Chế tạo và đánh giá hiệu quả hình thành phức hợp oxytocin PEG để làm thuốc bằng các phương pháp hóa sinh

Bộ Y tế
Trường Đại học Dược Hà Nội

CHẾ TẠO VÀ ĐÁNH GIÁ SỰ HÌNH THÀNH PHỨC HỢP OXYTOCINPEG BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA SINH

Người thực hiện:

Người hướng dẫn:
PGS. TS. Nguyễn Văn Rư
HVCH. Lê Quang Nghị


Nội dung
1

Đặt vấn đề

2

Nguyên liệu và phương pháp

3

4

F

Thực nghiệm và kết quả

Kết luận và đề xuất

1. Đặt vấn đề


Đặt vấn đề

Oxytocin

-

Đặc điểm cấu tạo

-

Vai trò

-

Sự kém bền phân tử

-

Dễ bị phân hủy bởi enzym trong cơ thể
Kém ổn định trong bảo quản

Phương pháp tăng độ bền ?


Phương pháp pegyl hóa

Tăng độ bền phân tử

Tăng cường tác dụng

Pegyl hóa
Giảm tính sinh miễn dịch của protein đối với cơ thể

Tăng thời gian bán thải


Mục tiêu

Gắn kết được Oxytocin với phân tử polyehthylen glycol tạo phức

1

2

hợp Oxytocin-PEG

Xác định hiệu quả hình thành phức hợp Oxytocin-PEG


2. Nguyên liệu
và phương pháp nghiên cứu


Nguyên liệu và phương pháp

Nguyên liệu

Hóa chất

Thiết bị

Oxytocin, methoxyl polyethylen glycol propion aldehyd 5kDa

Kali dihyrophosphat, ethanol, Tris(methylen, aminopersulfat, natri dodecyl
sulfat,…

Máy khuấy từ, điện di, buret, tủ lạnh, máy đo quang….


Phương pháp nghiên cứu


-

Gắn PEG vào phân tử Oxytocin

Dựa trên phản ứng khử

- Dựa trên nghiên cứu của Jenifer Collin và công sự
Đã thực hiện phản ứng liên hợp với Oxytocin với mPEG aldehyd. Xác
định vị trí gắn ở amin Cys

1.


Phương pháp nghiên cứu



Xác định sự hình thành Oxytocin-PEG bằng
phương pháp điện di

Điện di trên gel polyacrylamid có Natri dodecyl sulfat (SDS)


Phương pháp nghiên cứu



Phương pháp sắc ký lọc gel


Phương pháp nghiên cứu

 Định lượng hợp chất Oxytoicn-PEG bằng phương pháp đo quang trực tiếp
-

Chuẩn bị mẫu chuẩn: Cchuẩn= 0,02 mg/ml
Chuẩn bị mẫu thử: Gộp phân đoạn thể tích Ve
Đo quang UV ở bước sóng 280 nm
 

Nồng độ Cthử Oxytocin_PEG

Lượng hợp chất Oxytocin-PEG trong dung dịch sau sắc ký lọc gel
 

(mg)

Hiệu suất thu hồi hợp chất Oxytocin-PEG trong VR ml

 

H% =

(mg/ml)


3. Thực nghiệm và kết quả


3. Thực ngiệm và kết quả


3.1 Gắn PEG vào phân tử Oxytocin

•
•

8 mg Oxytocin
1 ml dung dịch đệm
phophat pH 4,5

•
•
•

40 mg mPEG aldehyd

Khuấy trộn trong 1 giờ trước

10 ml đệm phophat pH 4,5

khi để phản ứng xảy ra ở

250 mg NaCNBH3 khuấy 15 phút

0
4 C/24 giờ

Tiến hành tương tự dung dịch đệm pH 7,5


3.1 Gắn PEG vào phân tử Oxytocin

2 giai đoạn

-

Giai đoạn 1: ngưng tụ
Giai đoạn 2: khử hóa


3.1 Gắn PEG vào phân tử Oxytocin
Hai mẫu phản ứng cho kết quả tương tự

-

Không màu
Trong suốt.

-

Màu vàng nhạt
Trong suốt
Độ nhớt giảm


3.2 Xác định sự hình thành Oxytocin-PEG bằng điện di

1

2

3

Kết quả điện di ở pH 4.5

1

2

3

Kết quả điện di ở pH 7.5

Như vậy, trong mẫu phản ứng có có sự xuất hiện protein mới có khối lượng phân tử khoảng 6 kDa.


3.3 Tách chiết và xác định khối lượng phân tử Oxytocin-PEG

01

Vẽ pick sắc ký của Oxytocin và sản phẩm tạo thành trong quá
trình pegyl hóa

02
Xây dựng đường chuẩn về khối lượng phân tử


Kết quả rửa giải trên cột sắc ký lọc gel của

0.4

D

dung dịch Oxytocin

0.35
Oxytocin có 1 pick ở có đỉnh hấp

0.3

thụ cực đại ở V =18 ml.

0.25

0.2
0.15
0.1
0.05
0

ml
Đồ thị tương quan mật độ quang và các phân đoạn
rửa giải dung dịch Oxytocin.


Kết quả rửa giải trên cột sắc ký lọc gel của

0.35
0.3
0.25

D

mẫu phản ứng ở pH 4,5
Mẫu phản ứng xuất hiện
V e =12ml

đỉnh

pick

Ve=12ml

là

Oxytocin-PEG
Ve =18ml

0.2
0.15
0.1
0.05
0

ml

Đồ thị tương quan mật độ quang và các phân đoạn rửa giải dung dịch sau phản ứng liên hợp Oxytocin và mPEG
aldehyd ở pH 4,5.


Kết quả rửa giải trên cột sắc ký lọc gel của
mẫu phản ứng ở pH 7,5
D
0.4
Ve= 18ml

0.35

Mẫu phản ứng xuất hiện
đỉnh

0.3
0.25

Ve=12ml

pick

Ve=12ml

là

Oxytocin-PEG

0.2
0.15
0.1
0.05
0
ml
Đồ thị tương quan mật độ quang các phân đoạn rửa giải dung dịch sau phản ứng liên hợp Oxytocin và mPEG
aldehyd với pH 7,5


Nhận xét chung

Hỗn hợp sản phẩm tạo thành ở pH 4,5 và pH 7,5 đều cho thấy:
+ Có sự hình thành hợp chất Oxytocin-PEG
+ Pick sắc ký có đỉnh hấp thụ cực đại ở Ve =12ml
+ Lượng hợp chất Oxytocin-PEG nằm trong phân đoạn 9 ml -14ml


Xây dựng đường chuẩn về khối lượng phân tử

 Tiến hành:
Lọc qua cột gel các protein: Chymotrypsin, Casein, Insulin, Oxytocin đã biết khối lượng phân tử.

 Kết quả:
Protein

MW (kDa)

Log (MW)

Ve(ml)

Chymotrypsin

25

1,398

7

Casein

23,6

1,373

8

Insulin

5,78

0,762

12

Oxytocin

1,007

0,003

18


Xây dựng đường chuẩn về khối lượng phân tử

1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

logMW

f(x) = -0.13x + 2.36
R² = 1

Ve ml
6

8

10

12

14

16

18

20

Đồ thị hồi quy tuyến tính giữa logMW và Ve
Vậy MOxytocin-PEG = 6 kDa. Do đó trong phản ứng liên hợp, một phân tử mPEG aldehyd đã gắn kết với một phân
tử Oxytocin.