Các phương pháp phân tích công nghệ sinh học hiện đại

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
CÔNG NGHỆ SINH HỌC HIỆN ĐẠI

Biên Soạn:
PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng

www.hutech.edu.vn


PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Ấn bản 2014


3

HƯỚNG DẪN

MỤC LỤC

III

MỤC LỤC
MỤC LỤC .................................................................................................................. I
HƯỚNG DẪN........................................................................................................... IV
BÀI 1: QUY ĐỊNH AN TOÀN VÀ THAO TÁC TRONG PHÒNG …. SINH HỌC ..................... 1
1.1 QUY ĐỊNH AN TÒAN LÀM VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM ................................ 1
1.2 RỬA DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM ................................................................................ 2
1.3 CHUẨN BỊ VÀ BẢO QUẢN HÓA CHẤT.................................................................... 4

TÓM TẮT .................................................................................................................. 7
CÂU HỎI ÔN TẬP ...................................................................................................... 7
BÀI 2: CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SINH HỌC ............... 8
2.1 ĐO PH, DUNG DỊCH ĐỆM VÀ ĐIỆN CỰC ................................................................ 8
2.2 ĐIỆN CỰC ION VÀ ĐẦU DÒ SINH HỌC ................................................................ 15
2.3 CÁCH THỨC THỂ HIỆN NỒNG ĐỘ ....................................................................... 16
2.4 ĐỊNH LƯỢNG NITƠ........................................................................................... 17
2.5 ĐỊNH LƯỢNG CARBOHYDRATE ......................................................................... 18
2.6 ĐỊNH LƯỢNG LIPID .......................................................................................... 19
2.7 THẨM TÍCH VÀ SIÊU LỌC .................................................................................. 24
2.8 ĐÔNG KHÔ VÀ SẤY PHUN.................................................................................. 29
2.9 TẠO TINH THỂ PROTEIN ................................................................................... 32
2.10 XÁC ĐỊNH TRỌNG LƯỢNG BIOPOLYMER ......................................................... 34
TÓM TẮT ................................................................................................................ 37
CÂU HỎI ÔN TẬP .................................................................................................... 38
BÀI 3: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ SỬ DỤNG TRONG ....SINH HỌC................................... 39
3.1 KHÁI NIỆM VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ .............................................................. 39
3.2 SẮC KÝ GIẤY VÀ SẮC KÝ BẢN MỎNG .................................................................. 42
3.3 TINH SẠCH PROTEIN BẰNG SẮC KÝ CỘT ........................................................... 45
3.3.1 Kỹ thuật sắc ký trao đổi ion ........................................................................... 46
3.3.2 Sắc ký lọc gel .............................................................................................. 51
3.3.3 Phương pháp sắc ký ái lực ( affinity chromagraphy)........................................... 54
3.3.4 Phương pháp sắc ký cột lỏng ....(high-performance liquid chromatography) .......... 57
3.4 TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP ..................................................................... 57
3.5 SẮC KÝ KHÍ GC (GAS CHROMATOGRAPHY) ............................................................... 61
TÓM TẮT ................................................................................................................ 63
CÂU HỎI ÔN TẬP .................................................................................................... 64
BÀI 4: PHÂN TÍCH PROTEIN BẰNG ĐIỆN DI .............................................................. 65
4.1 KHÁI NIỆM VỀ ĐIỆN DI ..................................................................................... 65

4

HƯỚNG DẪN

MỤC LỤC

III

4.2 ĐIỆN DI TRÊN GEL .... (POLYCRYLAMIDE GEL ELECTROPHORESIS)
.............................. 66
4.2.1 Giới thiệu phương pháp PAGE......................................................................... 66
4.2.2 Điện di không liên tục ................................................................................... 69
4.2.3 Điện di SDS-PAGE ....................................................................................... 71
4.2.4 Điện di protein theo điểm đẳng điện IEF (Isoelectric Focusing of Protein) ............. 72
4.2.5 Điện di hai chiều (Two-dimensional Electrophoresis).......................................... 73
4.2.6 Điện di mao dẫn CE (Capillary Electrophoresis)................................................. 75
4.2.7 Điện di miễn dịch IE (Immunoelectrophoresis) ................................................. 75
4.3 NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA PROTEIN ............................................................ 77
TÓM TẮT ................................................................................................................ 80
CÂU HỎI ÔN TẬP .................................................................................................... 80
BÀI 5: PHÂN TÍCH ĐỘNG HỌC ENZYME TYROSINASE ................................................ 81
5.1 ĐỘNG HỌC ENZYME .......................................................................................... 81
5.2 THIẾT KẾ THỬ NGHIỆM PHÂN TÍCH ĐỘNG HỌC ENZYME.................................... 83
5.2.1 Khái niệm chung .......................................................................................... 83
5.2.2 Xác định họat tính enzyme ............................................................................ 85
5.3 ENZYME TYROSINASE ...................................................................................... 85
5.3.1 Nội dung thí nghiệm ..................................................................................... 86
5.3.2 Các bước tiến hành....................................................................................... 86
5.3.3 Phân tích kết quả ......................................................................................... 89

5.3.4 Đơn vị họat tính của enzyme.......................................................................... 90
5.3.5 Đánh giá các bước tinh chế enzyme ................................................................ 92
TÓM TẮT ................................................................................................................ 93
CÂU HỎI ÔN TẬP .................................................................................................... 94
BÀI 6: BÀI 6: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH QUANG PHỔ.............................................. 95
6.1 NGUYÊN LÝ HỌAT ĐỘNG CỦA THIẾT BỊ QUANG PHỔ.......................................... 95
6.1.1 Khái niệm chung .......................................................................................... 95
6.2 XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ SINH CHẤT ....................................................................... 98
6.3 QUANG PHỔ HÙYNH QUANG ........................................................................... 101
6.4 PHÂN TÍCH PROTEIN TRONG DUNG DỊCH ....................................................... 105
TÓM TẮT .............................................................................................................. 108
CÂU HỎI ÔN TẬP .................................................................................................. 108
BÀI 7: THU NHẬN VÀ TINH SẠCH NUCLEIC ACID .................................................... 109
7.1 PHƯƠNG PHÁP CƠ BẢN THU NHẬN NUCLEIC ACID .......................................... 109
7.1.1 Thu nhận DNA gồm 3 bước .......................................................................... 109
7.1.2 Thu nhận RNA tòan phần và mRNA ............................................................... 111
7.2 THU NHẬN DNA TỪ VI KHUẨN ......................................................................... 111
7.2.1 Sơ đồ tách chiết phân đọan DNA từ tế bào vi khuẩn ........................................ 112
7.2.2 Thu nhận DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn ..................................................... 113


5

HƯỚNG DẪN

MỤC LỤC

III

7.3 TINH SẠCH NUCLEIC ACID.............................................................................. 114

7.3.1 Tinh sạch nucleic acid bằng siêu ly tâm ......................................................... 114
7.3.2 Tinh sạch nucleic acid bằng sắc ký ................................................................ 115
7.4 ĐỊNH LƯỢNG NUCLEIC ACID .......................................................................... 115
7.4.1 Định lượng nucleic acid bằng quang phổ kế .................................................... 116
7.4.2 Định lượng nucleic acid bằng điện di.............................................................. 116
7.4.3 Tinh chế DNA từ gel điện di.......................................................................... 117
TÓM TẮT .............................................................................................................. 118
CÂU HỎI ÔN TẬP .................................................................................................. 118
BÀI 8: KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ ............................................ 119
8.1 CÁC ENZYME DÙNG TRONG KỸ THUẬT DI TRUYỀN........................................... 119
8.1.1 Các enzyme cắt giới hạn RE (restrictase) ...................................................... 119
8.1.2 Các enzyme thông dụng khác....................................................................... 120
8.2 ĐIỆN DI NUCLEIC ACID .................................................................................. 122
8.3 LAI PHÂN TỬ .................................................................................................. 123
8.3.1 Cơ sở khoa học của sự lai phân tử................................................................. 123
8.3.2 Các kiểu lai phân tử .................................................................................... 125
8.4 MẪU DÒ VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU MẪU DÒ .............................................. 130
8.4.1 Mẫu dò ..................................................................................................... 130
8.4.2 Tác nhân đánh dấu ..................................................................................... 131
8.4.3 Phương pháp đánh dấu ............................................................................... 131
8.5 TÁCH DÒNG DNA (CLONING DNA) .................................................................. 133
8.6 PHẢN ỨNG CHUỖI NHÂN SỢI DNA PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) ......
139
8.6.1 Các bước thực hiện PCR .............................................................................. 139
8.6.2 Ứng dụng của PCR...................................................................................... 140
8.6.3 Hạn chế của PCR ........................................................................................ 142
8.7 XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ DNA ............................................................................... 142
8.8 MICROARRAY ................................................................................................. 146
TÓM TẮT .............................................................................................................. 148
CÂU HỎI ÔN TẬP .................................................................................................. 148

BÀI 9: PHÂN LỌAI HỌC PHÂN TỬ ............................................................................ 149
9.1 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LỌAI KINH ĐIỂN .................................................... 149
9.2 PHÂN LỌAI PHÂN TỬ ...................................................................................... 149
9.2.1 Các phương pháp dùng trong phân lọai phân tử .............................................. 149
9.2.2 Các gen thường dùng trong phân lọai học phân tử........................................... 151
9.2.3 Giám định theo 16 S ribosome RNA ở prokaryote ............................................ 153
9.2.4 Giám định theo 18 S ribosome RNA lan hài (Paphiopedium).............................. 155
TÓM TẮT .............................................................................................................. 163
CÂU HỎI ÔN TẬP .................................................................................................. 163


6

HƯỚNG DẪN

MỤC LỤC

TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 164

III


7

HƯỚNG DẪN

MỤC LỤC

III

HƯỚNG DẪN
MÔ TẢ MÔN HỌC
Giáo trình Phương pháp nghiên cứu trong Công nghệ sinh học cung cấp kiến thức cơ bản cho sinh
viên đào tạo theo định hướng Công nghệ sinh học về nguyên lý, các kỹ thuật và các thiết bị thường sử
dụng trong các lĩnh vực nghiên cứu của Công nghệ sinh học hiện đại. Chủ yếu tập trung vào nhóm các
phương pháp và thiết bị phân tích protein và nucleic acid, hai đối tượng nghiên cứu chính của Công
nghệ sinh học hiện đại. Giáo trình gồm 9 bài giảng.
NỘI DUNG MÔN HỌC
Bài 1: Giới thiệu phòng thí nghiệm nghiên cứu CNSH và các thao tác cơ bản chuẩn bị làm việc trong
phòng thí nghiệm CNSH.
Bài 2: Giới thiệu tổng quan những phương pháp cơ bản trong nghiên cứu CNSH gồm phương pháp sử
dụng các lọai điện cực và biosensor, phương pháp chuẩn bị đệm, các phương pháp phân tích hóa
sinh truyền thống, phương pháp thẩm tích và lọc, ly tâm theo mẻ và liên tục, sấy phun và đông
khô, tạo tinh thể và các phương pháp xác định MW của biopolymer.
Bài 3: Giới thiệu nguyên lý của phương pháp sắc ký, chủ yếu tập trung vào sắc ký trao đổi ion, lọc
gel, sắc ký ái lực và HPLC trong thu nhận và tinh sạch protein. Các phương pháp này được trình bầy
theo các bước trong quy trình thu nhận và tinh sạch protein gồm 4 modul. Cuối cùng là các phương
pháp sắc ký thu nhận và tinh sạch protein tái tổ hợp, sự phát triển của các phương pháp sắc ký
ái lực, từ sử dụng nguyên lý ái lực kháng nguyên/kháng thể đến ái lực enzyme/cơ chất trong cột
GST và ái lực thứ tự amino acid His với Ni trong cột Nikel.
Bài 4: Giới thiệu phương pháp điện di bao gồm nguyên lý của phương pháp điện di, các kiểu điện di
phân tách, tinh sạch và thu nhận protein và nucleic acid.
Bài 5: Giới thiệu về enzyme tyrosinase. Phân tích các bước trong nghiên cứu động học tyrosinase. Đây
như là bài thực hành lớn nhằm giúp sinh viên biết cách tiếp cận phương pháp phân tích động học
phản ứng xúc tác bởi enzyme.


8

HƯỚNG DẪN

HƯỚNG DẪN

V

Bài 6: Giới thiệu phương pháp phân tích quang phổ bao gồm nguyên lý, cấu tạo của 3 lọai thiết bị đo
quang hấp phụ (OD) thường sử dụng là máy so mầu, quang phổ khả kiến và UV, quang phổ
hùynh quang. Giới thiệu sơ lược về công hưởng từ hạt nhân, phương pháp ghi phổ nhiễu xạ tia X
và khối phổ MS. Sử dụng 5 phương pháp phân tích quang phổ để định lượng protein.
Bài 7: Tách chiết và định lượng nucleic acid giới thiệu các phương pháp cơ bản thu nhận DNA và RNA
tòan phần từ tế bào vi khuẩn, thực vật và đông vật. Thu nhận plasmid từ tế bào vi khuẩn. Tinh sạch
nucleic acid bằng ly tâm, bằng sắc ký, định tính và định lượng nucleic acid bằng quang phổ, bằng
điện di. Tinh chế nucleic acid bằng điện di.
Bài 8: Giới thiệu các kỹ thuật cơ bản sử dụng trong sinh học phân tử bao gồm các nhóm enzyme sử
dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử, điện di nucleic acid, phương pháp lai phân tử, Các lọai
mẫu dò và phương pháp chế tạo, tách dòng DNA, phương pháp PCR và mục đích sử dụng, xác
định thứ tự nucleotide và microarray.
Bài 9: Phân lọai học phân tử giới thiệu cơ sở khoa học của phương pháp phân lọai truyền thống và
phương pháp phân lọai phân tử. Giới thiệu bản chất của phương pháp phân lọai phân tử, các gen
thường sử dụng cho phân lọai ở tế bào prokaryote và eukaryote. Giới thiệu các bước thực hiện
trong phân lọai phân tử vi khuẩn và hoa lan.
KIẾN THỨC TIỀN ĐỀ
Môn học Phương pháp nghiên cứu trong Công nghệ sinh học mô đòi hỏi sinh viên có nền tảng về
Hóa sinh, Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học.
YÊU CẦU MÔN HỌC
Người học phải dự học đầy đủ các buổi lên lớp và làm bài tập đầy đủ ở nhà.


9

HƯỚNG DẪN

HƯỚNG DẪN

V

CÁCH TIẾP NHẬN NỘI DUNG MÔN HỌC
Để học tốt môn này, người học cần ôn tập các bài đã học, trả lời các câu hỏi và làm đầy đủ bài
tập; đọc trước bài mới và tìm thêm các thông tin liên quan đến bài học.
Đối với mỗi bài học, người học đọc trước mục tiêu và tóm tắt bài học, sau đó đọc nội dung bài
học. Kết thúc mỗi ý của bài học, người đọc trả lời câu hỏi ôn tập và kết thúc toàn bộ bài học, người đọc
làm các bài tập.
PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ MÔN HỌC
Môn học được đánh giá gồm:
Điểm quá trình: 30%. Hình thức và nội dung do GV quyết định, phù hợp với quy chế đào tạo và tình
hình thực tế tại nơi tổ chức học tập.
Điểm thi: 70%. Hình thức bài thi tự luận trong 60 phút. Nội dung thuộc bài thứ 1 đến bài thứ 9.


1

1: QUY
ĐỊNHVÀ
ANTHAO
TOÀNTÁC
VÀ THAO
TÁC
TRONG
THÍ
NGHIỆM

CÔNG
BÀI 1: QUYBÀI
ĐỊNH
AN TOÀN
TRONG
PHÒNG
THÍPHÒNG
NGHIỆM
CÔNG
NGHỆ
SINHNGHỆ
HỌC SINH HỌC

1

BÀI 1: QUY ĐỊNH AN TOÀN VÀ
THAO TÁC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Yêu cầu:
- Nắm được nội dung trong Quy định an tòan trong phòng thí nghiệm CNSH
- Nắm được yêu cầu và cách thức chuẩn bị và bảo quản dung dịch và hóa chất thí
nghiệm
-

Hiểu được cách thức chuẩn bị nước cất và nước siêu tinh khiết sử dụng trong phòng thí
nghiệm.

1.1 QUY ĐỊNH AN TÒAN LÀM VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM
Trước khi bắt đầu làm việc trong phòng thí nghiệm, việc đầu tiên là phải nắm vững những quy định an
toàn trong phòng thí nghiệm, làm quen với các chỉ dẫn về độ độc hại hóa chất sử dụng, các yếu tố gây

nguy hiểm. Các biện pháp và thiết bị bảo vệ. Trong đó việc tuân thủ quy định làm việc trong phòng thí
nghiệm có ý nghĩa rất quan trọng.
1. Phải luôn đeo kính phòng hộ khi làm thí nghiệm.
2. Không làm việc một mình trong phòng thí nghiệm.
3. Phải nắm vững tính chất hóa học và tính chất vật lý của tất cả hóa chất sử dụng trong phòng thí
nghiệm. Tuân thủ bảng hướng dẫn sử dụng hóa chất. Luôn phải đeo găng tay khi làm việc với hóa
chất hay yếu tố lây nhiễm.


2

1: QUY
ĐỊNHVÀ
ANTHAO
TOÀNTÁC
VÀ THAO
TÁC
TRONG
THÍ
NGHIỆM
CÔNG
BÀI 1: QUYBÀI
ĐỊNH
AN TOÀN
TRONG
PHÒNG
THÍPHÒNG
NGHIỆM
CÔNG
NGHỆ

SINHNGHỆ
HỌC SINH HỌC

2

4. Nghiêm cấm ăn uống, hút thuốc trong phòng thí nghiệm.
5. Nghiêm cấm thực hành thí nghiệm chưa được dạy.
6. Không dùng miệng hút hóa chất bằng pipet hay ống hút.
7. Làm quen với hướng dẫn an tòan trong phòng thí nghiệm. Phải biết rõ vị trí bình cứu hỏa, tủ
thuốc y tế, vị trí nguồn cấp điện, cấp nước.
8. Phải tuân thủ hướng dẫn của người có trách nhiệm. Phải ghi kết quả thí nghiệm hoặc những vấn đề
nẩy sinh, khúc mắc... trong nhật ký phòng thí nghiệm của mình.

Hình 1.1: Bảng đánh giá an tòan hóa chất của acetic acid theo HMIS (Hazardous
Materials Indentification System)
1.2 RỬA DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM
Hiện dụng cụ thí nghiệm bằng nhựa, chủ yếu từ polyethylene được sử dụng khá phổ biến. Trước
khi sử dụng lần đầu phải rửa dung cụ nhựa bằng dung dịch urea 8M ( điều chỉnh về pH 1 bằng HCl).
Sau đó tráng bằng nước cất. Rửa tiếp bằng dung dịch KOH 1 N, tráng lại bằng nước cất. Sau đó tráng
bằng dịch EDTA 10-3 M để lọai bỏ kim lọai ở dạng vết. Sau lần xử lý này, chỉ cần rửa bằng dịch tẩy rửa
(dịch xà bông) và tráng bằng nước cất là đạt yêu cầu.
Nhiều chất hữa cơ và kim lọai hay bám trên bề mặt dung cụ thí nghiệm. Thông
thường có thể lọai bỏ chúng bằng dịch xà bông 0,5%. Sau đó tráng kỹ bằng nước cất


3

1: QUY
ĐỊNHVÀ
ANTHAO

TOÀNTÁC
VÀ THAO
TÁC
TRONG
THÍ
NGHIỆM
CÔNG
BÀI 1: QUYBÀI
ĐỊNH
AN TOÀN
TRONG
PHÒNG
THÍPHÒNG
NGHIỆM
CÔNG
NGHỆ
SINHNGHỆ
HỌC SINH HỌC

3

hoặc nước trao đổi ion là đủ. Trong nhiều trường hợp phải sử dụng dụng cụ thí nghiệm khô.
Có thể làm khô bằng cách tráng dụng cụ thí nghiệm bằng acetone. Nhưng tốt hơn cả là sau khi
rửa sạch bằng nước cất, hong cho khô và sấy trong tủ sấy. Lưu ý không sấy ống ly tâm bằng
cellulose nitrate trong tủ sấy, vì cellulose nitrate là chất dễ nổ.
Không rửa cuvette, đặc biệt là cuvette bằng thạch anh hoặc dụng cụ quang học, bằng dịch KOH pha
trong cồn, vì dịch này có thể ăn mòn bề mặt của chúng. Chỉ cần rửa bằng dịch xà bông 0,5%, dùng que
cuốn bông để rửa và sau đó tráng lại bằng nước cất là đạt yêu cầu. Trong thực hành phòng thí nghiệm,
để định lượng dung dịch người ta thường sử dụng một số dạng pipet và công cụ hỗ trợ hút dịch như
mô tả trong hình sau.

Hình 1.2: Một số dụng cụ định lượng thể tích dịch truyền thống
Hút dịch vào pipet nhờ quả bóp cao su. Chú ý không cho dịch tràn vào quả bóp cao su. Tiện dụng
hơn cả là dùng pipet tự động.


4

1: QUY
ĐỊNHVÀ
ANTHAO
TOÀNTÁC
VÀ THAO
TÁC
TRONG
THÍ
NGHIỆM
CÔNG
BÀI 1: QUYBÀI
ĐỊNH
AN TOÀN
TRONG
PHÒNG
THÍPHÒNG
NGHIỆM
CÔNG
NGHỆ
SINHNGHỆ
HỌC SINH HỌC

4

Hình 1.3: Thao tác lấy dịch bằng pipet tự động
1.3 CHUẨN BỊ VÀ BẢO QUẢN HÓA CHẤT
Nước dùng trong phòng thí nghiệm thường ở các dạng phổ biến sau: nước trao đổi ion, nước thẩm
tinh sạch bằng thấu ngược và nước cất. Tuỳ thuộc mục đích sử dụng, người ta cân nhắc nên sử dụng
loại nước nào cho phù hợp. Nước nhận được từ cột trao đổi ion chứa rất ít ion kim loại, nhưng vẫn
còn chứa các chất hữu cơ bị thôi ra từ nhựa trao đổi ion, làm gia tăng độ hấp phụ tia UV của nước. Do
vậy trong thí nghiệm sử dụng phép đo UV, nên sử dụng nước cất, không nên dùng nước trao đổi ion.
Nước cất được tạo thành trong quá trình ngưng tụ nước sôi từ nồi cất kim loại hoặc thuỷ tinh. Nước
cất ngưng tụ từ nồi chưng cất kim loại vẫn còn chứa một ít ion kim loại, có thể ảnh hưởng đến kết quả
thí nghiệm. Do chúng kết hợp với hoá chất sử dụng hoặc với mẫu đo. Nước cất hầu như không
chứa chất hữu cơ, nếu tốc độ cất nước tương đối chậm. Nước cất bằng thiết bị thuỷ tinh là tốt nhất.
Tốt nhất là sử dụng nước khử ion để cất nước. Không nên sử dụng nước máy, vì muối trong nước máy
sẽ bám cặn lên bộ đốt, làm giảm chất lượng của nước cất. Khi bộ đốt bị bám cặn muối, làm sạch nó
bằng cách ngâm vào nước giấm hoặc dung dịch HCl 10%.
Nước cất tinh khiết thường bị nhiễm bẩn trong quá trình bảo quản. Do tia UV giải phóng một số chất
hữu cơ từ thùng, can nhựa, ion kim loại tạo lớp trên bề mặt chai thủy tinh đựng nước cất. Nước cất
bằng thiết bị chưng cất thuỷ tinh ít khi bị vi sinh vật gây nhiễm. Thực nghiệm cho thấy nước cất tinh
khiết có thể bảo quản được lâu trong bình thủy tinh, nút chặt và để trong tủ lạnh. Nếu trong bình chứa
nước cất thấy có vi sinh vật phát triển, phải đổ bỏ, không sử dụng. Để phá huỷ chất hữu cơ gây nhiễm
bẩn, người ta thường cất hỗn hợp (1lít nước + 1 g potassium permanganate
+1ml 85% phosphour acid).


5

1: QUY
ĐỊNHVÀ
ANTHAO

TOÀNTÁC
VÀ THAO
TÁC
TRONG
THÍ
NGHIỆM
CÔNG
BÀI 1: QUYBÀI
ĐỊNH
AN TOÀN
TRONG
PHÒNG
THÍPHÒNG
NGHIỆM
CÔNG
NGHỆ
SINHNGHỆ
HỌC SINH HỌC

5

Hình 1.4: Hệ thống thu nhận nước cất (trái) và nước trao đổi ion (phải)
Quá trình lọai bỏ khóang khỏi nước gọi là làm mềm nước nhờ trao đổi ion. Người ta cho nước chẩy
qua nền nhựa tẩm Na. Ion Ca+2 trong nước sẽ bị hấp phụ lên hạt nhựa thế chỗ của Na+. Quá trình trao
đổi ion từ từ, các hạt nhựa cũng từ từ hấp phụ Ca+2, và nhả vào nước Na+ và K+ không ảnh hưởng
đến sức khỏe của người.

Hình 1.5. Hệ thống thu nhận nước thẩm thấu ngược
Nước tinh khiết tạo thành trong quá trình thẩm thấu ngược nhờ áp suất ép nước qua màng được
chế tạo đặc biệt, có khả năng giữ lại cả các ion khóang.

6

1: QUY
ĐỊNHVÀ
ANTHAO
TOÀNTÁC
VÀ THAO
TÁC
TRONG
THÍ
NGHIỆM
CÔNG
BÀI 1: QUYBÀI
ĐỊNH
AN TOÀN
TRONG
PHÒNG
THÍPHÒNG
NGHIỆM
CÔNG
NGHỆ
SINHNGHỆ
HỌC SINH HỌC

6

Chuẩn bị dịch và bảo quản hóa chất:
Việc chuẩn bị dung dịch và bảo quản hóa chất phải tuân thủ qui định của nhà sản xuất. Nồng độ của

dung dịch hóa chất thường thể hiện theo độ mol, độ chuẩn hoặc theo %. Theo trọng lượng hoặc theo thể
tích, hoặc theo trọng lượng/thể tích (mg/ml hoặc g/lit) ... Tốt nhất là bảo quản dung dịch trong tủ lạnh.
Khi chuẩn bị dung dịch phải tính đến độ ngậm nước của hoá chất để tạo được dung dịch đạt nồng độ
mong muốn.
Phân tích thống kê số liệu thực nghiệm thu được bằng cách tính thông thường hoặc sử dụng phần
mềm phù hợp.


7

1: QUY
ĐỊNHVÀ
ANTHAO
TOÀNTÁC
VÀ THAO
TÁC
TRONG
THÍ
NGHIỆM
CÔNG
BÀI 1: QUYBÀI
ĐỊNH
AN TOÀN
TRONG
PHÒNG
THÍPHÒNG
NGHIỆM
CÔNG
NGHỆ
SINHNGHỆ

HỌC SINH HỌC

7

TÓM TẮT
Trong bài này, học viên làm quen với các quy định chung về an tòan làm việc trong phòng thí
nghiệm CNSH. Trước tiên là phải thực hiện đầy đủ nội quy làm việc trong phòng thí nghiệm. Đặc biệt
lưu ý đến an tòan phòng chống cháy, nổ và hóa chất độc hại. Sinh viên phải làm quen và hiểu các ký
hiệu ghi trên các lọ hóa chất.
Điểm tiếp theo là sinh viên phải làm quen và biết những đặc thù làm việc với các đối tượng sống
như vi khuẩn, nấm sợi, nấm men...và các quy định an tòan sinh học.
Sinh viên phải biết các lọai dụng cụ, các lọai thiết bị thường sử dụng trong phòng thí nghiệm
CNSH. Phải biết cách sử dụng các dụng cụ và thiết bị này cũng như việc chuẩn bị và bảo quản chúng.
Sinh viên phải làm quen với các công tác chuẩn bị làm việc trong phòng thí nghiệm CNSH. Đó là
việc chuẩn bị các lọai nước cất, nước siêu tinh khiết sử dụng cho các mục đích thí nghiệm khác nhau.
Cách thức bảo quản và sử dụng nước cất và nước siêu tinh khiết. Sinh viên phải làm quen và nắm
được cách thức chuẩn bị dung dịch và hóa chất thí nghiệm. Những điểm cần lưu ý trong quá trình
chuẩn bị cũng như cách thức bảo quản dung dịch và hóa chất thí nghiệm.

CÂU HỎI ÔN TẬP
Câu 1: Cho biết các ký hiệu hay sử dụng liên quan đến an tòan đối với hóa chất sử dụng trong
phòng thí nghiệm CNSH?.
Câu 2: Trình bầy cách thức chuẩn bị dung dịch hóa chất sử dụng trong phòng thí nghiệm CNSH?.
Câu 3: Trình bầy cách thức chuẩn bị và bảo quản dụng cụ và thiết bị sử dụng trong phòng thí nghiệm
CNSH?.
Câu 4: Trình bầy các lọai nước thường sử dụng trong phòng thí nghiệm CNSH và cách thức tạo và bảo
quản chúng?
Câu 5: Trình bầy lý do tại sao phải nắm bắt được yêu cầu an tòan sinh học khi làm việc trong phòng
thí nghiệm CNSH?.

8

2: CÁC
KỸ THUẬT
BẢN
TRONG
NGHIÊN
BÀI 2: CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢNBÀI
TRONG
NGHIÊN
CỨU CƠ
CÔNG
NGHỆ
SINH
HỌC CỨU CÔNG NGHỆ SINH HỌC

8

BÀI 2: CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢN
TRONG NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Yêu cầu:
- Hiểu được bản chất của dung dịch đệm, độ pH, điện cực
- Biết khái niệm về đầu dò sinh học
- Nắm được kỹ thuật thẩm tích, siêu lọc, định lượng nitơ, carbohydrate, lipid
- Nắm được kỹ thuật đông khô, sấy phun
- Hiểu được cách xác định trọng lượng đại phân tử
2.1 ĐO PH, DUNG DỊCH ĐỆM VÀ ĐIỆN CỰC
Thông thường độ pH của dịch thí nghiệm được đo bằng pH kế. Bộ phận quan trọng nhất là điện cực.

Các điện cực có thể sử dụng đơn lẻ (gồm điện cực thuỷ tinh nhạy với sự thay đổi nồng độ H+ và điện
cực so sánh, còn gọi là điện cực calomel). Hiện phổ biến hơn cả là sử dụng điện cực kép, kết hợp 2
điện cực trên.
Trước khi sử dụng phải kiểm tra dung dịch KCl bão hoà bên trong điện cực. Nếu mức dung dịch
KCl bão hoà trong điện cực thấp, phải bổ sung thêm dung dịch KCl bão hoà mới qua lỗ bên hông
điện cực. Trước khi chuẩn máy đo pH, phải điều chỉnh nhiệt độ về nhiệt độ của dung dịch pH chuẩn và
dung dịch cần đo. Nhấc điện cực ra khỏi dung dịch bảo quản, rửa kỹ bằng nước cất và lau khô bằng
giấy thấm. Ngâm điện cực vào dung dịch đệm chuẩn thứ nhất và điều chỉnh giá trị pH về giá trị pH của
đệm chuẩn, cho đến khi chỉ số pH trên máy đo ổn định. Lấy điện cực ra khỏi dung dịch đệm thứ
nhất, rửa và lau điện cực như mô tả ở trên. Lặp lại thao tác đo pH đối


9

2: CÁC
KỸ THUẬT
BẢN
TRONG
NGHIÊN
BÀI 2: CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢNBÀI
TRONG
NGHIÊN
CỨU CƠ
CÔNG
NGHỆ
SINH
HỌC CỨU CÔNG NGHỆ SINH HỌC

9

với dung dịch đệm chuẩn thứ hai. Giá trị pH đo được phải nằm trong khoảng sai số 
0,05 đơn vị so với giá trị của dung dịch đệm chuẩn thứ nhất. Nếu không đạt, phải chỉnh lại pH theo giá
trị chuẩn nói trên và kiểm tra lại đối với dung dịch đệm chuẩn thứ nhất. Điện cực rất dễ hỏng, do
vậy phải rất cẩn thận trong thao tác. Điện cực thuỷ tinh luôn được bảo quản trong dung dịch KCl 3M.
Sau khi được rửa sạch và lau khô. Khi đo dịch protein, thường protein bám màng trên bề mặt điện cực,
làm sai lệch kết quả. Trong

trường hợp này có thể xử lý bằng cách nhúng điện cực vào dịch

pepsin 5% trong 0,1 N HCl khoảng 2 giờ. Sau đó rửa sạch điện cực bằng nước cất, lau khô và giữ trong
dung dịch bảo quản.
Dịch đệm có nồng độ muối cao ảnh hưởng khá mạnh lên kết quả đo, vì giá trị pH phụ thuộc vào độ
hoạt động của ion, chứ không phụ thuộc vào nồng độ muối. Ở dung dịch loãng, độ hoạt động của ion
thường tương ứng với nồng độ. Còn ở dung dịch nồng độ muối cao, độ hoạt động của ion
không tương ứng với nồng độ của muối.Trong thực tế, thường người ta chuẩn bị sẵn dung dịch
mẹ (stock). Khi tiến hành thí nghiệm, người ta sẽ chuẩn bị dung dịch sử dụng, từ dung dịch mẹ. Do
vậy, phải xác định pH của dung dịch sử dụng, sau khi pha loãng từ dung dịch mẹ.
Nhiệt độ cũng ảnh hưởng lên phép đo pH, do hằng số phân ly pKa phụ thuộc vào nhiệt độ theo giá
trị pKa/ 0C = - 0,031. Thí dụ đệm Tris ở 40C có giá trị là 7,0, trong
khi ở 370C giảm xuống chỉ còn 5,95. Do vậy trong thực tế phải điều chỉnh pH của dịch đệm về
giá trị sử dụng là 5,95.
Phương trình Henderson-Hasselbalch cho phép tính giá trị pH khi biết tỷ lệ nồng độ mol của cặp
acid-base [A-]/[HA] và pKa của HA (giá trị pKa có trong các sách tra cứu
hóa học).
[A
pH  pKa  log 
][
HA]
Trong thực tế, đệm tốt nhất là đệm chứa nồng độ tương đương của HA và A-. Khi [A-] = [HA] thì
pH = pKa. Có nghĩa là pKa của cặp acid-base nằm ở tâm của vùng đệm hoạt động. Một số hệ đệm dùng

phổ biến trong nghiên cứu sinh học được ghi nhận trong bảng.


Phần lớn các thao tác nghiên cứu sinh học xẩy ra ở vùng đệm pH nằm trong khỏang giá trị
từ 6 đến 8. Tuy nhiên cũng có trường hợp xảy ra ở vùng đệm có giá trị rộng hơn từ 2 đến 12. Khó có
cặp acid và base nào phù hợp cho cả khoảng rộng pH nói trên. Do vậy thường người ta dùng kết hợp
một số hệ đệm, thông dụng hơn cả là hệ đệm phosphate, citrate và succinate.
Đệm phosphate được sử dụng rộng rãi nhất, độ đệm của nó nằm trong khoảng pH
6,5-7,5 và bản thân phosphate là muối phổ biến trong tế bào. Chủ yếu đệm phosphate được tạo
từ dung dich Na-phosphate và K-phosphate. Nhược điểm chủ yếu là đệm phosphate thường tạo cặn với
một số ion cần cho hoạt động sống, là Ca+2 và Mg+2 . Đôi khi đệm phosphate ức chế một số enzyme.

Hình 2.1: Các hệ đệm thường dùng trong nghiên cứu sinh học


Hình 2.2: Hệ điện cực đo pH cổ điển (trái) và điện cực kép (phải)


Đệm Tris là đệm tổng hợp Tris [Tris (hydroxymethyl) aminomethane], một lọai đệm có tính lưỡng
tính, được sử dụng rộng rãi với vùng pH tối ưu nằm trong khoảng
7,5-8,5. Tris ở dạng tinh thể có tính base, dễ định lượng và hoà tan tốt trong nước.
Thí dụ để chuẩn bị 1 lít 0,1 M đệm Tris, người ta cân 12,11 g (0,1mol), hoà tan trong
950-975 ml nước cất. Bổ sung HCl đậm đặc, khuấy và điều chỉnh cho đến khi đạt pH mong muốn. Cuối
cùng bổ sung nước cất đến 1 lít. Tuy là amine bậc một, Tris hầu như không ảnh hưởng đến các phản
ứng sinh hoá, không tạo tủa với Ca+2. Tuy nhiên pH của đệm phụ thuộc vào nồng độ. Giá trị pH giảm
0,1 đơn vị khi pha loãng 10 lần. Đệm Tris có thể có ảnh hưởng đến một số loại điện cực và sự thay đổi
do nhiệt của nó cao hơn so với các loại đệm khác. Để khắc phục, nên đo pH sau khi đã pha loãng
đệm, sử dụng điện cực phù hợp và chuẩn bị đệm ở nhiệt độ thực hiện.
Đệm carboxylic acid bao gồm các đệm acetate, fumarate, citrate và suscinate, chủ yếu dùng cho
vùng đệm có giá trị pH từ 3 đến 6. Do tất cả chúng đều là chất trao đổi, nên có ảnh hưởng tới các phản

ứng sinh học. Ngoài ra, citrate và suscinate còn tạo phức với Fe+3, Zn+2, Mg+2… Đệm fumarate có ưu
thế là dễ bay hơi, nên trong một số trường hợp có thể loại bỏ dễ dàng nhờ áp suất âm. Đệm borate có giá
trị vùng đệm trong khỏang pH từ 8,5 đến 10. Nhược điểm chủ yếu là nó dễ tạo phức với nhiều chất trao
đổi, đặc biệt là với các chất carbohydrate.
Đệm lưỡng tính (Zwitterionic buffer hay Good’s buffer) (1972), khắc phục được một số hạn chế
của các hệ đệm nói trên. Do vậy hiện được sử dụng rất rộng rãi. Hạn chế chủ yếu là giá thành cao.
Lưu ý là những đệm lưỡng tính phổ biến như Tris, HEPES và PIPES, thường chứa các gốc tự do nên
không thể sử dụng trong nghiên cứu phản ứng oxyhoá – khử.
Điện cực oxy là điện cực đo nồng độ oxy tan trong dung dịch. Điện cực oxy gồm: catod bằng Pt,
anod bằng Ag gắn vào tấm epoxy. Đầu cực bọc màng teflon và được cố định bằng khuyên tròn.
Màng này ngăn cách hai điện cực ngâm trong dung dịch KCl bão hoà với dung dịch cần đo trong
ngăn đựng mẫu. Màng teflon cho phép O2 và các khí khác qua lại dễ dàng. Khi tiếp xúc với bề mặt
catod Pt, phân tử khí O2 sẽ bị
khử trên bề mặt điện cực: O2 +4 e- + 2H2O  4 OH-. Còn trên anode sẽ xẩy ra phản
ứng 4 Ag0 + 4 Cl-  4AgCl- + 4e-. Tổng thể sẽ là 4 Ag0 + O2 + 4 Cl- +2 H2O  4
AgCl +4 OH-.


Hình 2.3: Sơ đồ họat động của điện cực đo oxy trong dung dịch
Như vậy dòng điện đi qua hệ điện cực tỷ lệ thuận với O2 thẩm thấu qua màng. Đồng nghĩa với số
lượng O2 hoà tan trong dung dịch. Dòng điện trên được khuyếch đại và ghi nhận theo đơn vị bão hoà
oxy. Điện cực oxy được sử dụng trong các nghiên cứu liên quan đến trao đổi oxy (phản ứng oxyhoá
khử, kiểm soát cung cấp khí cho quá trình lên men trong các bioreactor). Cần đặc biệt chú ý tới
màng teflon, nếu màng bị nhàu, bị thủng, bề mặt màng bị bẩn, thì kết quả nhận được sẽ bị sai lệch.
Không được lấy tay sờ lên màng, không làm bẩn màng bằng hoá chất hoặc chất có dầu khi tiến hành
bọc màng lên điện cực. Màng cũng hay bị bít bởi protein hay hoá chất có mặt trong ngăn đựng mẫu đo.
Kinh nghiệm cho thấy cần thường xuyên kiểm tra màng bằng kính hiển vi có độ phóng đại thấp. Cực
anod bằng bạc thường xuyên phải được rửa bằng dung dịch NH4OH nhằm tẩy Ag sulfate, giữ bề mặt
điện cực sáng bóng. Nhiệt độ đo cũng rất quan trọng. Do vậy điện cực đo thường đặt trong buồng ổn
nhiệt, có khuấy từ tránh làm suy giảm oxy trên bề mặt cathode. Sự xuất hiện bọt khí trong buồng

mẫu đo hoặc trong dung dịch KCl sẽ làm sai lệch kết quả đo, vì bọt khí chứa O2 nhiều hơn trong nước
bão hoà tới 20 lần.


Bảng 1.1: Thành phần và tính chất của một số đệm lưỡng tính tổng hợp


2.2 ĐIỆN CỰC ION VÀ ĐẦU DÒ SINH HỌC
Cho đến nay điện cực đo ion H+ và O2 đã được phát triển rất mạnh. Tuy nhiên một số ion, hoặc khí
khác cũng có thể đo được nhờ các hệ điện cực đặc hiệu hoạt động tương tự như điện cực oxy. Mỗi loại
điện cực ion được chế tạo từ vật liệu màng đặc biệt khác nhau, cho phép từng loại ion thẩm thấu qua
lại dễ dàng. Điện cực ion có độ nhạy cao, thiết bị đơn giản, thao tác nhanh. Nhược điểm chủ yếu
là kết quả đo thường bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các ion khác. Do vậy thao tác chủ yếu trong phép
đo dùng điện cực ion là tìm cách ngụy trang ion cần đo, hoặc loại bỏ ảnh hưởng của các ion khác.
Bảng 1.2: Điện cực ion đặc hiệu

Hình 2.4: Sơ đồ họat động của đầu dò sinh học


Đầu dò sinh học giống điện cực ion ở chỗ là cũng dùng để đo nồng độ phân tử sinh học (thường là
chất trao đổi). Thí dụ đo nồng độ urea, carbohydrate, enzyme, kháng thể và các chất trao đổi... Về bản
chất, đầu dò sinh học là thiết bị đo gồm đầu dò chứa yếu tố sinh học, làm nhiệm vụ phát hiện, tạo tín
hiệu sinh học. Chúng thường là enzyme, kháng thể, tế bào, thậm chí bào quan … ở dạng cố định và bộ
biến tín hiệu sinh học thành tín hiệu thể hiện trên thiết bị đo.
Lực ion của dung dịch biểu hiện nồng độ của ion trong dung dịch, có ảnh hưởng lên tính chất
của các chất tham gia quá trình sinh học cụ thể nào đấy. Lực ion I của dung dịch liên quan đến tất cả các
ion có mặt trong dung dịch và được tính bằng công thức:

Trong đó ci là nồng độ mol (M, mol/L) của ion i. Đối với chất điện phân như NaCl, thì lực ion bằng
nồng độ. Nhưng đối với MgSO4, thì lực ion lại gấp 4 lần. Ion đa hóa trị có lực ion mạnh hơn ion đơn

hóa trị. Thí dụ lực ion của 0,050 M của Na2SO4 trong dung dịch 0,020 M trong dịch KCl sẽ là:
2
2
2
I = 1/2 × [(0.050 M × 2 × (+1) ) + (0.050 M × 1 × (−2) ) + (0.020 M × 1 × (+1) )
2
+ 0.020 M × 1 × (−1) )] = 0.17 M
2.3 CÁCH THỨC THỂ HIỆN NỒNG ĐỘ
Dung dịch hóa chất thường được chuẩn bị theo một số cách thể hiện nồng độ sau:
- Nồng độ % tính theo khối lượng, là số g chất trong 100 g hỗn hợp (độ Brix)
- Nồng độ % tính theo thể tích, là số g trong 100 ml
- Nồng độ mol (M), là số gram mol/1 lít.
-

Nồng độ nguyên chuẩn N, là số gram nguyên chuẩn/1 lít. Gram nguyên chuẩn bằng tỷ lệ của
phân tử lượng/số ion H+ (đối với acid) hay OH- (đối với kiềm) trao đổi. Thí dụ HCL trao đổi 1 H+,
còn H2SO4 trao đổi 2 ion H+. Để biết độ N, so sánh dung dịch ta chuẩn bị với dịch có số N chuẩn
đã bíết.