm acid amin tự do đã tác dụng với
lactose.
1.3.4. Manitol
Mannitol là một đồng phân của sorbitol, độ ngọt vào khoảng 50%
saccharose, với một số tính chất ưu điểm tương ứng:
- Hương vị thơm ngon, vị ngọt tươi mát, dịu nhẹ, dễ chịu, thường được
ứng dụng để giảm thiểu vị đắng trong thực phẩm.
- Chất tạo ngọt năng lượng thấp chỉ khoảng 1.6 calories/gram
- Không gây sâu răng
- An toàn sử dụng cho có bệnh nhân tiểu đường trong chế độ ăn của họ.
Mannitol tồn tại lượng lớn trong thiên nhiên, ở các dịch tiết từ thực vật,

tảo biển và nấm tươi. Nó thường được tổng hợp bởi hydro hóa syrup đường
tương ứng. Trên thị trường, mannitol thường được bán ở dạng bột và hạt.
Không như sorbitol, mannitol không hút ẩm, vì lý do này, nó thường dùng
là bột bụi bao kẹo cao su, tránh kẹo cao su dính vào thiết bị và hàm bao trong
quá trình sản xuất. Ngoài ra, mannitol còn thấy trong chocolate, chất tạo mùi cho
kem. Ngoài ra, tính ổn định và mùi hương dễ chịu của mannitol thường ứng dụng
trong dược phẩm và thuốc nén dạng viên.

11


1.3.5. Sorbitol
Sorbitol được phát hiện bởi một nhà hóa học người Pháp trong các quả nho
ở tro núi lửa vào năm 1872. Nó là thành phần tự nhiên trong một số loại trái cây.
Ngày nay, sorbitol được tổng hợp bằng cách hydro hóa glucose và tồn tại ở cả hai
dạng tinh thể và chất lỏng.
Sorbitol được sử dụng trong thực phẩm nhằm ngăn cản sự mất độ ẩm. Sự ổn
định kết cấu của sorbitol được ứng dụng nhiều trong sản xuất bánh kẹo,
chocolate, các sản phẩm cần duy trì tính cứng và giòn. Đặc biệt trong các sản
phẩm sấy, sorbitol góp phần duy trì sự tươi mới trong quá trình bảo quản.
Sorbitol rất ổn định và khá trơ về mặt hóa học, nó có thể chịu được nhiệt độ
cao mà không tham gia phản ứng Millard. Đây là một ưu điểm. Ngoài ra, sorbitol
còn kết hợp tốt với các thành phần thực phẩm khác như đường, protein, gel, dầu
thực vật,… Nó cũng có chức năng trong nhiều sản phẩm như kẹo cao su, kẹo,
món tráng miệng đông lạnh, cookies, bánh, cũng như các sản phẩm chăm sóc
răng miệng, bao gồm kem đánh răng và nước súc miệng.
Với độ ngọt bằng khoảng 60% so với saccharose, cung cấp chỉ bằng 1/3
năng lượng so với đường cát, sorbitol được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ
chế biến thực phẩm. Sorbitol có vị ngọt mát, dễ chịu, tan mịn trong miệng. Nó là
chất làm ngọt hữu ích cho những người mắc bệnh tiểu đường, đồng thời an toàn

sử dụng cho các thực phẩm ăn kiêng, năng lượng thấp. Sorbitol cũng được sử
dụng trong chế biến mỹ phẩm và dược phẩm.
Trong y học, sorbitol được sử dụng với tác dụng nhuận tràng, loại bỏ các ion
kali natri ra khỏi cơ thể. Ngoài ra, còn có một số ứng dụng khác trong việc sản
xuất nhiên liệu tên lửa, lẫn nguyên liệu sinh học cho các quá trình chuyển hóa
trong cơ thể.

12


1.4. Vai trò của nguồn carbon cho sự tăng trưởng và phát triển của cây
trong nuôi cấy in vitro
1.4.1. Giới thiệu vai trò của nguồn carbon trong nuôi cấy in vitro
Tế bào thực vật, mô và các cơ quan được nuôi cấy trong môi trường nuôi
cấy in vitro thực vật, trong đó việc bổ sung các chất dinh dưỡng rất cần thiết cho
sự tăng trưởng và phát triển của cây con trong nuôi cấy in vitro thực vật. Quá
trình phát triển của công nghệ nuôi cấy mô, nhân giống cây trồng bị ảnh hưởng
rất lớn bởi thành phần của môi trường nuôi cấy.
Trong điều kiện in vitro, tế bào thực vật đòi hỏi các yếu tố tăng trưởng như
chất dinh dưỡng, vi chất dinh dưỡng, các chất tăng trưởng thực vật, các vitamin,
acid amin và các loại đường (nguồn carbon). Đường là yêu cầu cần thiết trong
việc theo dõi hiện tượng dị dưỡng trong nuôi cấy in vitro thực vật/ mixotrophy
của tế bào nuôi cấy để thay thế carbon. Trong khi đó cây trồng sử dụng quang
hợp từ bầu khí cho sự tăng trưởng và phát triển. Kết quả dị dưỡng từ các hoạt
động quang hợp thấp được coi là một trong những yếu tố hạn chế lớn đối với việc
cải thiện hiệu quả vi nhân giống. Carbon rất cần thiết cho việc hoàn thành vòng
đời của cây và sự vắng mặt của carbon có thể dẫn đến các cái chết của thực vật.
Trên cơ sở khoa học nguồn carbon cao sẽ gây ảnh hưởng đến sự tăng trưởng
và phát triển hình thái của thực vật, một phần thông qua khả năng thẩm thấu
khác nhau của thực vật sẽ ảnh hưởng đến tỷ lệ phân chia tế bào hoặc mức độ hình

thành của tế bào.
Ngoài ra, nguồn carbon thực hiện chức năng tổng hợp nhiều hợp chất, hoạt
động như xây dựng khối đại phân tử và có thể kiểm soát một số quá trình phát
triển trong tế bào. Koch chứng minh rằng đường kiểm soát sự biểu hiện của
nhiều gen thực vật và kết nối các quá trình phát triển và trao đổi chất ở thực vật là
rõ ràng. Do đó, carbohydrates là yếu tố rất quan trọng trong in vitro hình thái, quá
trình này đòi hỏi năng lượng cao. Nhu cầu về nguồn đường còn phụ thuộc vào
giai đoạn của sự phát triển và sự khác biệt giữa các loài. Một số loại đường chính
khác cây có khả năng sử dụng bao gồm hexoses monosaccharide (glucose,

13