Thử nghiệm các phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn bacillus spp và lactobacillus spp đối với một số nấm mốc aspergillus spp sinh aflatoxin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

THỬ NGHIỆM CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ KHẢ
NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN
BACILLUS SPP. VÀ LACTOBACILLUS SPP. ĐỐI VỚI
MỘT SỐ NẤM MỐC SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1515100007

: LÊ NGÔ VŨ PHƯỢNG
Lớp: 15HSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2016.


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự
hướng dẫn của TS. Nguyễn Hoài Hương khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực PhẩmMôi Trường của trường Đại Học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh.

Những kết quả trong đồ án này hoàn toàn không sao chép từ đồ án tốt nghiệp
của người khác với bất kì hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ án tốt nghiệp
hoàn toàn trung thực. Tôi xin chịu toàn bộ trách nhiệm về đồ án của mình.
TP.HCM, ngày 12 tháng 8 năm 2016
Sinh viên thực hiện

Lê Ngô Vũ Phượng.

i


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CÁM ƠN
Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn đến cha mẹ, người đã nuôi nấng dạy dỗ khuyến
khích và tạo mọi điều kiện cho con học tập để con có được thành quả như ngày hôm
nay.
Trong suốt khoảng thời gian học tại trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM, em
đã được các thây, cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Môi Trường hết
lòng hướng dẫn, giúp đỡ em trong quá trình học tập tại trường cũng như trong quá
trình thực hiện đồ án tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn đến quý Thầy, Cô nhờ
có thầy, cô đã trang bị cho chúng em kiến thức cần thiết để tự tin bước vào đời.
Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Hoài Hương, đã tận tình
hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt khoảng thời gian xây dựng đề cương và thực
hiện, hoàn thành đồ án này.
Em cũng xin cám ơn các Thầy, Cô trong phòng thí nghiệm và bạn bè đã quan
tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn thành đồ án tốt nghiệp này.
Cuối cùng, em xin cảm ơn các Thầy, Cô trong Hội Đồng Phản Biện đã dành
thời gian đọc và nhận xét đồ án này. Em xin gửi đến quý Thầy, Cô lời chúc sức
khỏe.

TP. HCM, ngày 12 tháng 8 năm 2016
Sinh viên thực hiện
Lê Ngô Vũ Phượng

ii


Đồ án tốt nghiệp

3


MỤC LỤC
TRANG
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................... vi
DANH MỤC BẢNG .................................................................................. vii
DANH MỤC HÌNH ................................................................................... ix
MỞ ĐẦU .................................................................................................... 2
CHƯƠNG I: TÔNG QUAN ................................................................... 4
1.1. Tổng quan về nấm: ..................................................................................4
1.1.1. Giới thiệu chung....................................................................................4
1.1.2.
Độc
tố
do
.............................................................................4

nấm

tiết

ra

1.1.3. Tác hại của nấm ....................................................................................5
1.1.3.1. Tác hại của nấm gây cho người và động vật......................................5
1.1.3.2.
Tác
hại
của
......................................................6
1.1.4.
Một số chủng
...........................................6

nấm

nấm

gây

gây

cho

hại

trên

thực
thực

vật
phẩm

1.2. Tổng quan về hợp chất kháng nấm: ........................................................7
1.2.1.
Hợp
chất
kháng
................................................................10

nấm

hóa

học

1.2.2. Tác hại của hợp chất kháng nấm hóa học .............................................10
1.2.3. Hợp chất kháng nấm trong sinh học .....................................................13
1.2.3.1.

Hợp chất kháng nấm từ thực vật: ....................................................13

1.2.3.2.

Hợp chất kháng nấm từ vi khuẩn: ...................................................17
a. Khả năng kháng nấm mốc của Bacillus spp. .............................17
b. Khả năng kháng nấm mốc của Lactobacillus spp......................19

1.3.

Các phương pháp sàng lọc các chủngVSV kháng nấm mốc:
..................21
1.3.1. Phương pháp đối kháng trực tiếp (cấy 2 đường vi khuẩn)....................21
1.3.2. Phương pháp đối kháng trực tiếp (đặt thạch khuếch tán) .....................23
1.3.3. Phương pháp đối kháng che phủ (đổ dĩa 2 lớp): ...................................25
4


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....... 26
2.1. Địa điểm nghiên cứu: ................................................................................26
2.2. Thời gian nghiên cứu: ...............................................................................26
2.3. Vật liệu nghiên cứu: ..................................................................................26
2.3.1. Giống vi sinh vật: ..................................................................................26
2.3.1. Hóa chất và môi trường sử dụng ...........................................................26
2.3.1.1. Hóa chất: .............................................................................................26
2.3.1.2. Môi trường nuôi cấy:...........................................................................26
2.4. Thiết bị và dụng cụ:...................................................................................27
2.4.1. Thiết bị: ..................................................................................................27
2.4.2. Dụng cụ: .................................................................................................28
2.5. Phương pháp luận:....................................................................................28
2.6. Phương pháp nghiên cứu: .........................................................................29
2.6.1. Sơ đồ nghiên cứu....................................................................................29
2.6.2. Khảo sát sự tăng trường của nấm mốc: ..................................................30
2.6.3. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp ria 2
đường vi khuẩn của 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với nấm mốc:
..........................................................................................................................30
2.6.4. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp đặt thạch
khuếch tán của 2 chủng VK Bacillus spp.và Lactobacillus spp.với nấm mốc:

..........................................................................................................................35
2.6.5. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng che phủ theo phương pháp đỗ dĩa 2
lớp của 2 chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với nấm mốc: .
..........................................................................................................................39
2.6.6. Một số phương pháp khảo sát hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của một số
chủng vi khuẩn .................................................................................................43
2.6.6.1. Nhuộm gram........................................................................................43
2.6.6.2. Nhuộm bào tử......................................................................................44
2.6.6.3. Một số thử nghiệm sinh hóa:...............................................................44


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .......................................... 45
3.1. Định danh sơ bộ khảo sát sinh lý - sinh hóa của một số chủng vi khuẩn
..................................................................................................................... 45
3.1.1. Nhuộm Gram:.................................................................................... 45
3.1.2. Nhuộm bào tử:................................................................................... 46
3.1.3. Một số thử nghiệm sinh hóa:............................................................. 47
3.2. Khảo sát sự tăng trưởng của nấm mốc: ...............................................
48
3.3. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp ria 2 đường vi khuẩn
của 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với các chủng nấm mốc:
..........................................................................................................................50
3.4. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp đặt thạch
khuếch tán của 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với các chủng nấm
mốc:..................................................................................................................66
3.5. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng che phủ thep phương pháp đỗ dĩa 2
lớp 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với các chủng nấm mốc
..........................................................................................................................81

3.6. So sánh khả năng đối kháng nấm mốc của 20 chủng vi khuẩn thông qua cách
chấm điểm LSD (Sai số khác biệt nhỏ nhất) ....................................................90

KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ..................................................................... 94
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................ 96
PHỤ LỤC


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
LAB

Lactobacillus spp

NA

Nutrient Agar

NB

Nutrient Broth

MT

Môi trường

PDA

Potato dextrose agar

VK

Vi khuẩn

VSV

Vi sinh vật


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1.Một số hợp chất kháng nấm hóa học được sử dụng để bảo quản hạt giống
..........................................................................................................................9

Bảng 1.2.Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men
(Corsetti và cộng sự, 1998) ..............................................................................18
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái của các chủng Bacillus spp. .............................45
Bảng 3.2. Một số phản ứng sinh hóa của các chủng Bacillus spp. .................47
Bảng 3.3. Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế các chủng nấm mốc của các chủng vi khuẩn
Bacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn...........
..........................................................................................................................53
Bảng 3.4. So sánh sô liệu tỉ lệ ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn Bacillus
spp. mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn....
..........................................................................................................................54
Bảng 3.5. Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế của các chủng nấm mốc của các vi khuẩn
Lactobacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn
..
..........................................................................................................................62

Bảng 3.6. So sánh số liệu tỉ lệ ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn
Lactobacillus spp. mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp cấy 2 đường vi
khuẩn ...............................................................................................................63
Bảng 3.7. Thống kê số liệu vòng ức chế các chủng nấm mốccủa các chủng vi khuẩn
Bacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp đặt thạch khuếch tán ...........
..........................................................................................................................68
Bảng 3.8. So sánh sô liệu vòng ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn
Bacillus spp. mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp đặt thạch khuếch tán
..........................................................................................................................69
Bảng 3.9. Thống kê số liệu vòng ức chế của các chủng nấm mốc của các vi khuẩn
Lactobacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp đặt thạch khuếch tán....
..........................................................................................................................76

vii


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.10.So sánh số liệu vòng ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn
Lactobacillus spp. mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp đặt thạch khuếch
tán .....................................................................................................................77
Bảng 3.11. Thống kê số liệu trung bình ức chế các chủng nấm mốc của các chủng vi
khuẩn Bacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp đỗ dĩa 2 lớp ..............
..........................................................................................................................84
Bảng 3.12. Sắp xếp sô liệu trung bình ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn
Bacillus spp. trong các nhóm theo phương pháp đõ dĩa 2 lớp .........................85
Bảng 3.13. Sắp xếp số liệu trung bình ức chế của các chủng nấm mốc của các vi
khuẩn Lactobacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp đỗ dĩa 2 lớp.......
..........................................................................................................................89
Bảng 3.14. Sắp xếp sô liệu trung bình ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn

Lactobacillus spp. trong các nhóm theo phương pháp đỗ dĩa 2 lớp ...............90
Bảng 3.15. Thống kê điểm các chủng vi khuẩn Bacillus spp. theo từng phương pháp
dựa
theo
xếp
hạng
....................................................................................91

LSD

Bảng 3.16.. Thống kê điểm các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. theo từng
phương pháp dựa theo xếp hạng LSD..............................................................92

8


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của Metalaxyl .......................................................10
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của Manocozeb ....................................................11
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của Hexacoconazole ............................................11
Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của Pyrones .........................................................14
Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của Viridines ........................................................15
Hình 1.6. Phương pháp cấy ria 2 đường thể hiện sự đối kháng của vi khuẩn
LAB đối với nấm mốc (trích từ Nora Laref, 2013)..........................................20
Hình 1.7. Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng của vi khuẩn có lợi theo phương
pháp ria 2 đường vi khuẩn................................................................................21
Hình 1.8. Phương pháp đặt thạch khuếch tán thể hiện sự đối kháng giữa vi khuẩn
Bacillus spp với Calbicans (trích dẫn Mounyr Balouiri, 2015) .......................

..........................................................................................................................22
Hình 1.9. Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng của vi khuẩn có lợi theo phương
pháp đặt thạch khuếch tán ................................................................................23
Hình 1.10. Phương pháp đối kháng che phủ của Bacillus spp. với các loại nấm
(trích từ Kumar và các cộng sự,2009)..............................................................24
Hình 1.11. Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng của vi khuẩn có lợi theo phương
pháp đỗ dĩa .......................................................................................................25
Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát nghiên cứu khả năng dối kháng của các chủng vi khuẩn
có lợi đối với nấm mốc ....................................................................................29
Hình 2.2. Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với
nấm mốc theo phương pháp cấy ria 2 đường ...................................................31

9


Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.3. Mô tả cách đo đường kính vòng ức chế theo phương pháp ria 2 đường vi
khuẩn ................................................................................................................35
Hình 2.4. Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với
nấm mốc theo phương pháp đặt thạch khuếch tán ...........................................36
HÌnh 2.5. Cách đặt thạch vi khuẩn trong phương pháp đặt thạch khuếch tán .
..........................................................................................................................37
Hình 2.6. Mô tả cách đo vòng ức chế của vi khuẩn theo phương pháp đặt thạch
khuếch tán ........................................................................................................38
Hìn h 2.7.Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với
nấm mốc theo phương pháp đỗ dĩa 2 lớp thạch ...............................................40
Hình 3.1. HÌnh thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn Bacillus spp...............45
HÌnh 3.2. Nhuộm Gram các chủng vi khuẩn ...................................................46
Hình 3.3. Nhuộm bào tử các chủng vi khuẩn...................................................47

Hình 3.4. Sự phát triển của nấm mốc sau 3 ngày trên MT PDA .....................48
Hình 3.5. Sự phát triển của nấm mốc sau 3 ngày trên MT MRS Cải tiến .......49
Hình 3.8. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus spp phân lập tử
phụ phế phẩm ...................................................................................................55
Hình 3.9. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốccủa nhóm Bacillus spp phân lập tử
phụ đất ..............................................................................................................56
Hình 3.10 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus spp phân lập
tử nước thải ......................................................................................................57
Hình 3.13. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốccủa nhóm Lactobacillus sp phân
lập tử nem .........................................................................................................63

1
0


Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.14. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốc của nhóm Lactobacillus sp phân
lập tử cơm mẻ ...................................................................................................64
Hình 3.18. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus spp phân lập
tử phụ phế phẩm ...............................................................................................70
Hình 3.19. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus 66spp phân
lập tử đất ...........................................................................................................71
Hình 3.20. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấmmốccủa nhóm Bacillus spp phân lập
tử nước thải ......................................................................................................72
Hình 3.24. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm Lactobacillus sp
phân lập tử nem ................................................................................................78
Hình 3.25. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm Lactobacillus sp
phân lập tử cơm mẻ ..........................................................................................79

11


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề:
Hiện nay, trên thế giới và nước ta đang nghiên cứu về các phương pháp đối
kháng lại các loại nấm mốc khác nhau như đối kháng giữa nấm có lợi với nấm
mốc hay đối kháng giữa các vi sinh vật có lợi với nấm mốc.
Độc tố của các loại vi nấm có nhiều loại như aflatoxin, ocharatoxin,
tricothecenes, zearalenone…. Các loại độc tố này rất nguy hiểm, thường gây
nhiễm trên nông sản, gây độc cho con người và gia súc như là gây tổn thương
gan (ung thư gan…), gây quái thai, gây đột biến và nếu bị nhiễm ở hàm lượng
cao sẽ gây chết người. Trong khi đó, thuốc trừ nấm mốc hóa học lại gây nhiều tác
dụng phụ ảnh hường đến đời sống của con người và động vật.
Vì vậy, ở nước ta đã có khá nhiều công trình nghiên cứu về khả năng đối kháng
lại nấm mốc gây hại trên nông sản và thực phẩm bằng các loại nấm có lợi khác
như Trichoderma spp…và sử dụng các thuốc bảo vệ thực vật hóa học. Nhưng
việc sử dụng vi sinh vật có lợi để đối kháng lại các loại nấm mốc gây hại vẫn còn
khá mới và chưa được áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm.
Từ những vấn đề trên, để phân lập được các chủng vi sinh vật có khả năng kháng
nấm mốc trong in vitro đã có nhiều đề tài và các phương pháp kháng nấm mốc
khác nhau nhưng chưa có sự so sánh giữa các phương pháp đó với nhau. Từ đó,
em đã thực hiện nhiều phương pháp kháng nấm mốc khác nhau và so sánh chúng
và sau đó, tìm ra phương pháp thích hợp và hiệu quả nhất với phòng thí nghiệm
của trường .Chính vì vậy, em xin thực đề tài “Thử nghiệm các phương pháp
đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và
Lactobacillus spp. đối với một số nấm mốc Aspergillus spp. sinh aflatoxin”.

1

2. Tình hình nghiên cứu:
Có rất nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật để kháng nấm mốc gây
hại trong nông sản và thực phẩm theo nhiều phương pháp khác nhau.


Trong nước đã có nhiều công trình nghiên cứu dùng vi sinh vật để kháng

lại
nấm mốc theo phương pháp đối kháng trực tiếp (Magaldi,2004) như: “ Phân
lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp. ứng dụng trong bảo quản nông sản”
(Văn Hương, 2015), đồ án tốt nghiệp “Khảo sát khả năng kháng nấm nhiễm
thực phẩm Aspergillus Niger và Mucor sp. Của vi khuẩn Lactobacillus
L5”(Phan Nguyễn Hương Thảo, 2015)….


Ngoài nước có công trình nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi

khuẩn
lactic được phân lập từ Kim Chi để kháng lại Aspergillus fumigatus Jeong75, Hàn Quốc theo phương pháp đối kháng che phủ (Magnusson và
Schnurer,2001) .

3. Mục đích nghiên cứu:
Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm mốc cao và hiệu quả
nhất từ bộ sưu tập các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. của
phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Môi Trường của trường.

4. Mục tiêu nghiên cứu:
Tìm ra phương pháp đánh giá khả năng đối kháng vi nấm hiệu quả nhất và dễ
thực hiện áp dụng trên bộ sưu tập các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và

Lactobacillus spp. của phòng thí nghiệm khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực
Phẩm- Môi Trường.

5. Nhiệm vụ nghiên cứu:
 Xác định tỉ lệ đối kháng của 10 chủng Bacillus spp. và 10
chủng
Lactobacillus spp. đối với 5 chủng nấm mốc Aspergillus spp. tiềm năng sinh
aflatoxin được phân lập từ hạt đậu phông, đậu nành và cà phê bằng phương
pháp đối kháng trực tiếp (Dual Culture Two Line Culture Method).
2




Xác định tỉ lệ đối kháng nấm theo phương pháp đặt thạch khuếch tán.

(Agar
Plug Diffusion Method).

3




Đánh giá khả năng đối kháng nấm theo phương pháp đối kháng che

phủ
.(Overlay Method).
 Đánh giá tương quan giữa các phương pháp, từ đó đề nghị phương
pháp

thích hợp nhất cho phòng thí nghiệm.

6. Phương pháp nghiên cứu:
a. Phương pháp luận:
Dựa trên các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. đã được phân
lập trong phòng thí nghiệm để thử nghiệm các phương pháp đối kháng nấm đã
được mô tả trong tài liệu.Từ đó, đưa ra phương pháp thích hợp nhất trong phòng
thí nghiệm để đối kháng lại các loại nấm mốc gây hại trên thực phẩm và hạt
giống cây trồng.

b. Phương pháp xử lí số liệu:
 Sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ
thị.
 Sử dụng phần mềm SAS 9.1 để xử lí số
liệu.

7. Kết quả đạt được từ đề tài:
 Tuyển chọn được chủng vi khuẩn Bacillusspp.và vi khuẩn Lactobacillus spp.
có hoạt tính kháng nấm tốt nhất trong bộ sưu tập của phòng thí nghiệm.
 Đánh giá tỉ lệ ức chế các loại vi nấm của 2 chủng vi khuẩn thông qua phương
pháp kháng nấm trực tiếp theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn. (Dual
Culture Two Line Culture Method).
 Xác định đường kính ức chế các loại nấm mốc của 2 chủng vi khuẩn qua
phương pháp đối kháng trực tiếp theo cách đặt thạch khuếch tán (Agar Plug
Diffusion Method).
 Đánh giá khả năng ức chế các loại nấm mốc của 2 chủng vi khuẩn
qua
phương pháp đối kháng che phủ (Overlay Method).
 Đã chọn được phương pháp cho kết quả ổn định nhất trong phòng thí
nghiệm.

4


8. Kết cấu đồ án:



Mở đầu
Chương 1: Tổng quan tài liệu- Nội dung chương đề cập đến các nội dung

liên
quan đến tài liệu nghiên cứu.


Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – Nội dung chương đề cập
đến các dụng cụ, thiết bị và phương pháp nghiên cứu trong đồ án.

 Chương 3: Kết quả và thảo luận – Nội dung chương đưa ra những kết quả
mà đề tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận, biện chứng kết quả thu
được
 Kết luận và kiến nghị- Nội dung tóm lại những kết quả mà đề tài đã đạt được
và kiến nghị cho những hướng cần cải tiến thêm trong đề tài.

5


Chương I: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về nấm:
1.1.1. Giới thiệu chung về nấm:
 Nấm học (Mycology) được nhà khoa học người Ý là Pier

Antonio
Micheli (1729) nghiên cứu ra qua tài liệu “Giống cây lạ” (Nova
Plantarum Genera) nhưng theo giáo sư Ekriksson Gunnan (1978) thì
người có công nghiên cứu sâu về nấm mốc lại là Elias Fries (17941874).Những đại diện tiêu biểu của nấm là nấm mốc, nấm men và nấm
lớn (nấm quả thể). Phần lớn các loài nấm này không quan sát được bằng
mắt thường. Đa phần chúng sống trong đất, chất mùn, xác của vi sinh
vật, cộng sinh hay kí sinh trên cơ thể của động vật, thực vật hay nấm
khác. Vi nấm có vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân hủy
các chất hữu cơ và không thể thiếu trong quá trình chuyển hóa và trao
đổi chất


Nấm mốc (hay còn gọi là vi nấm) là vi sinh vật chân hạch, ở thể tản, là

tế
bào không có diệp lục tố, thường sinh sản thông qua bào tử hoặc sống dị
dưỡng (hoại sinh, kí sinh, cộng sinh),quá trình sinh sản có thể là vô tính
nhay hữu tính.Vách tế bào chủ yếu là chitin, có hoặc không có cenllulose
và một số thành phần khác có hàm lượng thấp. Nấm mốc thường thường
phát triển dưới dạng sợi đa bào gọi là sợi nấm (hyphae) tạo hệ sợi
(mycelium). Có 2 loại sợi:


Sợi nấm dinh dưỡng: nằm trong lớp môi trường, làm nhiệm vụ hấp
thu chất dinh dưỡng cho toàn bộ hệ nấm.



Sợi nấm khí sinh: thường nhô ra môi trường, giữ vai trò sinh sản (tạo
bào tử).

1.1.2. Độc tố do nấm tiết ra:
 Theo Nguyễn Duy Tường (2009), độc tố của nấm mốc (mycotoxin) là
nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng, có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo

6


ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc đối với động vật có
vú, gia cầm và con người.


Hiện nay, có khoảng 300 loài độc tố được phát hiện và nghiên cứu. Tuy
nhiên, chỉ có khoảng 20 loài độc tố gây hại lên thực phẩm ở mức độ
nghiêm trọng và liên quan đến an toàn thực phẩm. Được tạo ra từ 5 chi
nấm: Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria, Clavicep, chúng
bao gồm:


Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, M1, M2 và G1, G2),
Ochratoxin A, Stermatocystin, Axit Cyclopianxoic.



Các độc tố của Penicillium: Pautulin, Ochratoxin A, Citrinin,
Penitrem A, Fumonisin, Moniliformin….



Các độc tố của Fusarium: Deoxynivalenon, Nivalenon, Zearalenon,

T-2 toxin.



Các độc tố của Alternaria: Axit Tenuazoic, Alternarion, Methyl
Ether Alternarion.

 Các độc tố của Clavicep: các alkaloid của nấm cựa gà.
 Trong đó, nấm gây độc chủ yếu và nguy hại nhất là Aflatoxin. Chúng là
độc tố vi nấm do nấm mốc Aspergillus flavus, A.parasiticus sản sinh ra,
thường gây độc tố ô nhiễm lên các loại đậu (như đậu phộng). Phản ứng
gây độc chủ yếu của chúng là trong gan. Nếu mức độ gây nhiễm thấp sẽ
tích lũy dần trong gan và làm giảm khả năng sinh sản của động vật về lâu
dài sẽ gây ra bệnh ung thư.


Ngoài ra, còn có 1 số độc tố của các vi nấm thường gặp như Ochratoxin
Penicillium và Aspergillus tiết ra. Độc tố Zearalenon và Tricothecenes
chủ yếu do nấm Fusarium tiết ra, độc tố Patulin lại do nấm Penicillium
và Fumonisin tiết ra.

7


1.1.3. Tác hại của nấm mốc:
1.1.3.1. Tác hại của nấm gây ra cho con người và động vật:
 Dị ứng hoặc ngộ độc do ăn hay tiếp xúc với nấm: Có khoảng 70 loài nấm
sinh bào tử là những tác nhân gây dị ứng. Chúng có thể là nấm mốc trong
nhà hay ngoài trời, đa phần là nấm sợi thuộc các chi Alternaria,
Aspergillus, Cladosporium, Helminthosporium, Epicoccum, Penicillium,

Fusarium..., chỉ có vài loài nấm đơn bào như Candida, Rhodotorula, có
một số loài là nấm lớn như Agaricus, Coprinus, Fomer, Ganoderma...
Bào tử nấm có thể gây ra những chứng như hen suyễn, viêm mũi dị ứng,
các bệnh nấm dị ứng phế quản phổi và viêm phổi quá mẫn. Ngộ độc do
ăn phải nấm độc, có thể làm rối loạn tiêu hóa, ảo giác, bào mòn ống tiêu
hóa, làm giảm khả năng đề kháng tiêu hóa các chât dinh dưỡng trong
thức ăn, nghiêm trọng hơn có thể dẫn tử vong.


Nấm kí sinh trên cơ thể người gây bệnh trực tiếp: Những loài có thể gây
bệnh cho người thuộc các chi như: Aspergillus, Candida, Cryptococcus,
Histoplasma và Pneumocystic. Chúng có thể gây ra các bệnh ngoài da ở
người như nấm chân, nấm móng, nấm tóc, hắc lào, lang ben,... cho đến
những bệnh nguy hiểm có thể gây chết người như viêm màng não (nấm
Cryptococcus), hay Viêm phổi do nấm Pneumocystic carinii.

1.1.3.2.

Tác hại của nấm gây ra cho thực vật:

 Những loài nấm gây bệnh trên cây trồng có thể gây thiệt hại lớn cho
ngành nông nghiệp và lâm nghiệp. Ví dụ như nấm đạo ôn (Magnaporthe
oryzae) gây bệnh cho lúa. Những loài gây bệnh cho cây thuộc các chi
Fusarium, Ustilago, Alternaría và Cochliobolus. Chúng làm thối rễ, tổn
thương các bộ phận của cây trồng, hoa, quả, làm giảm năng suất hoặc chất
lượng sản phẩm nông nghiệp do bị ẩm mốc,...
1.1.4. Một số chủng nấm gây hại trên thực phẩm:
 Trong hệ vi khuẩn, nấm mốc thiên nhiên (Fungal flora) có 3 chủng giống
nấm mốc chiếm ưu thế đã và đang gây độc cho thực phẩm là Aspergillus,

8


Fusarium và Penicillium thường tiết độc tố vi nấm vào thực phẩm vào
thời gian trước, trong và sau khi thu hoạch ngũ cốc, hạt có dầu, đậu
đỗ,…


Có 4 tác động gây độc của độc tố vi nấm là: độc cấp tính, mãn tính, gây
đột biến và quái thai. Phổ biến nhất là độc cấp tính, làm hư gan và rối
loạn chức năng hoạt động của thận, có thể gây chết đối với trường hợp
nặng. Các độc tố vi nấm tác động lên hệ thần kinh, ở nồng độ thấp gây tê
liệt động vật và ở nồng độ cao có thể gây tổn thương não và chết. Nhiều
công trình thử nghiệm đã xác định độc tố vi nấm có thể gây ung thư, đặc
biệt là ở gan. Qua thử nghiệm trên động vật nuôi trong nhà đã xác định
có một số độc tố vi nấm gây rối loạn tới sự sao chép ADN và gây hậu
quả là đột biến hoặc quái thai.

1.2. Tổng quan về các hợp chất kháng nấm:
Hợp chất kháng nấm là các chất ức chế sự tăng trưởng của nấm có tầm
quan trọng trong việc kiểm soát các tác nhân gây bệnh của nấm đối với
con người và động vật và trong việc phòng chống nấm mốc trong thực
phẩm và các vật liệu khác.
1.2.1. Hợp chất kháng nấm hóa học:
 Các hợp chất kháng nấm hóa học đa số đều có mặt trong các loại thuốc
trừ nấm mốc gây hại cho nông sản như Carbendazim, Metalaxyl, Anvil,
….

9

Bảng 1.1: Một số hợp chất kháng nấm hóa học thường gặp trong
thuốc bảo quản hạt giống. (Mathre và các cộng sự,2011).

 Các hoạt chất kháng nấm hóa học phổ biến như metalaxyl, mancozeb và
hexaconazole… chúng đều thông qua tế bào mô thực vật tiêu diệt các
nấm gây bệnh phát triển trong đó.
 Metalaxyl có tên hóa học là methyl N-(methoxyacetyl)-N-(2,6-xylyl)-DLalaninate là hoạt chất trừ nấm thuộc nhóm Alanine, đặc biệt hiêu quả với
nhóm nấm Oomycetes mà hai đại diện điển hình là Phytophthora và
Pythium gây nên các bệnh nghiêm trọng cho cây trồng. Hoạt chất
Metalaxyl có tác dụng nội hấp và lưu dẫn mạnh, thuốc được hấp thụ qua
lá, thân, rễ của cây trồng sau đó vẫn chuyển, lưu dẫn trong cây, ức chế sự
tổng hợp protein, can thiệp vào quá trình tổng hợp ARN ribosome của tế
bào nấm. Phòng trừ hiệu quả các loại nấm phát sinh từ đất và các loại nấm
phát tán bào tử trong không khí. (trích Chi cục trồng trọt và bảo vệ thực
vật tỉnh Lâm Đồng,2015).

10


Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của Metalaxyl
 Manocozeb có tên hóa học là Manganese Ethylene bisdithiocarbamate
phức hợp với kẽm, là hoạt chất thuộc nhóm thuốc diệt nấm
Dithiocarbamate. Manocozeb là phức hợp của kẽm và muối mangan, dạng
bột màu vàng hung, không tan trong nước và các dung môi hữu cơ khác,
bền trong môi trường khô nhưng thủy phân trong môi trường nóng, ẩm và
acid. Hoạt chất này không diệt nấm trực tiếp chỉ khi tiếp xúc với nước,
manocozeb mới bị hoạt hóa, giải phóng ethylene bisthiocyanate sunfua
(EBIS). Dưới tác động của tia cực tím, EBIS chuyển hóa thành ethylene
bisthiocyanate (EBI). EBIS và EBI tác động tới các enzyme có chứa nhóm

sulphydryl gây ức chế hoạt động của sáu quá trình sinh hóa khác nhau
trong tế bào chất và ty thể, phá vỡ sự nảy nầm của bào tử nấm mốc.( trích
dẫn từ Chi cục trồng trọt và bảo vệ thực vật tỉnh Lâm Đồng, 2014).

Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của Manocozeb

11




Hexaconazole có công thức hóa học là C19H17Cl2N3O3 là hoạt chất có chứa
trong thuốc kháng nấm hóa học Anvil 5SC. Là hoạt chất trừ nấm phổ
rộng, tiêu diệt nấm mốc thông qua cơ chế ngăn cản sinh tổng hợp
Ergosterol (chất cấu tạo nên màng nấm mốc), nấm sẽ bị cô lập và ngừng
phát triển do chúng không hình thành được tế bào mới. Chất này được mô
cây hấp thu rất nhanh, chuyển vị và lưu dẫn mạnh nên kiểm soát nấm mốc
nhanh chóng và hiệu quả và kéo dài cơ chế vừa phòng vừa trị bệnh.

Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của Hexaconazole.
1.2.2. Tác hại của hợp chất kháng nấm hóa học:
 Bên cạnh các lợi ích trong việc kháng nấm thì các hợp chất hóa học gây
ảnh hưởng mạnh đến môi trường và sức khỏe của con người và động vật.
Theo điều tra của cục Y tế dự phòng và môi trường Việt Nam, hằng năm
có trên 5000 trường hợp nhiễm độc hợp chất hóa học phải cấp cứu tại
bệnh viện và có trên 300 trường hợp tử vong (do ngộ độc cấp tính) vì
lượng chất hóa học còn tồn đọng quá cao trong thực phẩm. Nếu liều
lượng ít, được đưa gián tiếp vào cơ thể thông qua thực phẩm, về lâu dài
từ 3-5 năm sẽ phát bệnh (tim mạch, ung thư…)


Đối với con người: cơ thể con người nhiễm độc các hợp chất hóa
học

biểu hiện ở nhiều mức độ như là giảm sức khỏe, gây rối loạn hoạt động ở
hệ thần kinh, tim mạch, tiêu hóa hô hấp, bài tiết, gây các tổn thương bệnh
lý ở các cơ quan từ mức độ nhẹ đến nặng thậm chí tàn phế và tử vong. Ví
12