So sánh mối liên hệ di truyền giữa các chủng neisessria meningitidis (não mô cầu) ở khu vực phía nam bằng phương pháp điện di trong trườg xung điện (PFGE)

Đô án tốt nghiệp

MỤC LỤC
CHƯƠNG 1: MƠ ĐẦU ...................................................................................................1
1.1 Đặt vấn đề..............................................................................................................1
1.2 Mục tiêu, nội dung và phương pháp nghiên cứu ...................................................2
1.2.1 Mục tiêu ......................................................................................................2
1.2.2 Nội dung nghiên cứu ..................................................................................2
1.3 Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................2
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..........................................................................4
2.1 Tình hình nhiễm Neisseria meningitidis ...............................................................4
2.1.1 Tình hình nhiễm N. meningitidis trên thế giới ...........................................4
2.1.2 Tình hình nhiễm N. meningitidis tại Việt Nam ...........................................7
2.2 Tổng quan vê vi khuẩn Neisseria meningitidis .....................................................9
2.2.1 Phân loại N.meningitidis............................................................................9
2.2.2 Hình thái N. meningitidis ...........................................................................9
2.2.3 Tính chất nuôi cấy ....................................................................................10
2.2.4 Đặc điểm sinh hóa....................................................................................11
2.2.5 Đặc điểm dịch tễ.......................................................................................11
2.2.6 Cơ chế và khả năng gây bệnh ..................................................................13
2.2.6.1 Vật chủ và con đường lây nhiễm ....................................................13
2.2.6.2 Các yếu tố độc lực ..........................................................................13
2.2.6.3 Cơ chế gây bệnh .............................................................................15
2.2.7 Biểu hiện lâm sàng ...................................................................................17
2.2.7.1 Viêm họng .......................................................................................17
2.2.7.2 Nhiễm trùng huyết ..........................................................................17
2.2.7.3 Viêm màng não ...............................................................................19
2.2.8 Điều trị .....................................................................................................20
2.2.9 Phòng ngừa ..............................................................................................20
2.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử phân loại N. meningitidis ....................................22

i


Đô án tốt nghiệp

2.4 Kỹ thuật PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis): kỹ thuật điện di trong
trường xung điện hay điện di trong trường điện thay đổi. .........................................27
2.4.1 Nguyên tắc chung của PFGE ...................................................................27
2.4.2 Quy trình PFGE .......................................................................................29
2.4.3 So sánh kỹ thuật PFGE với các phương pháp phân loại sinh học
phân tử khác thường được sử dụng trong nghiên cứu. .....................................33
2.4.3.1 Ưu điểm ..........................................................................................33
2.4.3.2 Nhược điểm: ...................................................................................33
2.4.4 Ứng dụng của PFGE trong nghiên cứu dịch tễ học Neisseria
meningitidis .......................................................................................................34
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................39
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện..........................................................................39
3.2 Đối tượng nghiên cứu ..........................................................................................39
3.3 Vật liệu - sinh phẩm - môi trường - thiết bị ........................................................41
3.3.1 Vật liệu .....................................................................................................41
3.3.2 Sinh phẩm - hóa chất................................................................................41
3.3.3 Môi trường sử dụng..................................................................................42
3.3.4 Thiết bị......................................................................................................42
3.4

Phương pháp nghiên cứu..................................................................................44
3.4.1 Quy trình thực hiện ..................................................................................44
3.4.2 Mô tả quy trình .........................................................................................45
3.4.2.1 Hoạt hóa chủng vi khuẩn và tiến hành định danh sơ bộ băng
phương pháp truyền thống .........................................................................45

3.4.2.2 Thí nghiệm thực hiện test quy trình PFGE cải tiến........................45
3.4.2.3 Thí nghiệm trên các chủng .............................................................51
3.4.2.4 Tìm ra mối liên hệ di tryền giữa các chủng ...................................51

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................52
4.1 Kết quả khảo sát hình thái các chủng vi khuẩn thí nghiệm.................................52
4.2 Kết quả định danh ...............................................................................................52

ii


Đô án tốt nghiệp

4.2.1 Nhuộm gram .............................................................................................52
4.2.2 Thử nghiệm Catalase ...............................................................................53
4.2.3 Thử nghiệm Oxidase.................................................................................54
4.2.4 Thử nghiệm phân giải các loại đường .....................................................54
4.3 Kết quả kiểm tra quy trình PFGE trên chủng 12 – 705 DK. ...............................56
4.4 Kết quả điện di của 17 chủng để xây dựng mối liên hệ di truyên.......................57
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................66
5.1 Kết luận ................................................................................................................66
5.2 Kiến nghị ..............................................................................................................66
TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................................67

3


Đô án tốt nghiệp

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

AFLP

: Amplified Fragment Length Polymorphism

A. baumannii

: Acinetobacter baumannii

BA

: Blood Agar

Bp

: Base pairs

CA

: Chocolate Agar

CD

: Chủng dịch

CFU

: Colony Forming Units

CLB

: Cell Lysis Buffer

CSB

: Cell Suspension Buffer

CSF

: Kit for collection of cerebrospinal fluid

CTA

: Cystine Trypticase Agar

DNA

: Deoxyribonucleoic Acid

DK

: Đông khô

EDTA

: Ethylenediaminetetraacetic acid

EtBr

: Ethidium Bromide

ESBL

: Extended spectrum beta-lactamase

Kb

: Kilo base pairs

LOS

: Lipooligosaccharide

MLST

: Multilocus Sequence Typing

MLEE

: Multilocus enzyme electrophoresis

NAD

: Nicotine Adenine Dinudeotide

N. meningitidis

: Neisseria meningitidis

OMP

: Outer Membrane Protein

PCR

: Polymerase Chain Reaction

PFGE

: Pulsed Field Gel Electrophoresis

PS

: Polysaccharide

RNA

: Ribonucleic acid

RFLP

: Restriction Fragment Length Polymorphism

4


Đô án tốt nghiệp

S. typhi

: Salmonella typhi

S. aureus

: Staphylococcus aureus

TBE

: Tris-Borate-EDTA

TD

: Tự do

TP.HCM

: Thành phố Hồ Chí Minh

UV

: Ultra Violet

VCN

: Vacomycin-Colistin-Nystatin

WHO

: World Health Organization

µl

: Microliter

5


Đô án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 2.1 Phân bố của các phân nhóm N. meningitidis gây dịch trên toàn thế giới ...... 5
Hình 2.2 Vành đai viêm màng não ở châu Phi ............................................................. 6
Hình 2.3 Tiêu bản nhuộm dịch não tủy (A) và vi khuẩn N. meningitidis sau khi
nhuộm Gram (X100) tư khuẩn lạc (B) ......................................................................... 10
Hình 2.4 Hình thái khuẩn lạc N. meningitidis trên môi trường BA và CA................... 11
Hình 2.5 Các protein bê mặt và thành phần màng ngoài của N. meningitides ............. 14
Hình 2.6 Quá trình xâm nhiễm của N. meningitidis...................................................... 16
Hình 2.7 Một số phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử .................................. 24
Hình 2.8 Các bước thực hiện quy trình PFGE .............................................................. 29
Hình 2.9 Khả năng di động của phân tử DNA trong trường xung điện........................ 31
Hình 3.1 Sơ đồ thực hiện quy trình PFGE xác định mối liên hệ di truyên ................... 44
Hình 3.2 Các bước của quy trình PFGE chuẩn ............................................................ 45
Hình 4.1 Khuẩn lạc sau khi cấy qua đêm trên môi trường CA và BA tư chủng 12705DK ........................................................................................................................... 52
Hình 4.2 Kết quả nhuộm Gram ..................................................................................... 53
Hình 4.3 Kết quả thử nghiệm Catalase ......................................................................... 53
Hình 4.4 Kết quả thử nghiệm Oxidase .......................................................................... 54
Hình 4.5 Kết quả thử nghiệm 4 loại đường sau 24 giờ ................................................. 54
Hình 4.6 Kết quả chạy điện di PFGE trên chủng N. meningitidis (12-705 DK) .......... 57
Hình 4.7 Kết quả chạy điện di PFGE trên 17 chủng N. meningitides........................... 58
Hình 4.8 Kết quả phân tích mối liên hệ di truyên của 17 chủng vi khuẩn N.
meningitidis ................................................................................................................... 64

6


Đô án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Liêu lượng sử dụng kháng sinh dự phòng ..................................................... 22
Bảng 2.2 Một số enzym cắt hạn chế được dung cho kỹ thuật PFGE............................ 30
Bảng 2.3 Tiêu chuẩn tương đồng vê kiểu gen bằng kỹ thuật PFGE ............................. 33
Bảng 2.4 Minh hoạ các chủng vi sinh vật được phân tích dựa trên kết quả PFGE thu
được tư các đoạn nhiễm sắc thể .................................................................................... 38
Bảng 3.1 Danh sách 17 chủng vi khuẩn N. meningitidis thực hiện trong đê tài ........... 39
Bảng 3.2 So sánh các thông số thay đổi giữa PFGE theo WHO và cải tiến ................. 45
Bảng 3.3 Mô tả các bước thực hiện quy trình PFGE cải tiến ....................................... 46
Bảng 4.1 Kết quả test sinh hóa trên 17 chủng thí nghiệm ............................................ 55
Bảng 4.2 Số băng của 17 chủng N. meningitidis được cắt bởi NheI tư kết quả PFGE
ở hình 4.7....................................................................................................................... 59
Bảng 4.3 Số băng khảo sát được tư kết quả điện di PFGE ........................................... 61
Bảng 4.4 Các chủng khảo sát theo serogroup ............................................................... 62
Bảng 4.5 Biến động di truyên trên 17 chủng N. meningitidis ....................................... 63

vii


Đô án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1

Đặt vấn đê
Neisseria meningitidis (còn gọi là vi khuẩn não mô cầu) là một trong những

tác nhận hàng đầu gây ra hai thể bệnh viêm màng não mủ và nhiễm trùng huyết
nghiêm trọng trên toàn thế giới [9]. Bệnh có những triệu chứng, biểu hiện và lây lan
rất phức tạp. Ngay cả khi bệnh được chẩn đoán sớm và điêu trị đầy đủ thì tỉ lệ tử
vong vẫn chiếm 5 - 10%. Bệnh phát triển mạnh me nhất là vào mùa đông và trẻ em
dưới 5 tuổi có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất với tỷ lệ tử vong chiếm tư 20 – 50%. N.
meningitidis ky sinh ở nhiêu cơ quan trên cơ thể người như các niêm mạc mũi hầu,
họng, đường hô hấp, hệ thần kinh, máu, khớp, màng tim, đường niệu và sinh dục
[1], [13], [14].
N. meningitidis có thể truyền tư người sang người theo dịch tiết qua đường hô
hấp vì thế rất dễ lây lan và có khả năng phát triển thành dịch cao, đặc biệt là ở
những nơi tập trung đông người. Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới, hàng
năm có khoảng 300.000 – 500.000 trường hợp bệnh nhiễm não mô cầu [14]. Tại
Việt Nam, tính tư năm 2011 đến tháng 8 năm 2013, trung bình mỗi năm có 150
trường hợp mắc bệnh do não mô cầu với tỷ lệ tử vong khoảng 3,3% (theo số liệu
của viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh). Trong năm 2014, theo Tổng cục thống
kê, cả nước có 24 trường hợp mắc bệnh viêm màng não do não mô cầu gây ra, trong
đó 3 trường hợp tử vong [18].
Mười ba nhóm huyết thanh của N. meningitidis đã được ghi nhận, dựa trên cấu
trúc vỏ polysaccharide khác nhau, tuy nhiên chỉ có 6 nhóm huyết thanh có khả năng
gây dịch: A, B, C, X, Y và W – 135. Hiện nay, cách điêu trị hữu hiệu nhất đối với
N. meningitidis là dùng kháng sinh, tuy nhiên N. meningitidis được biết đến là rất
nhạy cảm với các loại thuốc kháng sinh được sử dụng để điêu trị và dự phòng.
Chính vì thế, cần có những nghiên cứu dịch tễ nhằm đưa ra đánh giá, cảnh báo và
kịp thời vê diễn biến của bệnh.
N. meningitidis rất đa dạng và phức tạp vê mặt di truyên nhưng các nghiên cứu
trong nước vê dịch tễ học của vi khuẩn này còn khá ít. Bên cạnh việc chẩn đoán và

1


giám sát thường niên thì việc quan tâm đến dịch tễ học phân tử của chủng trong
vùng dịch có y nghĩa hết sức quan trọng. Nhằm phục vụ công tác phòng chống dịch,
xác định nguồn gốc, thực hiện các thử nghiệm vắc-xin, nghiên cứu sự biến đổi di
truyên và mối liên quan giữa các chủng trong vùng dịch, giữa các chủng của các vụ
dịch trước để có biện pháp ứng phó kịp thời, đê tài “So sánh mối liên hệ di truyên
giữa các chủng Neisessria meningitidis (Não mô cầu) ở khu vực phía Nam bằng
phương pháp điện di trong trường xung điện (PFGE)” được thực hiện.
1.2

Mục tiêu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

1.2.1 Mục tiêu
-

So sánh mối liên hệ di truyền giữa các chủng N. meningitidis ở khu vực phía

Nam bằng phương pháp điện di trong trường xung điện.
1.2.2 Nội dung nghiên cứu
-

Thực hiện PFGE trên 17 chủng đã được phân lập và định danh N.

meningitidis theo quy trình cải tiến.
-

Phân tích kết quả điện di, so sánh và xây dựng mối liên hệ di truyền giữa các

chủng N. meningitidis.
1.3

Phương pháp nghiên cứu
Hiện nay, một trong những phương pháp được áp dụng rộng rãi để phân tích

mối quan hệ giữa các chủng vi khuẩn N. meningitidis là điện di trong trường xung
điện PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis). Bằng phương pháp này, mối liên hệ
di truyên của các chủng vi khuẩn se được xác định. Tại Việt Nam, có rất ít nghiên
cứu đánh giá vê mối liên hệ di truyền của các chủng vi khuẩn N. meningitidis. Vì
vậy, trong nghiên cứu này, ứng dụng phương pháp PFGE để đánh giá mối liên hệ di
truyên của các chủng vi khuẩn N. meningitidis đã được thu nhận và phân lập.
Mối liên hệ di truyên của một số chủng vi khuẩn N. meningitidis được xác
định bằng phương pháp PFGE tại Phòng xét nghiệm Vi Khuẩn Hô Hấp, thuộc Khoa
Vi sinh miễn dịch, Viện Pasteur Tp.HCM. Quy trình thực hiện dựa theo tiêu chuẩn
của WHO và theo nghiên cứu của Nguyễn Thúy Nga, “Hoàn thiện quy trình điện di
trong trường xung điện (PFGE) trên các chủng N. meningitidis”, năm 2014. Quy


trình được thực hiện như sau: Các chủng vi khuẩn được cấy lên môi trường BA/CA,
ủ ấm 37oC, 19 - 24 giờ, CO2 5%. Sau 24 giờ, quan sát khuẩn lạc, tiến hành định
danh sơ bộ bằng phương pháp truyền thống, chọn khuẩn lạc thuần, sau đó tiến hành
tạo huyền phù tế bào bằng dung dịch Cell Suspension Buffer. Tiếp tục hòa vi khuẩn
vào thạch agarose 1% có bổ sung Proteinase K, rồi cho vào những plugs, kết quả
tạo ra các plugs nhỏ có chứa toàn bộ tế bào vi khuẩn. Vi khuẩn được cố định trong
các plugs se chịu tác dụng của Protein K và dung dịch Cell Lysis Buffer, ly giải tế
bào qua đêm để giải phóng toàn bộ DNA, tiếp theo DNA này se bị phân cắt tại
những vị trí đặc hiệu bởi enzyme giới hạn NheI. Các plugs chứa DNA sau khi đã
được phân cắt được đặt vào những giếng tương ứng trong khuôn thạch agarose và
tiến hành điện di. Trong đó, bộ điện di được đặt với dòng điện có điện thế 160V,

cường độ 140mA, chạy trong vòng 24 giờ với ba pha : 2,2 giây – 8 giờ, 10 giây – 8
giờ, 35 giây – 8 giờ. Mẫu DNA sau điện di được nhuộm bằng Ethidiumbromide,
chụp ảnh và phân tích kết quả dựa trên tiêu chuẩn của Tenover và cs (1995).


CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1

Tình hình nhiễm Neisseria meningitidis

2.1.1 Tình hình nhiễm N. meningitidis trên thế giới
Bệnh viêm màng não do N. meningitidis được mô tả lần đầu tiên bởi
Vieusseus vào năm 1804 trong một trận dịch xảy ra ở vùng lân cận Geneva (Thụy
Sĩ) với 33 ca tử vong và ở New England vào năm 1806 [17]. Năm 1884, nhà bệnh
ly học người Ý Marchiafava và Celli lần đầu tiên mô tả hình dạng của N.
meningitidis trong dịch não tủy. Năm 1887, Anton Weichselbaum là người đầu tiên
phân lập vi khuẩn tư dịch não tủy của 6 trong 8 bệnh nhân viêm màng não và xác
định đây là nguyên nhân gây ra bệnh [47].
Hàng năm, theo thống kê của Tổ chức y tế thế giới có khoảng 300.000 đến
500.000 trường hợp viêm màng não do não mô cầu. Tỷ suất bệnh mắc hàng năm là
tư 1 - 2 trên 100.000 dân cho những trường hợp rải rác ,tư 5 - 10 trên 100.000 dân
cho những vùng có dịch nhỏ và tư 10 cho đến trên 100.000 dân khi xảy ra những vụ
dịch lớn hay đại dịch [53].
Sự phân bố của N. meningitidis trên thế giới theo nhóm huyết thanh thay đổi
tùy theo khu vực địa ly (hình 2.1). Dịch não mô cầu xảy ra tại các khu vực trên thế
giới gây ra do các nhóm huyết thanh khác nhau: nhóm A và C thường gây bệnh ở
Châu Á và Châu Phi, với nhóm A gây bệnh chủ yếu ở Châu Á. Nhóm B và C gây
bệnh phần lớn tại Châu Âu, Châu Mỹ. Nhóm C gây một số vụ dịch tại Canada, Mỹ
(1992 - 1993) và Tây Ban Nha (1995 - 1997). Nhóm B gây dịch nhiêu hơn tại Tân
Tây Lan với 500 trường hợp hàng năm. Nhóm W - 135 gây bệnh cho vài trăm

người đi hành hương ở Á Rập Saudi vào năm 2000 - 2001, gây dịch ở Burkina Faso
(Châu Phi) làm chết 1500 người trong số 3000 người mắc bệnh vào năm 2002 [46],
[54], [55].


Hình 2.1 Phân bố của các phân nhóm N. meningitidis gây dịch trên toàn thế giới
Nguồn: Tổ chức Y tế thế giới – WHO
Châu Phi được biết đến với tên gọi “vành đai viêm màng não” (meningitis
belt), chạy dài tư phía tây Senegal cho đến phía đông Ethiopia (Hình 2.2) với dân số
khoảng 300 triệu người, là nơi có tần suất dịch N. meningitidis cao. Dịch dễ xảy ra
là do khu vực này có khí hậu đặc biệt: trong mùa khô, giữa tháng 6 và 12, gió bụi
cùng với bệnh nhiễm trùng đường hô hấp do khí hậu lạnh ban đêm khiến miễn dịch
tại chỗ ở họng giảm và làm tăng nguy cơ viêm màng não [22]. Tập quán xã hội
cũng góp phần làm cho bệnh lan truyền dễ dàng hơn: điêu kiện nhà ở đông đúc, chật
chội và sự di cư của phần lớn người dân trong các chuyến đi hành hương hoặc đi
chợ truyên thống ở địa phương. Nhóm hay gây bệnh viêm màng não ở Châu Phi là
nhóm A, C và W - 135. Nhóm A được biết đến với tỷ lệ mắc cao nhất của bệnh
viêm màng não, gây ra bệnh dịch rất lớn, đặc biệt là ở Châu Phi, cận Sahara [22],
[30], [51]. Trong phần lớn các vụ dịch ở Châu Phi, tỷ suất tấn công tư 100 - 800
trên 100.000 dân và những quốc gia chịu ảnh hưởng nặng nê nhất là Burkina Faso,
Chad, Ethiopia và Niger. Vào năm 1996 - 1997, dịch viêm màng não lớn nhất trong
lịch sử Châu Phi xảy ra với hơn 250.000 trường hợp và 25.000 tử vong [54].


Hình 2.2 Vành đai viêm màng não ở châu Phi
Nguồn: Tổ chức Y tế thế giới - WHO
Theo hệ thống tăng cường giám sát bệnh não mô cầu, tư 1/1/2013 –
12/5/2013 tại “vành đai viêm màng não” có 9.249 trường hợp nghi ngờ nhiễm và
857 trường hợp tử vong do viêm màng não, chiếm tỷ lệ 9,3% [52].
Dịch viêm màng não cũng được xác định xảy ra ở Guinea với 404 trường hợp

nghi ngờ nhiễm trong đó có 38 trường hợp tử vong và ở phía Nam Sudan với 196
trường hợp nhiễm trong đó có 13 trường hợp tử vong. Ngoài ra, dịch bệnh do N.
meningitidis còn được ghi nhận ở Benin, Burkina Fasco và Nigeria xảy ra trong thời
gian ngắn [52].
Trong mùa dịch năm 2014, thông qua hệ thống tăng cường giám sát viêm
màng não 19 nước Châu Phi cũng đã ghi nhận 11.980 trường hợp nghi ngờ, trong
đó 1.146 ca tử vong.
Châu Á là nơi tập trung dịch bệnh viêm màng não trong 30 năm qua (Trung
Quốc năm 1979 và 1980, Việt Nam năm 1977, Mông Cổ 1973 - 1974 và 1994 1995, Saudi Arabia năm 1987, Yemen 1988) [55]. Các dịch lớn nhất có nguồn gốc
ở miên bắc Trung Quốc, lan rộng vê phía nam và sau đó trên toàn cầu, được gây ra


bởi nhóm huyết thanh A [14], [41], [44]. Một trong những dòng này lan rộng đến
tiểu lục địa Ấn Độ vào năm 1983 đến năm 1987. Tư năm 1987 đến 1996, chúng đi
qua khu vực Trung Đông gây ra đại dịch cho khách hành hương tại Mecca. Năm
1985, Bhutan cũng đã xảy ra viêm màng não với 247 trường hợp, trong đó 41
trường hợp tử vong được báo cáo giữa tháng 9 năm 1985 và tháng 1986. Trong
1982 - 1984, 1475 trường hợp xảy ra ở thung lũng Kathmandu, Nepal với tỷ lệ tử
vong cao nhất và tỷ lệ mắc bệnh ở trẻ dưới một tuổi. Nhiêu dịch viêm màng não do
N. meningitidis đã được ghi nhận trong năm 1966 và năm 1985 tại Delhi và Areas
[16], [47].
Năm 2005, bệnh tăng đột ngột tại Delhi, Ấn Độ và các quốc gia láng giêng của
bang Uttar Pradesh và Haryana. Tính đến ngày 17 tháng 06 năm 2005, 429 trường
hợp có nguy cơ bệnh viêm màng não đã được báo cáo tại Delhi trong đó 128 trường
hợp đã cho thấy nhiễm N. meningitidis [47].
Ngày nay, mặc dù có kháng sinh điều trị hữu hiệu và vắc xin có thể giúp
phòng ngừa được phần lớn các trường hợp bệnh, những vụ dịch (đặc biệt dịch xảy
ra tại Châu Phi, Tân Tây Lan, Singapore) và những thể bệnh nặng gây ra do loại vi
trùng này vẫn còn là một trong những vấn đê quan trọng hàng đầu của y tế thế giới.
2.1.2 Tình hình nhiễm N. meningitidis tại Việt Nam

Ơ Việt Nam, dịch bệnh viêm màng não gây ra phổ biến bởi vi khuẩn N.
meningitidis serogroup A, B và C. Vào năm 1939 - 1940 tại miên Bắc, có một vụ
dịch lớn gây nhiễm trùng huyết và viêm màng não do N. meningitidis lan tư Trung
Quốc sang. Sau năm 1941, miên Bắc vẫn còn thấy một số những vụ dịch nhỏ. Ơ
miền Nam, dịch viêm màng não xảy ra vào năm 1973 trong một trại tân binh. Năm
1977 - 1978, một trận dịch lớn đã xảy ra trên nhiêu tỉnh thành phía Nam, gây do não
mô cầu nhóm C. Ngoài các vụ dịch quan trọng nói trên, bệnh xảy ra lẻ tẻ, tuy có
khuynh hướng gia tăng vào các thời điểm như các tháng lạnh ở miên Bắc và các
tháng 6, 7, 8 tại các tỉnh phía Nam [54].


Theo số liệu của Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương, tỷ lệ mắc bệnh tư 1991 2000 ở Việt Nam là 2,3 trên 100.000 dân và là bệnh xếp thư 6 trong 10 bệnh
truyên nhiễm có tỷ lệ chết cao nhất (0,03 trên 100.000 dân) [55].
Theo Cục Y tế dự phòng, giai đoạn tư năm 2001 - 2011, trung bình ghi nhận
650 trường hợp mắc bệnh viêm màng não do N. meningitidis gây ra, chủ yếu ở các
tỉnh khu vực miền Bắc. Năm 2011 ghi nhận 305 trường hợp mắc và 4 trường hợp tử
vong. Bệnh xảy ra chủ yếu vào mùa xuân [63], [64].
Cuối tháng 12 năm 2011, bệnh nhiễm N. meningitidis khởi phát tại công ty
Fukukawa (Khu chế xuất Tân Thuận, Quận 7, TP.HCM). Đến tháng 02 năm 2012,
bệnh nhiễm não mô cầu đã xuất hiện ở 10 quận, huyện của TP.HCM, gồm các quận:
7, 8, 9, 10, Tân Bình, Tân Phú, Bình Tân, Gò Vấp và các huyện Bình Chánh, Củ
Chi [54], [56], [57].
Trong năm 2014, theo Tổng cục thống kê, cả nước có 24 trường hợp mắc bệnh
viêm màng não do N. meningitidis gây ra, trong đó 3 trường hợp tử vong [57]. Số ca
mắc bệnh so với năm 2013 tăng lên 4 ca nhưng so với trung bình 3 năm (2011 2013) thì giảm 86,8%.
Theo Bộ Y tế, tư đầu năm 2015 đến nay cả nước ghi nhận 24 ca bệnh viêm
màng não do não mô cầu, 2 người tử vong, tăng 16 ca so với cùng kỳ năm ngoái.
Trong đó riêng tháng 4, cả nước ghi nhận 11 ca viêm màng não do não mô cầu, 2 ca
tử vong [61].

2.2

Tổng quan vê vi khuẩn Neisseria meningitidis

2.2.1 Phân loại N.meningitidis
Vê phân loại khoa học, N.meningitidis được xếp loại vào:
Giới:

Bacteria

Ngành:

Proteobacteria

Lớp:

Beta Proteobacteria

Bộ:

Neisseriaceae

Họ:

Neisseriaceae

Chi:

Neisseria

Loài:

Neisseria meningitidis
N. meningitidis được xếp loại theo hệ thống phân typ huyết thanh, dựa trên sự

khác biệt cấu trúc của nang polysaccharide (nhóm huyết thanh), protein màng ngoài
chủ yếu OMP (typ huyết thanh), protein màng ngoài khác (phụ typ huyết thanh) và
lipo-oligosaccharide (typ miễn dịch) [12], [20].
N. meningitidis được chia thành 13 nhóm huyết thanh là: A, B, C, H, I, K, L,
M, X, Y, Z, 29E và W135, 20 typ huyết thanh, 10 phụ týp huyết thanh và 13 týp
miễn dịch [54].
2.2.2 Hình thái N. meningitidis
N. meningitidis là song cầu Gram âm, có vỏ polysaccharide, ái khí, không di
động, không tạo thành nha bào, đường kính 0,6 x 0,8µm, có thể thấy ở các dạng đơn
độc hoặc song cầu hình hạt cà phê úp mặt khuyết vào nhau hoặc đứng riêng từng
đôi cũng có thể tụ lại thành đám.
Quan sát phết nhuộm bệnh phẩm cho thấy chúng nằm trong hoặc ngoài bạch
cầu đa nhân. Các vi khuẩn N. meningitidis hầu hết đêu có vỏ nang [1],[54].


A

B

Hình 2.3 Tiêu bản nhuộm dịch não tủy (A) và vi khuẩn N. meningitidis sau
khi nhuộm Gram (X100) tư khuẩn lạc (B).
2.2.3 Tính chất nuôi cấy
N. meningitidis là một loại vi khuẩn khó mọc, chúng chỉ có thể mọc trên môi
trường giàu chất dinh dưỡng như thạch 5% máu cừu (blood agar) hay thạch máu

chín (chocolate agar) với nhiệt độ 35 - 37oC, CO2 5%, trong 18 - 24 giờ.
N. meningitidis có tính nhạy cảm với nhiệt độ lạnh và khô, do chúng tự ly giải
rất nhanh. Khi ở ngoài cơ thể, N. meningitidis sống được 3 - 4 giờ và bị tiêu diệt
ngay dưới tia cực tím, dung dịch Cloramin 0.5 – 1 %, nhiệt độ 55 - 60oC hoặc cồn
70o. Vì vậy bệnh phẩm não mô cầu cần được cấy ngay vào môi trường ấm và nhanh
chóng ủ trong bình nến [48].
Đối với bệnh phẩm là dịch tỵ hầu cần thiết dùng môi trường thạch máu chín có
bổ sung kháng sinh: Vancomycin để ức chế các vi khuẩn Gram dương, Colistin để
ức chế các vi khuẩn Gram âm và Nystatin để ức chế các loại vi nấm khác nhằm
sàng lọc các dòng Neisseria.
Trên môi trường thạch máu và thạch chocolate, khuẩn lạc N. meningitidis tròn,
lồi, nhẵn, ẩm ướt, óng ánh và có màu hơi xám, không có mùi đặc trưng. Sau 24 giờ
nuôi cấy, khuẩn lạc có đường kính khoảng 0,8 – 1 mm, không gây tan máu, để lâu


khuẩn lạc có màu xám đục, nhầy hơn do tự ly giải và có thể làm màu môi trường ở
dưới vùng vi khuẩn mọc đậm hơn.

BA

CA

Hình 2.4 Hình thái khuẩn lạc N. meningitidis trên môi trường BA và CA
2.2.4 Đặc điểm sinh hóa
Các phản ứng sinh hóa đặc trưng bao gồm: oxidase và catalase dương tính.
Lên men đường glucose, maltose, tạo môi trường acid và đổi màu Cystine Tryptic
Agar (CTA) tư đỏ sang vàng, không lên men đường sucrose, lactose [48].
2.2.5 Đặc điểm dịch tễ
Bệnh não mô cầu phổ biến toàn thế giới, thành từng ca rải rác hay những vụ
dịch nhỏ ở làng, xã, tập thể, cơ quan, nhưng cũng cũng có thể thành những vụ dịch

lớn. Mặc dù có kháng sinh và cả vaccine có hiệu quả, não mô cầu vẫn là một
nguyên nhân gây viêm màng não và nhiễm trùng nặng hàng đầu trên thế giới, gây tử
vong nhanh chóng cho một người trước đó còn khoẻ mạnh bình thường.
Não mô cầu là tác nhân gây bệnh duy nhất trong số những vi khuẩn gây viêm
màng não có thể gây thành dịch bên cạnh những ca rải rác. Dịch do N. meningitidis
xảy ra tại các khu vực trên thế giới do 5 nhóm huyết thanh A, B, C, Y và W - 135
gây ra với 90% các trường hợp mắc. Nhóm A, B và C chiếm phần lớn các trường
hợp bệnh do N. meningitidis trên toàn thế giới. Trong đó, nhóm A và C thường gây


bệnh ở Châu Á và Châu Phi, nhóm B và C gây bệnh phần lớn tại Châu Âu, Châu
Mỹ [47].
Trong những năm qua, số lượng các trường hợp liên quan đến nhóm huyết
thanh Y đã tăng lên. Tư năm 1996 đến năm 1998, một phần ba số trường hợp ở Hoa
Kỳ là do nhóm huyết thanh Y. Các trận dịch ở Irac và Thụy Điển trong giai đoạn
này cũng do nhóm huyết thanh Y gây ra (ET - 508). Đến năm 2000, một ổ dịch não
mô cầu xảy ra khi những người hành hương đến thánh địa Mecca do nhóm W - 135
gây ra và trong suốt hai năm 2002, 2003 trận đại dịch xảy ra ở Burkina Faso cũng
do nhóm W - 135 gây ra. Dịch bệnh viêm màng não do N. meningitidis gia tăng tư 1
- 3 trên 100.000 trường hợp ở các nước phát triển đến 10 - 25 trên 100.000 trường
hợp ở các nước đang phát triển. Sự khác biệt vê tỷ lệ tấn công phản ánh sự khác biệt
vê tính chất gây bệnh của các chủng N. meningitidis và cho thấy khả năng xuất hiện
bệnh tỷ lệ thuận với điều kiện kinh tế, xã hội và môi trường [47].
N. meningitidis có khả năng gây dịch lớn hoặc các trường hợp bệnh lẻ tẻ.
Nhóm A thường gây bệnh dịch lớn, xảy ra theo chu kỳ khoảng 20 - 30 năm hoặc
dịch nhỏ có chu kỳ 8 - 12 năm. Chẳng hạn như trong thế chiến thư I và thư II đêu đã
xảy ra dịch não mô cầu bên trong cũng như bên ngoài quân đội. Nhóm B và C
thường gây các trường hợp riêng lẻ, vẫn có khả năng gây nên các trận dịch. Một nửa
số trường hợp nhiễm N. meningitidis xảy ra ở trẻ em dưới 1 tuổi là do nhóm B gây
ra. Nhóm C thường xảy ra ở vị thành niên. Nhóm Y chỉ gây dịch riêng lẻ và chủ yếu

ở lứa tuổi thành niên [47], [53]. Tuổi dễ mắc bệnh nhất là trẻ em tư 6 tháng đến 3
tuổi hoặc thanh thiếu niên tư 14 - 20 tuổi và tỷ lệ bệnh thấp ở người trên 20 tuổi.
Không có sự khác biệt rõ rệt vê giới tính, tuy ở nam giới thường được ghi nhận mắc
bệnh viêm màng não và nhiễm trùng huyết nhiêu hơn ở nư giới [54].
Những trường hợp đầu tiên của dịch viêm màng não do não mô cầu thường
xẩy ra do những tiếp xúc trong gia đình hơn là tư cộng đồng. Tỷ lệ lây nhiễm cho
người thư hai là 400 - 1000 trên 100.000 thành viên trong gia đình. Lây lan ở trường
học cũng được ghi nhận, nhưng tỷ lệ chỉ 2 - 4 trên 100.000. Trong các vụ dịch ở
làng Đại học, tỷ lê lây lan cao nhất ở những sinh viên ở cư xá. Những trường hợp


lây đa số xẩy ra trong vòng 2 tuần kể tư khi có trường hợp mắc bệnh đầu tiên,
nhưng cũng có trường hợp kéo dài đến vài tháng sau [65].
Thời điểm bệnh xảy ra tại các nước khí hậu ôn đới thường vào mùa đông và
đầu mùa xuân, thấp nhất là giữa mùa hè. Tại các vùng nhiệt đới, bệnh gia tăng khi
có sự thay đổi thời tiết, khí hậu, thí dụ như vào lúc cuối mùa khô, đầu mùa mưa.
Dịch não mô cầu còn được nhận xét có nhiêu nguy cơ bộc phát vào các thời gian
con người tập trung đông đúc thí dụ như mùa khai trường, đợt tuyển quân. Bệnh
hay xảy ra và lan rộng tại các tập thể đông đúc ở thành thị hơn là nông thôn. Thí dụ
như nhà trẻ, trường học, ky túc xá, đặc biệt là trại lính, nhất là ở những tập thể mới
được thành lập, cá nhân sống chật chội, thiếu vệ sinh [48], [53].
2.2.6 Cơ chế và khả năng gây bệnh
2.2.6.1 Vật chủ và con đường lây nhiễm
N. meningitidis là vi khuẩn cư trú tại vùng họng mũi của người và lây truyền
theo các giọt nước nhỏ bài tiết qua đường hô hấp của bệnh nhân hay người lành
mang mầm bệnh. Ngoài khả năng gây bệnh, N. meningitidis cũng là một mối nguy
cơ tiềm ẩn, trong một nghiên cứu, N. meningitidis phân lập được tư mũi họng của 8
- 20% cá thể lành mạnh [23]. Người lành mang N. meningitidis là yếu tố lây truyền
mạnh hơn đối với những người đang mắc bệnh. Khi bệnh xảy ra lẻ tẻ, tỷ lệ mang vi
khuẩn này ở những người tiếp xúc gần gũi tăng 40% và tại những nơi đông dân cư,

đặc biệt trong các doanh trại quân đội hay các trận dịch lớn thì tỷ lệ này có thể lên
đến 60 - 80%.
Con người là ky chủ duy nhất của N.meningitidis và hiện nay chưa phát hiện
có ky chủ truyền bệnh nào khác. Thời gian ủ bệnh chính xác thường không xác định
rõ và đã được ước tính trung bình tư 2 - 10 ngày, thông thường tư 3 - 4 ngày.
2.2.6.2 Các yếu tố độc lực
N. meningitidis là tác nhân gây bệnh nguy hiểm trên người, chứa các yếu tố
độc lực tạo nên các cơ chế gây bệnh của vi khuẩn trên vật chủ bao gồm: pili, vỏ
polysaccharide, protein phân cắt kháng thể IgA và nội độc tố lipopolysaccharide
[62].


Hình 2.5 Các protein bê mặt và thành phần màng ngoài của N. meningitidis
[62]


Vỏ polysaccharide: chia N. meningitidis thành 13 nhóm huyết thanh. Lớp vỏ

này bao bọc bên ngoài tế bào vi khuẩn, bảo vệ chúng khỏi hiện tượng thực bào
của cơ thể vật chủ, tăng khả năng xâm nhập và tồn tại của vi khuẩn trong máu và
hệ thần kinh trung ương.


Pili: có vai trò quan trọng, tạo khả năng bám của vi khuẩn lên các tế bào

niêm mạc mũi họng, giúp vi khuẩn vượt qua hàng rào máu não đi vào hệ thần
kinh trung ương và tồn tại gây bệnh.


Các lipooligosaccharide: chứa carbohydrate lacto - N - neotetrose, đây là một

trong những yếu tố quyết định khả năng gây độc của vi khuẩn. Đồng thời,
lipooligosacchride cũng kích thích giải phóng TNF - alpha làm tổn thương tế bào
chủ, cảm ứng cho sự hình thành của các cytokine khác nhau gây tổn thương nội
mô mạch máu, dẫn đến hoại tử và tổn thương nghiêm trọng ở nhiều cơ quan và
hệ thống.


Protein porA và porB: đây là những protein màng ngoài lớn của N.

meningitidis đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra độc lực của vi khuẩn.


Trong đó, porB có khả năng chèn vào bên trong màng tế bào chủ gây chết tế bào,
nhiễm trùng và giúp vi khuẩn xâm nhập vào bên trong cơ thể vật chủ.


Protein Opa và Opc: những protein này khác nhau giữa các chủng, chúng tạo

điêu kiện cho vi khuẩn bám dính vào các tế bào biểu mô và bạch cầu trung tính.
2.2.6.3 Cơ chế gây bệnh
Cơ chế gây bệnh của N. meningitidis trải qua 3 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Vi khuẩn cố định lên và xuyên qua màng nhày hầu họng
Bệnh thường khởi phát do vật chủ (người) mang một loại vi khuẩn đường mũi
họng và vi khuẩn này mang đặc điểm có khả năng xuyên qua màng nhầy. Để có thể
cố định được lên màng nhầy, các vi khuẩn phải có cơ chế tiết ra những protease
giúp chúng phân giải được các phân tử thuộc cơ chế bảo vệ bởi hệ miễn nhiễm vật
chủ hoặc cắt đứt các liên kết phân tử của lớp tế bào biểu mô màng nhầy hầu họng.
Sau khi bám lên được, vi khuẩn phải xuyên niêm mạc để xâm nhập vào máu vật
chủ. Hai yếu tố giúp chúng thực hiện là nhung mao và protein vỏ. Các nhung mao

giúp chúng gắn kết với các thụ thể trên tế bào biểu mô màng nhầy tại những nơi se
hình thành túi thực bào để xuyên qua màng nhầy. Các protein vỏ có khả năng kết
hợp với protein vận chuyển kháng thể IgA, tạo thành phức hợp protein vỏ - protein
vận chuyển, có thể đi xuyên qua hàng rào tế bào biểu mô [3], [4].


Hình 2.6 Quá trình xâm nhiễm của N. meningitidis.
Nguồn: David Stephens et al, 2007,J. The Lancet, 369: 2196-2210
Trong đó, A: N. meningitidis xâm nhập vào bê mặt niêm mạc hầu họng.
B: Giai đoạn đính màng.
C: Hình thành tập đoàn
D: Xâm chiếm và định cư ở vùng hầu họng.
Giai đoạn 2: Vi khuẩn tăng sinh trong máu
Vi khuẩn tiếp tục du nhập vào máu, để sống sót và nhân lên vê số lượng,
chúng tiếp tục chống đỡ với một cơ chế bảo vệ nữa của vật chủ là khả năng thực
bào của bạch cầu trung tính và hoạt động diệt khuẩn của hệ bổ thể. Chính vỏ
capsule và protein trên bê mặt capsule của vi khuẩn giúp chúng vượt qua hàng rào
miễn nhiễm của vật chủ. Vì thế, hầu hết các vi khuẩn có độc lực cao và có thể sống
sót trong cơ thể vật chủ đêu có capsule.
Giai đoạn 3: Vi khuẩn xâm nhập màng não
Vi khuẩn sống sót trong máu và không ngừng nhân lên vê số lượng, nhưng để
vượt qua hàng rào máu não và xâm nhập vào hệ thần kinh trung ương thì điêu kiện
cần thiết là nồng độ của chúng phải đạt trên 103 CFU/ml [3], [4]. Đến giai đoạn này
những vi khuẩn có nhung mao se chuyển sang pha biến đổi với hình thái không
nhung mao hay vi khuẩn liên kết với bạch cầu đơn nhân để bước qua hàng rào máu


não, xâm nhập hệ thần kinh trung ương. Khi vi khuẩn vào được dịch não tủy, cơ chế
bảo vệ của vật chủ không đủ để khống chế chúng. Tại đây chúng kích thích miễn
dịch, tạo đáp ứng viêm trong khoang dưới nhện (dịch não tủy) và màng não. Những

phân tử chính gây nên hiện tượng trên là lipopolysaccharide (thành phần cấu tạo
chủ yếu của vi khuẩn Gram âm), peptidoglycan (thành phần cấu tạo chủ yếu của vi
khuẩn Gram dương), DNA của vi khuẩn và độc tố của vi khuẩn…Sau khi khơi mào
của các thành phần vi khuẩn, các chất trung gian gây viêm được tiết vào hệ thần
kinh trung ương se làm thay đổi tính thấm của hàng rào máu não.
2.2.7 Biểu hiện lâm sàng
Thông thường, bệnh nhân có triệu chứng hô hấp trước khi có bệnh cảnh nhiễm
trùng huyết hay viêm màng não, 99% biểu hiện của nhiễm não mô cầu là nhiễm
trùng huyết, viêm màng não mủ hay phối hợp cả hai.
2.2.7.1 Viêm họng
Viêm họng do N. meningitidis khó chẩn đoán vì phân lập được vi trùng tư cổ
họng cũng không xác định được đó chính là nguyên nhân gây bệnh. Thật vậy, phần
lớn người mang N. meningitidis ở họng mũi là người lành mang trùng. Nhiêu tác giả
đã ghi nhận thực sự có bệnh viêm họng mũi do não mô cầu. Bệnh xảy ra hàng loạt
khi đang thời gian có dịch, đa số không có triệu chứng lâm sàng rõ hoặc có thể sổ
mũi, viêm họng đỏ tuy hạch amiđan không to và không có hạch cổ.
2.2.7.2 Nhiễm trùng huyết
Nhiễm trùng huyết do N. meningitidis có nhiêu hình thức thay đổi, tư thể tối
cấp diễn tiến trong vòng vài giờ đến những bệnh âm ỉ kéo dài nhiêu ngày hoặc đôi
khi nhiêu tháng [52].
 Nhiễm trùng huyết thế cấp
N. meningitidis có thể gây nhiễm trùng huyết kèm theo viêm màng não mủ
hoặc không; do đó, cần khảo sát dịch não tủy các bệnh nhân nhiễm trùng huyết do
N. meningitidis để chẩn đoán kịp thời thể bệnh có phối hợp này. Tỷ lệ bệnh nhân
nhiễm trùng huyết cấp nhưng không kèm viêm màng não mủ chiếm khoảng 30 35%.


Khởi bệnh thường đột ngột, tuy trong nhiêu trường hợp bệnh nhân có tình
trạng tương tự như bị cảm cúm trước đó: mệt nhọc, đau họng, ho, nhức đầu…. Tiếp
theo, bệnh nhân sốt cao 39 - 40oC, ớn lạnh, rét run nhiêu lần, nhức đầu, nôn ói, đau

khớp, đau cơ đặc biệt đau nhiêu ở sống lưng và hai chân. Bệnh nhân có mạch
nhanh, thở nhanh và có thể có huyết áp thấp tuy sốc thực sự hiếm xảy ra trư khi rơi
vào thể tối cấp.
Biểu hiện rõ ràng nhất là tử ban, xuất hiện trong khoảng 75% các trường hợp,
trong vòng một hai ngày sau sốt. Tử ban cần được quan sát dưới nguồn ánh sáng tốt
và có đặc điểm: màu đỏ hoặc tím thẫm, bờ không tròn đêu, kích thước thay đổi tư 1
– 2 mm đến vài cm, bê mặt bằng phẳng không gồ lên mặt da, có khi có hoại tử vùng
trung tâm. Vị trí tử ban phân bổ khắp người, song thấy nhiêu nhất ở vùng nách
hông, quanh khớp (khuỷu, gối, cổ chân). Đôi khi tử ban có dạng bóng nước (nốt
phỏng) hoặc tràn rộng lớn như hình bản đồ.
Khi tử ban lan tràn nhanh chóng vê số lượng hoặc phát triển kích thước cần
lưu y bệnh đang diễn tiến đến thể tối cấp. Tuy nhiên không có tử ban không có
nghĩa là bệnh diễn tiến nhẹ. Ngoài ra, hầu hết trường hợp có xuất huyết niêm mạc
mắt, tuy xuất huyết các nơi khác (như xuất huyết tiêu hoá) hiếm xảy ra. Dấu hiệu
khác: lách to, nốt herpes ở khoé miệng.
 Nhiễm trùng huyết tối
cấp
Còn được gọi là hội chứng Waterhouse - Friderichsen, xảy ra với tỉ lệ khoảng
10 - 20% các trường hợp nhiễm trùng huyết do N. meningitidis. Đây là bệnh nhiễm
trùng huyết não mô cầu rất cấp tính, diễn tiến nhanh chóng đến tình trạng suy tuần
hoàn, sốc phổi và gây tử vong, có thể chỉ trong vòng vài giờ.
Bệnh nhân khởi đầu có các triệu chứng tương tự như nhiễm trùng huyết cấp
nhưng các dấu hiệu tiên lượng nặng xuất hiện rầm rộ và đầy đủ trong vòng 12 giờ
đầu tiên của bệnh:
 Sốt cao đột ngột 39 – 40oC, trên cơ địa trước đó khỏe mạnh.
 Kích động hoặc hôn mê sớm.
 Sốc xảy ra sớm và tái đi tái lại nhiều lần.