Thiết kế vector mang cấu trúc gen gmdreb2 nhằm phục vụ tạo cây đậu tương chuyển gen chịu hạn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

HOÀNG THỊ THU HOÀN

THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN GmDREB2
NHẰM PHỤC VỤ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG
CHUYỂN GEN CHỊU HẠN

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái nguyên, 2014


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

HOÀNG THỊ THU HOÀN

THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN GmDREB2
NHẰM PHỤC VỤ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG
CHUYỂN GEN CHỊU HẠN

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60. 42. 02. 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu

Thái Nguyên, 2014

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những nội dung trình bày trong luận văn là do tôi tm
hiểu, nghiên cứu dưới sự hướng dẫn của GS.TS Chu Hoàng Mậu và sự cộng
tác giúp đỡ của các cộng sự trong nhóm nghiên cứu. Các số liệu, kết quả
trình bày trong luận văn đã được sự đồng ý của cán bộ hướng dẫn và nhóm
nghiên cứu. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc.

Tác giả luận văn

Hoàng Thị Thu Hoàn


ii

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình
hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành bản luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn NCS Đào Xuân Tân và các thầy cô Bộ môn
Di truyền học & Sinh học hiện đại, khoa Sinh – Kỹ thuật nông nghiệp,
Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện các thí nghiệm của đề tài.
Tôi xin cảm ơn TS Lê Văn Sơn và các cán bộ Phòng Công nghệ DNA
ứng dụng, Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh
học đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Tân Trào, Tuyên
Quang đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong học tập và hoàn

thành khoá học.
Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình, bè bạn đã động viên
khuyến khích giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn.
Đề tài luận văn thuộc chương trình đào tạo nghiên cứu sinh và cao
học của Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, khoa Sinh-KTNN, trường Đại
học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên

Tác giả luận văn

Hoàng Thị Thu Hoàn


iii

MỤC LỤC
Trang
Trang bìa phụ
Lời

cam

đoan

..................................................................................................i Lời cảm ơn
......................................................................................................ii Mục lục
.........................................................................................................iii
mục

bảng

Danh

..............................................................................................iv

Danh mục hình ................................................................................................
v

Những

chữ

viết

.........................................................................................vi

tắt
MỞ

ĐẦU

....................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề ..................................................................................................
1
2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................
2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................
2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 3
1.1. CÂY ĐẬU TƯƠNG VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG.... 3
1.1.1.

Cây

đậu

tương

.............................................................................................................3

1.1.2.

Đặc

tính

chịu

............................................8

hạn

của

thực

vật

và

cây

đậu

tương

1.2. DREB VÀ GEN DREB2 ....................................................................... 13
1.2.1. Gen DREB ..................................................................................................................13
1.2.2. DREB2 và gen GmDREB2 ...................................................................................15
1.3. CHUYỂN GEN VÀ VECTOR CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT ........... 17
1.3.1. Kỹ thuật chuyển gen trực tiếp và gián tiếp ở thực vật .........................
17
1.3.2. Hệ thống vector dùng trong chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium
....... 19
Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 22


iii
2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ ............................................... 22
2.1.1.

Vật

liệu

.................................................................................................22

nghiên

2.1.2.
Hóa

chất
và
bị ..................................................................................................23
2.1.3.

Địa

điểm

...............................................................................................24

nghiên

cứu
thiết
cứu


iv
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................................... 24
2.2.1. Phân lập gen ...............................................................................................................24
2.2.1.1. Phương pháp tách chiết RNA ...........................................................................24
2.2.1.2. Phương pháp tổng hợp cDNA ..........................................................................25
2.2.1.3. Phương pháp PCR ................................................................................................26
2.2.1.4. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony – PCR) ......................27
2.2.1.5. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR..........................................................27
2.2.1.6. Phương pháp ghép nối gen đích vào
plasmid ..............................................27
2.2.1.7. Phương pháp tách chiết plasmid tái tổ hợp
..................................................28

2.2.1.8. Phương pháp xác định trình tự nucleotide của gen
...................................29

2.2.2. Phương pháp thiết kế vector

.................................................................................29

2.2.3. Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào A. tumefaciens.....................
30
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................. 31
3.1. PHÂN LẬP GEN GmDREB2 TỪ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CHỊU HẠN
DT2008................................................................................................. 31
3.1.1. Nhân bản gen GmDREB2 từ mRNA bằng kỹ thuật RT-PCR ...................31
3.1.2. Tách dòng đoạn mã hoá (cDNA) của gen GmDREB2 .................................32
3.1.3. Kết quả đọc trình tự đoạn mã hoá của gen GmDREB2 ...............................35
3.2. KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GmDREB2 ...... 38
3.2.1. Kết quả cắt plasmid pBT mang gen GmDREB2 bằng XbaI và SacI .......38
3.2.2. Kết quả cắt plasmid pBI121 bằng XbaI và SacI ............................................39
3.2.3. Tạo vector chuyển gen pBI121 mang cấu trúc GmDREB2 ........................40
3.3. KẾT QUẢ TẠO DÒNG VI KHUẨN A. tumefaciens MANG CẤU
TRÚC GEN GmDREB2 ....................................................................... 41
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................ 43
1. Kết luận .................................................................................................... 43
2. Đề nghị..................................................................................................... 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 44


4

DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Sản xuất đậu tương ở Việt Nam từ 2007 đến 2013 ......................... 7
Bảng 2.1. Trình tự cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu .................................. 23
Bảng 2.2. Thành phần cho phản ứng tổng hợp cDNA .................................. 25
Bảng 2.3. Thành phần của phản ứng PCR .................................................... 26
Bảng 2.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR .................................................. 26
Bảng 2.5. Thành phần gắn gen GmDREB2 vào vector tách dòng pBT ......... 27
Bảng 2.6. Thành phần hóa chất tách chiết plasmid .......................................
28
Bảng 3.1. Sự sai khác giữa trình tự đoạn gen GmDREB2 của giống đậu
tương DT2008 và trình tự có mã số DQ054363................................ 36
Bảng 3.2. Sự sai khác giữa trình tự amino acid của protein DREB2
(DT2008) và trình tự có mã số AAY89658 ...................................... 37


DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 2.1. Ảnh hạt của giống đậu tương DT2008 .......................................... 22
Hình 2.2. Sơ đồ cấu trúc các vector sử dụng trong nghiên cứu ..................... 23
Hình 2.3. Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen .................................................. 30
Hình 3.1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn mã hoá gen GmDREB2; ...
31
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm tinh sạch đoạn mã hoá của gen
GmDREB2 ........................................................................................ 32
Hình 3.3. Ảnh đĩa khuẩn lạc ......................................................................... 33
Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR từ khuẩn lạc mang plasmid
tái tổ hợp chứa đoạn cDNA của GmDREB2 ....................................... 34
Hình 3.5. Hình ảnh điện di kiểm tra plasmid pBT/GmDREB2 tái tổ hợp; ... 34
Hình 3.6. Sơ đồ so sánh trình tự đoạn mã hoá gen GmDREB2 của giống đậu

tương DT2008 và DQ054363............................................................. 35
Hình 3.7. Sơ đồ so sánh trình tự amino acid của protein DREB2 giữa giống
DT2008 và AAY89658 ...................................................................... 37
Hình 3.8. Ảnh điện di sản phẩm plasmid pBT/GmDREB2 được cắt bằng XbaI
và SacI ............................................................................................... 38
Hình 3.9. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm plasmid pBI121 được cắt bằng
XbaI và SacI ...................................................................................... 39
Hình 3.10. Hình điện di sản phẩm colony- PCR từ khuẩn lạc mang plasmid
pBI121/GmDREB2 tái tổ hợp............................................................. 41
Hình 3.11. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR từ vi khuẩn A. tumefaciens
mang plasmid pBI121/GmDREB2 ..................................................... 42


NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
ABA

Axit absisic

bp

Cặp base

cs

Cộng sự

C:I
DEPC

Chloroform : Isoamyl

Diethyl pyrocarbonate

DNA

Deoxyribonucleic Acid

DREB

Dehydration – Responsive Element Binding

dNTP

Deoxy Nucleotide Triphosphate

EDTA

Ethylene diamine tetra- acetic acid

E. coli

Escherichia coli

kb

Kilo base

LB

Luria Bertani

OD

Optical density

PCR

Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi

RNA

Ribonucleic Acid

TAE

Tris - Acetate - EDTA

Taq

Thermus aquaticus

v/p

vòng / phút

X-gal

5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactopyranoside


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) còn gọi là đậu nành là cây trồng
cạn ngắn ngày mang ý nghĩa chiến lược của nhiều quốc gia trên thế giới do
có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao. Hạt đậu tương chứa 30% - 56% protein,
chứa 12% - 25% lipid, chứa 36% - 40% hydrat cacbon và các loại amino acid
cần thiết cho cơ thể con người như: cystein, lysine, triptophan,
leucine, methyonine… Ngoài ra trong đậu tương còn chứa nhiều loại vitamin
(B1, B2, C, D, E, K…) là nguồn năng lượng cần thiết cho cuộc sống của con
người và động vật. Do có thời gian sinh trưởng ngắn, trong hệ rễ lại có nốt
sần mang vi khuẩn cố định nitơ không khí nên cây đậu tương thường được
trồng luân canh với lúa và ngô để tăng vụ, cải tạo đất bạc màu và bảo vệ môi
trường.
Cây đậu tương đang trở thành một trong những cây trồng quan trọng
không chỉ đối với Việt Nam mà còn ở nhiều nước trên thế giới. Sản phẩm
của nó làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc, nguyên liệu quan
trọng cho nhiều ngành công nghiệp.
Trong những năm gần đây hạn hán xảy ra thường xuyên đã tác
động xấu đến sự sinh trưởng, phát triển, làm giảm năng suất và sản lượng
cây trồng trong đó có đậu tương. Đậu tương là cây tương đối mẫn cảm với
điều kiện ngoại cảnh và thuộc vào nhóm cây chịu hạn kém, khi thiếu nước ở
các thời kì khác đều có tác động xấu, làm giảm năng suất cây đậu tương.
Đặc tính chịu hạn ở đậu tương là tính trạng đa gen mà sản phẩm
của các gen này liên quan trực tiếp đến sự biểu hiện tính chịu hạn hoặc có
chức năng điều hoà nhóm gen chịu hạn. DREB là một loại protein điều hòa


2

có chức năng kích thích hoạt động phiên mã của nhóm gen chịu hạn,
đây nhân tố


3

phiên mã đóng vai trò quan trọng trong sự biểu hiện của nhóm gen chịu hạn
khi cây đậu tương ở điều kiện cực đoan.
Vì vậy cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương trong định hướng
chọn giống chịu hạn bằng công nghệ gen đang được các nhà chọn giống
quan tâm ứng dụng. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã tiến hành
đề tài: “Thiết kế vector mang cấu trúc gen GmDREB2 nhằm phục vụ tạo cây
đậu tương chuyển gen chịu hạn”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Tạo được vector chuyển gen mang cấu trúc gen GmDREB2 phân lập từ
cây đậu tương chịu hạn và biến nạp được vào vi khuẩn Agrobacterium
tumefacien.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Tách chiết RNA tổng số và tạo cDNA. Nhân gen GmDREB2 bằng PCR với
cặp mồi đặc hiệu từ các giống đậu tương chịu hạn tốt DT2008. Tách dòng và
xác định trình tự đoạn mã hóa của gen GmDREB2;
3.2. Tạo vector chuyển gen mang gen GmDREB2. Kiểm tra vector tái tổ hợp
bằng enzym cắt giới hạn;
3.3. Tạo vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tái tổ
hợp.


4

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÂY ĐẬU TƯƠNG VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG
1.1.1. Cây đậu tương
Đậu tương là một trong những loại cây trồng mà loài người đã biết sử
dụng và trồng trọt từ lâu đời, vì vậy nguồn gốc của cây đậu tương cũng sớm
được xác minh. Cây đậu tương có nguồn gốc từ Trung quốc và nó sớm được
người dân thuần hóa và trồng làm cây lương thực vào khoảng thế kỉ 17
trước công nguyên. Sau đó, nó được đưa đến Triều Tiên, Nhật Bản, Nga,
sang Nam Á và Đông Nam Á qua con đường tơ lụa. Đậu tương truyền bá
sang Châu Âu vào khoảng thế kỉ thứ 17, sang Hoa Kì thế kỉ thứ 18 và ngày
nay Hoa Kì là quốc gia sản xuất đậu tương hàng đầu trên thế giới, chiếm 50%
sản lượng trên toàn thế giới, tiếp theo là các nước Trung Quốc, Ấn Độ,… Ở
trung du Việt Nam đậu tương được trồng từ lâu đời, sớm nhất là các tỉnh
thuộc khu vực trung du, miền núi phía Bắc và miền đông Nam Bộ [3], [5].
Cây đậu tương hay đậu nành có tên khoa học là Glycine max (L.)
Merrill, thuộc chi Glycine, họ đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướm
(Papilionoideae), bộ Phaseoleae và có bộ NST 2n = 40. Đối với đậu tương có
thể phân loại theo đặc điểm thực vật học, dựa vào thời gian sinh trưởng,
theo thời vụ. Theo cách phân loại của Hymowit và Newell (1984) dựa trên
đặc điểm về hình thái, sự phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắc thể thì ngoài
chi Glycine còn có thêm chi phụ Soja. Chi Glycine được chia ra thành 7 loài
hoang dại lâu năm, và chi phụ Soja được chia ra làm 2 loài: loài đậu tương
trồng Gtycine (L) Merr và loài hoang dại hàng năm G. Soja Sieb và Zucc [3],
[5], [9].


5

Cây đậu tương gồm các bộ phận chính: rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt.

Rễ đậu tương là rễ cọc, gồm rễ cái và các rễ phụ, trên rễ có nhiều nốt sần
chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum, có khả năng cố định đạm của không
khí tạo thành đạm dễ tiêu. Bộ rễ phân bố nông sâu, rộng hẹp, số lượng nốt
sần ít hay nhiều phụ thuộc vào giống, đất đai, khí hậu và kĩ thuật trồng.
Trong giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng, sinh trưởng của rễ nhanh hơn
thân, nên khi vào thời kì ra hoa rộ, lúc đó độ sâu của rễ thường dài gấp đôi
chiều cao của thân cây, và rễ vẫn tiếp tục phát triển cho đến khi quả vào
mẩy và hạt bước vào giai đoạn chín sinh lý mới ngừng lại [3], [5], [14].
Thân cây đậu tương là thân thảo, ít phân cành dạng bụi, thân hình
tròn, nhiều lông nhỏ, mang nhiều đốt. Thân khi còn non thường có màu
xanh hoặc màu tím khi về già chuyển sang màu nâu nhạt, chiều cao trung
bình từ 0,5 –
1,2 m, thay đổi tùy theo giống, thời vụ, mật độ cây, đất đai, phân
bón… Giống đậu tương dại cao 2 - 3 m. Những giống thân nhỏ lóng dài dễ bị
đổ hay mọc bò thường làm thức ăn cho gia súc. Những giống thân to
thường là thân đứng và có nhiều hạt và chống được gió bão [5]. Số cành
trên thân nhiều hay ít phụ thuộc vào giống và các kỹ thuật canh tác. Có
giống chỉ có 1 - 2 cành hoặc thậm chí không có cành. Các cành mọc ra từ
chồi ở các nách lá. Các chồi ở dưới thân chính sẽ phát triển thành các chùm
quả, các chồi ở giữa và ngọn thì phát triển thành các chùm hoa. Các cành
mọc ra ở đốt thứ nhất hay đốt thứ hai sẽ khỏe hơn các cành mọc ở phía
trên. Các cành cùng với thân sẽ tạo thành tán cây [14].
Cây đậu tương có 3 loại lá chính là: lá mầm, cặp lá đơn, lá chét và
ngoài ra còn có thêm lá gốc. Lá đậu tương có hình dạng khác nhau: tròn,
hẹp, bầu dục, lưỡi mác hoặc hình thoi… nhưng thường quy thành hai loại
là lá rộng và lá hẹp. Cặp lá mầm là 2 lá đầu tiên, khi mới mọc thường có màu


6

vàng hay xanh lục nhưng khi tiếp xúc với ánh sáng thì chuyển sang màu
xanh. Hạt


7

giống to thì cho lá mầm to thì chứa nhiều chất dinh dưỡng để nuôi cây,
khi hết chất dinh dưỡng thì khô và rụng đi. Cặp lá đơn xuất hiện khi cây
mọc được 2 - 3 ngày và mọc trên lá mầm. Lá có màu xanh đậm và có phiến lá
hình ô van. Lá đơn mọc đối xứng nhau. Lá đơn to màu xanh bóng là biểu
hiện cây sinh trưởng tốt. Lá đơn to xanh đậm biểu hiện của một giống có
khả năng chịu rét. Lá đơn nhọn gợn sóng là biểu hiện cây sinh trưởng không
bình thường. Đậu tương thường có 3 lá chét sau cặp lá đơn và được xếp
xen kẽ thành 2 hàng đối diện. Phiến lá chét có hình ô van rộng tới hẹp tùy
thuộc vào từng loại giống. Phần lớn trên lá có nhiều lông tơ. Những giống
có lá nhỏ và dài chịu hạn khỏe nhưng cho năng suất thấp. Còn những giống
có lá to chống chịu hạn kém nhưng lại cho năng suất cao. Lá gốc xuất hiện ở
cuống của mỗi cành, là một lá đơn rất nhỏ. Lá gốc không có cuống và lá gối
[3], [5].
Đậu tương là cây tự thụ phấn, có hoa dạng cánh bướm đặc trưng, hoa
đậu tương nhỏ, không hương vị, có màu tím, tím nhạt hoặc trắng, hoa mọc
từ nách lá hoặc ngọn. Hoa mọc thành từng chùm, mỗi chùm có từ 1 - 10
hoa và thường có 3 - 5 hoa. Hoa đậu tương nhiều nhưng tỉ lệ đậu quả thấp
do chịu nhiều ảnh hưởng từ môi trường [9], [14].
Quả đậu tương thuộc loại quả ráp, thẳng hoặc hơi cong, có nhiều lông
khi chín có màu vàng hoặc xám. Quả đậu tương có số lượng biến động từ 2
đến 20 quả trên một chùm hoa và có thể có 400 quả trên một cây. Một quả
thường có từ 1 đến 5 hạt, nhưng chủ yếu là 2 đến 3 hạt. Hạt đậu tương
không có nội nhũ mà chỉ có một lớp vỏ bao quanh một phôi lớn. Hạt có hình
tròn hoặc bầu dục, tròn dài, tròn dẹt, ovan... vỏ hạt thường nhẵn và có màu

vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen... đa số là hạt màu vàng. Trong hạt,
phôi thường chiếm 2%, lá mầm chiếm đến 90% và còn lại là vỏ hạt chiếm 8%
tổng khối lượng hạt [3], [5].


8

Đậu tương là cây trồng có giá trị kinh tế cao, nó được dùng làm thực
phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp, là
hàng xuất khẩu và là cây cải tạo đất tốt. Đậu tương có hàm lượng protein
cao hơn trong gạo, thịt, cá và cao gấp hai lần các loại đậu đỗ khác. Trong hạt
đậu tương không có thành phần cấu tạo của cholesteron. Đậu tương còn
được xem là cây cung cấp dầu thực vật quan trọng, lipid đậu tương chứa
thành phần các acid béo không no cao, tổng số chất béo chiếm khoảng 18%.
Hạt đậu tương còn chứa nhiều loại vitamin như: Vitamin nhóm B như: B1,
B2, B6, vitamin E,… Ngoài ra, nó còn chứa sắt, canxi, photpho và các thành
phần chất xơ tốt cho tiêu hóa. Đậu tương là cây cung cấp nguyên liệu hàng
đầu cho công nghiệp ép dầu và một số ngành công nghiệp khác như chế
biến cao su nhân tạo, mực in, chất dẻo, tơ nhân tạo… Đối với nông nghiệp
đậu tương được sử dụng làm thức ăn gia súc và đóng vai trò quan trọng
trong việc cải tạo đất trồng [5], [12], [14].
Đậu tương là cây trồng lấy hạt, cây có dầu quan trọng bậc nhất trên
thế giới, đứng hàng thứ 4 sau cây lúa mì, lúa nước và ngô. Do khả năng thích
ứng rộng nên nó đã được trồng ở khắp năm châu lục, nhưng tập trung nhiều
nhất ở châu Mỹ trên 70%, tiếp đến là Châu Á 21,27% và một số nước khác
trên thế giới. Hiện nay, đậu tương được trồng ở gần 80 quốc gia khác nhau
trên thế giới. Trong đó, 4 nước có sản lượng đậu tương đứng đầu là Mỹ,
Brazil, Argentina và Trung Quốc. Hiện nay đậu tương được trồng ở Việt Nam
có hai nguồn gốc, đó là các giống địa phương và giống nhập nội. Trước cách
mạng tháng 8 năm 1945, diện tích gieo trồng đậu tương ở Việt Nam chỉ

khoảng 32 ha, năng suất 4,1 tạ/ha, cho đến nay diện tích đó tăng lên đáng kể
[5], [18].
Ở Việt Nam, đậu tương được trồng trên cả 7 vùng nông nghiệp,
trong đó vùng núi phía Bắc có diện tích gieo trồng lớn nhất là 46,6%, đồng


9

bằng Sông Hồng 19,3%, vùng Tây Nguyên 11%, miền Đông Nam Bộ 10,2%,
đồng


10

bằng Sông Cửu Long 8,9%, khu Bốn 2,3% và vùng Duyên hải miền Trung
1,6%, diện tích gieo trồng đậu tương tính đến tháng 4/2010 là 123,9 nghìn
ha. Cây đậu tương chiếm một vị trí quan trọng trong nền nông nghiệp của
nước ta, đặc biệt là ở những vùng nông thôn nghèo, kinh tế chưa
phát triển [5], [7], [12], [18].
Trong những năm gần đây do ảnh hưởng của biến đổi khí hậu toàn
cầu cũng như hạn hán đã làm ảnh hưởng tới tình hình phát triển cây đậu
tương ở Việt Nam. Từ năm 2007 đến nay, diện tích trồng đậu tương có sự
biến động và có xu hướng tăng vào năm 2012, 2013, nhưng năng suất và
sản lượng đậu tương gần như không tăng đáng kể (Bảng 1.1).
Bảng 1.1. Sản xuất đậu tương ở Việt Nam từ 2007 đến 2013

Diện tích
(1000 ha)
Năng suất
(tấn/ha)

Tổng sản lượng
cả năm (tấn)

2007

2008

2009

2010

2011

2012

2013

190,1

192,1

146,2

197,8

173,6

200

230

1,45

1,39

1,46

002

1,46

1,5

1,52

275,5

267,6

213,6

296,9

254,2

300

350

Nguồn: Tổng cục thống kê [38]

Do chưa được đầu tư cao nên năng suất đậu tương còn nhiều hạn
chế. Năng suất đậu tương của nước ta rất thấp, chỉ bằng 50 – 70% năng suất
đậu tương của toàn thế giới. Sản lượng đậu tương sản xuất ra chưa kịp đáp
ứng nhu cầu trong nước. Hàng năm, chúng ta vẫn phải nhập khẩu một số
lượng đáng kể từ nước ngoài. Có nhiều nguyên nhân dẫn đến tình trạng
trên, có thể là do dịch bệnh, kỹ thuật canh tác, nhưng chủ yếu là do biến
đổi khí hậu và hạn hán. Cùng với việc nghiên cứu các công nghệ sinh học
và các loại đậu


11

tương cao sản mới để tm ra giống cho năng suất cao với chi phí sản xuất
thấp, các nhà chọn giống Việt Nam còn quan tâm nghiên cứu các giống đậu
tương có khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường như:
nóng, lạnh, hạn, mặn, phèn… [4], [7], [9].
1.1.2. Đặc tính chịu hạn của thực vật và cây đậu tương
Mỗi loài cây trồng có một giới hạn nhất định đối với các nhân tố
sinh thái của môi trường như: nhiệt độ (nóng, lạnh), nước, phèn,
độ mặn… Hạn tác động lên cây theo hai hướng chính làm tăng nhiệt độ
cây và gây mất nước trong cây [2], [14]. Trong những nhân tố sinh thái
của môi trường thì nước là một nhân tố giới hạn quan trọng của cây
trồng, là sản phẩm khởi đầu, trung gian và cuối cùng của các quá
trình chuyển hoá sinh hoá diễn ra trong cơ thể thực vật.. Nước là môi
trường để các phản ứng trao đổi chất xảy ra trong tế bào. Sự thiếu hụt
nước ảnh hưởng xấu đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây,
nếu thiếu nước nhẹ sẽ làm giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu nước trầm
trọng sẽ làm biến đổi hệ keo nguyên sinh chất làm tăng cường quá trình
già hóa tế bào khi bị khô kiệt nước, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học

dẫn đến tế bào, mô bị tổ n thương và chết. Thiếu nước trước tiên ảnh
hưởng đến sự cân bằng nước của cây, từ đó ảnh hưởng đến các chức
năng sinh lý như quang hợp, hô hấp, dinh dưỡng khoáng do đó ảnh
hưởng đến sinh trưởng và phát triển của thực vật [1], [7], [12]. Ở thực
vật khi bị thiếu hụt nước sẽ xảy ra sự hoạt hóa phosphoryl hóa các
protein. Một số protein kinase đã được mô tả như nhân tố truyền tín
hiệu (singnal transduction factor) liên quan đến phản ứng thẩm thấu ở
thực vật. Trong đó, SnRK2 (SNF1 – related protein kinase 2) là
protein liên quan đến các phản ứng thích nghi với điều kện bất lợi
của môi trường và nó điều hòa hoạt động bởi ABA (Umezawa và cs,
2004; Hiroaki Fujii và cs, 2009) [25]. Một số nghiên


12

cứu cũng đã chứng minh được rằng SnRK2.8 (SRK2C) có liên quan đến
phản ứng điều kiện khô hạn của cây trồng (Umezawa và cs, 2004) [36].
Những cây có khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất tương
đối ổn định trong điều kiện khô hạn gọi là cây chịu hạn. Khả năng của
thực vật có thể giảm thiểu mức độ tổn thương do thiếu hụt nước gây ra
gọi là tính chịu hạn [15], [17].
Khô hạn có thể phân ra làm các trường hợp sau:
(i) Hiện tượng khô xảy ra khi mất một phần nước trong các cơ quan ở
giai đoạn nhất định trong chu kì sống ở thực vật (hạt, hạt phấn, bào tử).
Hiện tượng này không làm ảnh hưởng đến tế bào, mô của cây. Đây là
quá trình biến đổi trạng thái trong tế bào có sự điều khiển của hệ thống
thông tin di truyền. Trong giai đoạn hình thành hạt nếu tế bào mất nước khả
năng chịu hạn tăng lên. Khả năng này đạt cực đại ở thời kì hạt chín và có
chiều hướng giảm dần khi hạt nảy mầm. Hạt khô còn có khả năng chống
chịu với hàng loạt điều kiện ngoại cảnh bất lợi khác như nhiệt độ, gió.

(ii) Hạn do tác động của môi trường chịu tác động bên ngoài rất lớn,
gây ảnh hưởng đến đời sống của cây, có thể gây hủy hoại cây cối và gây mất
mùa. Hiện tượng này xảy ra khi trong môi trường đất và không khí thiếu
nước đến mức áp suất thẩm thấu của cây không cạnh tranh được để lấy
nước vào tế bào. Những yếu tố bất lợi chính là các thành phần như thổ
nhưỡng, nhiệt độ, gió nóng hay thời tiết, khí hậu. Có hai loại hạn do môi
trường tác động là hạn đất và hạn không khí.
(iii) Hạn đất thường xảy ra ở những vùng có khí hậu hay thổ
nhưỡng đặc thù, hạn tác động mạnh mẽ lên bộ rễ của cây. Sự tác động
này được biểu hiện qua sự điều tiết các hoocmon giúp cho cây chống chịu
với điều kiện cực đoan.


13

(iv) Hạn nhiệt độ không khí thường xảy ra ở những vùng có gió nóng,
nhiệt độ cao. Hạn không khí thường tác động lên các bộ phận trên mặt
đất như lá, hoa. Hạn do tác động của môi trường dẫn đến hiện tượng mất
nước trong cây ở các bộ phận mô, tế bào khác nhau [8], [13].
Cây đậu tương là cây có nhu cầu về nước cao hơn các loại cây khác và
là cây chịu hạn kém. Trong suốt thời gian sinh trưởng, nhu cầu nước của cây
không đồng đều qua các giai đoạn. Hạn thường làm giảm 40% năng suất
đậu tương và tác động đến tất cả các giai đoạn sinh trưởng và phát triển, từ
nảy mầm, ra hoa, tạo hạt cũng như chất lượng hạt được tạo thành. Nói
chung hạn hán ảnh hưởng đến mọi giai đoạn sinh trưởng của cây, đặc biệt
với cây đậu tương thì giai đoạn tạo hạt đặc biệt cần nước vì giai đoạn này
quá trình tổng hợp protein diễn ra mạnh do đó nước cung cấp cho cây lúc
này có ý nghĩa lớn quyết định năng suất. Ở cây đậu tương, để tổng hợp 1kg
chất khô cần 500-530 kg nước. Trong quá trình nảy mầm thì nhu cầu về
nước của đậu tương cũng khá cao 50%, trong khi ở ngô chỉ là 30%, lúa là

26%.
Khi nghiên cứu về đặc tính chịu hạn của cây đậu tương về phương
diện sinh lý và di truyền đã cho thấy, các đặc tính này liên quan chặt chẽ
đến đặc điểm hóa keo của nguyên sinh chất, đặc điểm của quá trình trao đổi
chất. Khi gặp hạn, axit absisic (ABA) được sinh ra chủ yếu ở phần rễ rồi
chuyển hoá lên lá, gây hiện tượng héo lá, đóng khí khổng và đẩy nhanh tốc
độ già hoá bộ lá. Khi hàm lượng ABA được chuyển hoá tới hạt, làm hạt bị
lép trong quá trình đẫy hạt. Theo Paroda thì khả năng chịu hạn ở thực vật
liên quan đến một số đặc trưng về hình thái như chín sớm, mầu lá, diện tích
lá, khả năng phát triển của hệ rễ, số lượng lông hút, mầu sắc thân, độ phủ
lông trên thân lá... Ngoài ra, khả năng chịu hạn còn liên quan đến một số
yếu tố sinh lý như khả năng đóng mở của khí khổng, quá trình quang hợp, hô
hấp, điều chỉnh áp suất thẩm thấu, nhiệt độ tán cây...


14

Tính chịu hạn của cây đậu tương mang tính đa gen, chúng thể hiện ở
nhiều khía cạnh khác nhau: như sự phát triển nhanh của bộ rễ, tính chín
sớm tương đối cũng như bản chất di truyền của từng giống có khả năng sử
dụng nước tiết kiệm trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây. Căn
cứ vào đặc điểm này, đậu tương được chia thành hai nhóm:
- Nhóm chịu được sự mất nước trong từng giai đoạn phát triển của cây.
- Nhóm chịu được sự thiếu nước trong tất cả giai đoạn phát triển
cây. của
Ở giai đoạn cây con khi gặp hạn, đậu tương có thể dễ vượt qua
hơn, còn ở những giai đoạn sau như giai đoạn ra hoa, kết quả, hạt chín sữa
mà gặp hạn thì sẽ dẫn đến năng suất giảm đáng kể.
Signh và Sarkar (1991) chia cơ chế chịu hạn ở thực vật làm 3 loại:
- Tránh hạn: là khả năng của cây có thể hoàn thành chu kỳ sống của

nó trước khi sự thiếu hụt nước xuất hiện.
- Chịu hạn: là khả năng của cây có thể sống, phát triển và cho năng
suất trong điều kiện cung cấp nước hạn chế hoặc thụ động trải qua các giai
đoạn thiếu nước và tiếp tục phát triển khi điều kiện trở lại bình thường.
- Chống hạn: là khả năng của cây trồng chống lại sự thiếu hụt nước
bằng cách duy trì nước trong mô tế bào cao [6], [9], [13].
Đã có rất nhiều công trình khoa học trên thế giới nghiên cứu về tính
chịu hạn của cây đậu tương nhằm góp phần quan trọng trong công tác chọn
giống.
Năm 2004, nhóm nghiên cứu gồm Huang và cs của trường Đại học Tự
nhiên và Kỹ thuật Pingtung - Taiwan đã phân lập được gen P5CS ở đậu tương
từ mRNA với kích thước 2148 bp. Gen P5CS là nhân tố giới hạn cho nhịp độ
tổng hợp proline ở thực vật trong điều kiện bất lợi do hạn và do mặn gây nên
[6].


Prorcel và cs (2005) đã nghiên cứu phân lập gen P5CS ở đậu tương
và đăng kí trên ngân hàng gen NCBI với mã số là AJ715851, kích thước
là 831 bp [35].
Ở Việt Nam, Nguyễn Thị Thúy Hường và cs (2009) đã phân lập gen
P5CS từ mRNA với kích thước 2148 bp [34].
Hiroaki và cs (2009) đã tm ra ABRE1 là một nhân tố phiên mã của
ABA. ABRE có khả năng tăng cường tính chịu hạn ở Arabidopsis [26].
Năm 1998, Ji Hoon Ahn và cs phát hiện gen Sb-HRGP3 dài 1.353 bp ở
đậu tương mã hoá hydroxyproline giàu glycoprotein hoạt động mạnh
trong mô của vùng chuyển đổi cấu tạo sơ cấp sang cấu tạo thứ cấp của rễ. Ở
rễ thứ cấp, gen này hoạt động mạnh hơn so với các rễ chính. Rất có thể, sự
biểu hiện của gen Sb-HRGP3 liên quan đến việc chấm dứt sự kéo dài của rễ
[19].
Khi nghiên cứu về gen TCS (gen hai thành phần hệ thống có chức năng

chống hạn) ở đậu tương các tác giả Dung Tien Le, Rie Nishiyama, Yasuko
Watanabe và cs (2011) nhận thấy, cơ chế kháng hạn là một trong hai cơ chế
liên quan đến rễ và chồi. Khảo sát hình thái của 29 hệ rễ cây đậu tương
các tác giả đã có nhận xét là sự phát triển của bộ rễ có sự tương quan mật
thiết với các cơ chế kháng hạn. Sự thích nghi linh hoạt của hệ rễ là một yếu
tố quan trọng để duy trì sự sống trong điều kiện hạn hán.
Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu phân lập các gen liên
quan đến tính chịu hạn, chịu nóng của cây đậu tương. Trần Thị Phương Liên
và cs (2003) phân lập gen chaperonin CCTδ từ giống đậu tương địa phương
chịu hạn Cúc Vàng, gen này gồm 1602 nucleotide mã hoá cho 533 axit amin
[8]. Nguyễn Thu Hiền và cs (2005) phân lập gen dehydrin với kích thước 751
bp liên quan đến khả năng chịu hạn từ hai giống đậu tương vàng Mường
Khương và Cao Bằng 4. Nguyễn Thị Thuý Hường và cs (2011) đã phân lập,
tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm
chuyển vào cây đậu tương Việt Nam [6].