Nghiên cứu nhân nhanh chồi lan kim tuyến (anoectochilus setaceus) in vitro phục vụ công tác chuyển gen tạo rễ tóc

Nghiên cứu nhân nhanh chồi lan kim tuyển (Anoectochilus Setaceus) in Vitro phục vụ
công tác chuyển gen tạo rễ tóc
Giảng viên hướng dẫn: TS. Hà Thị Loan
SV: Nguyễn Thị Kim Ngân
Lớp: 13DSH01
MSSV: 1311101018

Page 1


Đồ án tốt
nghiệp
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự
hướng dẫn khoa học của Tiến sĩ Hà Thị Loan. Các số liệu sử dụng phân tích trong
đồ án có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo đúng quy định. Các nội dung nghiên
cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức
nào trước đây, nếu phát hiện có bất kỳ gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách
nhiệm.

TP. Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 6 năm 2017
Sinh viên trường ĐH Công Nghệ TP.HCM
Nguyễn Thị Kim Ngân


Đồ án tốt
nghiệp
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành bài luận văn này, em luôn nhận được sự giúp đỡ về nhiều mặt
của các cấp Lãnh đạo, các tập thể và cá nhân.
Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô trường Đại học

Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh, quý thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học – Thực
phẩm – Môi trường đã dạy dỗ, truyền đạt cho em những kiến thức chuyên môn bổ
ích trong suốt bốn năm học vừa qua.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn và sự tri ân sâu sắc đến Ban lãnh đạo Trung tâm
Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện về kinh phí và trang thiết bị
để em thực hiện đề tài này. Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Tiến
sĩ Hà Thị Loan cùng với những Anh (Chị) cán bộ làm việc tại phòng Thực nghiệm
cây trồng đã tạo điều kiện thuận lợi cho em được học hỏi, tiếp cận những kiến thức
thực tế, tích lũy nhiều kinh nghiệm về thao tác trong phòng thí nghiệm. Đồng thời
các Anh (Chị) đã góp ý, bổ sung và chỉnh sửa những kiến thức thiếu sót để em có
thể hoàn thành tốt đề tài này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể bạn bè, người thân, gia đình
những người đã luôn bên cạnh em, cổ vũ tinh thần và đã ủng hộ em trong suốt thời
gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn!
TP. Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 6 năm 2017
Sinh viên trường ĐH Công Nghệ TP.HCM
Nguyễn Thị Kim Ngân


Đồ án tốt
nghiệp
MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. iv
DANH

MỤC

BẢNG

..................................................................................................v DANH MỤC BIỂU
ĐỒ........................................................................................... vi DANH MỤC HÌNH
................................................................................................ vii LỜI MỞ ĐẦU
............................................................................................................1
CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................4
1.1. Giới thiệu về kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật ...................................4
1.1.1. Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô thực vật .........................................................4
1.1.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật..............................5
1.1.3. Các giai đoạn nuôi cấy mô thực vật .......................................................12
1.1.4. Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô thực vật ...........13
1.2. Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ...........................................14
1.2.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng .......................................................................14
1.2.2. Nuôi cấy mô sẹo .......................................................................................14
1.2.3. Nuôi cấy tế bào đơn .................................................................................15
1.2.4. Nuôi cấy tế bào trần ................................................................................15
1.2.5. Nuôi cấy hạt phấn ....................................................................................16
1.2.6. Nuôi cấy protoplast..................................................................................16
1.3. Chuyển gen tạo rễ tóc nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ................16
1.3.1. Đặc điểm và cơ chế xâm nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào
chủ......................................................................................................................16
1.3.2. Vai trò, chức năng của oncogen rol (root inducing locus) .....................19
i


Đồ án tốt
nghiệp
1.3.3. Tình hình nghiên cứu rễ tóc trên một số loài dược liệu và cây trồng .....21
1.4. Tổng quan về cây lan kim tuyến..................................................................22
1.4.1. Nguồn gốc và phân bố .............................................................................22
1.4.2. Phân loại. .................................................................................................23

1.4.3. Đặc điểm hình thái...................................................................................23
1.4.4. Điều kiện sinh sống của lan kim tuyến ....................................................25
1.4.5. Giá trị dược liệu của lan kim tuyến .........................................................25
1.4.6. Nhân giống cây lan kim tuyến .................................................................26
1.4.7. Tình hình nghiên cứu cây lan kim tuyến ..................................................27
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................29
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................29
2.2. Vật liệu nghiên cứu ......................................................................................29
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu ..............................................................................29
2.2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất .........................................................29
2.2.3. Môi trường nuôi cấy ................................................................................31
2.2.4. Điều kiện nuôi cấy ...................................................................................31
2.3. Phương pháp ...................................................................................................31
2.3.1. Pha môi trường .....................................................................................31
2.3.2. Các thao tác trong phòng cấy.................................................................32
2.4. Nội dung nghiên cứu .....................................................................................33
2.5. Bố trí thí nghiệm..........................................................................................33
2.5.1. Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA đến vị trí mẫu cấy chồi
lan kim tuyến
......................................................................................................33
ii


Đồ án tốt
nghiệp
2.5.2. Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên nhân nhanh chồi
lan kim tuyến. .....................................................................................................34
2.5.3. Nội dung 3: Bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tóc từ các cơ quan của
lan kim tuyến được lây nhiễm từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes .............36
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............Error! Bookmark not defined.

3.1. Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA đến vị trí mẫu cấy lan kim
tuyến… ..................................................................................................................38
3.2. Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên nhân nhanh chồi lan
kim tuyến. ..............................................................................................................43
3.3. Nội dung 3: Bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tóc từ các cơ quan của lan
kim tuyến được lây nhiễm từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ......................48
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .........................................................54
4.1. Kết luận. .........................................................................................................54
4.2. Kiến nghị ........................................................................................................54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................55

3


Đồ án tốt
nghiệp
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
CNSH

Công Nghệ Sinh Học

TPHCM

Thành phố Hồ Chí Minh

MS

Murashige – Skoog

BA

Benzyl Adenin

NAA

Napthalene Acetic Acid

BAP

6-Benzyl Amino Purine

2,4-D

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

IBA

3-Indole butyric acid

IAA

3-Indole acetic acid

NT

Nghiệm thức

ĐC

Đối chứng

Cs

Cộng sự

YMB

Yeast mannitol broth

B5

Gamborg’s

4


Đồ án tốt
nghiệp
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thời gian và nồng độ các chất khử trùng (Street, 1974) ............................6
Bảng 2.1. Khảo sát nồng độ BA và NAA đến vị trí mẫu cấy lan kim tuyến ............34
Bảng 2.2. Khảo sát nồng độ BA và NAA dùng để nhân nhanh chồi lan kim tuyến.35
Bảng 2.3. Các cơ quan của lan kim tuyến được chuyển gen ....................................37
Bảng 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tái sinh chồi lan kim tuyến
sau 8 tuần theo dõi.....................................................................................................39
Bảng 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên nhân nhanh chồi lan kim tuyến
sau 8 tuần theo dõi.....................................................................................................44
Bảng 3.3. Khảo sát khả năng tạo rễ tóc từ các cơ quan của lan kim tuyến được lây
nhiễm vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes chủng 15834 và chủng TR7 sau 4 tuần
nuôi cấy. ....................................................................................................................48

5


Đồ án tốt
nghiệp
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến số chồi và chiều cao chồi của
mẫu cấy đốt thân lan kim tuyến sau 8 tuần nuôi cấy. ...............................................40
Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến tỷ lệ tái sinh chồi của mẫu
cấy đốt thân lan kim tuyến sau 8 tuần nuôi cấy. .......................................................41
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến số chồi và chiều cao chồi của
mẫu cấy đốt thân lan kim tuyến sau 8 tuần nuôi cấy. ...............................................46

6


Đồ án tốt
nghiệp
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium ................................................19
Hình 1.2. Lan kim tuyến ở ngoài vườn ươm.............................................................23
Hình 2.1. Cây Lan Kim tuyến ngoài tự nhiên ...........................................................29
Hình 3.1. Ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tái sinh chồi lan kim tuyến...............38
Hình 3.2. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA lên sự nhân nhanh chồi lan kim tuyến44
Hình 3.3. Ảnh hưởng của việc chuyển gen chứa vi khuẩn Agobacterium rhizogenes
chủng Tr7 và chủng 15834 vào các cơ quan của lan kim tuyến sau 4 tuần nuôi cấy ở
các nghiệm thức NT1, NT2, NT3, NT4. ...................................................................51

vii

Đồ án tốt
nghiệp
LỜI MỞ ĐẦU
I.

Đặt vấn đề

Từ xưa đến nay, lan được biết đến như một loài hoa quý phái, hoa dành cho
bậc vương giả. Lan là một loài hoa được trồng rất phổ biến ở Việt Nam nói riêng và
ở các nước trên thế giới nói chung. Lan ở việt nam tượng trưng cho một vẻ đẹp
thuần khiết, thanh cao và mang nhiều ý nghĩa. Cùng với sự phát triển của ngành
trồng lan trong thời gian qua, loài hoa quý này không chỉ hấp dẫn mọi du khách do
sự đa dạng về hình dáng và màu sắc mà còn mang lại giá trị hiệu quả kinh tế cao.
Họ Lan Orchidaceae là một trong số những họ thực vật đa dạng nhất của Việt
Nam, với tổng số khoảng 865 loài thuộc 154 chi. Thông thường Lan được sử dụng
làm cảnh. Ngoài ra, có nhiều loài Lan còn được sử dụng làm thuốc (Nguyễn Tiến
Bân, 2005).
Chi Lan kim tuyến Anoectochilus ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài,
trong đó có loài Lan kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume, tên khác
Anoectochilus roxburghii Wall. ex Lindl. được biết đến nhiều không những bởi giá
trị làm cảnh, mà bởi giá trị làm thuốc của nó. Do bị thu hái nhiều để bán làm thuốc
từ rất lâu, nên loài Lan kim tuyến đang bị đe dọa nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt
chủng ngoài tự nhiên nếu chúng ta không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Hiện nay,
Lan kim tuyến được cấp báo trong Nghị định 32/2006/NĐ-CP thuộc nhóm IA,
nghiêm cấm khai thác sử dụng vì mục đích thương mại và trong Sách Đỏ Việt Nam
(2007), phân hạng EN A1a,c,d (Sách Đỏ Việt Nam, 2007).
Sản xuất các hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào trần đã được công bố trên
nhiều loài cây dược liệu, đáng chú ý là sản xuất và thương mại hóa shikonin,

berberine and ginseng ở Nhật Bản. Tuy nhiên sản xuất các hợp chất thứ cấp bằng
phương pháp nuôi cấy tế bào vẫn còn một số tồn tại như dòng tế bào không ổn định,
năng suất thấp và khi nuôi cấy quy mô lớn gặp khó khăn như dễ bị lây nhiễm, việc
điều chỉnh nguồn khí oxy, … (Rao and Ravishankar, 2002). Hướng mới để sản xuất
các hợp chất thứ cấp là nuôi cấy rễ chuyển gen (rễ tóc). Nuôi cấy rễ tơ, loại rễ hình
1


Đồ án tốt
nghiệp
thành do sự xâm nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào mô thực vật bị
tổn thương từ lâu đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như
phân tích chức năng của gen, biểu hiện protein ngoại lai, sản xuất các hợp chất thứ
cấp hay biến đổi thành phần các chất chuyển hóa ở thực vật (Lê Thu Ngọc và cs,
2013). Công nghệ chuyển gen tạo rễ tóc cho phép nhanh chóng thu được sinh khối
lớn trong thời gian ngắn đã thành công trên một số loài thực vật, điển hình là sâm
ngọc linh đem lại hiệu quả cao. Trên thế giới cũng như trong nước đã có một số đề
tài nghiên cứu về lan kim tuyến: Nhân sinh khối in vitro loài Anoectochilus
formosanus (Chow và cs, 1982). Nhân nhanh chồi in vitro loài lan kim tuyến Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl. (Phùng Văn Phê và cs, 2010)…
Lan kim tuyến được xem như là loài dược liệu quý cho sức khỏe con người
nên hiện nay loài thực vật này đang có nguy cơ bị người dân khai thác cạn kiệt để
bán cho các thương nhân nước ngoài bởi giá trị kinh tế cao với mức giá dao động từ
1,2 – 1,6 triệu đồng / 1 kg lá tươi. Mặt khác khả năng tái sinh của cây lan kim tuyến
trong tự nhiên thấp, đặc biệt là những nơi môi trường sinh thái bị tàn phá. Loài thực
vật này chủ yếu mọc trong rừng già trên vùng núi cao, nơi có ẩm độ cao và nhiệt độ
thấp, ở những nơi đất tốt và tơi xốp, không có ánh sáng trực tiếp của mặt trời
(Dương Đức Chiến, 2014). Chính vì môi trường sống ngoài tự nhiên khá khó khăn
cũng như loài dược liệu quý này có giá trị kinh tế cao nên việc ứng dụng công nghệ
nuôi rễ tóc thu sinh khối là cần thiết.
Xuất phát từ những cơ sở đó, người thực hiện đề tài đã tiến hành: “Nghiên

cứu nhân nhanh chồi lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) in vitro phục vụ
công tác chuyển gen tạo rễ tóc”.
II.

Mục đích, nhiệm vụ và phương pháp nghiên cứu

1. Mục đích
Đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về loài lan (Anotoecchilus setaceus
Blume), chi Lan kim tuyến.

2


Đồ án tốt
nghiệp
Tạo nguồn vật liệu in vitro làm vật liệu cho các nghiên cứu chuyển gen tạo rễ
tóc.
2. Nhiệm vụ
Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA đến vị trí mẫu cấy lan kim tuyến.
Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên nhân nhanh chồi lan kim tuyến.
Bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tóc từ các cơ quan của lan kim tuyến được
lây nhiễm từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes.
3. Phương pháp nghiên cứu
Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với số liệu thu thập được xử lý bằng
phần mềm SAS và Microsoft Excel 2010.
III.

Các kết quả đạt được và kết cấu của đồ án.

1. Các kết quả đạt được của đề tài

Xác định nồng độ NAA và BA tối ưu lên sự tái sinh chồi và nhân nhanh chồi
lan kim tuyến.
Xác định nguồn mẫu (các mô hay cơ quan của lan kim tuyến) phù hợp cho
hiệu suất chuyển gen tạo rễ tóc nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes.
2. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp
Đồ án gồm 4 chương
- Chương 1: Tổng quan tài liệu.
- Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu
- Chương 3: Kết quả và thảo luận.
- Chương 4: Kết luận và kiến ghị.

3


CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Giới thiệu về kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật

1.1.1. Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô thực vật
Theo Dương Công Kiên (2002), những mốc chính trong lịch sử phát triển của
công nghệ tế bào thực vật:
Năm 1665: Robert Hooke quan sát được tế bào sống dưới kính hiển vi và
đưa ra khái niệm tế bào.
Năm 1838: Mattias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế
bào.
Năm 1902: Haberlandt lần đầu tiên thí nghiệm nuôi cấy mô cây một lá mầm
nhưng không thành công.
Năm 1904: Hannig tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy phôi đầu tiên ở các loài
họ cải Crucifers.

Năm 1922: Knudson và Bot. Gaz. Cho hạt phong lan nảy mầm in vitro.
Năm 1924: Blumenthal và cộng sự nuôi cấy hình thành callus từ rễ cà rốt
trong môi trường có acid lactic.
Năm 1929: Laibach sử dụng nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất hòa
hợp khi lai ở Linum spp.
Năm 1934: White đã thành công khi nuôi cấy mô rễ cà chua trong thời gian
dài.
Năm 1934: Kogl và cộng sự lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, 1
phytohormone thực vật đầu tiên có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân chia
tế bào.
Năm 1936: LaRue và Bull đã nuôi cấy phôi các loài cây hạt trần khác nhau.
Năm 1939: Gautheret, Nobecourt và White lần đầu tiên nuôi cấy, mô sẹo
thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá.


Năm 1941: Overbeek và cộng sự đã sử dụng nước dừa trong nuôi cấy phôi
non ở cà rốt.
Năm 1942: Gautheret lần đầu tiên theo dõi sự hình thành chất trao đổi thứ cấp
trong nuôi cấy mô sẹo thực vật.
Năm 1950: Morel lần đầu tiên nuôi cấy thành công cây một lá mầm bằng nước
dừa.
Từ năm 1950 – 1960: Hàng loạt thành công tiếp theo trong nuôi cấy mô như
nuôi cấy cây 1 lá mầm, nuôi cấy noãn, nuôi cấy phát sinh cơ quan, nuôi cấy câh
sạch virus, vi ghép, nuôi cấy đơn bội, tái sinh phôi soma, sản xuất sinh khối thực
vật, nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy đỉnh sinh trưởng,…
Năm 1962: Murashige và Skoog phát minh môi trường nuôi cấy mô tế bào
thực vật- môi trường MS.
Từ năm 1964 – 1998: hàng loạt các công trình thành công trong nuôi cấy mô
như cải tiến môi trường và phương pháp nuôi cấy, chuyển gene để lai tạo giống mới
thương mại hóa sản phẩm nuôi cấy mô.

Giai đoạn hiện nay, ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống,
vào sản xuất các hợp chất thứ cấp, nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao.
1.1.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.1.2.1. Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật
a. Điều kiện vô trùng
Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối thiểu cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự
phân hóa tế bào và cơ quan nuôi cấy. Vì thế, nuôi cấy in vitro luôn được nuôi cấy
trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm bảo tốt điều kiện vô trùng, mô nuôi cấy
hoặc môi trường sẽ bị nhiễm, chết (Dương Công Kiên, 2002).
Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định.
Nếu tìm được nồng độ và thời gian xử lý thích hợp sẽ cho tỷ lệ sống cao.


 Các bước để xử lý khử trùng bề mặt mẫu vật
- Chọn lựa mẫu cấy tốt nhất, rửa kỹ mẫu bằng nước máy (trong dòng chảy)
cho sạch bụi bẩn.
- Ngâm rửa mẫu bằng nước xà phòng loãng trong 3 phút (lắc nhẹ liên tục
trong quá trình ngâm).
- Rửa sạch xà phòng bằng nước máy (trong dòng chảy). Chuyển vào tủ đã
được xử lý, vô trùng mẫu từ trước, mọi thao tác từ đây đều phải áp dụng các biện
pháp vô trùng.
- Dùng kẹp vô trùng gắp chuyển mẫu sang dung dịch khử trùng (kẹp này
không dùng lại nữa nếu không khử trùng lại), ngâm (lắc nhẹ) mẫu trong dung dịch
khử trùng trong thời gian ấn định.
- Rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng 3 – 4 lần. Nếu rửa không sạch, chất
khử trùng có thể làm chết mẫu.
- Nhập mẫu sau khi khử trùng chuyển mẫu ra giấy thấm đặt trên đĩa petri vô
trùng. Tiến hành cắt tỉa tách mẫu, tỉa bỏ các phần dập nát, hư hỏng và cấy chuyền
ngay vào môi trường đã chuẩn bị trước.
Bảng 1.1. Thời gian và nồng độ các chất khử trùng (Street, 1974)

Tác nhân vô trùng

Nồng độ

Hiệu quả

(%)

Thời gian xử lý
(phút)

Calcium hypochorite

9 – 10

5 – 30

Rất tốt

Natri hypochlorite

2

5 – 30

Rất tốt

Hydro peroxide

10 – 12

5 – 15

Tốt

Nước Brom

1–2

2 – 10

Rất tốt

HgCl2

0,1 – 1

2 – 10

Trung bình

Chất kháng sinh

4 – 50 mg/l

30 – 60

Khá tốt

b, Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ
Ánh sáng và nhiệt độ là hai yếu tố chính ảnh hưởng cơ bản đến quá trình sinh
trưởng của mô nuôi cấy.
 Ánh sáng
Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như:
cường độ chiếu sáng, thời gian chiếu sáng và chất lượng ánh sáng.
Trong tạo chồi ban đầu và nhân chồi tiếp theo, cường độ ánh sáng phù hợp
nằm trong khoảng 2000 – 2500 lux. Nhưng trong giai đoạn tạo rễ, cây cần chiếu
sáng ở cường độ cao hơn để kích thích cây chuyển từ giai đoạn dị dưỡng sang tự
dưỡng, có khả năng quang hợp. Trong giai đoạn này, cường độ ánh sáng được
Murashige (1974) đề nghị là 3.000 – 10.000 lux và nhiều phòng thí nghiệm cho
rằng con số 40
– 75 µmol/m2/s (tương đương 3.300 – 6.200 lux) là thích hợp (Edwin, 1993).
 Nhiệt độ
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng
đến sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây. Tùy thuộc vào xuất xứ
của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhiệt độ thích hợp nhất cho
sự sinh trưởng ở nhiều loài cây là 250C (Nguyễn Văn Uyển, 1993).
1.1.2.2. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát triển
hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy mô là thành phần môi trường
nuôi cấy. Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo
loài và bộ phận nuôi cấy. Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí
nghiệm thì thành phần môi trường cũng sẽ thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của
mẫu cấy (Dương Công Kiên, 2002).


Có rất nhiều loại môi trường nuôi cấy thực vật khác nhau. Trong đó, có một
số môi trường cơ bản được sử dụng phổ biến như: MS, B5, SH có hàm lượng
khoáng

đa lượng cao. Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều
gồm một số thành phần cơ bản sau:
-

Các muối khoáng đa lượng và vi lượng.

-

Nguồn cacbon.

-

Các vitamin.

-

Các chất điều hòa sinh trưởng.

- Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết
khoai tây…
a. Các muối khoáng đa lượng và vi lượng
Khoáng đa lượng: nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không
khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng cần
phải cung cấp là N, P, K, Ca, Mg (Trần Văn Minh, 2010).
Khoáng vi lượng: nhu cầu khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô thực vật in
vitro là lĩnh vực còn ít được nghiên cứu. Trước đây, khi kĩ thuật nuôi cấy mô mới ra
đời, người ta không nghĩ tới việc bổ sung khoáng vi lượng vào môi trường nuôi cấy.
Các nguyên tố vi lượng cần cung cấp cho tế bào là: Fe, Mn, Zn, Cu, B, Co, I, …

(Trần Văn Minh, 2010).
b. Nguồn cacbon
Trong môi trường nuôi cấy, các mô không có khả năng tự dưỡng do không
quang hợp đầy đủ trong điều kiện thiếu sự trao đổi khí với bên ngoài, do vậy cần
cung cấp đường để giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp các chất hữu cơ, giúp tế bào
phân chia, tăng sinh khối. Các loại đường thường được sử dụng là saccharose, dglucose, d-fructose. Saccharose là nguồn các cacbon được sử dụng rộng rãi nhất cho
các loại cây, nồng độ saccharose thay đổi từ 2 – 3% hoặc cao hơn tùy thuộc vào
giống, tuổi mẫu cấy, giai đoạn sinh trưởng và yêu cầu thí nghiệm (Dodds và
Roberts, 1985).
c. Các vitamin


Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Thông
thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của


chúng. Trong nuôi cấy in vitro thì một số vitamin được bổ sung vào môi trường và
trở thành yếu tố giới hạn sự phát triển của chúng như: thiamine (B1), acid nicotinic
(PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol (Trần Văn Minh, 2010).
Thiamine là một vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào.
Vitamin C đôi khi được sử dụng ở nồng độ cao như là một chất chống oxi hóa. Myoinositol có vai trò quan trọng cho sự phân chia tế bào vì thúc đẩy sự hình thành
thành tế bào. Thường sử dụng ở nồng độ cao 50 – 100 ppm (Trần Văn Minh,2010).
d. Chất điều hòa sinh trưởng
Chất điều hoà sinh trưởng thực vật (plant growth regulator), có tên khoa học
là phytohormon, là chất hữu cơ có mặt trong cây với hàm lượng rất nhỏ nhằm tham
gia vào điều khiển quá trình trao đổi chất và các quá trình hình thành mới các cơ
quan ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây. Cho đến nay người ta đã
tìm được rất nhiều chất tự nhiên hoặc nhân tạo ảnh hưởng rất mạnh đến sự sinh
trưởng và phát triển của thực vật. Người ta chia các phytohormon ra làm 5 nhóm
chính: Auxin, Gibberrellin, Cytokinin, Abcisic acid và Ethylene (Nguyễn Văn Uyển,

1993). Trong đó, auxin và cytokinin là hai nhóm được sử dụng phổ biến nhất.
 Nhóm các auxin
Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng thường
xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần
khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền
phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được phối hợp sử
dụng với các cytokinin. Các auxin sử dụng có thể là auxin tự nhiên hoặc tổng hợp
bao gồm (IAA, NAA, 2,4-D, IBA) chủ yếu được sử dụng để kích thích sự phân bào
và tạo rễ nhưng nếu sử dụng liều lượng quá cao dễ tạo ra các đột biến (Hoàng Minh
Tấn và CS, 1993).
Vai trò sinh lý của Auxin
- Kích thích sự phân chia và kéo dài tế bào.


- IAA kích thích chồi bên sản sinh ra ethylene làm ức chế sinh trưởng chồi
đỉnh.
- Kích thích hình thành rễ và tham gia cảm ứng phát sinh phôi vô tính.
- 2,4-D sử dụng rộng rãi cho sự phát sinh mô sẹo.
- Tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus).
- Kích thích tạo chồi bất định ở nồng độ thấp.
 Nhóm các cytokinin
Trong nuôi cấy mô thực vật, cytokinin dùng để kích thích sự phát sinh
chồi, sử dụng kết hợp với auxin kích thích phân chia tế bào. Nồng độ cytokinin cao
kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ (Narayaswamy, 1994). Trong môi trường
nuôi cấy, tỷ lệ Auxin/Cytokinin nếu nghiêng về phía auxin sẽ kích thích hình thành
rễ, nghiêng về phía cytokinin sẽ thúc đẩy hình thành chồi, ở tỷ lệ trung gian sẽ hình
thành mô sẹo. Cytokinin gồm có kinetin, BAP, zeatin, TDZ.
- Kinetin hình thành và phát triển trong điều kiện nhiệt độ cao từ chế phẩm
DNA có tác dụng kích thích sự phát sinh chồi.
- Zeatin thực chất là một dẫn xuất của adenine có tác dụng kích thích sự tạo

chồi nhưng giá thành cao nên ít sử dụng.
- BAP có hoạt tính cao hơn kinetin và bền nhiệt với độ cao hơn zeatin.
Vai trò sinh lý của nhóm Cytokinin
- Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng chồi in vitro.
- Kìm hãm sự già hóa và kéo dài tuổi thọ của cây.
- Ức chế sự hình thành rễ.
- Kích thích sự nảy mầm của hạt, củ.
- Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh.
e. Các chất hữu cơ bổ sung


 Nước dừa
Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và
chất kích thích sinh trưởng. Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hóa và
nhân nhanh chồi ở nhiều loài cây. Thông thường nước dừa được xử lý để loại trừ
các protein, sau đó được lọc qua màng lọc để khử trùng trước khi bảo quản lạnh.
Nước dừa thường sử dụng với nồng độ 5 – 20% thể tích môi trường (George, 1993;
George,
1996).
 Dịch chiết nấm men
Có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của mô và tế bào. Dịch
chiết nấm men là chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô tế bào động
vật với nồng độ thích hợp (Trần Văn Minh, 2010).
 Dịch chiếc khoai tây
Dịch chiết khoai tây có chứa cacbohydrat, acid amin, các vitamin B, C và
các yếu tố khoáng như kali, sắt, magie rất tốt cho sự sinh trưởng và phát triển của
mô, tế bào. Chiết xuất khoai tây được bổ sung vào môi trường nuôi cấy lan, bao
phấn lúa và một số cây ngũ cốc khác (Trần Văn Minh, 2010).
 Than hoạt tính
Bổ sung than hoạt tính vào trong môi trường nuôi cấy có tác dụng khử độc.

Ảnh hưởng của than hoạt tính: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinh
trưởng và làm đen môi trường. Khả năng kích thích sự tăng trưởng của mô thực vật
là do than hoạt tính kết hợp với các hợp chất phenol độc do mô tiết ra trong suốt thời
gian nuôi cấy.
 Độ pH và agar
Độ pH ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của các ion trong môi trường
khoáng, khả năng đông tụ agar và sự tăng trưởng của tế bào. Độ pH của môi trường
nuôi cấy thích hợp cho đa số các loại cây trồng dao động từ 5,5 - 6,0. Nếu pH thấp
thì agar sẽ không đông sau khi hấp khử trùng (Trần Văn Minh, 2010).


Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar để làm rắn môi
trường. Nồng độ agar sử dụng thường là 0,6 – 1%, đây là loại tinh bột đặc chế từ
rong biển để tránh hiện tượng mô chìm trong môi trường hoặc bị chết vì thiếu oxi
nếu môi tường lỏng và tĩnh (Trần Văn Minh, 2010).
1.1.3. Các giai đoạn nuôi cấy mô thực vật
1.1.3.1. Giai đoạn 1: Chọn lựa và khử trùng mẫu
Mẫu cấy là mảnh thực vật được đặt trong môi trường nuôi cấy. Để tiến
hành nuôi cấy in vitro thành công, khi lựa chọn mô cần lưu ý đến tuổi sinh lý của cơ
quan được dùng làm mẫu cấy, vụ mùa lấy mẫu, chất lượng của cây lấy mẫu, kích
thước và vị trí lấy mẫu đó. Mẫu cấy sau khi chọn lựa được rửa sạch bằng xà phòng
và khử trùng bề mặt bằng các chất khử trùng hóa học như calcium hypochloride,
sodium dichloroisocyanurate, clorua thủy ngân, …(Dương Công Kiên, 2003).
1.1.3.2. Giai đoạn 2: Tạo thể nhân giống
Mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân
giống in vitro. Có hai thể nhân giống in vitro là thể chồi và thể cắt đốt. Tạo thể nhân
giống in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng. Đối
với những loài không có khả năng nhân giống, người ta thường nhân giống bằng
cách tạo cụm chồi từ mô sẹo. Trong môi trường nhân giống thường bổ sung
cytokinin, GA3 và các chất hữu cơ khác (Dương Công Kiên, 2003).

1.1.3.3. Giai đoạn 3: Nhân giống in vitro
Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp
nuôi cấy mô và tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật
liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi trường tạo
thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân
giống kéo dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra
nhanh. Cây nhân giống in vitro ở trạng thái trẻ hóa và được duy trì trong thời gian
dài (Dương Công Kiên, 2003).


1.1.3.4. Giai đoạn 4: Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh
Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ để chuẩn bị
chuyển ra vườn ươm. Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra môi
trường bình thường. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là các
chất kích thích quá trình tạo rễ. Điều kiện nuôi cấy gần với điều kiện tự nhiên bên
ngoài, một bước làm thích nghi trước khi tách ra khỏi điều kiện in vitro. Sự ra rễ phụ
thuộc vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hóa
của mẫu, kiểu di truyền. Người ta thường bổ sung auxin để kích thích quá trình ra
rễ in vitro (Dương Công Kiên, 2003).
1.1.3.5. Giai đoạn 5: Chuyển cây con ra vườn ươm
Cây con đã ra rễ được lấy ra khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và được đặt
trong chậu, luống ươm có cơ chất dễ thoát hơi nước, tơi xốp, nơi có bóng râm, độ
ẩm cao, cường độ chiếu sáng thấp,… Trong những ngày đầu, cần phủ nilon để tránh
sự thoát hơi nước ở lá. Rễ cây trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần dần lụi đi và rễ
mới xuất hiện, cây con thường được xử lý ra rễ bằng cách ngâm rễ hay phun lên lá
các hợp chất kích thích ra rễ ở nồng độ thấp để rút ngắn thời gian ra rễ. Đây là giai
đoạn quan trọng trong quá trình nhân giống vô tính vì cây con thường bị chết do sự
khác biệt về điều kiện sống giữa in vitro và ex vitro (Dương Công Kiên, 2003).
1.1.4. Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô thực vật
Về mặt lý luận và thực tiễn, nhân giống thực vật bằng kỹ thuật nuôi cấy mô

có những ưu điểm sau:
-

Hệ số nhân giống cao.

-

Các cây đồng nhất về mặt di truyền.

-

Tất cả các bộ phận của cây đều có thể làm vật liệu nhân giống.

-

Có thể nhân giống quanh năm.

-

Khắc phục được đặc tính khó nhân giống và bất thụ ở một số cây trồng.

-

Chất lượng giống cao, tạo nguồn giống sạch bệnh cho sản xuất.

-

Tạo cây có khả năng ra hoa, tạo quả sớm.