Nghiên cứu tạo đột biến in vitro và đánh giá sinh trưởng, phát triển, sai khác di truyền của các dòng đột biến giống hoa cẩm chướng quận chúa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

VŨ HOÀNG HIỆP

NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN IN VITRO VÀ ĐÁNH GIÁ
SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN, SAI KHÁC DI TRUYỀN
CỦA CÁC DÒNG ĐỘT BIẾN GIỐNG HOA CẨM CHƯỚNG
QUẬN CHÚA (DIANTHUS CARYOPHYLLUS L.)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
CHUYÊN NGÀNH: KHOA HỌC CÂY TRỒNG

HÀ NỘI, NĂM 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NGÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

VŨ HOÀNG HIỆP

NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN IN VITRO VÀ ĐÁNH GIÁ
SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN, SAI KHÁC DI TRUYỀN
CỦA CÁC DÒNG ĐỘT BIẾN GIỐNG HOA CẨM CHƯỚNG
QUẬN CHÚA (DIANTHUS CARYOPHYLLUS L.)

CHUYÊN NGÀNH: KHOA HỌC CÂY TRỒNG
MÃ SỐ: 62.62.01.10

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. NGUYỄN THỊ LÝ ANH

HÀ NỘI, NĂM 2014


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, hình
ảnh, kết quả trình bày trong luận án này là trung thực và chưa từng được sử
dụng để bảo vệ một học vị nào trước đây.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án này đã
được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2014
Tác giả

Vũ Hoàng Hiệp

i


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận
được sự quan tâm giúp đỡ tận tnh của nhiều tập thể và cá nhân.
Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn
Thị Lý Anh đã tận tnh hướng dẫn, dìu dắt, tạo mọi điều kiện thuận lợi và chia sẻ
những khó khăn cùng tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành

luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo, các thầy giáo, cô giáo, cán bộ
công nhân viên của Viện Sinh học Nông nghiệp - Học viện Nông nghiệp Việt
Nam đã sẻ chia kinh nghiệm và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình
thực hiện đề tài nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể các thầy giáo, cô giáo Bộ môn Di truyền
và chọn giống cây trồng, Khoa Nông học, Ban Quản lý đào tạo, Ban Giám đốc
Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ về mặt học vấn cũng như tạo điều
kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án.
Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Cao đẳng Cộng đồng Hải
Phòng đã tạo điều kiện cho tôi có thể đảm bảo thời gian để học tập và thực hiện
luận án.
Để hoàn thành được luận án này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, động viên
chân tnh của các thành viên trong gia đình, các bạn bè, đồng nghiệp,... Tôi xin
được trân trọng ghi nhớ và cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu đó.
Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2014
Tác giả

Vũ Hoàng Hiệp

ii


MỤC LỤC
Lời cam đoan

i Lời

cảm ơn

ii Mục lục

iii Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

vii

Danh mục các bảng

viii Danh

mục các hình

x

MỞ ĐẦU

1

1

Tính cấp thiết của đề tài

1

2

Mục tiêu nghiên cứu

2

3

Yêu cầu của đề tài

4

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

5

Đóng góp mới của luận án

2
3
4

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

5

1.1

Giới thiệu chung về cây hoa cẩm chướng

5

1.1.1

Nguồn gốc, phân loại

5

1.1.2

Đặc điểm thực vật học của cây hoa cẩm chướng

7

1.1.3

Yêu cầu ngoại cảnh của hoa cẩm chướng

7

1.1.4

Yêu cầu dinh dưỡng

8

1.2

Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng trên thế giới và trong nước

9

1.2.1

Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng trên thế giới

9

1.2.2

Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng tại Việt Nam

11

1.3

Ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào trong nhân giống cây
hoa cẩm chướng

12

Đột biến tạo biến dị di truyền và ứng dụng đột biến trong chọn
tạo
giống cây trồng

16

1.4.1

Đột biến tạo biến dị di truyền

16

1.4.2

Các tác nhân gây đột biến

17

1.4.3

Vai trò của đột biến nhân tạo trong công tác chọn tao giống cây
trồng

21

1.4

3


1.5

Xử lý gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro và ứng dụng trong chọn
tạo giống cây trồng

24

1.5.1

Xử lý gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro

1.5.2

Các phương pháp xử lý gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro

1.5.3

Nguồn vật liệu xử lý đột biến in vitro

29

1.5.4

Sàng lọc thể đột biến

29

1.6

Một số kết quả nghiên cứu về cây hoa cẩm chướng

1.6.1

Kết quả nghiên cứu trên thế giới

30

1.6.2

Kết quả nghiên cứu trong nước

35

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

24
25

30

39

2.1

Vật liệu nghiên cứu

39

2.2

Nội dung nghiên cứu

41

2.2.1

Nghiên cứu nhân giống in vitro cho cây cẩm chướng giống Quận Chúa 41

2.2.2

Nghiên cứu các phương pháp xử lý gây tạo đột biến in vitro cho cây
cẩm chướng

2.2.3

41

Nghiên cứu phân lập các dạng chồi in vitro biến dị sau xử lý và đánh
giá sự sinh trưởng phát triển của các dạng chồi

2.2.4

Nghiên cứu sự sinh trưởng phát triển và phân lập các dạng biến dị
của cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện tự nhiên

2.2.5

42

Nghiên cứu đánh giá sự sai khác di truyền của một số dòng biến dị
có triển vọng đã phân lập bằng chỉ thị SSR

2.2.6

41

42

Nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro cho một số dòng đột biến
được tuyển chọn

42

2.3

Phương pháp nghiên cứu

42

2.3.1

Phương pháp bố trí thí nghiệm

42

2.3.2

Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.

47

2.3.3

Phương pháp gây tạo đột biến in vitro

47

2.3.4

Phương pháp đánh giá sự sai khác di truyền của các dòng đột biến

2.3.5

bằng chỉ thị phân tử SSR

50

Phương pháp theo dõi, đánh giá

53

4


2.4

Phương pháp xử lý số liệu

55

2.5

Thời gian và địa điểm nghiên cứu

54

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1

56
56

3.1.1

Nghiên cứu nhân giống in vitro cho cây cẩm chướng giống Quận

Chúa cứu tạo vật liệu khởi đầu
Nghiên

3.1.2

Nghiên cứu nhân nhanh chồi in vitro

56

3.1.3

Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh

62

3.1.4

Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp ra cây đến tỷ lệ sống và

55

sinh trưởng của cây in vitro ngoài vườn ươm
3.2

Nghiên cứu xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng in vitro
bằng EMS và tia gamma nguồn 60Co

3.2.1

65

Nghiên cứu xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng nuôi cấy
in vitro bằng EMS

3.2.2

63

65

Nghiên cứu xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng nuôi cấy
in vitro bằng tia gamma nguồn 60Co

3.2.3

Nghiên cứu xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co cho cây
hoa cẩm chướng in vitro

3.3

80

Nghiên cứu khả năng sinh trưởng, phát triển của các dạng chồi in
vitro

3.3.1

84

Nghiên cứu khả năng ra rễ của các dạng chồi in vitro cây cẩm

chướng sau xử lý

3.3.2

75

85

Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của các dạng chồi in vitro
cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện khí canh

3.3.3

86

Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của các dạng chồi in vitro
cây cẩm chướng sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng

3.4

88

Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý gây tạo đột biến đến sự phát sinh
biến dị của cây cẩm chướng giai đoạn ngoài đồng ruộng

3.4.1

89

Ảnh hưởng của xử lý EMS đến sự phát sinh biến dị của cây cẩm

chướng giai đoạn ngoài đồng ruộng

5

96


3.4.2

Ảnh hưởng của xử lý chiếu xạ đến tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng
sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng

3.4.3

96

Ảnh hưởng của xử lý kết hợp EMS và chiếu xạ đến tỷ lệ biến dị của
cây cẩm chướng sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng

3.4.4

96

Đặc điểm hình thái một số dạng biến dị về màu sắc hoa sau xử lý
giai đoạn ngoài đồng ruộng

3.5

97

Nghiên cứu đánh giá sai khác di truyền của một số dòng cẩm chướng
bằng kỹ thuật SSR

103

3.5.1

Kết quả tách chiết DNA tổng số

103

3.5.2

Kết quả phân tích sự nhân bản DNA với các cặp mồi

3.5.3

Kết quả phân tích chỉ số PIC với các cặp mồi

3.5.4

Đánh giá độ thuần di truyền của các dòng cẩm chướng nghiên cứu

3.5.5

Hệ số đồng dạng và mối quan hệ di truyền giữa các mẫu giống cẩm

104
115

chướng

117

117

3.6
121

Nghiên cứu nhân giống in vitro một số dòng đột biến được tuyển chọn

3.6.1

Nghiên cứu ảnh hưởng chế độ khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu

3.6.2

Đánh giá khả năng nhân nhanh in vitro của các dòng cẩm chướng đột
biến được tuyển chọn.

3.6.3

124

Nghiên cứu ảnh hưởng của auxin đến khả năng tạo cây in vitro hoàn
chỉnh của hai dòng cẩm chướng H6 và H7

3.6.4

122

125

Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp ra cây đến tỷ lệ sống và
sinh trưởng của cây in vitro ngoài vườn ươm

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

126
129

1

Kết luận

129

2

Đề nghị

130

Danh mục công trình đã công bố có liên quan đến luận án

131

Tài liệu tham khảo

132

Phụ lục

141

6


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Tên đầy đủ

AFLP

Amplicon fragment length polymorphism

BA

Benzyl adenin

BAP

6-Benzylamino purine

CT

Công thức

CS

Cộng sự

DMSO

Dimethyl sulfoxide DNA

Deoxyribonucleic acid DES
Dimethylsulfate
ĐC

Đối chứng

EI

Ethylenimine

EMS

Ethylmethane sulphonate

FAO

Food and Agriculture Organization

IAA

3-Indoleacetic acid

IAEA

International Atomic Energy Agency

IBA

α-Indol butyric acid

LD50

Liều gây chết 50% mẫu thí nghiệm

LPB

Protocorm-Like-Bodies

MS

Môi trường Murashige and Skoog

NEU

Nitrosoethylurea

NMU

Nitrosomethylurea

NXB

Nhà xuất bản

PIC

Polymorphic Information Content r

Hệ số tương quan
RAPD

Random amplified polymorphic DNA

RFLP

Restriction fragment length polymorphisms

SSR

Simple sequence repeats

TDZ

Thidiaruzon

α NAA

α-Napthaleneaxetic acid
vii


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT

1.1
1.3

Tên bảng

Trang

Diện tích trồng và năng suất hoa cẩm chướng ở một số nước năm
2000
Số giống cây trồng được tạo ra bằng phương pháp gây tạo đột biến
ở
một số quốc gia tính đến năm 2007

2.1

10
23

Trình tự nucleotit của các primer được sử dụng trong các phản ứng
SSR-PCR

39

3.1

Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến tỷ lệ mẫu sống

55

3.2

Ảnh hưởng của BA và kinetin trong môi trường MS đến hệ số nhân,
sinh
trưởng của chồi in vitro

58

3.3

Ảnh hưởng của của tổ hợp kinetin và auxin đến hệ số nhân, sinh
trưởng của chồi in vitro

3.4

61

Ảnh hưởng của α-NAA và than hoạt tính trong môi trường MS tới
khả năng ra rễ của chồi in vitro

3.5

63

Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây cẩm
chướng in vitro ngoài vườn ươm

3.6

64

Ảnh hưởng của EMS đến khả năng sống, phát sinh chồi in vitro cây
cẩm chướng

66

3.7

Sự biến động tỷ lệ mẫu chết qua các tuần nuôi cấy

69

3.8

Ảnh hưởng của EMS đến sự phát sinh hình thái của chồi in vitro cây
cẩm chướng với thời gian xử lý 1 giờ

3.9

Ảnh hưởng của EMS đến sự phát sinh hình thái của chồi in vitro cây
cẩm chướng với thời gian xử lý 2 giờ

3.10

72

Ảnh hưởng của EMS đến sự phát sinh hình thái của chồi in vitro cây
cẩm chướng với thời gian xử lý 3 giờ

3.11

72

73

Ảnh hưởng của liều lượng xử lý tia gamma nguồn 60Co đến khả năng
sống và sinh trưởng của chồi in vitro

76

3.12

Sự biến động tỷ lệ mẫu chết qua các tuần nuôi cấy

76

3.13

Tỷ lệ chồi biến dị và các dạng chồi sau xử lý tia gamma nguồn 60Co

79

8


3.14

Ảnh hưởng của liều lượng xử lý EMS và tia gamma nguồn 60Co đến
81

khả năng sống, sinh trưởng của chồi

3.15

Tỷ lệ chồi biến dị và các dạng chồi in vitro sau xử lý kết hợp EMS
và tia gamma nguồn 60Co

84

3.16

Khả năng ra rễ của chồi in vitro sau xử lý

85

3.17

Sự sinh trưởng, phát triển của các dạng chồi sau xử lý đột biến trong
điều kiện khí canh

3.18

87

Sự sinh trưởng, phát triển của các dạng chồi sau xử lý đột biến trong
điều kiện ngoài đồng ruộng

3.19

88

Ảnh hưởng của xử lý EMS đến tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng sau

xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng

3.20

Ảnh hưởng của xử lý chiếu xạ đến tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng
sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng

3.21

94

Tỷ lệ biến dị của các dạng chồi cẩm chướng sau xử lý giai đoạn
ngoài đồng ruộng

3.23

93

Tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý kết hợp EMS và chiếu xạ
giai đoạn ngoài đồng ruộng

3.22

92

95

Đặc điểm hình thái một số dạng biến dị về màu sắc hoa sau xử lý
giai đoạn ngoài đồng ruộng sau

99

3.24

Thống kê số băng DNA thu được của các mẫu giống cẩm chướng

104

3.25

Hệ số PIC của 20 mồi SSR

116

3.26

Tỷ lệ dị hợp tử của dòng, giống cẩm chướng

117

3.27

Hệ số tương đồng di truyền giữa các dòng, giống cẩm chướng

118

3.28

Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ mẫu sống

123

3.29

Ảnh hưởng của cytokinin đến sự sinh trưởng phát triển và hệ số
nhân
của hai dòng cẩm chướng H6 và H7

125

3.30

Khả năng ra rễ in vitro của các dòng cẩm chướng H6 và H7

126

3.31

Ảnh hưởng của giá thể ra cây đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây
in vitro ngoài vườn ươm

127

9


DANH MỤC CÁC HÌNH
STT

Tên hình

Trang

1.1

Hình ảnh một số loài hoa cẩm chướng phổ biến

1.2

Tỷ lệ đóng góp của các tác nhân trong đột biến tạo giống cây trồng

6

tại Nhật Bản năm 2008

18

Số giống cây trồng được tạo ra theo phương pháp gây tạo đột
biến
trên thế giới qua các năm

21

1.4

Tỷ lệ các giống đột biến trên các châu lục vào năm 2008

22

1.5

Trình tự các bước xử lý đột biến in vitro bằng chiếu xạ

27

2.1

Mẫu giống hoa nghiên cứu

39

3.1

Chồi in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung BA với nộng độ khác
59
nhau
Chồi in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung kinetin với nộng độ

1.3

3.2

khác nhau

60

3.3

Cây cẩm chướng giai đoạn ngoài vườn ươm

65

3.4

Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ EMS đến tỷ lệ chết của chồi in vitro
cây cẩm chướng

68

3.5

Chồi in vitro cây cẩm chướng sau xử lý EMS với thời gian xử lý 2 giờ

70

3.6

Các dạng chồi thu được sau xử lý EMS

71

3.7

Chồi in vitro cây cẩm chướng sau xử lý chiếu xạ tia gamma nguồn
60
Codạng chồi thu được sau xử lý tia gamma nguồn 60Co
Các

77
83

3.10

Các dạng chồi thu được sau xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn
60
Co số dạng biến dị về hình thái thân lá
Một

3.11

Hình ảnh một số dạng biến dị về màu sắc hoa

91

3.12

Cấu trúc một số dạng biến dị về màu sắc hoa

102

3.13

Kết quả điện di DNA tổng số

103

3.14

Kết quả phân tích với mồi CB003a

105

3.15

Kết quả phân tích với mồi CB004a

106

3.16

Kết quả phân tích với mồi CB006a

106

3.17

Kết quả phân tích với mồi CB011a

106

3.18

Kết quả phân tích với mồi CB016a

106

3.8
3.9

10

79
90


3.19

Kết quả phân tích với mồi CB018a

108

3.20

Kết quả phân tích với mồi DCB134

108

3.21

Kết quả phân tích với mồi DCB224

109

3.22

Kết quả phân tích với mồi DCB109

109

3.23

Kết quả phân tích với mồi DCB140

110

3.24

Kết quả phân tích với mồi CB027a

110

3.25

Kết quả phân tích với mồi CB020a

111

3.26

Kết quả phân tích với mồi DCB221

111

3.27

Kết quả phân tích với mồi DCB131

112

3.28

Kết quả phân tích với mồi CB026a

112

3.29

Kết quả phân tích với mồi CB047a

113

3.30

Kết quả phân tích với mồi DCB135

113

3.31

Kết quả phân tích với mồi CB057a

114

3.32

Kết quả phân tích với mồi CB041a

114

3.33

Kết quả phân tích với mồi CF003a

115

3.34

Sơ đồ mối quan hệ di truyền giữa các dòng, giống cẩm chướng

118

3.35

Mẫu dòng đột biến được lựa chọn nghiên cứu nhân giống in vitro

122

11


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Trong nông nghiệp cùng với việc phát triển các cây lương thực, thực phẩm
cây hoa cũng đã trở thành một lĩnh vực thu hút được sự quan tâm và đầu tư bởi
sản xuất hoa đã trở thành một ngành thương mại mang lại lợi ích lớn cho nền
kinh tế.
Trong những loài hoa cắt cành, cẩm chướng ngày càng được biết đến và ưa
chuộng bởi màu sắc đẹp, phong phú, kiểu dáng hoa đa dạng, hoa tươi lâu, dễ vận
chuyển, bảo quản… Cẩm chướng đã trở thành một trong bốn loài hoa cắt
cành được trồng phổ biến trên thế giới, chiếm 17% tổng sản lượng hoa cắt

(Nguyễn Thị Kim Lý, 2012). Đây cũng là loại hoa có nhiều triển vọng trong sản
xuất nội tiêu cũng như xuất khẩu của Việt Nam. Ở nước ta hiện nay, chủ yếu
trồng các giống cẩm chướng nhập nội từ nước ngoài (Nguyễn Thị Kim Lý, 2012) do
đó không chủ động và chi phí sản xuất cao, đặc biệt là không thể mở rộng sản
xuất và xuất khẩu bởi không có bản quyền giống. Vì vậy, việc phát triển cây hoa có
giá trị này không chỉ là việc nhân nhanh các giống nhập nội hay tìm ra những biện
pháp kỹ thuật nhằm nâng cao năng suất chất lượng hoa mà còn phải tạo ra được
những giống hoa cẩm chướng mới đáp ứng được nhu cầu thị trường, phù hợp với
điều kiện sinh thái và có bản quyền của Việt Nam.
Đối với cây hoa việc chọn tạo giống tập trung chủ yếu là tạo giống có màu
sắc mới. Điều này được thực hiện thông qua con đường lai xa, đa bội hóa và gây
tạo đột biến (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007). Tuy nhiên đối với cây hoa
cẩm chướng ở nước ta việc lai xa rất khó thực hiện bởi khả năng thụ phấn thụ
tinh rất khó. Vì vậy việc tạo giống có màu sắc mới chỉ có thể thực hiện thông qua
con đường gây tạo đột biến. Phương pháp chọn tạo giống bằng gây tạo đột biến
được nghiên cứu, phát triển từ giữa thế kỷ 20 và ngày càng phát triển rộng rãi
mang lại những thành tựu to lớn trong công tác chọn tạo giống cây trồng. Theo
báo cáo của Tổ chức Năng lượng nguyên tử quốc tế, tính đến năm 2013 đã có
1


3.200 giống cây trồng đột biến thuộc trên 200 loài khác nhau được công nhận
và ứng dụng trong

2


sản xuất (IAEA, 2013). Hơn thế nữa, việc gây tạo đột biến nhân tạo kết hợp với
nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro đã trở thành công cụ hữu hiệu giúp giảm
thiểu chi phí và thời gian chọn tạo giống cây trồng mới. Kỹ thuật xử lý đột biến in

vitro đã gây tạo và làm tăng tần số xuất hiện đột biến với các tính trạng có giá trị
kinh tế ở các loài thực vật nói chung và cây hoa nói riêng, góp phần không nhỏ
cho việc cải tiến giống cây trồng. (Okamura, 2006; Shu, 2009; IAEA, 2009, 2013).
Bằng phương pháp chọn lọc và lai tạo thông thường để tạo một giống cây trồng
mới ổn định về năng suất, có chất lượng cao phải mất 6 - 10 thế hệ, nhưng nếu
áp dụng phương pháp đột biến in vitro chỉ cần 3 - 6 thế hệ. Phương pháp này
được đánh giá là một trong những thành tựu của thế kỷ 20 (Đào Thị Thanh Bằng
và cs., 1997).
Hiện nay trên thế giới việc nghiên cứu sử dụng các tác nhân như
Ethylmethane sulphonate (EMS) và tia gamma để gây đột biến in vitro cho nhiều
loại cây trồng được nhiều tác giả quan tâm và mang lại hiệu quả cao trong công
tác chọn tạo giống cây trồng mới (Arani and Majidi, 2004; Tulmann et al., 2004;
Luan và cs., 2007; Shin et al., 2007; Nguyễn Thị Lý Anh và cs., 2009a, 2009b,
2011b,…). Trong khi đó ở Việt Nam việc nghiên cứu xử lý đột biến in vitro trong
chọn tạo giống cây trồng nói chung và cây hoa nói riêng còn nhiều hạn chế. Xuất
phát từ những vấn đề nêu trên chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo đột
biến in vitro và đánh giá sinh trưởng, phát triển, sai khác di truyền của các
dòng đột biến giống hoa cẩm chướng Quận Chúa (Dianthus caryophyllus L.)”
phục vụ cho công tác chọn tạo giống hoa cẩm chướng ở nước ta.
2. Mục têu nghiên cứu
Nghiên cứu phương pháp xử lý đột biến in vitro nhằm xác định được
phương pháp xử lý đột biến hiệu quả và tạo được các dòng biến dị di truyền làm
nguồn nguyên liệu cho công tác chọn tạo giống hoa cẩm chướng mới.
3. Yêu cầu của đề tài
- Xác định khả năng nhân giống in vitro cho cây cẩm chướng giống Quận
3


Chúa, làm cơ sở cho việc tái sinh và tạo cây hoàn chỉnh các mẫu xử lý đột biến in

4


vitro bằng tác nhân gây đột biến.
- Xác định hiệu quả xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng trong
nuôi cấy mô mang lại hiệu quả cao:
+ Xác định nồng độ, thời gian xử lý EMS thích hợp cho chồi nhân in vitro
cây hoa cẩm chướng.
+ Xác định liều lượng xử lý tia gamma nguồn 60Co thích hợp cho chồi nhân
in vitro cây hoa cẩm chướng.
+ Xác định hiệu quả của xử lý phối hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co cho
chồi nhân in vitro cây hoa cẩm chướng.
- Phân lập các thể đột biến qua các thế hệ nhân chồi in vitro.
- Sàng lọc các dạng biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện
tự nhiên.
- Đánh giá sự sai khác di truyền của một số dòng đột biến có triển vọng đã
phân lập bằng chỉ thị SSR.
- Xác định phương pháp khử trùng mẫu, môi trường nhân nhanh,
môi trường ra rễ và giá thể ra cây thích hợp cho một số dòng đột biến có tiềm
năng được tuyển chọn.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tễn của đề tài

4.1. Ý nghĩa khoa học
Đề tài là công trình nghiên cứu có hệ thống đối với cây cẩm chướng bao
gồm các nội dung nhân giống vô tính in vitro, tạo vật liệu di truyền mới bằng
phương pháp gây tạo đột biến bởi tác nhân hóa học, vật lý kết hợp nuôi cấy
in vitro, ứng dụng chỉ thị phân tử trong xác định thể đột biến và xây dựng quy
trình nhân giống vô tính in vitro cho một số dòng đột biến có tiềm năng được
tuyển chọn.
Kết quả nghiên cứu của đề tài đã cung cấp các dẫn liệu khoa học có giá trị

về việc nhân giống in vitro và phương pháp tạo giống mới thông qua xử lý đột
5


biến in vitro của cây hoa cẩm chướng. Đồng thời là tư liệu có giá trị cho việc
nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống cây trồng.
Các kết quả của đề tài là cơ sở để tiếp tục phát triển hướng nghiên cứu tạo
dòng đột biến mới làm nguồn nguyên liệu di truyền cho việc chọn tạo giống bằng
xử lý đột biến in vitro không chỉ đối với cây cẩm chướng mà còn có thể mở rộng
với nhiều đối tượng cây trồng khác.

4.2. Ý nghĩa thực tễn
Đề tài đã xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cho một số dòng,
giống hoa cẩm chướng, góp phần giải quyết khó khăn trong thực tiễn về
nhân giống hiện nay.
Đề tài đã ứng dụng thành công phương pháp xử lý đột biến in vitro và xây
dựng được quy trình xử lý gây tạo đột biến kết hợp nuôi cấy in vitro cho cây hoa
cẩm chướng bằng tác nhân EMS và chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co.
Đã tạo được các vật liệu khởi đầu phục vụ cho công tác nghiên cứu chọn
tạo giống hoa cẩm chướng mới và chọn lọc được một số dòng đột biến có triển
vọng.
5. Đóng góp mới của luận án
Các kết quả nghiên cứu đã xác định được tác nhân gây đột biến EMS và tia
gamma nguồn 60Co cho hiệu quả cao trong việc gây tạo biến dị có tiềm năng có
thể làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống hoa cẩm chướng mới.
Đề tài đã tạo ra các dòng đột biến có tiềm năng và đánh giá được đặc điểm
sinh trưởng phát triển của các dòng đột biến mới về màu sắc hoa trong điều kiện
tự nhiên. Các dòng đột biến này cũng đã được đánh giá sự sai khác di truyền bằng
chỉ thị phân tử SSR và xác định mối quan hệ di truyền với cây mẹ (không xử lý đột
biến).

Đề tài đã xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cho 2 dòng đột biến
có triển vọng (dòng H6 và dòng H7) trong số các dòng đột biến được tạo ra, phục
6


vụ cho các nghiên cứu tiếp theo để phát triển hai dòng này thành giống hoa cẩm
chướng mới.

7


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về cây hoa cẩm chướng

1.1.1. Nguồn gốc, phân loại
Theo Jawaharlal et al. (2005), cẩm chướng có tên tiếng Anh: Carnation; tên
khoa học: Dianthus caryophyllus L. Hoa cẩm chướng thuộc:
- Giới thực vật: Plantae
- Lớp 2 lá mầm: Magnoliopsida
- Phân lớp cẩm chướng: Caryophyllidae
- Bộ cẩm chướng: Caryophyllales
- Họ cẩm chướng: Caryophyllaceae
- Chi: Dianthus
- Loài: Caryophyllus.
Theo Jurgens et al. (2003), Jawaharlal et al. (2005) họ cẩm chướng có 80
chi và trên 2.000 loài, phân bố chủ yếu ở Bắc bán cầu, tập trung nhiều ở vùng Địa
Trung Hải, một số ít ở Nam bán cầu và miền núi nhiệt đới. Ở Việt Nam gặp trên
10 chi với 25 loài (Hoàng Thị Sản và Hoàng Thị Bé, 2006; Trung tâm Dữ liệu
thực vật Việt Nam, 2007).

Loài D. caryophyllus: dựa trên hình dạng, kích thước hoa và hình thái cây
loài này được chia thành các nhóm: hoa chuẩn - Standards (sims), hoa chùm Sprays (miniatures). Hoa chuẩn là dạng hoa một bông to trên một cành. Hoa
chùm là dạng có một số lượng lớn hoa nhỏ trên cành, có thể sinh ra cành hoa có
nhiều nhánh nhỏ với rất nhiều hoa (Galbally and Galbally, 1997). Thông thường,
cẩm chướng là cây lưỡng bội, tuy nhiên các thể tứ bội cũng đã được tìm thấy.
Phần lớn các giống cây trồng hiện nay là các thể lưỡng bội (Sato et al., 2000).
Cẩm chướng có nguồn gốc từ vùng Địa Trung Hải, bắt đầu được nuôi trồng
để thưởng ngoạn từ thế kỷ XVI. Năm 1750, các nhà làm vườn Pháp đã tạo ra

8


giống cẩm chướng Remontant, cây cao, ra hoa nhiều lần trong năm. Năm 1846,
họ

9


đã trồng được rất nhiều giống cẩm chướng hoang dại và điều khiển cho chúng ra
hoa quanh năm. Năm 1852, cây cẩm chướng từ châu Âu được nhập vào Mỹ. Sau
đó hàng trăm giống hoa cẩm chướng mới đã được tạo ra, trong đó các giống như
North, Berwick, Maine và Wiliam Sim đã trở thành những giống hàng đầu. Từ các
giống hoa này, người ta đã gây đột biến và lai tạo ra rất nhiều giống cẩm chướng
khác nhau (Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc, 2005).
Trong sản xuất hiện nay ngoài các giống thuộc loài D. caryophyllus được sử
dụng chủ yếu dưới dạng hoa cắt còn có các giống thuộc hai loài, D. barbatus và D.
chinensis được trồng dưới dạng hoa thảm và hoa chậu (Jawaharlal et al., 2005; Lê
Đức Thảo, 2010).
Loài D. barbatus: Thân cứng cáp, nhẵn, cao 25 - 50 cm. Lá dẹp, màu xanh
nhạt hay xanh đậm, dài 3 - 7 cm. Hoa mọc thành chùm khít nhau, rộng 1 - 2 cm,

màu trắng, hồng đỏ, tím hay hai màu giữa các lá bắc khá to, mùi thơm nhẹ. Một
số giống thuộc loài này như giống Wee Willie và Summer Beauty thường trồng
bằng hạt vào đầu mùa xuân và ra hoa vào đầu mùa hè (Jawaharlal et al., 2005; Lê
Đức Thảo, 2010).
Loài D. chinensis: Thân thảo lâu năm, có chiều cao 30 - 50 cm, thân cây
trưởng thành thường có các rãnh, lá phẳng, rộng, màu xanh nhạt đến xanh đậm,
chiều dài lá 3 - 5 cm, chiều rộng 2 - 4 mm. Hoa có nhiều màu sắc khác nhau,
đường kính hoa 3 - 4 cm, cánh hoa thường có lông. Loài D. chinensis tập trung
chủ yếu ở vùng ôn đới. Có 2 giống phổ biến thuộc loài này là Hồng Nhật Bản (D.
chinensis var Heddewigii) và Hồng tua (D. chinensis var Lacinatus) (Jawaharlal et
al., 2005).

Dianthus chinensis

Dianthus barbatus

Dianthus caryophyllus

Hình 1.1. Hình ảnh một số loài hoa cẩm chướng phổ biến
10


(Nguồn: Flickriver, 2012)

11


1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây hoa cẩm
chướng
- Rễ: Cẩm chướng có bộ rễ chùm, chiều dài của rễ 15 - 20 cm, phân bố tập

trung ở tầng đất mặt 20 cm, một số ít có khả năng ăn sâu tới 40 - 45 cm (Lê Đức
Thảo, 2010; Nguyễn Thị Kim Lý và cs., 2012).
- Thân: Thân thuộc dạng thân thảo, nhỏ và mảnh, phân nhánh nhiều, và
nửa hóa gỗ. Thân rất dễ gẫy ở đốt. Các đốt thân thường gẫy khúc. Thân thường
có màu xanh nhạt, bao phủ một lớp phấn trắng xung quanh. Cẩm chướng loại
thấp cây cao
30 - 50 cm, thường mọc thành bụi, các đốt thân dài 2 - 3 cm. Loại cao cây 50 - 80
cm, đốt dài 4 - 6 cm (Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc, 2005; Nguyễn Thị Kim Lý
và cs., 2012).
- Lá: Lá mọc đối từ các đốt thân, gốc lá ôm lấy thân, phiến lá dày, hình lưỡi
mác, mép lá trơn, mặt lá nhẵn, không có độ bóng. Trên mặt lá phủ một lớp phấn
trắng, mỏng và mịn, lớp phấn này có tác dụng làm giảm sự bốc hơi nước (Đặng
Văn Đông và Đinh Thế Lộc, 2005; Nguyễn Thị Kim Lý và cs., 2012).
- Hoa: Có hai dạng hoa chính: hoa chùm và hoa đơn. Hoa nằm trên đầu
cành và có nhiều màu sắc khác nhau. Ngay cả trên một hoa cũng có thể có 2 - 3
màu khác nhau. Hoa đẹp, có mùi thơm nhẹ. Nụ hoa có đường kính 2 - 2,5 cm. Khi
hoa nở hoàn toàn có đường kính 6 - 8 cm. Chiều cao bông hoa khoảng 4 - 7,5 cm
(Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc, 2005; Nguyễn Thị Kim Lý và cs., 2012).
- Hạt: Hạt cẩm chướng nhỏ. Mỗi quả thường có từ 300 - 600 hạt (Nguyễn
Thị Kim Lý và cs., 2012).

1.1.3. Yêu cầu ngoại cảnh của hoa cẩm chướng
- Ánh sáng: Theo Jawaharlal et al. (2005) cẩm chướng là cây ưa sáng và
thích hợp với thời gian chiếu sáng ngày dài. Thời gian chiếu sáng trong ngày càng
dài, cây càng nhanh phân hóa hoa, hoa nở đều, chất lượng hoa tốt. Theo Nguyễn
Thị Kim Lý và cs. (2009) cường độ ánh sáng thích hợp là 1.500 - 3.000 lux, tối
thích là 2.000 - 2.500 lux. Trong quá trình phát triển, cường độ ánh sáng cao (trên
12