Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (m, GP5, GP5ectoM) của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ agrobacterium tt

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ MINH HẰNG

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN (M, GP5,
GP5ectoM) CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN
SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TRONG CÂY THUỐC LÁ
BẰNG PHƯƠNG PHÁP THẨM LỌC NHỜ
AGROBACTERIUM

Chuyên ngành: Hoá sinh học
Mã số: 9420116

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2019


Công trình được hoàn thành tại Viện Công nghệ sinh học
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Nguyễn Trung Nam
Viện Công nghệ sinh học
2. PGS. TS. Chu Hoàng Hà
Viện Công nghệ sinh học

Phản biện 1: PGS. TS. Đồng Huy Gới
Phản biện 2: GS. TS. Đậu Ngọc Hào
Phản biện 3: GS. TS. Chu Hoang Mậu

Luận án được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án phiên chính thức tại
Viện Công nghệ sinh học
Vào hồi ……giờ….., ngày…..tháng…..năm 2019.

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Thư viện Viện Công nghệ sinh học
- Trang web của Bộ GD & ĐT


NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Nguyễn Thị Minh Hằng, Hồ Thị Thương, Nguyễn Thu Giang, Phạm Bích Ngọc,
Nguyễn Trung Nam, Chu Hoàng Hà (2017). Tách dòng và đồng biểu hiện gen mã
hóa hai loại kháng nguyên vỏ GP5ecto (vùng ngoại bào) và M của virus gây hội
chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học
Tự nhiên và Công nghẹ, Tập 33(1S): 150-158.
2. Nguyễn Thị Minh Hằng, Hồ Thị Thương, Nguyễn Thu Giang, Phạm Thị Vân,
Phạm Bích Ngọc, Nguyễn Trung Nam, Chu Hoàng Hà (2017). Biểu hiện và tinh
sạch protein M của virus PRRS gây bệnh lợn tai xanh bằng công nghệ biểu hiện
tạm thời trong lá thuốc lá Nicotinana benthamiana. Tạp chí Công nghẹ Sinh học
15(3): 547-554.
3. Nguyễn Thị Minh Hằng, Hồ Thị Thương, Phạm Bích Ngọc, Nguyễn Trung Nam,
Chu Hoàng Hà (2018). Xác định khả năng kích thích tạo kháng thể đặc hiệu của
kháng nguyên tái tổ hợp GP5-ELP của virus PRRS gây hội chứng rối loạn sinh
sản và hô hấp ở lợn trên động vật thí nghiệm. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y.
Tập 25(5): 35-42.
4. Nguyễn Thị Minh Hằng, Hồ Thị Thương, Nguyễn Thu Giang, Phạm Bích Ngọc,
Nguyễn Trung Nam, Chu Hoàng Hà (2018). Nghiên cứu tối ưu các điều kiện biểu
hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên M của virus PRRS trong lá cây thuốc lá
Nicotinana benthamiana. Tạp chí Công nghẹ Sinh học 16(2): 293-300.

5. Nguyễn Thị Minh Hằng, Phạm Bích Ngọc, Nguyễn Trung Nam, Chu Hoàng Hà (2018).
Đánh giá khả năng kích thích đáp ứng kháng thể đặc hiệu của kháng nguyên M và
GP5ectom/PRRSV được sản xuất từ thực vật trên chuột bạch. Hội nghị Khoa học Công
nghệ sinh học toàn quốc 2018: 194-199.

6. Nguyễn Thị Minh Hằng, Hồ Thị Thương, Nguyễn Thu Giang, Phạm Bích Ngọc,
Nguyễn Trung Nam, Chu Hoàng Hà (2016). Đánh giá sự biểu hiện tạm thời kháng
nguyên GP5 tái tổ hợp của virus PRRS trong mô lá thuốc lá Nicotinana tabacum.
Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc lần thứ IV, khu vực phía nam, 2016: “Ứng
dụng Công nghệ sinh học vào thực tiễn”; P1-14:57.


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine reproductive and respiratory
syndrome – PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm trên lợn do virus gây ra. Ở Việt
Nam, bệnh còn được gọi là “Bệnh lợn tai xanh” (theo ngôn ngữ đại chúng) do lợn mắc
bệnh thường bị xung huyết ở tai, lúc đầu đỏ sẫm, sau tím xanh. PRRS gây thiệt hại kinh
tế rất lớn ở những nước có bệnh. PRRS được phát hiện ở Mỹ vào năm 1987. Hàng năm
nước Mỹ phải chịu những thiệt hại do bệnh này ước tính khoảng 664 triệu USD cho việc
tiêu huỷ lợn chết, lợn ốm, chi phí chống dịch và xử lý môi trường.
Ở Việt Nam, dịch PRRS do virus thể độc lực cao xuất hiện lần đầu tiên vào năm
2007. Từ đó đến nay, dịch đã xuất hiện ở hầu hết các địa phương trong cả nước. Theo
thống kê của Cục Thú y, từ cuối tháng 4/2016 đến tháng 11/2016, đã xuất hiện 14 ổ dịch
PRRS tại 8 huyện của 4 tỉnh là Quảng Trị, Hậu Giang, Nghệ An và Hà Tĩnh, làm 3.433
con lợn mắc bệnh, trong đó có 1.242 con lợn bị tiêu huỷ. PRRS đã ảnh hưởng nặng nề
tới ngành chăn nuôi lợn trong nước. Bệnh vẫn xuất hiện ở một số địa phương và có tính
chất 2-3 năm một lần. Điều này cũng cho thấy nguy cơ xuất hiện trở lại của dịch bệnh
này trong thời gian tới.
Hiện nay, các vaccine phòng PRRS chủ yếu là vaccine vô hoạt và nhược độc. Các

vaccine vô hoạt thường an toàn nhưng khả năng bảo hộ thấp. Các vaccine nhược độc bảo
hộ tốt hơn nhưng còn nhiều lo ngại về tính an toàn của các loaị vaccine này. Vaccine
nhược độc có thể giảm dần mức bảo hộ do giảm mức tương đồng với chủng mới (nếu
có) và bản thân virus vaccine sau nhiều lần truyền nhiễm cũng có thể đột biến trở thành
cường độc. Mặc dù vậy, phòng chống PRRS tại Việt Nam đã đạt hiệu quả cao. Hiện nay,
dịch chỉ xuất hiện lẻ tẻ, trong những năm gần đây hầu như không có dịch, một phần là
nhờ biện pháp chủ động tiêm phòng cho lợn.
Virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn ở nước ta hiện nay được
xác định là thể độc lực cao và chưa có thuốc đặc trị. Việc phòng chống dịch chủ yếu vẫn
là tiêm phòng vaccine kết hợp các biện pháp thú y (Tiêu độc khử trùng, vệ sinh truồng
trại, cách ly và tiêu huỷ lợn bệnh ...). Để phòng chống virus thể độc lực cao đang lưu
hành tại Việt Nam cần phải có thêm vaccine phù hợp. Nhu cầu về các loại vaccine PRRS
thế hệ mới trong đó có vaccine tiểu đơn vị, an toàn và hiệu quả hơn là vấn đề cấp thiết.
Protein GP5 và M là những protein cấu trúc chính của virus PRRS (PRRSV) được
lựa chọn là những ứng viên tiềm năng để sản xuất vaccine tiểu đơn vị chống PRRSV.
Các kháng thể kháng GP5 và M ở lợn là các kháng thể có khả năng trung hoà PRRSV.
Sự kết hợp đoạn peptit miền ngoài của kháng nguyên GP5 (GP5ecto) được cho là chứa các
epitope trung hoà của GP5 với protein M với mong muốn sẽ tạo được protein tái tổ hợp
heterodimer GP5ectoM có khả năng kích thích tạo đáp ứng miễn dịch mạnh và trở thành
một trong những ứng viên tiềm năng để phát triển sản xuất vaccine chống PRRSV.
Kháng nguyên của virus PRRS có thể được sản xuất trong hệ thống thực vật nhằm
phát triển vaccine tiểu đơn vị phòng PRRS thông qua phương pháp biểu hiện gen tạm
thời. Hệ thống biểu hiện gen tạm thời ở thực vật bằng phương pháp thẩm lọc nhờ
Agrobacterium nhằm sản xuất kháng nguyên có nhiều ưu điểm như: Mức độ biểu hiện
kháng nguyên cao, có thể sản xuất ở quy mô lớn, phương pháp thực hiện đơn giản, thời
gian nhanh, không bị ảnh hưởng bởi vị trí gắn gen đích trong tế bào thực vật và có thể
tiến hành biểu hiện trong các mô đã biệt hóa hoàn toàn như lá, cung cấp kháng nguyên
cho mục đích sản xuất vaccine chống chủng virus mới xuất hiện một cách nhanh chóng
khi dịch bệnh xảy ra.

Căn cứ vào các luận cứ khoa học và tình hình thực tiễn nêu trên, luận án được thực
hiện với đề tài “Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (M, GP5, GP5ectoM) của virus gây
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong cây thuốc lá bằng phương pháp
thẩm lọc nhờ Agrobacterium” với mục đích tạo cơ sở khoa học và thực nghiệm để biểu
hiện các gen mã hoá kháng nguyên của chủng virus PRRS gây hội chứng rối loạn sinh sản
và hô hấp ở lợn đang lưu hành ở Việt Nam bằng phương pháp biểu hiện gen tạm thời trong
thực vật phục vụ cho định hướng phát triển sản xuất vaccine thế hệ mới.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu chung
Nghiên cứu cơ sở khoa học và thực nghiệm của việc sản xuất kháng nguyên tái tổ
hợp M/GP5/GP5ectoM của chủng virus PRRS (PRRSV) đang gây bệnh lợn tai xanh ở Việt
Nam bằng công nghệ biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá phục vụ cho định hướng phát triển
vaccine thế hệ mới.
Mục tiêu cụ thể
− Thiết kế được 3 cấu trúc vector chuyển gen mang gen m, gp5optimize (gp5opt) và
gp5ecto-m của chủng virus thể độc lực cao gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp
ở lợn dưới sự điều khiển biểu hiện bởi promoter CaMV 35S.
− Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hoá 3 loại kháng nguyên M, GP5 và
GP5ectoM của chủng PRRSV thể độc lực cao trong lá cây thuốc lá và tinh sạch được
kháng nguyên M, GP5 và GP5ectoM tái tổ hợp từ mô lá thuốc lá.
− Đánh giá được tính sinh miễn dịch của protein tái tổ hợp M, GP5 và GP5ectoM trên
động vật thí nghiệm.
3. Nội dung nghiên cứu
(1) Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang các gen m/gp5opt/gp5ecto-m mã
hoá kháng nguyên M-ELP/ GP5-ELP /GP5ectoM-ELP và tạo chủng Agrobacterium
mang vector tương ứng; (2) Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen m/ gp5opt/
gp5ecto-m ở lá cây thuốc lá N. benthamiana. Biểu hiện tạm thời và tinh sạch các kháng
nguyên M-ELP/ GP5-ELP/ GP5ectoM-ELP tái tổ hợp; (3) Đánh giá tính sinh miễn dịch
dịch thể của kháng nguyên M-ELP/ GP5-ELP/ GP5ectoM-ELP tái tổ hợp trên động vật

thí nghiệm.
4. Đóng góp mới của luận án
Luận án đã tiến hành thực hiện nghiên cứu một cách tổng thể, từ việc thiết kế vector
chuyển gen mang các gen mã hóa kháng nguyên của virus PRRS gây bệnh lợn tai xanh, tối
ưu các điều kiện biểu hiện gen tạm thời trong thực vật, biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên
và đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm.
Luận án là công trình nghiên cứu thành công đầu tiên tại Việt Nam về việc thiết kế
vector chuyển gen và biểu hiện tạm thời các gen m/ gp5opt/ gp5ecto-m mã hoá kháng
nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP của chủng virus PRRS gây bệnh lợn
tai xanh đang lưu hành tại Việt Nam trong lá cây thuốc lá N. benthamiana bằng phương
pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium.
Kết quả của luận án cũng đã chứng minh được các kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP,
GP5-ELP và GP5ectoM-ELP có khả năng kích thích sinh kháng thể đặc hiệu kháng virus
PRRS trên động vật thí nghiệm. Trong đó, kháng nguyên GP5ecto (vùng ngoại bào của
GP5) dung hợp với kháng nguyên M (GP5ectoM-ELP) kích thích đáp ứng kháng thể đặc
hiệu tốt hơn kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP riêng lẻ. Kháng nguyên GP5ectoM-ELP và
GP5-ELP là hai ứng viên tiềm năng để sản xuất vaccine tiểu đơn vị chống PRRSV thể độc
lực cao đang gây bệnh ở Việt Nam.


5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
5.1. Ý nghĩa khoa học
Luận án cung cấp cơ sở khoa học quan trọng trong việc thiết kế các cấu trúc vector
chuyển gen mang gen m/gp5opt/gp5ecto-m mã hóa cho các kháng nguyên tái tổ hợp M,
GP5 và GP5ectoM của PRRSV dung hợp Elastin - like polypeptide (ELP); biểu hiện tạm
thời kháng nguyên tái tổ hợp trên cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ
Agrobacterium; tách chiết, tinh sạch và đánh giá khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch
dịch thể của các kháng nguyên tái tổ hợp này trên động vật thí nghiệm. Kết quả đề tài luận
án là bằng chứng khoa học về tiềm năng của việc sản xuất, phát triển vaccine tiểu đơn vị
phòng PRRS trong thực vật.

5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Các cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen m/ gp5opt/ gp5ecto-m mã hóa các
kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP của chủng virus PRRS đang
lưu hành ở Việt Nam và các chủng A. tumefaciens mang các vector này có thể được sử dụng
để nghiên cứu biểu hiện, sản xuất và phát triển vaccine tiểu đơn vị phòng PRRS.
Quy trình biểu hiện gen tạm thời trên lá cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ
A. tumefaciens với các điều kiện tối ưu của đề tài luận án có thể ứng dụng để sản xuất các
kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP hoặc các protein tái tổ hợp
khác.
Kháng nguyên tái tổ hợp GP5-ELP và GP5ectoM-ELP được tạo ra trong đề tài luận
án là hai ứng viên tiềm năng cho sản xuất vaccine tiểu đơn vị phòng bệnh lợn tai xanh ở
Việt Nam.
6. Cấu trúc của luận án
Luận án gồm 131 trang (Từ Mở đầu đến Kết luận và kiến nghị, không bao gồm Danh
mục các công trình công bố, Tóm tát luận án bằng Tiếng Anh, tài liệu tham khảo và các phụ
lục), được chia thành các phần: Mở đầu gồm 5 trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu, 37
trang; Chương 2: Vật liệu và phương pháp, 17 trang; Chương 3: Kết quả nghiên cứu, 47
trang; Chương 4: Bàn luận kết quả nghiên cứu, 22 trang; Kết luận và đề nghị: 2 trang; Các
công trình đã công bố liên quan đến luận án: 1 trang; Tóm tắt luận án bằng tiếng anh: 7
trang; Luận án có 7 bảng số liệu, 51 hình. Ngoài ra, tài liệu tham khảo: 229 tài liệu tham
khảo, trong đó 14 tài liệu tiếng Việt và 215 tài liệu tiếng Anh; Phụ lục: 5 trang;
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận án đã tham khảo và tổng kết 16 tài liệu trong nước, 217 tài liệu nước ngoài với các
nội dung liên quan, bao gồm: (1) Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn, như: Sơ lược
tình hình dịch bệnh; bệnh tích của PRRS; virus PRRS; (2) Vaccine phòng PRRS: Vaccine
sống - nhược độc; vaccine vô hoạt; các dạng vaccine thử nghiệm dựa vào kháng nguyên GP5 và
M chống PRRSV; (3) Biểu hiện tạm thời kháng nguyên của PRRSV ở thực vật bằng phương
pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium, như: Lợi thế của phương pháp biểu hiện gen tạm thời
nhờ A. tumefaciens; quá trình thẩm lọc nhờ A. tumefaciens; một số giải pháp tăng cường

biểu hiện gen tạm thời ở thực vật.
Với các dẫn liệu thu thập được, kết quả phân tích cho thấy Hội chứng rối loạn sinh sản và
hô hấp ở lợn (PRRS) do virus PRRS (PRRSV) gây ra, là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm
ở lợn, được phát hiện lần đầu tiên ở Mỹ vào năm 1987 và đã lây lan ở nhiều quốc gia trên
thế giới, gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn. PRRSV là loại virus RNA
không ổn định, thay đổi nhanh chóng cả về đặc tính di truyền và kháng nguyên, có tốc độ


tiến hóa nhanh nhất trong số các virus RNA. Điều này, gây ra nhiều khó khăn cho việc
nghiên cứu sản xuất vaccine phòng PRRS. Hiện nay, trên thế giới đã có hơn 20 loại vaccine
thương mại phòng PRRS. Các vaccine được sản xuất từ các chủng virus dòng châu Âu và
dòng Bắc Mỹ dưới hai dạng chủ yếu là vaccine sống – nhược độc và vaccine vô hoạt.
Vaccine vô hoạt thường an toàn, có khả năng phòng ngừa các triệu chứng lâm sàng nhưng
hiệu quả bảo hộ không cao. Vaccine nhược độc tạo ra miễn dịch bảo hộ tốt với các chủng
tương đồng nhưng mức bảo hộ có thể giảm dần do giảm mức tương đồng với các chủng
mới, có nguy cơ phát triển độc tính trở lại, bản thân virus vaccine sau nhiều lần truyền
nhiễm có thể đột biến trở thành cường độc.
Ở Việt nam, phát hiện bệnh PRRS lần đầu tiên vào năm 1996 trên đàn lợn giống 51 con
nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam và dịch bệnh nặng xuất hiện từ năm 2007 cho đến nay.
Công ty Hanvet đã nghiên cứu và sản xuất thành công vaccine PRRS nhược độc chủng
Hanvet 1.VN để phòng chống PRRS ở Việt Nam. Tuy nhiên, do sự biến đổi di truyền phức
tạp của PRRSV, các loại vaccine đang lưu hành trên thực địa hiện nay đang mất dần hiệu
lưc. Virus gây dịch tai xanh ở nước ta hiện nay được xác định là thể độc lực cao, thuộc
chủng PRRSV Bắc Mỹ type II, tương đồng với chủng virus gây bệnh thể độc lực cao ở
Trung Quốc nên việc phòng bệnh khó khăn, dịch cũng nguy hiểm hơn và cần phải có
vacxin phù hợp.
Để nâng cao hiệu quả phòng chống PRRS, việc nghiên cứu sản xuất các loại vaccine thế
hệ mới có sự bảo hộ cao với các biến chủng mới của PRRSV hiện nay là rất cần thiết.
Vaccine tiểu đơn vị được sản xuất trong thực vật phòng PRRS là hướng nghiên cứu đã được
đánh giá là có nhiều triển vọng và ưu điểm như ổn định và bền vững, đảm bảo hoạt tính sinh

học, dễ dàng sản xuất với khối lượng lớn, chi phí sản xuất thấp. Protein GP5 và M là những
protein cấu trúc chính của virus PRRS được lựa chọn là những ứng viên tiềm năng để
sản xuất vaccine tiểu đơn vị chống virus PRRS. Nhiều hệ thống biểu hiện GP5 và M của
PRRSV đã được thử nghiệm. Biểu hiện gen tạm thời ở thực vật bằng phương pháp thẩm
lọc nhờ Agrobacterium là phương pháp để sản xuất kháng nguyên có nhiều ưu điểm đã
được chứng minh, như: Hàm lượng kháng nguyên cao, có thể sản xuất với số lượng lớn,
chi phí thấp, thực hiện đơn giản, thời gian nhanh, không bị ảnh hưởng bởi vị trí gắn gen
đích trong tế bào thực vật và có thể tiến hành biểu hiện trong các mô đã biệt hóa hoàn
toàn như mô lá. Với sự hiểu rõ về cấu trúc phân tử hệ gen và tính kháng nguyên của virus
PRRS gây bệnh lợn tai xanh và các thành tựu đạt được về biểu hiện, sản xuất vaccine tiểu
đơn vị trong thực vật phòng chống bệnh virus là căn cứ để chúng tôi thực hiện đề tài luận án
này.
Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Chủng vi khuẩn
Chủng Escherichia coli DH5α; A. tumefaciens C58C1; chủng A. tumefaciens C58C1 mang
vector pIBT-35S-2bCMV/ pIBT-35S-HC-Pro PVY.
2.1.2. Các vector và vật liệu thực vật, động vật
Vector nhân dòng pRTRA chứa đoạn promoter 35S và đoạn 100xELP (pRTRA 35S-H5Histag-Cmyc-100xELP) (Scheller và đồng tác giả, 2006; Hoang, 2012). Vector pCB301Kan (Xiang et al., 1999); Plasmid pGEM-PRRS (VN07196) mang gen m và gp5 phân lập từ
virus PRRS chủng Việt Nam; vector pBSK mang đoạn gen gp5opt (gp5 optimize) đã được
tối ưu mã di truyền. Cây thuốc lá Nicotiana benthamiana; Chuột bạch chủng BALB/C; Lợn
con 20 ngày tuổi; tế bào MARC -145 và chủng virus PRRS 07196.


2.1.3. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu
Cặp mồi nhân gen gp5opt là GP5-optimize-BamHI F và GP5-optimize-BamHI R; cặp
mồi nhân gen gp5ecto-m là GP5ecto- NcoI-F và GP5ecto- pspOMI-R, M-pspOMI-F và MBamHI-R; cặp mồi nhân gen m là M-BamHI-F và M-BamHI-R; cặp mồi giải trình tự vector
là 35S-SQF và 35S-Term.

2.1.4. Hóa chất
Kit tách chiết plasmid, kit thôi gel và kit tinh sạch DNA (QIAGEN), thang DNA 1 Kb,
thang protein (Fermentas), các loại enzyme cắt giới hạn của Fermentas. Các hoá chất Yeast
extract, Agarose, Trypton, v.v. các loại kháng sinh kanamycin, rifamycine và các hóa
chất thông dụng khác của các hãng Merck, Sigma,v.v. Kháng thể kháng Cmyc, kháng thể
anti-mouse IgG cộng hợp HRP (Promega - USA), kháng nguyên scFv (50 ng/µl), kháng thể
rabit anti-pig IgG cộng hợp Peroxidase, hóa chất hiện màu TMB, DAB, kit hiện phim
(Thermo Scientific), Protein (H5-pII)3 v.v.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nhân dòng gen m, gp5opt và gp5ecto-m và ghép nối vào vector pRTRA
Đoạn gen m và gp5ecto-m được nhân dòng bằng PCR sử dụng khuôn là plasmid pGEMPRRS (VN07196) và đoạn gen gp5opt được nhân dòng từ khuôn là plasmid pBSK mang
gen gp5opt với các mồi đặc hiệu tương ứng. Thành phần phản ứng PCR bao gồm 0,3 μM
primer, 0,2 μM dNTPs, 2,5U Pwo SuperYield DNA polymerase, 5 μl đệm 10X Pwo
SuperYield PC, 20 ng DNA khuôn trong tổng số 50 µl hỗn hợp. Chu trình nhiệt như sau:
940C/ 3 phút; 32 chu kỳ với 940C/ 30 giây, 550C/ 50 giây, 720C/ 1 phút; tiếp đó là 720C/ 10
phút và sản phẩm được giữ ở 40C. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8%, sau
đó được tinh sạch và xử lý với enzyme cắt giới hạn đã được thiết kế để ghép nối vào
plasmid pRTRA 35S-Histag-Cmyc-100xELP và biến nạp vào E. coli theo phương pháp sốc
nhiệt của Sambrook và đtg (2012).
Khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp được chọn lọc trên môi trường LB đặc bổ sung kháng
sinh 50 mg/l kanamycin. Vector tái tổ hợp được tách chiết từ các khuẩn lạc dương tính
(Colony-PCR) được giải trình tự và phân tích kiểm tra tính chính xác bằng phần mềm
BioEdit 7.0 và Lasergen 7 (DNAstarinc, Madison, WI, USA).
2.2.2. Thiết kế cấu trúc vector pCB301 mang gen m/ gp5opt/ gp5ecto-m
Vector nhân dòng pRTRA tái tổ hợp mang gen m, gp5opt và gp5ecto-m và vector
pCB301 cùng được phân cắt bằng enzyme HindIII. Các sản phẩm cắt từ vector pRTRA bao
gồm 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP; 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-100xELP; 35S-gp5ecto-mHistag-Cmyc-100xELP và được ghép nối vào vector pCB301 sử dụng T4 DNA ligase và
được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt (Sambrook et
al., 2012). Việc chọn các dòng khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp được thực hiện trên môi
trường LB đặc có chứa 50 mg/l kanamycin và bằng phản ứng Colony-PCR. Các vector tái tổ

hợp pCB301 mang gen m/ gp5opt/gp5ecto-m, được tách chiết từ các dòng khuẩn lạc dương
tính và kiểm tra bằng phản ứng cắt với enzyme giới hạn HindIII và NcoI. Các vector chuyển
gen sau đó được biến nạp vào chủng A. tumefaciens C58C1 bằng phương pháp xung điện.
Tách chiết và tinh sạch plasmid: Plasmid được tách chiết theo phương pháp của
Sambrook và cộng sự (2012). Sử dụng bộ Kit do hãng Fermentas cung cấp để tinh sạch
plasmid. Phương pháp xử lý DNA bằng enzyme cắt giới hạn: Thành phần phản ứng cắt được
thực hiện theo sự hướng dẫn của hãng sản xuất bộ Kit sử dụng enzyme.
2.2.3. Biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp trong lá thuốc lá


2.2.3.1. Chuẩn bị dịch khuẩn
Chủng A. tumefaciens mang vector pCB301 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP hoặc
pCB301 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-100xELP hoặc pCB301 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc100xELP và chủng A. tumefaciens C58C1 mang vector pIBT-35S-2bCMV hoặc vector
pIBT-35S-HC-Pro PVY được nuôi trong môi trường YEB có bổ sung kháng sinh, nuôi lắc
200 v/ph, 12-18h ở 280C cho đến khi mật độ vi khuẩn OD 600 đạt 0,5 - 1,0. Vi khuẩn được
thu nhận sau khi ly tâm dịch nuôi ở tốc độ 5.000 v/ph trong 15 phút. Cặn khuẩn của 2 chủng
được hòa tan trong đệm MES tới OD600 = 0,5 để dùng cho biến nạp. Dịch khuẩn có thể dùng
riêng rẽ hay trộn với nhau theo tỷ lệ 1:1, tùy theo mục đích của thí nghiệm.
2.2.3.2. Phương pháp biến nạp gen đích vào lá cây thuốc lá
Quá trình biến nạp được tiến hành với cây thuốc lá trồng từ 3 - 8 tuần. Cây được úp
ngược và nhấn chìm toàn bộ phần lá vào bình chứa dịch khuẩn đã được chuẩn bị ở trên, tiếp
theo chuyển hệ thống này vào bình hút chân không. Áp suất bình hút chân không được
chỉnh tới tới 27 inches Hg, hút trong 1,5 phút, sau đó giảm áp suất bình về áp suất không khí
và mở nắp. Các cây thuốc lá sau khi biến nạp được tiếp tục nuôi và chăm sóc trong buồng
sinh trưởng.
2.2.4. Đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện biểu hiện gen tạm thời đến mức độ biểu hiện
protein tái tổ hợp trong lá cây thuốc lá
2.2.4.1. Đánh giá ảnh hưởng của vector hỗ trợ biểu hiện gen
Để đánh giá ảnh hưởng của vector hỗ trợ đến mức độ biểu hiện của các gen m, gp5opt
và gp5ecto-m trong lá thuốc lá, dịch A. tumefaciens mang vector pCB301 chứa gen m/

gp5opt/ gp5ecto-m được lây nhiễm vào lá hoặc dịch vi khuẩn này kết hợp với dịch A.
tumefaciens mang vector hỗ trợ pIBT-35S-2bCMV/ pIBT-35S-HC-Pro PVY, với lệ dịch
(1:1) (xâm nhiễm kép). Mẫu lá được thu sau 3, 4, 5, 6 ngày sau biến nạp, tách chiết protein
tổng số để đánh giá mức độ biểu hiện của gen chuyển. Mức độ biểu hiện gen chuyển được
đánh giá bằng phương pháp lai Western blot sử dụng kháng thể kháng Cmyc.
2.2.4.2. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ acetosyringone
Thí nghiệm được bố trí với dịch A. tumefaciens mang vector chuyển gen mục tiêu và A.
tumefaciens chứa vector pIBT-35S-HC-Pro PVY, không được bổ sung AS và bổ sung AS
với nồng độ 450 µM và 600 µM.
2.2.4.3. Đánh giá ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn dùng cho biến nạp
Thí nghiệm đánh giá mật độ khuẩn được tiến hành với với dịch khuẩn có giá trị OD 600 từ
0,2; 0,5; 1,0 (gồm chủng A. tumefaciens mang vector chuyển gen mục tiêu và chủng A.
tumefaciens mang vector hỗ trợ pIBT-35S-HC-Pro PVY, lượng dịch 2 lít với tỷ lệ 1:1) và bổ
sung AS ở nồng độ 450 µM).
2.2.4.4. Đánh giá ảnh hưởng của tuổi của lá được xâm nhiễm
Thí nghiệm: Lá non gồm các lá thứ 1, 2, 3 từ ngọn xuống; lá bánh tẻ gồm những lá tại
vị trí chính giữa của thân cây; lá già gồm những lá 1, 2, 3 từ gốc lên.
2.2.4.5. Đánh giá ảnh hưởng của tuổi cây
Cây thuốc lá 3, 4, 5, 6, 7 và 8 tuần tuổi; các lá non và lá bánh tẻ được cho xâm nhiễm
với dịch khuẩn (gồm chủng A. tumefaciens mang vector chuyển gen mục tiêu và chủng A.
tumefaciens mang vector pIBT-35S-HC-Pro PVY, OD600 = 0,5) với nồng độ AS 450 µM.


2.2.5. Tách chiết và xác định nồng độ protein tổng số
Protein tổng số từ mẫu lá được tách chiết bằng dịch chiết PBS và bảo quản ở -20 oC.
Hàm lượng protein tổng số được đo ở bước sóng 595 nm theo phương pháp của Bradford
(1976) với đường chuẩn được xây dựng dựa vào protein BSA chuẩn đã biết trước nồng độ.
2.2.6. Điện di SDS-PAGE và lai Western blot
Protein hòa tan tổng số được phân tách trên gel polyacrylamide (10%) theo phương pháp
của Laemmli (1970).

Sau khi điện di protein tổng số trên gel SDS-PAGE, sau đó được chuyển lên màng
nitrocellulose bằng máy chuyển màng ở 25V, 1.3A trong 20 phút. Màng chứa kháng
nguyên được phủ bằng sữa tách bơ 5% (pha trong dung dịch PBS 0,05% Tween) trong
5h; màng được ủ với kháng thể kháng Cmyc qua đêm; sau đó, màng được ủ với kháng
thể 2 anti-mouse IgG có gắn HRP (đối với mẫu huyết thanh chuột) hoặc anti-pig IgG gắn
peroxidase (đối với các mẫu huyết thanh lợn). Phát hiện sự có mặt của kháng nguyên tái
tổ hợp bằng cách ngâm màng lai trong dung dịch hiện màu có chứa cơ chất DAB trong
15 phút (Phan, 2012).
2.2.7. Tinh sạch protein M, GP5 và GP5ectoM
2.2.7. 1. Tối ưu nồng độ PEG trong quá trình thu nhận protein đích
Thí nghiệm: PEG 8000 được bổ sung ở dải nồng độ (2% - 10%) vào 2 ml dịch chiết lá
thực vật chuyển gen. Dịch chiết lá sau đó được ly tâm ở 13.000 v/p, trong 30 phút, ở 4 oC.
Protein dịch được biến tính và kiểm tra mức độ thu nhận protein đích bằng lai Western blot.
2.2.7.2. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng phương pháp mITC
Protein tái tổ hợp gắn ELP được tinh sạch bằng phương pháp mITC theo phương pháp của
Phan, 2012.
2.2.7.2. Phương pháp tính hiệu suất thu hồi protein tinh sạch
Tính hiệu suất thu hồi protein tinh sạch dựa sử dụng protein chuẩn (ScFv-cmyc) đã biết
trước hàm lượng và đo bằng phương pháp Bradford.
2.2.8. Phương pháp đánh giá tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên tái tổ hợp trên động
vật thí nghiệm
2.2.8.1. Gây miễn dịch trên chuột
Kháng nguyên tái tổ hợp sau khi tinh sạch được sử dụng để gây miễn dịch trên chuột bạch 6
tuần tuổi với hàm lượng 5 µg/con chuột. Kháng nguyên được trộn đều, đồng nhất với chất bổ trợ
với tỷ lệ 1:1. Chuột được chia làm 5 nhóm. Nhóm 1: Tiêm vaccine PRRS nhược độc (đối
chứng dương); nhóm 2: Tiêm PBS (đối chứng âm), nhóm 3: Tiêm kháng nguyên M-ELP;
nhóm 4: Tiêm kháng nguyên GP5-ELP; nhóm 5: Tiêm kháng nguyên GP5ectoM-ELP.
Nhóm 1 được tiêm vaccine PRRS nhược độc chủng Hanvet 1.VN một lần duy nhất. Các
nhóm 2, 3, 4, 5 được tiêm nhắc lại 3 lần. Mẫu máu được lấy để chiết huyết thanh tại ba thời
điểm: Ngày 0 (Trước khi tiêm), 21 và 35. Phân tích huyết thanh chuột sau 2 lần tiêm và sau

3 lần tiêm bằng ELISA và Western blot.
2.2.8.2. Gây miễn dịch trên lợn
Lợn con 3 tuần tuổi khỏe mạnh, âm tính với kháng thể kháng PRRSV được chia thành
bốn nhóm, mỗi nhóm 3 con lợn. Nhóm 1: Tiêm vaccine PRRS nhược độc chủng Hanvet
1.VN; nhóm 2: Tiêm dịch chiết lá thuốc lá không chuyển gen (WT); nhóm 3: Tiêm dịch
chiết thô chứa protein GP5-ELP (150 µg/ml); nhóm 4: Tiêm dịch chiết thô chứa protein
GP5ectoM-ELP (150 µg/ml). Nhóm 1 được tiêm vaccine PRRS nhược độc một lần duy
nhất. Các nhóm 2, 3 và 4 được tiêm nhắc lại 3 lần: ngày 0, 14 và 28.


2.2.8.3. Xác định kháng thể kháng GP5-ELP và GP5ectoM-ELP trong huyết thanh lợn
Mẫu máu của lợn được lấy để chiết huyết thanh tại bốn thời điểm: Ngày 0, 14, 28, 35 và
49. Các huyết thanh chiết từ các mẫu máu của lợn thí nghiệm được sử dụng với vai trò là
kháng thể 1 cho việc xác định kháng thể IgG đặc hiệu bằng ELISA, Western blot và phản
ứng IPMA. Tất cả các huyết thanh lợn đã được pha loãng 20 lần. Khả năng sản sinh kháng
thể IgG đặc hiệu của từng loại kháng nguyên tương ứng được tính toán sau lần tiêm thứ 2 và
thứ 3.
Phương pháp ELISA: Để kiểm tra các kháng thể có mặt trong huyết thanh chuột/lợn, sử
dụng các phiến ELISA giám sát dịch tễ huyết thanh học của PRRS đã được gắn sẵn các
kháng nguyên của PRRSV tự nhiên. Tiếp theo đĩa được phủ với huyết thanh (đã được pha
loãng 100 lần), trong 2 giờ; rửa đĩa 5 lần với PBS 1X; phủ đĩa với kháng thể anti-mouse
IgG có gắn HRP (kháng thể 2) với độ pha loãng 500 lần, trong 2 giờ; rửa lại bằng dung dịch
PBS 1X 5 lần. Đĩa được hiện màu trong dung dịch hiện màu có chứa cơ chất TMB, 15 phút,
sản phẩm phản ứng cho màu xanh, sau đó cố định màu bằng HCl 1N, màu của phản ứng
được đo ở bước sóng 450 nm.
Phương pháp Western blot: Phản ứng lai Western được thực hiện như mục 2.2.6.2 với
thay đổi kháng thể thứ nhất được dùng trong trường hợp này là kháng thể trong huyết thanh
của chuột/lợn.
Lai miễn dịch chéo: Phản ứng Western blot được thực hiện với kháng nguyên tái tổ hợp;
kháng thể sơ cấp là kháng huyết thanh của nhóm chuột/lợn được tiêm vaccine PRRS nhược

độc chủng Hanvet 1.VN; kháng thể thứ cấp là anti-mouse IgG gắn HRP (Đối với huyết
thanh chuột)/ anti-pig IgG gắn peroxidase (Đối với huyết thanh lợn).
Phương pháp miễn dịch có gắn enzyme trên thảm tế bào một lớp (IPMA): Phương
pháp thực hiện theo tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-21:2014 về Bệnh động vật.
Xử lý và phân tích thống kê kết quả thực nghiệm: Phân tích thống kê được thực hiện trên
chương trình Ecxel sử dụng phương pháp Student’ t-test p ≤ 0,05 là có ý nghĩa thống kê.
2.3. Địa điểm nghiên cứu: Phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Phòng thí nghiệm trọng điểm
Công nghệ gen, Phòng thử nghiệm sinh học - Viện Công nghệ sinh học và Trung tâm chẩn
đoán thú y TƯ.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen m, gp5, gp5ecto-m và tạo chủng
Agrobacterium mang vector
3.1.1. Vector pCB301 mang gen mã hoá kháng nguyên M dung hợp Elastin like
-polypeptide (M-ELP)
3.1.1.1. Tạo vector pRTRA 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP
Gen m (528 bp) được khuếch bằng PCR và ghép nối thành công vào vector pRTRA tạo
thành vector tái tổ hợp pRTRA 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP; sau đó vector được biến nạp
tế bào E. coli. Kết quả đã được kiểm tra bằng kỹ thuật colony-PCR và bằng cắt enzyme giới
hạn (Hình 3.1). Vector pRTRA 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP và vector chuyển gen
pCB301 được xử lý bằng cùng HindIII; sản phẩm thu được là: Đoạn DNA gồm cấu trúc
35S-m-Histag-Cmyc-100xELP có kích thước khoảng 3,0 kb và khung vector pCB301 mở
vòng có kích thước khoảng 5,5 kb.


Hình 3.1. Tao vector tách dòng pRTRA 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP. (A): Sản phẩm PCR
nhân gen m; (B): Sản phẩm colony-PCR chọn dòng vi khuẩn; (C): Sản phẩm cắt pRTRA tái
tổ hợp bằng BamHI.3.1.1.2. Thiết kế vector pCB301 35S- m-Histag-Cmyc-100xELP
Khung vector pCB301 được ghép nối với cấu trúc cassette 35S-m-Histag-Cmyc100xELP tạo vector chuyển gen pCB301 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP. Kết quả kiểm tra

bằng kỹ thuật colony-PCR và bằng cắt enzyme giới hạn (3.2) cho thấy đã thiết kế thành
công vector pCB301 mang cassette 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP đảo chiều với cassete
gen chọn lọc (Nos pro-nptIII-Nos ter). Vector chuyển gen có cassette đảo chiều này được
dùng để biến nạp vào A. tumefacines phục vụ cho thí nghiệm biểu hiện tạm thời.

Hình 3.2. Kết quả thiết kế vector pCB301 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP. (A): Vector
chuyển gen pCB301 tái tổ hợp được cắt bằng HindIII; (B): Vector pCB301 tái tổ hợp cắt
bằng NcoI; (C): Sơ đồ vector pCB301 mang cassette 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP đảo
chiều với cassete Nos pro-nptIII-Nos ter.
Vector chuyển gen pCB301 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP được biến nạp vào chủng A.
tumefaciens C58C1. Kết quả đã tạo thành công chủng A. tumefaciens C58C1 mang vector
chuyển gen pCB301 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP.
3.1.2. Vector chuyển gen mã hoá kháng nguyên GP5-ELP
3.1.2.1. Tạo vector pRTRA 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-100xELP
Gen gp5opt (510 bp) được khuếch đại bằng PCR và ghép nối vào vector pRTRA; sau đó
vector được biến nạp tế bào E. coli.

Hình 3.3. Thiết kế vector tách dòng pRTRA 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-100xELP. (A): PCR
nhân gen gp5opt; (B): Sản phẩm colony-PCR chọn dòng vi khuẩn mang pRTRA tái tổ hợp;
(C): Sản phẩm cắt pRTRA tái tổ hợp bằng BamHI.
Kết quả được kiểm tra bằng kỹ thuật colony-PCR và bằng cắt enzyme giới hạn cho thấy đã
tạo thành công pRTRA 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-100xELP (Hình 3.3).


3.1.2.2. Thiết kế vector pCB301 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-100xELP
Kết quả đã thiết kế thành công vector pCB301có cassette gen 35S-gp5opt-Histag-Cmyc100xELP đảo chiều so với cassette gen NOS pro-nptIII-NOS ter (Hình 3.4).

Hình 3.4. Kết quả thiết kế vector chuyển gen pCB301 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-100xELP.
(A): Vector chuyển gen pCB301 tái tổ hợp được cắt bằng HindIII; (B): Vector pCB301 tái tổ
hợp cắt bằng NcoI; (C): Sơ đồ vector pCB301 mang cassette 35S-gp5opt-Histag-Cmyc100xELP đảo chiều.

Đã tạo được chủng A. tumefaciens C58C1 mang vector pCB301 35S-gp5opt-HistagCmyc-100xELP. Kết quả được kiểm tra bằng kỹ thuật Colony – PCR.
3.1.3. Vector chuyển gen mã hoá hỗn hợp kháng nguyên GP5ectoM-ELP
3.1.3.1. Tạo vector pRTRA 35S- gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP
Đoạn gen gp5ecto (192 bp) mã hóa cho một đoạn protein GP5 vùng ngoại bào (GP5
ectodomain) và gen m (528 bp) mã hóa protein M được khuếch đại đơn lẻ bằng phản
ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu tương ứng. Sản phẩm PCR nhân gen gp5ecto được cắt
bằng NcoI và pspOMI; sản phẩm PCR nhân gen m được cắt bằng pspOMI và BamHI và
đồng thời cắt vector pRTRA 35S-Histag-Cmyc-100xELP bằng NcoI và BamHI; sau đó,
ghép nối 3 sản phẩm cắt này với nhau đã tạo được vector tái tổ hợp pRTRA 35Sgp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP (Hình 3.5).

Hình 3.5. Thiết kế vector nhân dòng pRTRA 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP.
3.1.3.2. Thiết kế vector chuyển gen pCB301 35S-gp5ecto-m -Histag-Cmyc-100xELP
Kết quả cắt vector pRTRA-35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP và vector pCB301
bằng HindIII, sau đó ghép nối cassette 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP với khung
vector pCB301 mở vòng đã tạo được vector pCB301 mang cassette 35S-gp5ecto-mHistag-Cmyc-100xELP đảo chiều so với cassett e gen kháng kháng sinh (NOS pro-nptIIINOS ter) (Hình 3.6). Đã tạo được chủng A. tumefaciens C58C1 mang vector pCB301 35Sgp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP. Kết quả được kiểm tra bằng kỹ thuật Colony – PCR.


Hình 3.6. Kết quả phân tích kiểm tra vector pCB301 mang gen gp5ecto-m mã hóa kháng
nguyên GP5ecto-M dung hợp ELP.
3.2. Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên M, GP5,
GP5ectoM dung hợp ELP trong cây thuốc lá
3.2.1. Ảnh hưởng của vector hỗ trợ đến sự biểu hiện tạm thời các gen mã hoá các kháng
nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP
Kết quả cho thấy, vector hỗ trợ pIBT-35S-HC-Pro PVY mang gen mã hóa protein HcPro PVY hỗ trợ tăng cường biểu hiện kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ecto-M tốt
hơn so vector hỗ trợ pIBT-35S-2bCMV mang gen mã hóa protein 2b CMV (Hình 3.7). Vì
vậy, Hc-Pro PVY được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.

Hình 3.7. Ảnh hưởng của vector hỗ trợ pIBT-35S-2bCMV và pIBT-35S-HC-Pro PVY đến
mức độ biểu hiẹn kháng nguyên tái tổ hợp thông qua kế quả lai Western sử dụng kháng thể
kháng Cmyc.

3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến sự biểu hiện tạm thời các gen mã hoá các kháng
nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP
Thí nghiệm với 2 nồng độ AS là 450 µM và 600 µM; kết quả cho thấy sử dụng nồng độ
AS 450 µM là phù hợp nhất cho biểu hiện tạm thời của các gen mã hoá các protein tái tổ
hợp ở lá thuốc lá (Hình 3.8).


Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến sự biểu hiẹn của các gen mã hóa các protein tái
tổ hợp được xác định bằng lai Western blot sử dụng kháng thể kháng Cmyc.
3.2.3. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến sự biểu hiện tạm thời các gen mã hoá các
protein tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP

Hình 3.9. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn (OD600) đến sự biểu hiẹn tạm thời của các gen mã
hoá các kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP được xác định bằng lai Western.
Thí nghiệm biến nạp được tiến hành với dịch khuẩn có các giá trị OD 600 là 0,2; 0,5 và 1,0.
Kết quả thu được cho thấy mật độ vi khuẩn với giá trị OD 600 = 0,5 là phù hợp nhất cho biểu
hiẹn tạm thời các gen mã hoá các protein tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELPở
lá thuốc lá (Hình 3.9).
3.2.4. Ảnh hưởng của tuổi sinh lý của lá đến sự biểu hiện tạm thời các gen mã hoá các
protein tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP
Kết quả thu được cho thấy tuổi sinh lý của lá ảnh hưởng rõ rệt đến hiểu quả biểu hiện gen tạm
thời. Lá non và lá bánh tẻ là thích hợp nhất cho biểu hiện của các gen mã hóa các kháng nguyên
M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP tái tổ hợp.

Hình 3.10. Ảnh hưởng của tuổi sinh lý của lá đến biểu hiện tạm thời các gen mã hoá cho
các protein tái tổ hợp được xác định bằng lai Western blot.
3.2.5. Ảnh hưởng của tuổi cây đến sự biểu hiện tạm thời các gen mã hoá các protein tái
tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP
Kết quả thu được cho thấy, cây thuốc lá ở 4 - 6 tuần tuổi là thích hợp để sử dụng cho biểu
hiện tạm thời các gen mã hóa các kháng nguyên nghiên cứu.

Hình 3.11. Ảnh hưởng của tuổi cây đến sự biểu hiẹn tạm thời các gen mã hóa các
protein tái tổ hợp được xác định bằng lai Western blot.
3.2.6. So sánh mức độ biểu hiện các gen mã hoá các protein tái tổ hợp (M-ELP, GP5ELP, GP5ectoM-ELP) trong điều kiện đã được tối ưu

Hình 3.12. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiẹn tạm thời các gen mã hoá các kháng nguyên
tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP bằng lai miễn dịch dựa vào protein chuẩn
đã được định lượng H5-pII.
Kết quả phân tích cho thấy mức độ biểu hiện của các protein tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP
và GP5ectoM-ELP, tương ứng là 0,75%; 0,48% và 0,95 % protein hòa tan tổng số, tương
ứng là 52,4 mg/kg; 35 mg/kg và 66,8 mg/kg lá tươi (Hình 3.12).
3.3. Tinh sạch protein tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP
3.3.1. Tối ưu nồng độ PEG 8000 cho quá trình tinh sạch
Nồng độ 6% PEG 8000 bổ sung vào dịch chiết thực vật trong quá trình tinh sạch kháng
nguyên M-ELP là tốt nhất (Hình 3.13).

Hình 3.13. Kết quả tối ưu nồng độ PEG 8000 cho tinh sạch kháng nguyên MELP.
Kết quả cho thấy, nồng độ 8% PEG 8000 bổ sung vào dịch chiết thực vật trong quá trình
tinh sạch kháng nguyên GP5-ELP là tốt nhất (Hình 3.14).

Hình 3.14. Kết quả
tối ưu nồng độ
PEG 8000 cho tinh
sạch kháng nguyên GP5-ELP.


Nồng độ 8% PEG 8000 bổ sung vào dịch chiết thực vật trong quá trình tinh sạch kháng
nguyên GP5ectoM-ELP là tốt nhất (Hình 3.15).

Hình 3.15. Kết quả tối ưu nồng độ PEG8000 cho tinh sạch kháng nguyên GP5ectoM-ELP.
3.3.2. Tinh sạch protein tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP bằng phương
pháp mITC
3.3.2.1. Tinh sạch protein M-ELP

Hình 3.16. Đánh giá sự tinh sạch của protein M-ELP bằng SDS-PAGE và lai miễn dịch. A,
B: 1: Dịch chiết thô trước xử lý; 2: Dịch chảy qua màng; 3: Protein M-ELP tách rửa khỏi
màng; (C): Protein M-ELP thu nhận được sau khi tinh sạch.
Kết quả thu được cho thấy, đã tinh sạch thành công protein M-ELP tái tổ hợp (66 kDa)
bằng phương pháp mITC có độ tinh sạch cao (Hình 3.16).
Định lượng protein thu nhận được bằng phương pháp đo Bradford, lai miễn dịch và phần
mềm Image J, cho thấy đã tinh sạch và thu nhận đúng protein M-ELP (hình 3.17) với hiệu
suất thu hồi là 86,5%, mức độ tinh sạch là 82,1%.

Hình 3.17. Định lượng protein tái tổ hợp M-ELP bằng lai miễn dịch. ScFV-Cmyc (đối
chứng dương) được đưa vào giếng với các nồng độ 50, 100, 150, 200 ng/giếng.
3.4.2.2. Tinh sạch protein tái tổ hợp GP5-ELP
Kết quả thu được cho thấy, đã tinh sạch thành công protein GP5-ELP tái tổ hợp bằng
phương pháp mITC có độ tinh sạch cao (Hình 3.18). Hiệu suất thu hồi protein GP5-ELP là
98%, mức độ tinh sạch là 81,1%.

1

2

3

4

5

6


Hình 3.18. Đánh giá sự tinh sạch của protein GP5-ELP bằng lai Western blot và điẹn di
SDS-PAGE.

Hình 3.19. Định lượng protein tái tổ hợp GP5-ELP bằng lai Western blot và hàm lượng
ScFV-Cmyc.
3.4.2.3. Tinh sạch protein tái tổ hợp GP5ectoM-ELP
Kết quả thu được cho thấy, đã tinh sạch thành công protein GP5ectoM-ELP tái tổ hợp
bằng phương pháp mITC có độ tinh sạch cao (Hình 3.20). Hiệu suất thu hồi protein GP5ELP là 95%, mức độ tinh sạch là 98%.

Hình 3.20. Đánh giá sự tinh sạch của protein GP5ectoM-ELP bằng lai Western blot và điẹn
di SDS-PAGE.

Hình 3.21. Định lượng protein tái tổ hợp GP5ectoM-ELP bằng lai Western blot và ScFV.
3.5. Tính sinh miễn dịch dịch thể của các kháng nguyên tái tổ hợp trên động vật thí
nghiệm
3.5.1. Xác định kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột
3.5.1.1. Khả năng kích thích tạo kháng thể IgG đặc hiẹu của kháng M-ELP


Hình 3.22. Xác định kháng thể IgG đặc hiẹu kháng PRRSV trong huyết thanh chuột được
tiêm M-ELP bằng ELISA; Giá trị ELISA trung bình của huyết thanh chuột có độ lệch chuẩn
được thể hiện ở từng chấm đen. Một chấm đen là giá trị ELISA của một con chuột. Thanh
ngang là giá trị trung bình của nhóm chuột (3 con chuột/nhóm) (*: P≤0.05).
Kết quả cho thấy, kháng nguyên M-ELP tái tổ hợp được tạo ra có khả năng kích thích phản
ứng miễn dịch, sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trên chuột sau 2 lần tiêm
phát hiện bằng ELISA (Hình 3.22) và sau 3 lần tiêm phát hiện bằng lai Western blot (Hình

3.23).

Hình 3.23. Kết quả Western blot xác định kháng thể IgG đặc hiẹu kháng M-ELP trong huyết
thanh chuột. A: Lai miễn dịch chéo, kháng nguyên là M-ELP, kháng thể sơ cấp là huyết thanh
thu từ nhóm được tiêm vaccine PRRS nhược độc, kháng thể thứ cấp là anti-mouse IgG gắn
HRP, B và C: Sau 2, 3 lần tiêm M-ELP và PBS.
3.5.1.2. Khả năng tạo kháng thể đặc hiẹu IgG của kháng nguyên GP5-ELP
Kết quả cho thấy, kháng nguyên GP5-ELP tái tổ hợp được tạo ra có khả năng kích thích
phản ứng miễn dịch, sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trên chuột sau 2 lần
tiêm phát hiện bằng ELISA (Hình 3.24) và lai Western blot (Hình 3.25).

Hình 3.24. Xác định kháng thể IgG đặc hiẹu kháng PRRSV trong huyết thanh chuột
được tiêm GP5-ELP bằng kỹ thuật ELISA.

Hình 3.25. Kết quả Western blot xác định kháng thể IgG đặc hiẹu kháng GP5-ELP trong
huyết thanh chuột.
3.5.1.3. Xác định kháng thể IgG đặc hiẹu kháng nguyên GP5ectoM-ELP


Kết quả cho thấy, kháng nguyên GP5ectoM-ELP tái tổ hợp được tạo ra có khả năng kích
thích phản ứng miễn dịch, sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột sau 2 lần tiêm phát
hiện bằng ELISA (Hình 3.25) và lai Western blot (Hình 3.27).

Hình 3.26. Xác định kháng thể IgG đặc hiẹu kháng PRRSV trong huyết thanh chuột
được tiêm GP5ectoM-ELP bằng kỹ thuật ELISA.
Từ kết quả phát hiện kháng thể kháng PRRSV bằng ELISA và Western blot trong huyết
thanh chuột, cho thấy 3 loại kháng nguyên có khả năng kích thích hình thành kháng thể IgG
đặc hiệu trên chuột.

Hình 3.27. Kết quả Western blot xác định kháng thể IgG đặc hiẹu kháng GP5ectoM-ELP trong

huyết thanh chuột.
3.5.2. Gây miễn dịch trên lợn
Dựa trên các kết quả đạt được trên chuột, hai loại kháng nguyên là GP5-ELP và
GP5ectoM-ELP được lựa chọn để tiếp tục đánh giá tính sinh miễn dịch trên lợn. Kháng
nguyên GP5-ELP và GP5ectoM-ELP được định lượng bằng lai Western blot dựa vào
protein chuẩn đã được định lượng (H5-pII)3 bằng kháng thể kháng Cmyc (Hình 3.28). Từ
kết quả định lượng này, hai loại kháng nguyên được chuẩn về nồng độ 150 µg/ml mỗi loại
và gây miễn dịch cho lợn thí nghiệm.

Hình 3.28. Kết quả định lượng các protein GP5-ELP, GP5ectoM-ELP bằng lai Western
blot dựa vào protein chuẩn đã được định lượng (H5-pII)3 bằng kháng thể kháng Cmyc.


3.5.2.1. Xác định kháng thể IgG đặc hiẹu kháng GP5-ELP

Hình 3.29. Xác định kháng thể IgG đặc hiẹu kháng PRRSV trong huyết thanh của lợn được
tiêm GP5-ELP bằng phản ứng ELISA.
Kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trong huyết thanh lợn được phân tích ở ngày thứ
28 (sau 2 lần tiêm kháng nguyên) và ngày thứ 35 (sau 3 lần tiêm kháng nguyên) được xác
định bằng phản ứng ELISA (Hình 3.32) và lai Western blot (Hình 3.29). Giá trị ELISA phân
tích huyết thanh của nhóm chuột được tiêm GP5-ELP là thấp hơn so với vaccine PRRS
nhược độc trên lợn. Ở nhóm lợn đối chứng âm WT không phát hiện được kháng thể IgG
đặc hiệu kháng PRRSV.

Hình 3.30. Kết quả lai Western blot xác định kháng thể IgG đặc hiẹu kháng GP5-ELP
trong huyết thanh của lợn.
3.5.2.2. Xác định kháng thể IgG đặc hiẹu kháng GP5ectoM-ELP

Hình 3.31. Xác định kháng thể IgG đặc hiẹu kháng PRRSV trong huyết thanh lợn được
tiêm GP5ectoM-ELP bằng ELISA

Phản ứng ELISA cho kết quả dương tính với kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV ở
các mẫu huyết thanh của nhóm lợn được tiêm dịch chiết thực vật chứa protein GP5ectoMELP và vaccine PRRS nhược độc (Hình 3.31).


Hình 3.32. Xác định kháng thể IgG đặc hiẹu kháng GP5ectoM-ELP trong huyết thanh lợn
bằng lai Western blot.
3.5.2.3. Xác định kháng thể đặc hiẹu trong huyết thanh lợn bằng phương pháp miễn dịch
một lớp (IPMA)

Hình 3.33. Xác định kháng thể IgG đặc hiẹu kháng GP5-ELP, GP5ectoM-ELP và vaccine
PRRS nhược độc bằng xét nghiẹm miễn dịch đơn lớp (IPMA). Các tế bào bị nhiễm PRRSV
được ủ với huyết thanh đã được pha loãng. Các kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV gắn
với tế bào bị nhiễm virus và được phát hiện qua IPMA, sử dụng các kháng thể Rabit antipig IgG cộng hợp peroxidase là kháng thể thứ cấp; Đối với GP5-ELP, GP5ectoM-ELP và
WT: Tiêm vào các ngày 0, 14 và 28; Đối với vaccine PRRS nhược độc tiêm 1 lần duy nhất
vào ngày 0; Huyết thanh của tất cả các nhóm thu vào các ngày 0, 14, 28, 35 và 49 sau khi tiêm chủng.
Phân tích huyết thanh của các lô lợn thí nghiệm được tiêm vaccine PRRS nhược độc và
2 loại protein tái tổ hợp GP5-ELP, GP5ectoM-ELP bằng IPMA đều cho kết quả dương tính
với kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV. Huyết thanh của nhóm lợn được tiêm dịch chiết
lá thuốc lá WT, cho kết quả âm tính (Hình 3.33). Từ kết quả phát hiện kháng thể đặc hiệu
kháng PRRSV bằng phản ứng ELISA và kháng thể kháng GP5-ELP, GP5ectoM-ELP bằng
lai Western blot, cho thấy kháng nguyên GP5-ELP, GP5ectoM-ELP có khả năng kích thích
hình thành kháng thể đặc hiệu IgG kháng GP5 và GP5ectoM của PRRSV trên lợn.


Hình 3.34. Phát hiẹn IgG đặc hiẹu kháng PRRSV bằng xét nghiẹm miễn dịch đơn lớp
(IPMA). Các tế bào bị nhiễm PRRSV được ủ với huyết thanh đã được pha loãng. Các
kháng thể IgG đặc hiệu PRRSV gắn với tế bào bị nhiễm virus và được phát hiện qua
IPMA, sử dụng các kháng thể Rabit anti-pig IgG cộng hợp peroxidase là kháng thể thứ cấp.
(A): Kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trong huyết thanh của nhóm lợn được tiêm
vaccine PRRS nhược độc; (B): Kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trong huyết thanh

của nhóm lợn được tiêm GP5-ELP; (C): Kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trong
huyết thanh của nhóm lợn được tiêm GP5ectoM-ELP, (D): Huyết thanh của nhóm lợn được
tiêm WT - âm tính với kháng thể kháng PRRSV.
Kết quả xét nghiệm IPMA cho thấy lợn được gây miễn dịch bởi 2 loại kháng nguyên
tái tổ hợp nghiên cứu đều cho hiệu giá kháng thể cao. Hiệu giá kháng thể trong huyết thanh
của nhóm lợn được tiêm GP5ectoM-ELP là cao hơn so với nhóm được tiêm GP5-ELP và
nhóm tiêm vaccine ở hầu hết các thời điểm phân tích huyết thanh, đạt giá trị cao nhất
(2560) sau 35 ngày và duy trì ổn định ở ngày 49. Ở thời điểm 49 ngày sau gây miễn dịch,
hiệu giá kháng thể ở tất cả lợn con thí nghiệm đều đạt giá trị ngang bằng vaccine PRRS
nhược độc thương mại. Kết quả đạt được cho thấy các protein tái tổ hợp GP5-ELP và
GP5ectoM-ELP của PRRSV được biểu hiện trong mô lá thuốc lá bằng phương pháp biểu
hiện gen tạm thời nhờ A. tumefaciens, có hoạt tính sinh học, giữ nguyên được tính kháng
nguyên liên quan đến GP5 và M của chủng PRRSV ban đầu. Protein tái tổ hợp GP5ELP, đặc biệt là GP5ectoM-ELP là hai ứng viên tốt cho các nghiên cứu phát triển sản
xuất vaccine phòng bệnh lợn tai xanh.
Chương 3
BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thiết kế và biểu hiện tạm thời gen gp5opt, m mã
hoá cho kháng nguyên GP5 và M của PRRSV, gen gp5ecto-m mã hoá cho vùng ngoại bào
của kháng nguyên GP5 (GP5 ectodomain) liên kết với kháng nguyên M của PRRSV, dung
hợp với ELP nhằm biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp ở mức cao trong tế bào thực vật
(pCB301 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP, pCB301 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-100xELP,
pCB301 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP). Kết quả của nghiên cứu này đã biểu
hiện tạm thời thành công kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP trong lá
thuốc lá N. benthamiana bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium với hàm lượng
khá cao (protein M-ELP là 52,4 mg/kg lá tươi, GP5-ELP là 35 mg/kg lá tươi và GP5ectoMELP là 66,8 mg/kg lá tươi). Kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu biểu hiện tạm thời
protein huỳnh quang xanh (GFP) dung hợp với đầu C của protein GP5 (GP5C-GFP) nhờ
virus vector dựa vào Pepino mosaic virus (PepMV) đạt 37,29 mg/kg lá tươi. Vector tái tổ
hợp dựa vào virus khảm dưa chuột Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV) biểu
hiện các epitope trung hoà của GP5 đạt 35,84 mg/kg lá dưa chuột tươi bằng phương pháp

thẩm lọc nhờ Agrobacterium Tran (2017); biểu hiện tạm thời protein GP5 ở lá thuốc lá N.
benthamiana đạt 5 mg/kg lá tươi (Cordis, 2015). Ngược lại, các protein GP5 và M khi biểu
hiện trong cây chuyển lại đạt rất thấp, như biểu hiện protein GP5 trong cây thuốc lá N.
tabacum chuyển gen chỉ đạt 110 ng/g lá tươi (Chia et al., 2010); biểu hiện protein LTB GP5 trong cây thuốc lá chuyển gen chỉ đạt 155 ng/g lá tươi (Chia et al., 2011); biểu hiện của
protein GP5 trong cây khoai tây chuyển gen chỉ đạt 2,5 – 4,7 µg/g lá tươi và 0,8 – 1,2 µg/g
ở củ khoai tây (Chen and Liu, 2011), và mức độ biểu hiện protein GP5 trong cây chuối
chuyển gen đạt từ 157 - 257 ng/g lá tươi (Chan et al., 2013). Như vậy, mức độ biểu hiện của
protein M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP trong nghiên cứu của chúng tôi bằng phương
pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium ở lá thuốc lá N. benthamiana là cao hơn đáng kể so với


biểu hiện tạm thời nhờ vector virus thực vật hoặc trong cây chuyển gen. Nguyên nhân dẫn
đến mức độ biểu hiện protein M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP khá cao, có thể do các
protein M, GP5 và GP5ectoM được dung hợp với ELP làm giảm mức độ nhạy cảm của
protein dung hợp ELP đối với các protease thực vật (Zhang et al., 1996) hoặc giảm khả
năng bị thủy phân (Raucher và Chilkoti, 2001). Floss và cộng sự (2007) đã sử dụng phương
pháp tương tự và đề xuất rằng việc sử dụng chiến lược dung hợp ELP có thể tăng cường sự
biểu hiện của kháng thể trung hòa HIV biểu hiện trong hạt. Protein HA của virus cúm gia
cầm H5N1 dung hợp với ELP được tích luỹ trong cây thuốc lá chuyển gen là 0,5% - 1%
protein hoà tan tổng số (TSP) (Phan et al., 2013). Trong khi protein HA không gắn ELP tích
luỹ trong cây thuốc lá chuyển gen chỉ đạt 0,04% TSP của lá. Lợi ích của việc dung hợp ELP
cũng đã được ghi nhận đối với kháng nguyên HIV-1 (Floss et al., 2008, 2009), Ngoài ra,
Các gen mã hoá protein mục tiêu được thiết kế dưới sự điều khiển của promoter 35S CaMV
là promorter cơ định và biểu hiện mạnh, có thể liên tục biểu hiện gen đích trong các mô thực
vật khác nhau, ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau ở mọi không gian và thời gian
(Beihaghi et al., 2018). Do đó, các gen mã hoá protein M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoMELP dưới sự điều khiển bởi promoter 35S CaMV đã được biểu hiện liên tục ở các mô đã
biệt hoá như lá thuốc lá N. Benthamiana. Promoter điều khiển được xem như là một trong
những yếu tố quyết định đến mức độ biểu hiện gen và hàm lượng protein đích. Đây có thể
cũng là một trong những yếu tố giúp tăng cường mức độ biểu hiện 3 loại kháng nguyên
quan tâm. Mặt khác, có thể do trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng vector hỗ trợ mang

gen mã hóa protein Hc-Pro của virus khoai tây PVY là những protein gây ức chế sự câm
lặng RNA (Du et al., 2008; Ye et al., 2009).
Từ các kết quả biểu hiện, sinh tổng hợp protein trong lá thuốc lá cho thấy, biểu hiện
tạm thời chỉ biểu hiện protein trong các mô đã biệt hoá, không tạo ra cây chuyển gen nên
không gặp phải những vấn đề về pháp lý đối với cây chuyển gen (An toàn sinh học, các vấn
đề về môi trường sinh thái đối với cây chuyển gen: Ảnh hưởng đến hệ sinh thái trong đất,
phát tán nguồn gen...). Quy trình thực hiện đơn giản, giá thành cho sản xuất thấp, có thể sản
xuất lượng protein mong muốn trong thời gian ngắn. Mức độ biểu hiện cao rất quan trọng.
Có thể chỉ cần một lượng sinh khối lá nhỏ có thể đã đáp ứng được nhiều liều vaccine. Trong
khi cây chuyển gen biểu hiện protein rất thấp, tinh sạch cũng khó khăn đối với các phần
thân, rễ. Đối với phương pháp biểu hiện tạm thời, để duy trì nguyên liệu cho sản xuất
vaccine thế hệ mới bằng phương pháp này chỉ cần lưu giữ các trình tự vector đã được thiết
kế thành công (hoặc các chủng Agrobacterium mang vector tương ứng). Đây cũng là những
ưu điểm trong sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp.
Kết quả gây miễn dịch trên chuột bạch với ba loại kháng nguyên nghiên cứu đều có
khả năng kích thích đáp ứng kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột. Từ kết quả phân tích huyết
thanh chuột bằng ELISA và Western blot cho thấy cả ba loại kháng nguyên nghiên cứu đều
kích thích hệ miễn dịch của chuột tạo kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV tự nhiên.
Trong đó, kháng thể kháng M-ELP xuất hiện muộn nhất, sau 2 lần tiêm. Kháng thể này đã
không được phát hiện thông qua lai Western, mặc dù đã được phát hiện bằng ELISA. Trong
khi kháng thể đặc hiệu IgG kháng GP5-ELP và GP5ectoM-ELP đã được phát hiện bằng
ELISA và Western blot ở tất cả các thời điểm phân tích huyết thanh. Điều này chứng tỏ
trong huyết thanh của chuột sau hai lần tiêm kháng nguyên M-ELP có thể đã xuất hiện
kháng thể đặc hiệu IgG kháng M-ELP nhưng ở một mức độ quá nhỏ, chưa thể phát hiện trên
màng lai.. Kháng nguyên GP5ectoM-ELP cho khả năng kích thích tạo kháng thể đặc hiệu
tốt nhất trên chuột trong 3 loại protein nghiên cứu. Tương tự, nghiên cứu của Piron và
cộng sự (2014) cho thấy chuột được tiêm protein GP5 tinh sạch biểu hiện trong hạt
Arabidopsis đã kích thích sản sinh kháng thể đặc hiệu kháng GP5 trong huyết thanh; nghiên

cứu của Jiang và cộng sự (2006), chuột tiêm kháng nguyên GP5 và M biểu hiện từ virus
vector adenovirus có hàm lượng kháng thể đặc hiệu cao hơn đáng kể so với chuột chỉ được
tiêm vector biểu hiện GP5 hoặc M riêng lẻ. Trong nghiên cứu của chúng tôi, việc tạo ra
kháng nguyên tái tổ hợp GP5ectoM-ELP là sự kết hợp của epitope quan trọng của kháng
nguyên GP5 và kháng nguyên M tạo ra protein dạng heterodimers đã giúp kích thích hệ
miễn dịch sản sinh kháng thể đặc hiệu tốt hơn protein M-ELP hoặc GP5-ELP riêng lẻ trên
chuột. Chính vì vậy, chúng tôi chỉ lựa chọn GP5-ELP và GP5ectoM-ELP để tiếp tục gây miễn
dịch trên lợn.
Hiệu giá kháng thể kháng PRRSV trong huyết thanh của lợn được xác định bằng
phản ứng IPMA
Theo Jiang và cộng sự (2006), sau các kết quả đánh giá bước đầu về tính sinh miễn dịch
của vaccine DNA biểu hiện GP5, M và GP5-M trên chuột, tính sinh miễn dịch của pCIORF5/ORF6 (GP5-M) được tiếp tục đánh giá ở lợn con (vật chủ tự nhiên). Tất cả lợn con được
tiêm chủng đều sản sinh kháng thể trung hòa sau 10 tuần kể từ khi tiêm mũi đầu tiên, trong khi
không có kháng thể trung hòa có thể phát hiện được ở lợn con được tiêm với pCI-ORF5 (GP5
riêng lẻ). Những kết quả này chỉ ra rằng sự hình thành các phân tử protein dị hợp GP5-M có thể
liên quan đến sự biến đổi sau phiên dịch và vận chuyển GP5 và có thể đóng một vai trò quan
trọng trong phản ứng miễn dịch chống lại nhiễm PRRSV. Quan trọng hơn, sự đồng biểu hiện của
GP5 và protein M tạo thành heterodimers có thể cải thiện đáng kể tính sinh miễn dịch của vaccine
DNA. Sự kết hợp này có thể được sử dụng như một chiến lược để phát triển vaccine chống lại
PRRSV (Jiang et al., 2006). Trong nghiên cứu của chúng tôi, qua các kết quả gây miễn dịch trên
lợn, xác định hiệu giá kháng thể đặc hiệu kháng PRRSV trong huyết thanh lợn bằng IPMA, cho
thấy hai loại kháng nguyên tái tổ hợp GP5-ELP và GP5ectoM-ELP đều gây ra đáp ứng miễn dịch
dịch thể, kích thích sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu với hiệu giá kháng thể cao trên lợn. Trong đó,
kháng nguyên GP5ectoM-ELP có khả năng kích thích hệ miễn dịch dịch thể với hàm lượng
kháng thể tạo thành cao hơn so với kháng nguyên GP5-ELP trong cùng một điều kiện nghiên
cứu. Như vậy, sự dung hợp gen gp5ecto và m tạo thành gen gp5ecto-m mã hoá kháng nguyên
dạng heterodimers GP5ectoM trong các tế bào thực vật, dẫn đến làm tăng khả năng kích thích
miễn dịch với hàm lượng kháng thể cao hơn hẳn so với GP5-ELP và vaccine PRRS nhược độc
ngay sau một lần tiêm kháng nguyên (Ngày thứ 14 sau mũi tiêm 1). Điều này có thể là do sự
dung hợp của protein GP5 miền ngoài (GP5 ectodomain) với protein M làm tăng tính “cồng

kềnh” và phức tạp của phân tử kháng nguyên dẫn đến làm tăng khả năng kích thích sự hình thành
kháng thể trong đáp ứng miễn dịch chống lại PRRSV, gây đáp ứng miễn dịch tốt hơn so với
protein GP5 riêng lẻ. Kháng nguyên tái tổ hợp GP5ectoM-ELP chứa những quyết định kháng
nguyên quan trọng (epitope) quan trọng trong việc kích thích hình thành kháng thể đặc hiệu của
GP5 và toàn bộ phân tử protein M. Ngoài ra, GP5ectoM-ELP chứa đuôi ELP, tuy nhiên ELP đã
được chứng minh là không ảnh hưởng đến tính sinh miễn dịch của các protein mục tiêu khi được
dung hợp cùng ELP (Phan et al., 2012). Như vậy, việc kết hợp với protein M cũng có thể là một
trong những lý do giúp cho phân tử GP5ectoM-ELP có khả năng kích thích đáp ứng kháng thể
đặc hiệu tốt. Mặc dù trong nghiên cứu này, kháng thể trung hoà chưa được xác định nhưng từ các
kết quả thu được thông qua việc xác định hiệu giá kháng thể bằng IPMA, cũng đã cho thấy khả
năng kích thích tạo kháng thể đặc hiệu kháng PRRSV ở các con lợn là khá tốt. Trong đó,
GP5ectoM có khả năng kích thích tạo kháng thể đặc hiệu kháng PRRSV tốt hơn so với GP5
(Nhanh hơn, hàm lượng kháng thể cao hơn).
Các hướng nghiên cứu trên thực vật nhằm tạo cây/củ ăn được phòng PRRS chưa cho hiệu
quả như mong muốn. Mặt khác, việc kích thích hệ miễn dịch tạo kháng thể của protein tái tổ hợp
qua đường miệng cũng có thể bị giảm hiệu quả do sự phân cắt của các protease trong niêm mạc
miệng, hệ tiêu hoá dẫn đến làm giảm hàm lượng kháng nguyên hoặc thay đổi cấu trúc của kháng