Chế tạo và đánh giá hiệu quả hình thành phức hợp oxytocin PEG để làm thuốc bằng các phương pháp hóa sinh

Contents
ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN..........................................................................................................................2
1.1.

TỔNG QUAN VỀ PROTEIN.......................................................................................................2

1.2.

OXYTOCIN....................................................................................................................................4

1.2.1.

Đặc điểm cấu tạo của Oxytocin. [5].....................................................................................4

1.2.2.

Tính chất hóa lý của Oxytocin [5], [6].................................................................................5

1.2.3.

Sự tổng hợp Oxytocin trong cơ thể người..............................................................................5

1.2.4.

Tác dụng dược lý của oxytocin.............................................................................................6

1.3. PHƯƠNG PHÁP TĂNG ĐỘ BỀN OXYTOCIN..........................................................................................7
1.3.1. Tạo ra các chất có cấu trúc tương tự với Oxytocin: carbetocin và desamino-oxytocin..............7
1.3.2. Kỹ thuật liên kết vào cầu nối disulfide trên oxytocin...................................................................8
1.3.3. Tạo hệ đệm chứa ion kim loại.......................................................................................................9

1.3.4. Bột khô công thức.......................................................................................................................10
1.3.5.
1.4.

Các phương pháp liên hợp với Oxytocin..........................................................................10

PHƯƠNG PHÁP PEGYL HÓA.................................................................................................10

1.4.1. Polyethylen glycol........................................................................................................................11
1.4.2. Đại cương về phương pháp pegyl hóa protein dược dụng..........................................................11
1.4.3. Pegyl hóa Oxytocin......................................................................................................................14
1.5.

CÁC NGHIÊN CỨU PEGYL HÓA CÁC PROTEIN VÀ OXYTOCIN...............................18

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM......................................................................20
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ...........................................................................................................20
2.1.1. Nguyên vật liệu............................................................................................................................20
2.1.2. Dụng cụ máy móc........................................................................................................................21
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU.....................................................................................................................21
2.3. PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM..........................................................................................................22
2.3.1. Tiến hành gắn PEG vào phân tử Oxytocin..................................................................................22
2.3.2. Xác định sự có mặt của hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG bằng phương pháp điện di ....23
2.3.3. Sử dụng phương pháp sắc ký lọc gel để sơ bộ đánh giá hiệu quả hình thành và tinh chế hợp
chất liên hợp Oxytocin-PEG..................................................................................................................24
2.3.4. Phương pháp định lượng Oxytocin và hợp chất liên hợp...........................................................26


CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU..............................................................................................................28
3.1. LIÊN HỢP mPEG aldehyd VỚI OXYTOCIN VÀ ĐÁNH GIÁ TỶ LỆ HÌNH THÀNH HỢP CHẤT LIÊN HỢP..28

3.1.1. Tổng hợp Oxytocin-PEG.............................................................................................................28
3.1.2. Kết quả điện di.............................................................................................................................28
3.1.3. Xây dựng phương trình tương quan giữa logarit khối lượng phân tử protein và thể tích rửa giải
(Ve) trong sắc ký lọc gel........................................................................................................................29
3.1.4. Xác định khối lượng phân tử hợp chất liên hợp trong phản ứng Pegyl hóa bằng sắc ký lọc gel
................................................................................................................................................................33
3.1.5. Xác định hàm lượng Oxytocin-PEG trong các mẫu phản ứng ở hai pH sau sắc ký lọc gel......35
3.2. Đánh giá ảnh hưởng của lượng mPEG aldehyd tham gia phản ứng tới tỷ lệ hợp chất Oxytocin-PEG
trong dung dịch sau sắc ký lọc gel..............................................................................................................36
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN...................................................................................................................................39
4.1.Về điều kiện của phản ứng Pegyl hóa Oxytocin.............................................................................39
4.2. Xác định khối lượng của các protein sau phản ứng liên hợp.............................................................39
4.3. Về đánh giá lượng Oxytocin-PEG trong dung dịch sau sắc ký lọc gel................................................40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................................................................42
KIẾN NGHỊ...................................................................................................................................................43


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Oxytocin là một hormone nonapeptide cyclic (Cys-Tyr-Ile-GLN-Asn-Cys-Pro-Leu-GlyNH 2 ) tiết ra từ thùy sau tuyến yên gây co thắt tử cung. Ngày nay, người ta đã tổng hợp được nó
để làm thuốc phổ biến được sử dụng trong sản khoa . Trên lâm sàng, oxytocin là thuốc lựa chọn
đầu tiên để được chỉ định để khởi phát chuyển dạ và ngăn ngừa xuất huyết tử cung .Tuy nhiên,
Oxytocin không bền đối với các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình từ sinh tổng hợp đến sử dụng
làm giảm tác dụng điều trị của thuốc. Oxytocin dễ bị tiêu hủy bởi enzym trong đường tiêu hóa,
do đó phải được bào chế dưới dạng thuốc tiêm hoặc dạng xịt mũi. Một vấn đề lớn trong sử dụng
các chế phẩm dạng lỏng chứa Oxytocin kém ổn định trong bảo quản. Đặc biệt phổ biến ở các
nước đang phát triển, ví dụ ở Châu Phi, Châu Á và Mỹ Latinh, nơi khí hậu nhiệt đới thường có
nhiệt độ ban ngày vượt quá 40 ° C nhiệt độ cao, Oxytocin mất hoạt tính sinh học . Do lợi ích
trong việc giảm tử vong mẹ liên quan đến băng huyết sau sinh, nhiều nhà khoa học trên thế giới

đã nỗ lực để phát triển ổn định công thức oxytocin.
Để khắc phục nhược điểm trên , các nhà khoa học đã tìm ra các giải pháp cho vấn đề bảo vệ cấu
trúc oxytocin. Một trong số đó là kỹ thuật pegyl hóa: gắn polyethylen glycol (PEG) vào phân tử
protein. Pegyl hóa mang lại nhiều ưu điểm cho Oxytocin như: làm tăng độ ổn định, tăng cường
tác dụng điều trị, giảm tính sinh miễn dịch của thuốc protein đối với cơ thể. Hiện nay, kỹ thuật
pegyl hóa thật sự đã chứng minh được tính ưu việt của nó, thể hiện ở số lượng chế phẩm protein
dược dụng được gắn PEG đang không ngừng tăng trên thị trường dược phẩm.
Nhằm mục đích bào chế dạng đường uống và tăng cường độ bền phân tử trong quá trình bào chế
đền bảo quản, đồng thời triển khai được kỹ thuật Pegyl hóa vào việc cải biến một số protein dược
dụng ở Việt Nam , chúng tôi tiến hành đề tài “ Chế tạo và đánh giá hiệu quả hình thành phức
hợp Oxytocin-PEG để làm thuốc bằng các phương pháp hóa sinh” với các mục tiêu sau:
1. Gắn kết được Oxytocin với polyehthylen glycol tạo phực hợp Oxytocin-PEG.
2. Xác định hiệu quả hình thành phức hợp Oxytocin-PEG.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.
TỔNG QUAN VỀ PROTEIN.
 Khái niệm


2

Protein là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là axít
amin. Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptide (gọi là chuỗi
polypeptide). Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu
trúc không gian khác nhau của protein.(1) (2)(3).
 Các bậc cấu trúc của protein
Người ta phân biệt ra 4 bậc cấu trúc của protein.1,2,3
Cấu trúc bậc một: Cấu trúc bậc một của protein thực chất là trình tự sắp xếp của các
axit amin trên chuỗi polypeptide. Cấu trúc bậc một của protein có vai trò tối quan trọng vì

trình tự các axit amin trên chuỗi polypeptide sẽ thể hiện tương tác giữa các phần trong
chuỗi polypeptide, từ đó tạo nên hình dạng lập thể của protein và do đó quyết định tính
chất cũng như vai trò của protein. Sự sai lệch trong trình tự sắp xếp của các axit amin có
thể dẫn đến sự biến đổi cấu trúc và tính chất của protein.1,2,3
Cấu trúc bậc hai: là sự sắp xếp đều đặn các chuỗi polypeptide trong không gian. Chuỗi
polypeptide thường không ở dạng thẳng mà xoắn lại tạo nên cấu trúc xoắn α và cấu trúc nếp gấp
β, được cố định bởi các liên kết hyđro giữa những axit amin ở gần nhau. Các protein sợi như
keratin, Collagen... (có trong lông, tóc, móng, sừng)gồm nhiều xoắn α, trong khi các protein cầu
có nhiều nếp gấp β hơn.1,2.
Cấu trúc bậc ba: là cấu dạng 3 chiều của toàn bộ chuỗi polypeptid. Chỉ mối tương tác
không gian giữa các gốc acid amin ở xa nhau trong mạch polypeptid, và là dạng cuộn lại trong
không gian của toàn mạch polypeptid. Cấu trúc này được ổn định nhờ các tương tác yếu: lực Van
der Walls, liên kết tĩnh điện, liên kết hydro giữa các mạch bên của các acid amin, đặc biệt là
tương tác kỵ nước của các nhóm acid amin không phân cực trong trung tâm protein. Mỗi protein
cầu có cấu trúc bậc III khác nhau tương ứng với chức năng sinh học riêng biểu hiện ở tỷ lệ phần
trăm cấu dạng α và β 1,2
Cấu trúc bậc bốn: là chỉ mối quan hệ không gian của nhiều chuỗi polypeptid kết
hợp chặt chẽ với nhau [1]. Mỗi chuỗi này gọi là một “tiểu đơn vị”. Chúng gắn với nhau
nhờ các liên kết hydro, lực Van der Walls giữa các nhóm phân bố trên bề mặt của các
chuỗi polypeptid [2]. Ví dụ: hemoglobin… Phân tử protein cấu trúc bậc IV có thể phân ly
thuận nghịch thành các tiểu đơn vị. Khi phân ly hoạt tính sinh học có thể bị thay đổi.
 Phân loại protein theo chức năng sinh học.
Loại
protein

Chức năng

Protein cấu
Cấu trúc, nâng đỡ
trúc

Protein
Enzyme

Ví dụ
Collagen và Elastin tạo nên cấu trúc sợi rất bền của mô liên
kết, dây chẳng, gân. Keratin tạo nên cấu trúc chắc của da,
lông, móng. Protein tơ nhện, tơ tằm tạo nên độ bền vững của
tơ nhện, vỏ kén

Xúc tác sinh học:
Các Enzyme thủy phân trong dạ dày phân giải thức ăn,
tăng nhanh, chọn lọc Enzyme Amylase trong nước bọt phân giải tinh bột chín,


3

Protein
Hormone

các phản ứng sinh
hóa

Enzyme Pepsin phân giải Protein, Enzyme Lipase phân giải
Lipid

Điều hòa các hoạt
động sinh lý

Hormone Insulin và Glucagon do tế bào đảo tụy thuộc tuyến
tụy tiết ra có tác dụng điều hòa hàm lượng đường Glucose

trong máu động vật có xương sống

Huyết sắc tố Hemoglobin có chứa trong hồng cầu động vật
Protein vận
Vận chuyển các chất có xương sống có vai trò vận chuyển Oxy từ phổi theo máu
chuyển
đi nuôi các tế bào
Tham gia vào chức
Protein vận
năng vận động của
động
tế bào và cơ thể
Protein thụ
quan

Protein dự
trữ

Actinin, Myosin có vai trò vận động cơ. Tubulin có vai trò
vận động lông, roi của các sinh vật đơn bào

Cảm nhận, đáp ứng
các kích thích của
môi trường

Thụ quan màng của tế bào thần kinh khác tiết ra (chất trung
gian thần kinh) và truyền tín hiệu

Dự trữ chất dinh
dưỡng

Albumin lòng trắng trứng là nguồn cung cấp axit amin cho
phôi phát triển. Casein trong sữa mẹ là nguồn cung cấp Acid
Amin cho con. Trong hạt cây có chứa nguồn protein dự trữ
cần cho hạt nảy mầm

Bảng 1.1: Phân loại protein theo chức năng.
 Một số tính chất hóa lý của protein
-

Sự biến tính của protein

Dưới tác dụng của các tác nhân vật lý như tia cực tím, sóng siêu âm, khuấy cơ học... hay tác
nhân hóa học như axit, kiềm mạnh, muối kim loại nặng,... gây phá hủy hoàn toàn cấu trúc không
gian (các liên kết bên trong phân tử trừ liên kết peptid) và làm giảm hay mất những tính chất ban
đầu của protein (tính chất lý hóa, độ tan và tính chất sinh học) .Đó là hiện tượng biến tính
protein. Ví dụ: Albumin trứng bị đông vón ở nhiệt độ cao và không thể hòa tan trở lại khi làm
lạnh [1].
Trong những điều kiện nhất định, protein bị biến tính có thể trở về trạng thái ban đầu tùy
theo mức độ. Hiện tượng đó được gọi là sự biến tính thuận nghịch [1].
-

Tính lưỡng tính:

Trong phân tử protein chứa các gốc aa acid (Glu, Asp) mang điện âm và các gốc aa kiềm
(Lys, Arg, His) mang điện dương. Điện tích của protein phụ thuộc vào pH của môi trường. Ở một


4

pH nào đó mà tổng điện tích âm và điện tích dương bằng không ,gọi là pI (điểm đẳng điện)
protein trung hòa về điện ,dễ dàng kết tụ vào nhau và không di chuyển trong điện trường. Mỗi
protein có một pI đặc trưng nên có thể tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp bằng điện di trong
huyết thanh [2].
-

Tính chất hòa tan và kết tủa:

Protein có khả năng hòa tan trong dung dịch muối loãng.Protein dạng sợi tan trong
dung dịch muối đậm đặc.Albumin tan được cả trong nước. Khi hòa tan, protein tạo thành các
dung dịch keo do protein có lớp áo nước bao quanh và do protein mang điện tích cùng dấu nên
đẩy nhau. Khi làm mất 2 yếu tố hòa tan trên, protein sẽ tích tụ lại và gây tủa [4].
Một số phản ứng hóa học của protein.
1.2.

OXYTOCIN
1.2.1. Đặc điểm cấu tạo của Oxytocin. [5]
Oxytocin là một peptid gồm 9 aminoacid (một nonapeptide ) trong chuỗi cysteine-

tyrosine-isoleucine-glutamine-asparagine-cysteine-proline-leucine-glycine-amit
, có một cầu nối disulfide nối các
phân tử cysteine có công thức phân tử C43H66N12O12S2, khối lượng phân tử là 1007,193 Da.

Hình 1.2.1. Công trúc không gian của oxytocin
Với cấu trúc của protein bậc I, phân tử Oxytocin có chứa các liên kết peptid của
các acid amin và một cầu nối disulfur trong phân tử. Giữa các phân tử còn liên kết với
nhau bằng các liên kết hydro hay liên kết ion. Cách sắp xếp của acid amin trong chuỗi
polypeptid quyết định cấu trúc không gian và tính chất sinh học của Oxytocin.

5

Một số vị trí trên cấu trúc Oxytocin dễ bị suy thoái là các acid amin Cys1, Gln4,
Asn5 và Gly9 dễ bị oxy hóa, thủy phân trong môi trường acid, nhiệt độ và ánh sáng thông
qua sự hình thành các chất trung gian.Do các acid amin này có chứa N bậc một dễ tham
gia phản ứng hóa học và thủy phân trong môi trường phân ly và điều kiện không phù hợp
[1], [2]. Ngoài ra, liên kết disulfid Cys1-Cys6 là vị trí hay gây ra sự suy thoái, đa số các
quá trình suy thoái cấu trúc xảy ra sau khi loại bỏ liên kết ở cacbon β ở Cys 1, tạo ra
enamin N và cysteine persulfid. Tạo điều kiện cho sự hình thành trisulfid và tetrasulfid
Oxytocin hoặc thúc đẩy sự hình thành dimer Oxytocin và các sản phẩm khác [5].

Hình 1.2.1. Sự hình thành disulfid từ Oxytocin
-

1.2.2. Tính chất hóa lý của Oxytocin [5], [6].
Oxytocin là bột vô định hình trắng hoặc gần như trắng.
Dễ hút ẩm, rất dễ tan trong nước, acid acetic, butanol và ethanol.
Khi nung nóng để phân huỷ, nó phát ra hơi độc của sulfur oxid và nitric oxid.
Điểm đẳng điện của oxytocin là pI = 5,51.
Để định tính và định lượng Oxytocin dùng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

với detector UV ở 280 nm.
Thêm một số phản ứng màu của protein vào nhé
1.2.3. Sự tổng hợp Oxytocin trong cơ thể người.
Các oxytocin peptide được tổng hợp từ một protein tiền chất ‘precursor protein ’ không
-

hoạt động từ gen oxytocin [7] [8] [9] Protein tiền chất này cũng bao gồm các protein vận chuyển
oxytocin neurophysin I [10]. Protein tiền chất không hoạt động được thủy phân dần thành các
mảnh nhỏ hơn (một trong số đó là neurophysin I) thông qua một loạt các enzyme. Sự thủy phân

cuối cùng giải phóng oxytocin nonapeptide hoạt tính được xúc tác bởi peptidylglyxin alphaamidating monooxygenase[11]. Ở vùng dưới đồi, oxytocin được tạo thành trong các tế bào thần
kinh trung và được lưu trữ trong thân Herring tại các đầu cuối sợi trục ở tuyến yên sau. Sau đó
nó được đưa vào trong máu từ thùy sau của tuyến yên. Bên ngoài não, các tế bào chứa oxytocin
được tìm thấy trong một số mô bao gồm ở nữ giới trong thể vàng [12] [13] và nhau thai [14]; ở
nam giới trong tế bào kẽ hạch của Leydig [15]; và ở cả hai giới tính trong võng mạc, [16] tuyến
thượng thận, [17] tuyến ức (18) và tuyến tụy [19].


6

1.2.4. Tác dụng dược lý của oxytocin.
- Trên cơ tử cung: làm tăng co bóp cơ trơn tử cung theo nhịp, tần số và cả biên độ
co bóp sinh lý. Tính cảm thụ của cơ trơn tử cung với Oxytocin tăng dần trong suốt thời
kỳ có thai, phụ thuộc nhiều vào sự có mặt của Estrogen [20]. Receptor của Oxytocin trên
tử cung người đã được xác định. Khi gắn với Oxytocin, các receptor sẽ hoạt hóa
phospholipase C làm giải phóng Ca++ nội bào đồng thời gây khử cực kênh Ca ++ nhạy cảm
với điện thế, làm tăng nhập Ca ++ vào tế bào. Do đó, Oxytocin thể hiện tác dụng đôi là
điều hòa sự co bóp của các tế bào cơ tử cung và kích thích tế bào nội mạc, tế bào màng
rụng sản xuất prostaglandin [21]. Khi oxytocin được sử dụng với liều quá mức, kích thích
quá mức tử cung, với các cơn co cứng hoặc kéo dài, có thể dẫn đến vỡ tử cung, sẹo cổ tử
cung và rò rỉ âm đạo, xuất huyết sau sanh, lưu lượng máu tử cung bị suy giảm, thuyên tắc
nước ối, và chấn thương bào thai bao gồm xuất huyết nội sọ,các rối loạn nhịp tim khác,
tổn thương thần kinh trung ương hoặc tổn thương não, và tử vong do ngạt.
Sự co lại của tử cung: Điều quan trọng đối với sự giãn nở cổ tử cung trước khi sinh, oxytocin gây
co thắt trong giai đoạn thứ hai và thứ ba của chuyển dạ . Việc phóng thích Oxytocin trong thời
gian cho con bú gây ra những cơn co thắt nhẹ nhưng thường đau trong vài tuần đầu của chu kỳ
sữa. Điều này cũng giúp phục hồi tử cung với tác dụng làm cầm máu sau đẻ [22].
- Ở những bà mẹ đang cho con bú sữa mẹ, oxytocin hoạt động ở tuyến vú,
Oxytocin gây co giật các tế bào niêm mạc bao quanh các tuyến dẫn sữa của vú. Điều này
ép sữa từ các kênh các xoang lớn hơn, và do đó tạo điều kiện cho việc đẩy sữa. Với sự

chuyển tiếp từ vùng dưới đồi qua thần kinh cột sống đến tuyến vú sẽ làm tăng bài xuất
sữa khi trẻ sơ sinh bú. Sự kích thích gây ra ở nơron tạo Oxytocin từ các đầu cuối sợi thần
kinh thần kinh của tuyến yên [23].
- Do nó tương tự như vasopressin, nó có thể làm giảm bài tiết nước tiểu một chút. Ở
một số loài, oxytocin có thể kích thích bài tiết natri từ thận. Ở người, liều cao có thể dẫn
đến nồng độ natri thấp (hạ natri máu).
- Trên hệ tim mạch: Ở mức liều gây co bóp tử cung chưa đủ ảnh hưởng đến huyết áp. Ở
mức liều cao gây giãn mạch rõ ràng và tạm thời làm hạ huyết áp, tăng nhịp tim do phản xạ và
nóng mặt. Oxytocin và thụ thể của nó cũng được tìm thấy trong tim ở một số loài gặm nhấm, và


7

hormon này có thể đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển phôi của tim bằng cách thúc
đẩy sự khác biệt về tế bào cơ tim [24], [25]. Tuy nhiên, sự vắng mặt của Oxytocin hoặc thụ thể
của nó ở chuột nhắt không gây ra tình trạng thiếu máu tim[26].
- Chuẩn bị các nơ-ron bào thai sinh nở: Chuyển qua nhau thai, oxytocin ở người mẹ đến
não bào thai và kích hoạt chuyển đổi trong hoạt động của chất dẫn truyền thần kinh GABA từ
kích thích đến ức chế trên nơ-ron vỏ não thai nhi. Điều này sẽ làm êm dịu não bộ của thai nhi
trong thời gian sinh và giảm khả năng bị tổn thương do hypoxic [27].
- Điều chỉnh hoạt động của tuyến thượng thận - tuyến yên - thận: Oxytocin gián tiếp ức
chế sự giải phóng hormon adrenocorticotropic và cortisol, trong những trường hợp đó có thể coi
nó là một chất đối kháng của vasopressin [28].
1.3. PHƯƠNG PHÁP TĂNG ĐỘ BỀN OXYTOCIN.
1.3.1. Tạo ra các chất có cấu trúc tương tự với Oxytocin: carbetocin và desamino-oxytocin
Các chất này đã được đánh giá liên quan đến việc duy trì hoạt động tử cung trong khi tăng
cường độ ổn định [29], [30]. Các nhà khoa học đã tìm ra hai chất phổ biến là desamino-oxytocin
và carbetocin. Cả hai đều có ái lực trên cùng mộ thụ thể với Oxytocin và gây ra cơn co thắt cùng
một cơ chế. Đặc biệt thời gian bán thải trong máu của hai chất này đều cao hơn nhiều so với
Oxytocin do sự thay đổi cấu trúc [31]. Desamino-oxytocin và carbetocin khác với Oxytocin là

trong cấu trúc thiếu nhóm amino tự do ở cuối. Phân tử carbetocin cũng thay thế một trong số các
sulfur tại cầu disulfide bằng nhóm CH2.

Hình : Cấu trúc của Desamino-oxytocin và Carbetocin
Cả hai chất tương tự oxytocin này đều có thời gian bán hủy kéo dài với sự duy trì một số hoạt
động co bóp tử cung cho thấy nhóm amino trong oxytocin không cần thiết cho hoạt động sinh


8

học. Đối với carbetocin, tăng thời gian bán thải là 4- 10 lần so với oxytocin, nên chỉ dùng một
lần tiêm thay vì truyền kéo dài. Carbetocin được chấp thuận sử dụng cho y tế và thú y ở nhiều
quốc gia khác nhau [32].
1.3.2. Kỹ thuật liên kết vào cầu nối disulfide trên oxytocin
Vì vị trí chính của sự thoái hoá trên peptide là ở liên kết disulfid nên các nghiên cứu đã tạo ra các
chất tương tự oxytocin khác nhau bằng cách được thay thế bằng một phần ở liên kết này với các
nguyên tử khác. Nhằm mục đích để tránh loại bỏ liên kết trong cacbon β ở Cys 1 và vì liên kết
disulfid Cys1-Cys6 không phải là một trong những vị trí liên quan trực tiếp đến thụ thể và tác
dụng sinh học của oxytocin [33].
Điều này đã được đánh giá vào những năm 1960 và 1970, để xác định hoạt tính có duy trì nếu
một trong hai hoặc cả hai thiol trong liên kết disulfide đã được thay đổi sang thành các nhóm
CH2 như trong carbetocin . Người ta thấy rằng tác dụng sinh học vẫn được quan sát, mặc dù nó
đã được ức chế vừa phải, do đã thay đổi kích cỡ vòng của peptide. Điều này cho thấy cầu nối
disulfide không phải là một điều kiện tiên quyết cho việc duy trì hoạt động sinh học [34], [35] .
Các nghiên cứu gần đây của Alewood và các đồng nghiệp đã tập trung vào việc thay thế disulfide
bằng các cầu thioether, selenylsulfide, diselenide và ditelluride, và sự tổng hợp của nhiều chất
tương tự oxytocin có chứa các liên kết disulfid đã thay đổi (hình 3.).

Hình 1.4. Các chất tương tự oxytocin liên kết vào cầu nối disulfide của oxytocin
Kết quả nghiên cứu tác dụng trên thụ thể và sự ổn định huyết tương của các chất tương tự

Oxytocin - với sự thay thế cầu nối disulfide của Alewood cho thấy sự giảm kích thước vòng ([-


9

S]- OT) làm giảm đáng kể ái lực với thụ thể do đó làm giảm hoat động sinh học. Mặc dù việc
thay thế nguyên tử S trong cysteine với một nhóm CH2 ([CH2- S] -OT) vẫn duy trì ái lực và hoạt
tính. Việc thay thế cystein với selenocystein hoặc tellurocystein không có ảnh hưởng lớn đến
hoạt động chức năng, mặc dù giảm ái lực kết hợp 10 lần đã được quan sát khi thay thế cả hai
cystein. Đồng thời cho thấy sự ổn định trong hyết tương của con người ở nhiệt độ cao (550C)
[36], [37].
1.3.3. Tạo hệ đệm chứa ion kim loại.
Oxytocin là ổn định nhất ở pH hơi acid (pH ~ 4.5). Ở pH có tính axit cao (pH <3), peptide có thể
chịu sự thủy phân, trong khi ở pH trung tính thì Oxytocin sẽ dimer hóa hoặc trimer hóa dẫn đến
mất hoạt tính.
Nghiên cứu của Avanti đánh giá độ ổn định của oxytocin trong nước bằng cách sử dụng hệ đệm
để lưu trữ (citrate, axetat hoặc aspartate, pH 4,5) kết hợp với các ion kim loại hóa trị I (Na+, K+ )
hoặc các in kim loại hóa trị II (Ca2+, Mg2+ và Zn2+). Kết quả cho thấy rằng khi bảo quản dung
dịch có chứa Ca2+ (50 mM) và Zn2+ (2-50 mM) , sự ổn định được tăng lên từ 60 % đến 100 % ở
40C, tuy nhiệt ở nhiệt đô cao không cải thiện được. Sử dụng kim loại hóa trị II và dung dịch đệm
citrate, aspartat thì cải thiện đáng kể ở nhiệt độ cao (550C), với nồng độ ion kim loai là 2mM
[38]. Người ta chứng minh rẳng ở 700C, việc phân hủy liên kết disufid giảm từ 20% - 70 % trong
dung dịch chứa ion kim loại Zn và đệm aspartate. Các chứng minh trên cho thấy liên kết disulfid
Cys 1- Cys6 được bảo vệ ở dung dịch đệm chứa ion kim loại [39], [40], [41].
1.3.4. Bột khô công thức
Tạo ra các chế phẩm oxytocin dang bột khô với kích thước nano, bột siêu mịn để sử dụng qua
đường hô hấp hoặc đường truyền tĩnh mạch thông thường bằng phương pháp phun sấy, đông
khô, hoặc kỹ thuật tạo nano. Việc sử dụng qua đường hô hấp giúp cho việc hấp thu tốt hơn đồng
thời giải quyết sự kém bền trong dung dịch. Nghiên cứu của Mc Intosh xác định thành phần chế
phẩm gồm hỗn hợp glycine, leucine và manitol tạo ra các hạt kích thước từ 1 đến 5 . Công thức

đã chứng minh hiệu quả tương đương dạng bột khô so với peptid tự nhiên và không gây tác dụng
co bóp ở mô khí quản. Công thức này duy trì nhiệt độ thử nghiệm khá cao (500C) [42],[43].
1.3.5.

Các phương pháp liên hợp với Oxytocin.


10

Đây là phương pháp gắn Oxytocin với các đại phân tử, nhằm mục đích tăng độ bền của phân tử,
tác dụng của Oxytocin và giảm liều sử dụng oxytocin.
Cavallaro và cộng sự đã gắn kết Oxytocin vào N-succinnyl-oxytocin đã được chức năng hóa ở
amin N –cuối với α, β-poly (N-2-hydroyethyl)-DL-aspartamid-poly (ethylene glycol) 2000
( PHEA-PEG2000) kết quả tổng hợp được PHEA- PEG2000-oxytocin-succinyl. Nghiên cứu thử
nghiệm thủy phân trên in vitro cho thấy hợp chất trên ổn định ở pH 7,4 và trong huyết tương.
Đồng thời đánh giá hoạt tính sinh học trên ống nghiệm cho thấy ái lực kết hợp của oxytocin với
thụ thể cải thiện đáng kể [44].
Với hướng nghiên cứu sử dụng β-cyclodextrin, olihosaccharide cyclic liên hợp với oxytocin
bằng cách sử dụng cầu nố cacboxyl (kích hoạt bằng 1-hydrobenzotriazole và
dicyclohexylcarbodiimide). Kết quả cho thấy việc liên hợp có hiệu lực trên cơ tử cung tuy nhiên
tác dụng giảm so với oxytocin và có tác dụng phụ gây ra cơn hen. Do được sử dụng làm với các
chỉ định khác [45].
Một hướng khác của Hudnut và Cook sáng chế vào năm 2004 kết hợp Oxytocin ( một số chất
tương tự) vào vi nang poly ( lactic –co-glycolide) [46].
Như vậy, các phương pháp làm tăng độ bền vững và tác dụng của Oxytocin đang được quan
tâm nhiều và đạt được một số thành tựu nhất định ,tuy nhiên còn gặp một số nhược điểm nên
chưa được ứng dụng trong điều trị lâm sàng.
1.4. PHƯƠNG PHÁP PEGYL HÓA.
1.4.1. Polyethylen glycol.
Polyethylen glycol (PEG) là hợp chất cao phân tử có công thức cấu tạo

Hình : Công thức cấu tạo của polyethylene glycol.
Bản chất là các chuỗi ehtylen glycol, có thể chất từ lỏng đến chất rắn như sáp, nhờn như dầu.
Với trọng lượng phân tử thường từ 500 đến 20.000 Da. PEG có đặc điểm là polymer trơ, hòa tan
trong nước, không gây độc, không gây dáp ứng miễn dịch khi vào cơ thể [47], [48]. Với những


11

đặc tính quan trong này, PEG là chất lý tưởng để sử dụng trong y học và công nghệ dược phẩm
với nhiều ứng dụng khác nhau. Tuy nhiên, nếu chỉ sử dụng đơn thuần PEG trong cơ thể thì
những tính chất không được ứng dụng. Chỉ khi PEG được kết hợp với chất khác thì hiệu quả mới
được bộc lộ.
1.4.2. Đại cương về phương pháp pegyl hóa protein dược dụng.
Năm 1977, Frank Davies, Abraham Abuchowsky và các đồng nghiệp nghiên cứu sự kết hợp
PEG với albumin huyết thanh, catalase thành công đã mở ra cho khoa học thế giới một kỷ thuật
mới để bảo vệ cấu trúc protein [49]. Từ đó công nghệ Pegyl hóa được thiết lập và phát triển.
Pegyl hóa là quá trình gắn các phân tử PEG với các phân tử khác như các peptid, protein và
những đoạn kháng thể để cải thiện đặc tính và hiệu quả điều trị của thuốc [50]. Bản chất của quá
trình pegyl hóa là tạo liên kết đồng hóa trị của phân tử PEG với phân tử tham gia liên kết [ 51].

 Nguyên lý của phương pháp Pegyl hóa protein dược dụng
Quá trình pegyl hóa được quyết định bởi trung tâm ái điện tử của dẫn chất PEG. Để gắn kết PEG
với 1 phân tử, cần thiết phải hoạt hóa PEG bằng cách tạo ra các dẫn chất có một nhóm chức năng
ở một hoặc cả 2 đầu của phân tử PEG. Việc chọn nhóm chức năng dựa trên loại nhóm có khả
năng phản ứng sẵn có trên phân tử sẽ Pegyl hóa. Đối với Pegyl hóa protein, các acid amin


12

thường có khả năng phản ứng gồm: lysin, cystein, histidin, arginin, acid aspetic, acid glutamic,
serin, thronin, tyrosin, các vị trí protein dễ tham gia phản ứng là đầu N-tận (α-NH 2) và đầu C-tận
(-COOH), nhóm thiol (gốc Cys) và nhóm hydroxyl [52].
Tuy nhiên, cách thức phổ biến nhất tạo liên kết PEG-protein là hoạt hóa PEG với nhóm
chức năng thích hợp cho phản ứng với lysin (-NH 2) và đầu N-tận (α-NH2) [52], [53]. Trong
trường hợp này, PEG có thể được hoạt hóa bằng nhiều con đường biến đổi hóa học khác nhau
như hình 1.6 [54].

Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của những dẫn chất PEG hoạt hóa dùng cho phản ứng Pegyl hóa vào
nhóm amin
(a) là PEG-dichlorotriazin, (b) PEG-tresylat, (c)PEG-aldehyd, (d) PEG-succinimidyl succinat, (e)
PEG-imidazol carbonat, (f) PEG-phenyl carbonat, (g) PEG-succinimidyl carbonat, (h) PEGbenzotriazol carbonat và (i) PEG hoạt hóa kiểu ester.


13

Dẫn chất PEG hoạt hóa phản ứng với protein trong những điều kiện xác định để tạo ra
liên kết protein-PEG. Nguyên lý tổng quát của phản ứng này như sau:
R1

PH

C

HC

PEG
NH2

R3

R2

R1

P

H3C

CH

NH R3

PEG

O

Trong đó: R1 là nhóm thế, R2 là nhóm chức tham gia liên kết, R3 là liên kết.

 Ưu nhược điểm của protein được Pegyl hóa (protein-PEG)
Trong Pegyl hóa protein dược dụng, những đặc tính đặc biệt của PEG làm thay đổi một số đặc
điểm của phân tử protein như: sự thay đổi về hình thể, tính tan, sự đáp ứng miễn dịch, có thể gây
ảnh hưởng tới ái lực liên kết của thuốc với các receptor tế bào, có thể thay đổi sự hấp thu, phân
bố thuốc trong cơ thể [54]. Điều này tạo nên những ưu điểm của protein-PEG như sau:
- Các nhóm hydroxyl của PEG kéo các phân tử nước của môi trường vào hợp chất, làm tăng
quá trình solvat hóa của protein. Mặt khác, PEG còn có phần hữu cơ nên làm tăng khả năng hòa
tan của protein trong nhiều dung môi phân cực và không phân cực. Như vậy, Pegyl hóa làm tăng
độ hòa tan và tính linh động của protein trong máu và các dịch sinh lý. Do đó hiệu quả điều trị
của thuốc protein-PEG cao hơn so với sử dụng protein tự nhiên với hàm lượng tương tự [54].
- PEG làm tăng kích thước phân tử protein, giúp phân tử protein-PEG khó đi qua mao quản

thận hơn. Do vậy việc thải trừ thuốc khỏi thận bị giảm xuống, hợp chất được giữ lại trong cơ thể
lâu hơn [54], [55].
- PEG như các “cánh tay” xung quanh phân tử protein, tạo khoảng không giữa protein với
môi trường. Do đó, protein được bảo vệ tránh khỏi hiện tượng tiêu hủy do các tác nhân hóa lý
(nhiệt độ, pH…), các enzyme tiêu hóa protein, các đại thực bào và các kháng thể. Đồng thời,
tránh được sự nhận diện của hệ thống miễn dịch, do đó giảm tính sinh miễn dịch cảu protein
[55].
- Trong môi trường lỏng, một tiểu đơn vị ethylen oxid kết hợp khá bền vững với 2-3 phân tử
nước, như vậy chuỗi polymer sẽ di động và chính sự di động này làm phân tử PEG có thể tích
quét (chiếm chỗ) lớn. Thể tích quét làm cho protein Pegyl hóa tác dụng gấp 5-10 lần một protein


14

hòa tan có trọng lượng phân tử tương tự. Sự gia tăng thể tích này làm tăng cường tác dụng dược
động học và dược lực học của protein-PEG . Hợp chất PEG-thuốc làm giảm độc tính của thuốc,
giảm khả năng gây dị ứng với cơ thể, tác dụng phụ của thuốc thấp hơn. Đặc tính của thuốc được
cải thiện, hiệu quả điều trị nâng cao [54], [55].
- PEG làm tăng kích thước phân tử protein, giúp phân tử protein-PEG khó lọt qua mao quản
thận hơn. Do vậy việc thải trừ thuốc khỏi thận bị giảm xuống, hợp chất được giữ lại trong cơ thể
lâu hơn [54].
Những ưu điểm kể trên của thuốc được Pegyl hóa làm tăng hiệu quả điều trị của thuốc, làm
giảm liều dùng, tăng khoảng liều đưa thuốc vào cơ thể thuận lợi cho bệnh nhân trong quá trình
điều trị.
Hợp chất protein-PEG cũng có những nhược điểm. PEG bảo vệ cấu trúc protein, và trong
một số trường hợp nó “che kín” cả trung tâm hoạt động và vị trí kết hợp với receptor, ngăn cản
thuốc liên kết với receptor. Điều này làm giảm hoặc thậm chí mất tác dụng của thuốc. Khắc phục
nhược điểm này bằng việc điều chỉnh thay đổi vị trí Pegyl hóa ra xa phần hoạt động của protein
[54].
1.4.3. Pegyl hóa Oxytocin.

 Pegyl hóa vào đầu N-tận trong phân tử Oxytocin.
- Sử dụng dẫn chất do alkyl hóa mPEG
Dẫn chất aldehyd của PEG là dẫn chất hay sử dụng
Sự ngưng tụ của aldehyd với N-tận của protein , ban đầu thông qua sự hình thành các sản phẩm
của imin (Schiff base). Các bazơ Schiff có khả năng đảo ngược dễ dàng thành các amin bậc hai
ổn định trong dung dịch có một tác nhân khử như natri borohydrid (NaBH 4) hoặc natri
cyanoborohydrid (NaCNBH3), quá trình này được gọi là amination khử. NaCNBH 3 thường được
sử dụng hơn do làm phản ứng xảy ra nhanh hơn và có chọn lọc làm giảm hợp chất trung gian
Schiff và không làm giảm aldehyd hoặc cacbonyl ít phản ứng khác có trong dung dịch [56], [57].


15

Hình 1.8. Quá trình khử amin qua trung gian tạo bazơ Schiff
pH là yếu tố rất quan trọng trong quá trình tổng hợp, trong đó tác nhân khử imin
thành amin (NaCNBH3) tốt nhất ở pH 6,5-8,5. Mặc dù điều chỉnh pH đến điều kiện acid
nhẹ (pH 4,5) là điều kiện phản ứng thích hợp của aldehyd và amin, cho phép sự kết hợp
chọn lọc của amin đầu và cuối[58], [59].
Ngoài ra, có thể dử dụng dẫn chất PEG- tresylated, và dẫn chất PEG –epoxyd
thực hiện pegyl hóa ở nhóm amino [60].
-

Sử dụng dẫn chất do acyl hóa mPEG

Dẫn chất este của N- hydroxy succinid với các mPEG carboxylic acid (PEG-NHS)- đây là dẫn
chất tiêu biểu để pegyl hóa bằng cách este hóa gốc amin của Oxytocin. Các thuốc thử NHS este
phản ứng với các nucleophil (như amin nucleic), với việc giải phóng N-hydroxy succinimid dẫn
đến liên kết amid ổn định với peptid hoặc protein [61].

Hình 1.7. Phản ứng của NHS ester và một peptid

Phản ứng được tiến hành dưới điều kiện kiềm nhẹ chẳng hạn đệm bicarbonat pH từ 8,5 đến 9,5
và ở nhiệt độ thấp (4-250C) trong thời gian ngắn 1h.
Tuy nhiên, chất phản ứng NHS bị thủy phân nhanh trong nước dẫn đến khó khăn
trong hình thành nhóm succinimidyl ester, với thời gian bán thải giảm đáng kể khi gia
tăng pH. Bằng cách thêm một nhóm sulfonat, phản ứng xảy ra chậm, làm tăng khả năng
hòa tan trong nước, cho phép phản ứng ghép được thực hiện trong điều kiện nước tạo
Sulfonat NHS este. Cũng có báo cáo rằng thuốc thử succinimidyl có thể không phản ứng
chọn lọc với các amin, đặc biệt phản ứng với các amin acid như tyrosin, histidin và serin
[62], [63], [64].
-

Sử dụng dẫn chất acid carboxylic của PEG.


16

Sự liên kết của các nhóm carboxylat với các amin để tạo thành các liên kết amid.
Sử dụng các hợp chất carbodiimid như 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)
carbodiimid.HCl (EDC) hoặc dicyclohexylcarbodiimid (DCC) kích hoạt các nhóm
carboxyl để thay thế bằng các amin phản ứng . Phản ứng xảy ra trong pH acid làm giảm
độ bền của protein nên hiệu suất thấp cũng như ảnh hưởng tới chất lượng sản phẩm sau
phản ứng tổng hợp [65].

Hình 1.9. Liên hợp với các nhóm Cacboxylic


Pegyl hóa vào cầu nối disulfid của Oxytocin
Việc tác động vào cầu nối disulfid không phải lúc nào cũng thuận lợi để tăng lực
liên kết disulfid trong protein hoặc peptid, vì nó là yếu tố quan trọng để duy trì cấu trúc
của protein hoặc tác dụng sinh học. Gần đây đã có một số phương pháp liên hợp được

báo cáo cho phép bảo tồn được cầu nối disulfid với 2 hoặc 3 cầu disulfid cacbon và ít gây
ra những thay đổi trong cấu trúc của protein và peptid [66], [67].
- Sử dụng dibromo hoặc dithiomaleimid tạo cầu nối cacbon sulfid
Dibromomaleimid là chất để tạo phức hợp với Oxytocin tại cầu nối disulfid, bằng
cách chèn thêm một cầu nối vào disulfid [68]. Phức hợp này trong các điều kiện thử
nghiệm invitro giải phóng ra và bảo tồn cấu trúc Oxytocin. Mặt khác, phức hợp này làm
tăng độ bền của phân tử Oxytocin. Sử dụng Dibromomaleimid để Pegyl hóa là một chất
phản ứng thuận lợi nhưng khó khăn trong giải phóng disulfid từ phức hợp PEG với của
protein [69]. Phản ứng được tiến hành ở pH 7,5-8,5 . Khi ở pH cao hơn ,bên cạnh phản
ứng ở cầu nối disulfid còn xảy ra ở các amin.


17

Hình 1.10. Gắn hợp chất dibromo và dithiomaleimid tạo cầu nối cacbon sulfid
Phương pháp tạo cầu nối disulfid của Oxytocin được mở rộng khi tạo phức với
hợp chất dithiomaleimid, phản ứng xảy ra tương tự với quá trình tạo phức hợp của
dibromomaleimid với Oxytocin [70], [71].
- Phức hợp disulfid với các hợp chất asen
Phương pháp được phát triển gần đây là sử dụng các phân tử PEG có chứa asen
làm các chất kết nối với cầu disulfid. Các phản ứng dựa vào ái lực của nhóm As (III) với
các thiol tạo thành chelat khá chặt chẽ. Làm tăng lực liên kết ở cầu disulfid và tăng độ
bền phân tử Oxytocin. Đây là phương pháp thay thế cho phương pháp tạo phức với các
hợp chất cầu nối dibromo/ dithiomaleimid. Các phức hợp arsenic này đã được chứng
minh là có thể đảo ngược trong sự hiện diện của các dithiol khác để tạo chelat chéo, như
giảm lipoic acid, cho phép cơ chế giải phóng Oxytocin được dễ dàng. Tuy nhiên, tác
dụng của các hợp chất asen giải phóng trong cơ thể chưa được đánh giá [72].
- Liên hợp cầu nối ba nguyên tử cacbon Vinyl sulfon/ bis-sulfon
Vinyl sulfon là một nhóm các chất phản ứng ở các vị trí đặc biệt. Phản ứng thông
qua bổ sung vào các nhóm sulfhydryl lần lượt ở pH kiềm, tạo ra các liên kết β-thioether

ổn định [73], [74]. Năm 2006 một phương pháp chọn lọc để nhắm mục tiêu và tạo ra liên
kết giữa mạch ba carbon dựa trên các phản ứng của thiols với vinyl sulfon [75], [76].
Một chất phản ứng bis-sulfon được tổng hợp có thể được sử dụng để cải tiến
peptid tại một vị trí đặc hiệu, và đặc biệt trong trường hợp các liên kết disulfid yếu, theo
cách tương tự như dibromo/ dithiophenolmaleimides. Sau khi giảm lực liên kết disulfid
theo quy trình, việc thêm β'-monosulfon α, β không bão hòa được thực hiện với chất thiol
đầu tiên. Điều này lần lượt tạo ra một liên kết đôi thứ hai mà có thể trải qua bổ sung khác
với thiol thứ hai. Sự liên hợp này tạo ra một cây cầu ba cacbon qua vị trí của disulfid giữ
lại cấu trúc của peptid và ngăn ngừa làm mất hoạt tính của Oxytocin. Đây là một kỹ thuật
liên hợp khó thực hiện do kỹ thuật phức tạp, và khó tinh chế được hợp chất tinh khiết sau
phản ứng [77].


18

 Pegyl hóa vào đầu C-tận trong phân tử oxytocin.
Các dẫn chất của PEG phản ứng với nhóm acid carboxylic trong môi trường tác nhân kết hợp
như DCC và EDC trong điều kiện acid tạo ra liên kết amid. Hai dẫn chất thường sử dụng là dẫn
chất amin và dẫn chất hydrazid của PEG.Do phản ứng có thể xảy ra liên kết chéo với các amin
của protein. Để tránh liên kết chéo đó, người ta sử dụng dẫn chất PEG-hydrazid [78].
 Pegyl hóa vào nhóm hydroxyl trên phân tử Oxytocin.
PEG – epoxid phản ứng với nhóm hydroxyl ở môi trường kiềm (8,5- 9,5). Cầu nối được hình
thành trong khoảng 14-25h tại 4-250C [79].
Ptpu
1.5. CÁC NGHIÊN CỨU PEGYL HÓA CÁC PROTEIN VÀ OXYTOCIN.
Các nghiên cứu về PEG hóa protein đã được quan tâm từ rất lâu. Đến hiện nay, các
tác giả ngày càng quan tâm nhiều hơn lĩnh vực này đặc biệt là các ứng dụng trong nghành
Dược và sản phẩm nâng cao hiệu quả điều trị của thuốc.
Ranganath năm 2015, đã nghiên cứu so sánh tác dụng của interleukin-6 và hợp chất pegyl
hóa interleukin-6 ( Peginterleukin -6). Kết quả cho thấy Peginterleukin-6 có tác dụng của

interleukin-6 và kéo dài thời gian bán thải của thuốc ở loài gặm nhậm và khỉ [80].
Kletzl và cộng sự đã thử nghiệm năm 2017 tác dụng Insulin tái tổ hợp bằng PEG trên 62
tình nguyện viên. Kết quả cho thấy thời gian bán thải của thuốc từ 14-20 giờ, không xảy ra
hạ đường huyết sau khi sử dụng [81].
Jennifer Collins và nhóm nghiên cứu năm 2016 đã thực hiện tổng hợp pegyl hóa oxytocin
và xác định độ bền của sản phẩm trong quá trình bảo quản. Kết quả cho thấy lượng


19

Oxytocin còn lại sau 28 ngày ở 500C là 2,5 %, trong khi với hợp chất pegyl hóa thì 93,5 %
cac 86,5 % tương ứng với phức hợp Oxytocin-NHS và Oxytocin-mPEG còn lại [82].
Tại Việt Nam gần đây đã có một số nghiên cứu quan tâm đến vấn đề pegyl hóa các
protein làm tiền thuốc. Nâng cao ổn định cũng như tác dụng điều trị của thuốc.
Thầy Nguyễn Văn Rư (2017) đã nghiên cứu tổng hợp sản phẩm pegyl hóa từ Insulin tụy
lợn và mPEG-CHO với điều kiện thích hợp, xây dựng được qui trình kỹ thuật xác định hiệu
suất gắn kết sản phẩm đạt 96,9 %. Tinh chế và đông khô thu sản phẩm dạng bột. Xác định
được khối lượng phân tử sản phẩm Insulin-mPEG là 17,8 kDa, kết quả 1 phân tử mPEG
aldehyde 12,0 kDa gắn kết vào vị trí –NH2 nhạy cảm ở đầu chuỗi β của Insulin. Khảo sát
độ bền protein ở 3 môi trường là dịch nước bọt, dịch vị và dịch tụy nhân tạo., sau 3 giờ sự
thủy phân protein trong khoảng 10-25% so với sự thủy phân Insulin tự nhiên là 100% [83].
Nghiên cứu tổng hợp Oxytocin-PEG hiện chưa có nghiên cứu được thực hiện ở Việt Nam.
Các nghiên cứu trên thế giới đã thực hiện tổng hợp Oxytocin-PEG và thử nghiệm đặc tính,
độ bền trong bảo quản. Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài này.

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ
2.1.1. Nguyên vật liệu
* Nguyên liệu
- Oxytocin: dạng bột vô định hình màu trắng, độ tinh khiết trên 97%.

20

Xuất xứ: Đức (hãng sigma aldrich) Code: O6379 CAS: 50-56-6
- Methoxy polyethylene glycol propion aldehyd 5 kDa: dạng bột màu gần như
trắng, độ tinh khiết 98%.
Công thức: CH3O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-CHO
Xuất xứ: Đức (hãng sigma aldrich) Code: JKA3039
* Hóa chất
- Sodium cyanoborohydride (NaCNBH3), Acrylamid, Bis - acrylamide,
Tris(hydroxymehtyl)

aminomethan,

Sodium

dodecyl

sulfat,

Sephadex

G50,

chymotrypsin, α- amylase, pepsin, pancreatin, Alpha-lactalbumin, Chymotrypsin, Insulin,
Lactoglobulin và Cytochrome C đạt TC DĐVN4 [1] (các hóa chất nhập của hãng Sigma).
- Hydroxylamin hydrochlorid, acid acetic, ethyl acetat, aceton, toluen, acid
chlohydric, ethyl ether, natri hydrocarbonat, natri phosphat, dichloromethan, natri sulfat,
ethyl natri sulfat, dicyclohexyl carbodiimid (DCC), kali dihydrophosphat, ammonium

persulfat, dithiothreitol (DTT), glycerol, bromophenol blue, glycine, coomassie blue, acid
acetic,

methanol,

natri

dihydrophosphat

monohydrat,

tetramethylethylenediamin

(TEMED), natri hydroxyd, natri carbonat được sản xuất tại Trung Quốc.
- Cồn tuyệt đối sản xuất tại Việt Nam.
2.1.2. Dụng cụ máy móc
- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA (Đức)
- Bơm hút chân không KNF (Đức)
- Cân kỹ thuật Sartorius (Đức)
- Nồi đun cách thủy HH.11-2-II (Trung Quốc)
- Máy đo quang UV- Vis UVD 2950 (Mỹ)
- Cân phân tích Mettler Toledo AB 204S (Thụy Sỹ)
- Cột sắc ký buret 25ml


21

- Máy điện di đứng Omni PAGE Mini Wide (Anh)
- Nhiệt kế thủy ngân (Trung Quốc)
- Tủ lạnh Hitachi (Nhật Bản)

- Dụng cụ thủy tinh khô và sạch: bình cầu 1 cổ loại 25ml, 50ml, 100ml; bình cầu
2 cổ loại 50ml; bình cầu 3 cổ loại 100ml, cốc thủy tinh, đũa thủy tinh, đĩa petri, ống
nghiệm, đũa thủy tinh, …
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Tiến hành phản ứng Pegyl hóa Oxytocin ở hai môi trường pH khác nhau, xác định sản phẩm
hình thành bằng phương pháp điện di
- Xác định khối lượng phân tử hợp chất Oxytocin đã được Pegyl hóa trong phản ứng bằng
sắc ký đồ lọc gel.
- Đánh giá sự ảnh hưởng pH đến tỷ lệ hợp chất Oxytocin-PEG có trong dung dịch rửa giải
sau sắc ký lọc gel so với nguyên liệu tham gia phản ứng.
- Xác định ảnh hưởng của lượng mPEG aldehyd tham gia phản ứng đến tỷ lệ hợp chất
Oxytocin-PEG có trong dung dịch rửa giải sau sắc ký lọc gel.
2.3. PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM
2.3.1. Tiến hành gắn PEG vào phân tử Oxytocin
* Nguyên tắc: Các mPEG aldehyd liên hợp với Oxytocin tạo thành hợp chất liên
hợp polymer hóa hình lược là một base Schiff. Sự liên hợp này được thực hiện trong môi
trường đệm phosphat ở pH thích hợp. Tác nhân khử hóa NaCNBH 3 có tác dụng làm giảm
polymer trung gian Schiff, tăng hiệu suất tạo thành hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG [56],
[57].
Dựa trên nghiên cứu của Jennifer Collins sử dụng 2 phân tử mPEG (Mw = 2 kDa
& Mw = 5 kDa) của α-methoxy-ω-formylpoly (ethylene glycol) (aldehyde PEG) được
liên hợp với oxytocin với tác nhân khử của NaCNBH3 được tiến hành trong môi trường
đệm phosphate pH 7,5,ở 10 ° C qua đêm.Đã xác định được vị trí gắn mPEG aldehyd vào
nhóm -NH2 của acid amin Cystein ở vị trí số 1 [41].
* Sơ đồ phản ứng


22

Phản ứng có thể xảy ra theo nhiều khả năng. Nguyên lý chung như sau:

Hình 2.2. Nguyên tắc của phản ứng liên hợp
* Mục đích: Gắn kết được phân tử mPEG aldehyd vào phân tử Oxytocin dược
dụng.
* Tiến hành
- Điều kiện pH thích hợp cho phản ứng Pegyl hóa Oxytocin là ở: pH 4,5 thuận lợi
cho phản ứng giữa nhóm aldehyd và amin[84] và pH 7,5 là điều kiện tốt cho hoạt động
của tác nhân khử NaCNBH3[85].
- Pha các dung dịch đệm phosphat pH 4,5 và 7,5 theo dược điển Việt Nam IV
[86].
- Thực hiện phản ứng: Tỷ lệ phản ứng của Oxytocin/ mPEG aldehyd/ NaCNBH 3
là 1: 1: 4. Hòa tan 8 mg Oxytocin trong 1 ml dung dịch đệm phophat pH 4,5. Thêm 41
mg mPEG aldehyd trong 10 ml dung dịch đệm phophat pH 4,5 đã hòa tan 250 mg
NaCNBH3, khuấy đều trong 15 phút. Khuấy trộn đều hai dung dịch trên trong vòng 1 giờ
trước khi để phản ứng xảy ra ở 40C trong thời gian 24 giờ (qua một ngày đêm) .
- Tiến hành tương tự với các thành phần như phản ứng trên trong dung dịch đệm
pH 7,5.
2.3.2. Xác định sự có mặt của hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG bằng phương pháp điện di .
* Nguyên tắc:


23

Có nhiều phương pháp điện di, nhưng ở đây chúng tôi sử dụng phương pháp là
điện di trên gel polyacrylamid có sử dụng Natri dodecyl sulfat (SDS) được gọi tắt là SDS
- PAGE. Là một kỹ thuật được sử dụng để phân tách các protein dựa trên khối lượng phân
tử và tốc độ di chuyển khác nhau của chúng qua gel polyacrylamide, dưới tác dụng của
điện trường một chiều. Phương pháp này còn được gọi là phương pháp điện di không liên
tục và mẫu protein được gây biến tính. SDS là tác nhân làm biến tính và âm tính hóa
protein. Khi được xử lý bằng chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disufit là DTT

(dithiotheitol) đưa cấu trúc protein bậc 2, 3, 4 về bậc 1và làm tích điện âm cho protein.
Điều này làm cho điện tích mới của phân tử protein tỷ lệ với khối lượng phân tử của nó
[86], [87].
* Tiến hành
- Chuẩn bị các hệ đệm, gel điện di ,dung môi pha mẫu, và các thành phần đổ gel
(gel cô và gel phân tách)
- Chuẩn bị gel phân tách, tạo khuôn bản gel.
- Chuẩn bị mẫu
+ Mẫu 1: là Maker protein gồm có Oxytocin, Alpha-lactalbumin, Chymotrypsin,
Insulin, Lactoglobulin và Cytochrome C. Pha từ các chất có khối lượng nhỏ.
+ Mẫu 2: Mẫu sau phản ứng pha với dung dịch pha mẫu theo tỷ lệ 1:1.
+ Mẫu 3: Mẫu chứa 8 mg Oxytocin và 41 mg mPEG aldehyd được pha với 10 ml
dung dịch pha mẫu. Tiến hành chạy điện di ngay sau khi pha.
-Lắp khuôn gel vào độ điện di, cho dung dịch điện di vào hai buồng điện di,bơm từ 5 15μl mẫu vào giếng theo thứ tự, đậy hộp điện di, đóng điện (150 V)
- Sau khi chạy điện di Bản gel được lấy ra và nhuộm bằng phương pháp nhuộm Comassie
Brillant Blue.
2.3.3. Sử dụng phương pháp sắc ký lọc gel để sơ bộ đánh giá hiệu quả hình thành và tinh
chế hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG
* Nguyên tắc