Báo cáo thực hành dược liệu chứa saponin

BÁO CÁO THỰC TẬP DƯỢC LIỆU
Bài: DƯỢC LIỆU CHỨA SAPONIN (Cam thảo)

I. Chuẩn bị
1. Nguyên vật liệu thí nghiệm:
- Rễ và thân rễ của cây cam thảo
- Dung môi, hóa chất: cồn 70%, methanol, ether ethylic, anhydric acetic,
acid sulfuric đậm đặc, NaCl 0,9%, HCl 0,1N, NaOH 0,1N
II. Thử nghiệm tính tạo bọt:
2.1. Xác định chỉ số bọt
a. Cách tiến hành:
1g bột
dược liệu
+100 ml nước cất sôi
Đun trên cách thủy 30 phút
Dịch chiết
Lọc nóng
Dịch lọc

Chờ dịch lọc nguội
Chuyển vào bình định mức 100ml
Thêm nước cất cho đủ 100ml
Dung dịch A
Chia nhỏ ra 10 ống nghiệm

(1)

(2)

(3)

(9)

(10)


Thêm nước cất vào mỗi ống nghiệm
cho đủ 10ml

Dung dịch B

Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh
theo chiều dọc ống nghiệm trong 15
giây

Dung dịch

Để yên ống nghiệm trong 15 phút


Đo độ cao cột bọt


b. Hiện tượng:
- Cột bọt trong các ống nghiệm khác nhau theo thứ tự từ 1 đến 10.
- Ống nghiệm số 7 có cột bột cao đúng 1cm nên chỉ số bọt chính là
độ pha loãng của dung dịch trong ống nghiệm 7

 Bảng chiều cao cột bọt:
1
0

2
0.3

3
0.4

4
0.5

5
0.6

6
0.7

7
1,0

8
1.2

9
1.3

10
1.5

(cm
)

 Kết luận: Cột bọt số 7 cao đúng bằng 1cm nên chỉ số bột chính là độ pha
loãng của dung dịch trong ống nghiệm này.
Tính kết quả:

CSB = x A x k
= x 100 x 1 = 142.857 (ml)

Trong đó:

n: số thứ tự ống có cột bọt cao 1cm
A: độ pha loãng của dung dịch ban đầu
K: độ pha loãng trung gian.

 Vậy chỉ số bọt CSB = 142.857 ml

 Giải thích:


- Saponin có tính chất hoạt động bề mặt (phân tử saponin có cùng một
lúc một đầu ưa nước và một đầu kỵ nước), khi hòa tan vào nước làm
giảm sức căng bề mặt của dung dịch nên tạo nhiều bọt khi lắc.
- Ta chọn ống nghiêm 7 vì đúng với yêu cầu khái niệm Chỉ số bọt : cột
bọt cao 1cm và bền trong 15 phút.
- Phản ứng nhằm đánh giá nguyên liệu có chứa saponin -> Dược liệu
cam thảo có chứa saponin

2.2. Định tính bằng phản ứng Liebermann-Burchard:

0,5g dược liệu

+5ml cồn 70%
Đun cách thủy 5 phút
Lọc bông
Bã

Dịch lọc
Cô trên bếp cách thủy

Cắn
+1ml anhydric acetic +1ml CHCl3
Khuấy kỹ cho


tan
Dung dịch
+1 ml H2SO4 đ

Phản ứng dương tính

Hiện tượng: Mặt ngăn cách giữa 2 lớp có

màu nâu đỏ

Lớp dung dịch phía trên có màu nâu đỏ

 Kết quả của quá trình định tính Saponin bằng phản ứng Liebermann –
Burchard: loại saponin trong Cam thảo là Saponin triterpenoid
 Giải thích:
- Ban đầu dùng cồn để chiết saponin ( do phần saponin thường dễ tan
trong dung môi phân cực ) trong cam thảo sau đó dùng CH3Cl để

chiết sapogenin ( do phần sapogenin tan trong dung môi kém phân
cực).
- Phản ứng đặc hiệu lên màu với các dẫn chất có chứa nhân steroid, cơ
chế của phản ứng là sự khử nước của acid mạnh.
2.3 So sánh cột bọt trong môi trường OH- và H+ :
a. Tiến hành.

Dịch chiết


1ml dịch chiết/nước
1ml NaOH 0,1N

1ml dịch chiết/nước
1ml HCl 0,1N

Lắc mạnh cả 2 ống trong vòng 15 giây
Để yên cho cột bọt ổn định


Hiện tượng:
ống cao ngang nhau

cột bọt ở cả 2

 Kết luận: sơ bộ có thể kết luận trong Cam thảo có chứa saponin
triterpenoid
 Giải thích:
- Cấu trúc genin của saponin triterpennoid có 30C, cấu tạo từ 6 đơn vị
heniterpen nối vs nhau theo quy tắc đầu đuôi. Nhóm methyl ở C28 dc

oxy hóa thành nhóm carboxyl kết hợp vs đường tạo thành dây nối
pseudoglycosid.
- Do vậy khung của triterpen bền hơn nên bọt 2 cột bằng nhau. Còn
khung của steroid dễ bị khử bởi acid nên có sự chênh lệch bọt
 KẾT LUẬN CHUNG:
Dựa trên hiện tượng tạo bọt và màu tạo thành của phản ứng Liebermann kết
luận loại saponin có trong Cam thảo là Saponin Triterpenoid


III.

Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
Chuẩn bị
Bình sắc ký

Chuẩn bị bản mỏng
Dùng bản mỏng silicagel
e. Phát hiện
tráng sẵn cắt thành những
miếng có kích thước 2,5 x
10 cm.
Dùng bút chì kẻ lên bản
mỏng 1 đường thẳng cách
mép dưới 1cm để chấm thử,
1 đường thẳng cách mép
trên 0,5 cm.

được rửa sạch và để thật khô.
Lót 1 miếng giấy lọc quanh
lòng bình.

Cho hệ dung môi CHCl3MeOH-H2O (65:35:10; lớp
dưới) vào bình sắc ký sao cho
lớp dung môi trong bình cao
khoảng 0,5cm. Đậy nắp bình
sắc ký, đặt ở nơi phẳng, để
yên trong 15-30 phút cho bão
hòa dung môi.

0,5g bột cam thảo và
5ml methanol vào 1 ống
nghiệm đun cách thủy
10 phút, lọc, cô cắn, cho
vào vài giọt MeOH, lắc
cho
tan.

Đưa lên bản mẫu và khai triển; Dùng mao quản lấy mẫu, chấm lên giấy thấm
cho bớt dung dịch, sau đó chấm lên bản mỏng thành chấm cách mép dưới 1 cm(
vết chấm phải cao hơn mức dung môi trong bình sắc ký). Chờ cho MeOH bay
hết rồi cho vào bình sắc ký, đậy nắp.
Khi dung môi chạy tới đường thẳng trên thì lấy bản mỏng ra, để nhiệt độ phòng
cho khô.


Phát hiện:
Soi đèn UV 254nm và 365nm

Cam thảo

Cam thảo

Đọc kết quả

- Số lượng vết: 6 vết
- Rf của vết ( Tỉ lệ khoảng dịch chuyển của chất thử
và khoảng dịch chuyển của dung môi ):
Rf =
Với: lA là đoạn đường di chuyển của chất A
lo là đoạn đường di chuyển của dung môi


Tính toán:
Đi theo hướng chiều chuyển động của dung môi, trên bản mỏng sắc
ký ta có 5 vết, đặt tên theo thứ tự là 1, 2, 3, 4, 5, 6
Ta có:
Quãng đường dung môi đi được là lo = 19
Quãng đường đi được của vết 1: l1 = 1,5
Rf1 = = 0,08
Quãng đường đi được của vết 2: l2 = 7,5
Rf2 = = 0,39
Quãng đường đi được của vết 3: l3 = 10
Rf3 = = 0,53
Quãng đường đi được của vết 4: l4 = 12
Rf4 = = 0,63
Quãng đường đi được của vết 5: l5 = 15
Rf5 = = 0,79
Quãng đường đi được của vết 6: l6 = 16
Rf6 = = 0,84



Phương pháp sắc ký lớp mỏng dùng để định tính Saponin. Màu sắc
với các thuốc thử đặc hiệu của các vết trên sắc ký đồ là những yếu tố
để nhận định sự có mặt của một Saponin, một nhóm Saponin trong
hỗn hợp phân tích

 Giải thích:
- Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho
pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần
tách.
+ Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân
tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các
phiến kính hoặc phiến kim loại.
+ Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với
nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận.


+Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp
mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với
những tốc độ khác nhau. Kết quả, ta thu được một sắc ký đồ trên lớp
mỏng.
- Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi
ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy
thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động.
Dùng methanol làm dung môi mà không dùng nước vì:
+ Dung môi thích hợp dùng trong sắc ký lớp mỏng sẽ là một dung môi
có tính phân cực khác với pha tĩnh. Nếu một dung môi phân cực được
dùng để hòa tan mẫu thử trên một pha tĩnh phân cực, vệt nhỏ mẫu thử
sẽ lan tròn do mao dẫn , và các vệt khác nhau có thể trộn lẫn vào nhau.

Do đó, để hạn chế sự lan tròn của các vệt mẫu, dung môi được sử
dụng để hòa tan mẫu thử phải không phân cực, hoặc phân cực một
phần, nếu pha tĩnh phân cực, và ngược lại.
+ Ngoài ra nước còn hòa tan được rất nhiều chất nên ảnh hưởng đến
quá trình sắc ký.
2. Chuẩn bị bình sắc ký và dung môi: cho dung môi vào bình, quanh
thành bình lót giấy lọc để bão hoà dung môi trong bình sắc ký được nhanh hơn.
3.
Khi dùng hệ sắc ký bản mỏng, phải cho hệ dung môi vào bình đậy
kín và để yên cho dung môi thấm ướt giấy lọc vì:
Để tránh dung môi bay hơi và coi hệ dung môi có đồng nhất hay
không. Nếu hệ dung môi thấm ướt giấy lọc thì hệ dung môi đã đồng nhất.
4 . Hệ dung môi và tỷ lệ dung môi ảnh hưởng đến tỉ lệ Rf:
Các hợp chất được tách ra dựa trên sự cạnh tranh của chất tan và pha
động để có được sự liên kết với pha tĩnh.
Ví dụ: Nếu silicagel được dùng như pha tĩnh, nó được xem là phân
cực. Cho trướt hai hợp chất phân cực khác nhau, chất nào có tính phân cực
mạnh hơn sẽ có sự liên kết với silicagel lớn hơn và vì thế sẽ có khả năng đẩy
pha động ra khỏi các chỗ lien kết. Do đó hợp chất có tính phân cực nhỏ hơn sẽ
di chuyển lên cao hơn trên bảng sắc ký ( Rf sẽ lớn hơn). Nếu pha động được
thay bằng dung môi phân cực hơn hoặc hỗn hợp các dung môi, nó sẽ có khả
năng đẩy các chất tan ra khỏi chỗ liên kết với silicagel, và tất cả chất trên bảng
sắc kí sẽ di chuyển lên cao hơn.