Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc hợp chất steroid từ hợp chất methanol cây thạch vĩ họ dương xỉ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

HOÀNG THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC
HỢP CHẤT STEROID TỪ DỊCH CHIẾT METHANOL
CÂY THẠCH VĨ (Pyrrhosia Lingua (Thunb.)Farwell)
HỌ DƯƠNG XỈ (Polypodiaceae)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành: Sư phạm Hóa học

Phú Thọ, 2017


TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

HOÀNG THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC
HỢP CHẤT STEROID TỪ DỊCH CHIẾT METHANOL
CÂY THẠCH VĨ (Pyrrhosia Lingua (Thunb.) Farwell)
HỌ DƯƠNG XỈ (Polypodiaece)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành: Sư phạm Hóa học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: 1.ThS. Nguyễn Thị Bình Yên
Trường Đại học Hùng Vương

2.ThS. Nguyễn Thị Nga
Học viện phòng không – Không quân

Phú Thọ, 2017


LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn thầy hướng dẫn
khoa học: ThS. Nguyễn Thị Bình Yên - Trường Đại học Hùng Vương và
ThS.Nguyễn Thị Nga- Học viện Phòng không- Không quân đã chỉ ra hướng
nghiên cứu và tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận
tốt nghiệp.
Ngoài ra, để hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này, em đã nhận được
sự giúp đỡ hết sức nhiệt tình của các Thầy cô giáo, các cán bộ công nhân viên
và đặc biệt là cô giáo chủ nhiệm Phạm Thị Thanh Huyền. Em xin chân thành
cảm ơn các Thầy, các Cô, các nhà khoa học Trường Đại học Hùng Vương đã
giảng dạy, hướng dẫn và tạo điều kiện tốt nhất để em thực hiện các thực
nghiệm hóa học.
Nhân dịp này em xin bày tỏ sự cảm ơn sâu sắc đến Ban Lãnh đạo
Trường Đại học Hùng Vương, Khoa Khoa học Tự nhiên - Trường Đại học
Hùng Vương đã tạo cho em một môi trường học tập khoa học, nghiêm túc.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và các bạn
sinh viên K11. ĐHSP Hóa học-Trường Đại học Hùng Vương đã hỗ trợ, động
viên em trong suốt quá trình học tập và thực hiện Đề tài.
Phú Thọ, ngày 12 tháng 5 năm 2017
Sinh viên

Hoàng Thị Nhung

-i-

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ............................................ iii
DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................ v
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lý do lựa chọn đề tài ................................................................................. 1
2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................... 2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................... 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3
1.1 Giới thiệu về chi Pyrrhosia ..................................................................... 3
1.2 Đặc điểm thực vật loài Thạch vĩ .............................................................. 4
1.3 Các nghiên cứu về hóa thực vật chi Pyrrhosia của Việt Nam ................ 5
1.4 Sơ lược về lớp chất steroid ...................................................................... 5
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU .................................................................................................................. 8
2.1 Đối tượng nghiên cứu.................................................................................. 8
2.2 Nguyên vật liệu và thiết bị ....................................................................... 8
2.2.1 Nguyên vật liệu .................................................................................. 8
2.2.2 Thiết bị nghiên cứu ............................................................................ 9
2.3 Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 11
2.3.1 Phương pháp ngâm chiết ................................................................ 11
2.3.2 Phương pháp sắc ký ........................................................................ 12
2.3.3 Phương pháp phổ hồng ngoại ......................................................... 15
2.3.4 Phương pháp phổ khối lượng .......................................................... 15
2.3.5 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân(NMR) ......................... 16
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 19
3.1 Quá trình điều chế cặn dịch chiết MeOH cây Thạch vĩ ........................ 19
3.2 Quá trình phân lập các chất từ dịch chiết MeOH cây Thạch vĩ ............ 20
3.2.1 Khảo sát thành phần định tính và lựa chọn dung môi .................... 20

3.2.2 Quá trình phân lập các chất............................................................ 22


-ii-

3.3 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập được ............................................ 28
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 35
1. Kết luận .................................................................................................... 35
2. Kiến nghị.................................................................................................. 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 36


-iii-

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
❖ Các phương pháp sắc ký
TLC

Thin Layer Chromatography: Sắc ký lớp mỏng

CC

Column Chromatography: Sắc ký cột

❖ Các phương pháp phổ
1

H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng
hưởng từ hạt nhân proton

13

C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng
hưởng từ hạt nhân carbon 13

DEPT
s: singlet

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer: Phổ DEPT
d: doublet

t: triplet

m: multiplet

❖ Tên của các hợp chất được viết theo nguyên bản Tiếng Anh


-iv-

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh cây Thạch vĩ ...................................................................... 4
Hình 1.2. Cấu tạo khung steroid ....................................................................... 6
Hình 2.1. Cây Thạch vĩ (tại Lâm Thao) ............................................................ 8
Hình 2.2. Máy cất quay chân không ................................................................. 9
Hình 2.3. Cột sắc ký với kích thước khác nhau .............................................. 10
Hình 2.4. Bộ chưng cất dung môi ................................................................... 10
Hình 2.5. Máy soi UV ..................................................................................... 11
Hình 2.6: Hộp thủy tinh chạy bản mỏng ......................................................... 11
Hình 2.7.Sơ đồ chung của phương pháp ngâm chiết ...................................... 12

Hình 2.8. Minh họa sắc ký lớp mỏng .............................................................. 13
Hình 2.9. Minh họa sắc ký cột ........................................................................ 14
Hình 2.10. Độ chuyển dịch hóa học của proton .............................................. 17
Hình 2.11. Ví dụ minh họa về sự tách vạch phổ ............................................. 18
Hình 3.1. Hình cặn dịch chiết MeOH ............................................................. 19
Hình 3.2. Kết quả khảo sát TLC cặn chiết MeOH Thạch vĩ........................... 21
Hình 3.3. TLC cặn MeOH Thạch vĩ với hệ dung môi (V) ............................. 21
Hình 3.4. Cột tổng khi đưa silica gel lên ........................................................ 22
Hình 3.5. Cột tổng silica gel cặn MeOH ......................................................... 23
Hình 3.6. Hình ảnh khảo sát TLC các phân đoạn F1÷F9 ............................... 23
Hình 3.7. Cột phân đoạn F8 ............................................................................ 24
Hình 3.8. Hình ảnh TLC các lọ từ 30 – 46 của phân đoạn F8.3 ..................... 26
Hình 3.9. Sơ đồ phân lập dịch chiết MeOH câyThạch vĩ ............................... 27
Hình 3.10. Hình ảnh chất PLM3.2 và sắc ký đồ TLC .................................... 27


-v-

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Độ phân cực một số dung môi thông dụng ...................................... 9
Bảng 3.1. Kết quả các phân đoạn thu được từ phân đoạn F8 ......................... 25


-1-

MỞ ĐẦU
1. Lý do lựa chọn đề tài
Xã hội ngày càng phát triển thì nhu cầu về sức khỏe càng được mọi
người quan tâm hơn, trong đó phải kể đến những nhà khoa học đã có những
bước tiến đáng kể trong việc tìm ra những sản phẩm có nguồn gốc thiên

nhiên, không chỉ chữa khỏi bệnh mà còn giúp cơ thể phòng bệnh như cây
Trinh nữ hoàng cung, cây Giác đế, cây Lược vàng, cây Thạch vĩ,...
Ngày nay, việc dùng các loài thuốc có nguồn gốc tự nhiên ngày càng
được ưa chuộng và các công trình nghiên cứu về chúng cũng ngày càng phát
triển.Cùng với sự phát triển của công nghệ tổng hợp hóa dược tạo ra các biệt
dược, các nhà khoa học vẫn đang cố gắng tìm hiểu, khám phá các hoạt tính
sinh học khác nhau của các hợp chất có nguồn gốc từ nhiều loài thực vật khác
nhau.
Việt Nam là nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, lượng mưa
lớn, độ ẩm tương đối cao, nhiệt độ trung bình tháng trên 18 0C lượng mưa
trung bình từ 1000-1500 mm . Với diện tích tự nhiên lên đến 331.212 km2 và
những đặc thù về khí hậu thiên nhiên đã tạo nên sự đa dạng sinh học cao trong
thành phần các loài thực vật. Trên cơ sở các tài liệu đã công bố của các nhà
sinh vật Việt Nam, được tổng hợp từ những tài liệu đáng tin cậy, trên toàn
lãnh thổ Việt Nam hiện có tới 19.375 loài thực vật trong đó có tới khoảng
13.000 loài hạt kín. Trong số 13.000 loài hạt kín nói trên, theo thống kê của
Viện Dược liệu Việt Nam, hiện biết có khoảng 4.000 loài được sử dụng làm
thuốc chữa bệnh theo kinh nghiệm dân gian và đông y; đã và đang là điều
kiện tốt để mở ra và phát triển hơn nữa tiềm năng nghiên cứu về các hợp
chất tự nhiên từ các loài thực vật của Việt.
Chi Pyrrhosia ở Việt Nam có 17 loài ví dụ như Pyrrhosia Lingua,
Pyrrosia Sheareri, Pyrrosia Petiolosa, Pyrrosia Pekinesis,...và các loài này đã
và đang được sử dụng trong y học cổ truyền [1] mở ra tiềm năng nghiên cứu
hóa thực vật về các loài này.


-2-

Theo Từ điển thực vật thông dụng của tác giả Võ Văn Chi chỉ ra cho
thấy cây Thạch vĩ có chứa triterpenoid diploptene, steroid β–sitosterol. Gần

đây, năm 2016 nhóm tác giả Bùi Thị Thu Giang, Nguyễn Thị Sang đã bước
đầu công bố thành phần hóa học cây Thạch vĩ của Việt Nam. Trong đó từ các
dịch chiết EtOAc, n-Hexane đã phân lập được hỗn hợp β–sitosterol và
stigmasterol; hopane-22- ol. Nhằm mục tiêu tìm kiếm và hiểu biết về các hợp
chất thiên nhiên từ cây Thạch Vĩ, tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu phân lập
và xác định cấu trúc hợp chất Steroid từ dịch chiết Methanol cây Thạch vĩ
(Pyrrhosia Lingua (Thunb.) Farwell) họ Dương xỉ (Polypodiaceae).
2. Mục tiêu của đề tài
- Điều chế cặn dịch chiết MeOH ( methanol) của cây Thạch vĩ.
- Phân lập chất sạch từ các phân đoạn của dịch chiết MeOH cây Thạch
vĩ.
- Xác định cấu trúc chất phân lập được bằng các phương pháp phổ cộng
hưởng từ hạt nhân, phổ hồng ngoại, phổ khối lượng.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
- Ý nghĩa khoa học:
+ Kết quả của đề tài đóng góp thông tin cho lĩnh vực nghiên cứu hóa học
hữu cơ về cấu trúc các hợp chất thiên nhiên có trong loài Thạch vĩ.
+ Cung cấp dữ liệu về phổ cộng hưởng từ hạt nhân của một số hợp chất
thiên nhiên từ thực vật.
- Ý nghĩa thực tiễn:
+ Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc thành phần hóa học của cây
Thạch vĩ. Từ đó tìm hiểu về hoạt tính sinh học của các chất phân lập được.
+ Góp phần nâng cao kiến thức, kỹ năng về kỹ thuật chiết tách, phân lập
hợp chất thiên nhiên, về phổ cộng hưởng từ hạt nhân cho sinh viên.
+ Đề tài còn là tài liệu tham khảo cho sinh viên ngành hóa học và cán bộ
nghiên cứu hóa học hữu cơ.


-3-

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu về chi Pyrrhosia
Pyrrhosia Mirb, họ Ráng – Polypodiaceae [Từ chữ Hy Lạp pyros; lửa; ổ
túi bào tử phủ kín mặt dưới phiến lá, nhìn xa nom như màu lửa] – Ráng tai
chuột, Thạch Vĩ.
Ổ túi bào tử tròn hoặc thuôn và xếp thành nhiều hàng, chéo gốc với gân
giữa và gần sát vào nhau, phủ gần kín mặt dưới của phiến lá. Có hai loại lông
hình sao, đều có cuống dài.
Gồm khoảng 100 loài, chủ yếu ở vùng ôn đới và nhiệt đới, một số ít loài
mọc ở châu Phi và Ôxtrâylia. Ở Việt Nam có 17 loài [1].
Pyrrhosia clavata (Baker) Ching - Ráng tai chuột. Loài này có ở Trung
Quốc, Lào và Việt Nam.
Pyrrosia lanceolata(L.) Farw. [P. adnascens (Sw.) Ching] – Ráng tai
chuột thường, Lưỡi mèo tai chuột. Phân bố Nam Trung Quốc và các nước
nhiệt đới châu Á. Ở nước ta, cây mọc phổ biến ở các miền núi, trung du và
đồng bằng.
Pyrrhosia lingua (Thunb.) Farwell. – Thạch vĩ, hay còn được gọi là
thạch bì, thạch lan, phi đao kiếm hay kim tinh thảo ráng hỏa mạc lưỡi,... Ráng
tai chuột lưỡi dao.Phân bố ở Nhật Bản, Đài Loan, Nam Trung Quốc và Việt
Nam. Ở nước ta, gặp nhiều nơi từ Cao Bằng, Lạng Sơn, Lào Cai, Phú Thọ, Hà
Tây, đến Thừa Thiên – Huế và Lâm Đồng.
Pyrrhosia mollis (G. Kunze) Ching – Ráng tai chuột mềm, Thạch vĩ
lông mềm. Phân bố ở Trung Quốc và nhiều nước nhiệt đới châu Á: Ấn Độ,
Mianma, Lào, Việt Nam, Inđônêxia, Phillipin. Ở nước ta, có gặp tại Lào Cai
(Sa Pa), Lâm Đồng (Đà Lạt).
Pyrrhosia piloselloides (L.) M. G. Price [Drymoglossum piloselloides
(L.) C. Presl] – Ráng tai chuột vẩy ốc. Phân bố ở Ấn Độ, Trung Quốc, Thái
Lan, Việt Nam, Inđônêxia, Phillippin và Iran. Ở nước ta có gặp từ Lạng Sơn,
Lào Cai, Quảng Bình, Quảng Nam, Bình Định tới Khánh Hòa và Lâm Đồng.

-4-

Pyrrhosia porosa (C. Presl) Hovenkamp var. tonkinensis (Giesenh.)
Hovenkamp [P.tonkinensis (Giesenh.) Ching] – Ráng tai chuột Bắc, Thạch vĩ
Bắc Bộ. Loài của Bắc Việt Nam và Nam Trung Quốc. Ở nước ta có gặp tại
Hà Tây (Ba Vì), Lào Cai (Sa Pa) và Ninh Bình (Cúc Phương).
Theo tác giả Võ Văn Chi, một loài thuộc chi Pyrrhosia của Việt Nam
được sử dụng làm thuốc trong y học dân giân như cây Thạch vĩ được dùng để
làm thuốc lợi tiểu, chữa ung nhọt,…
1.2 Đặc điểm thực vật loài Thạch vĩ
Cây Thạch vĩ (Pyrrhosia lingua (Thunb.) Farwell.) là một loại cây
dương xỉ nhỏ, có thân rễ nằm ngang, dài tới 0,05m, dày vào khoảng 4mm, có
nhiều nhánh phân chia theo lối đơn túc. Trên thân rễ, có nhiều vẩy to, ở mặt
dưới từng quãng có nhiều rễ hình sợi, phân nhánh mọc đối, có dạng cây thảo
sống nhiều năm, cao 10 – 30cm, mép gợn sóng. Cuống 2 – 10 cm, mảnh, có
đốt ở gốc; phiến hơi đa dạng, tròn dài, nhỏ hay hẹp thon, dài 8 – 18cm, rộng 2
– 5cm, dai, gân phụ rõ, mặt trên gần như không lông, mặt dưới có lông hình
sao vàng hoe.

Hình 1.1. Hình ảnh cây Thạch vĩ
Ổ bào tử phủ kín mặt dưới, màu đỏ đậm; bào tử xoan, nâu nhạt.
Cây phụ sinh trên thân cây và bám trên đá trong rừng ở độ cao 100 –
1800m. Có nơi cây mọc thành những đám rất lớn [1].


-5-

1.3 Các nghiên cứu về hóa thực vật chi Pyrrhosia của Việt Nam
Theo Từ điển thực vật thông dụng của tác giả Võ Văn Chi chỉ ra cho

thấy cây Thạch vĩ có chứa steroid như β – sitosterol (1) [1].
Gần đây, năm 2016 nhóm tác giả Bùi Thị Thu Giang, Nguyễn Thị Sang
đã bước đầu công bố thành phần hóa học cây Thạch vĩ của Việt Nam. Trong
đó từ các dịch chiết EtOAc, n-Hexane đã phân lập được hỗn hợp β–sitosterol
và stigmasterol (2); hopane-22- ol (3).

1.4 Sơ lược về lớp chất steroid
Steroid là một loại hợp chất hữu cơ có chứa một sự sắp xếp đặc trưng
của bốn vòng cycloalkane được nối với nhau. Ví dụ về các steroid bao gồm
các chất béo ăn cholesterol, hormon sinh dục estradiol và testosterone, và
thuốc chống viêm dexamethasone. Lõi của steroid bao gồm 20 nguyên tử
cacbon liên kết với nhau mang hình thức của bốn vòng hợp nhất: ba vòng


-6-

cyclohexane (được xem như là vòng A, B, và C) và một vòng cyclopentane
(vòng D). Các steroid khác nhau đối với từng nhóm chức năng gắn liền với
cốt lõi bốn vòng và oxi hóa của các vòng.
Steroid là các hợp chất chất béo hữu cơ hòa tan có nguồn gốc tự nhiên
hoặc tổng hợp, có công thức từ 17 nguyên tử cacbon sắp xếp thành 4 vòng và
bao gồm cả các sterol và axit mật, thượng thận, và kích thích tố giới tính. Một
số steroid có nguồn gốc thiên nhiên như: hợp chất digitalis, và các tiền chất
của một số loại vitamine nhất định. Steroid rất đa dạng và phong phú, bao
gồm các hình thức của một số loại vitamine D, digitalis, sterol (ví dụ:
cholesterol) và các axit mật. Các sterol là các dạng đặc biệt của các steroid,
với một nhóm hydroxyl tại vị trí-3 và một khung lấy từ cholestane.Hàng trăm
steroid riêng biệt được tìm thấy ở thực vật, động vật và nấm. Tất cả các
steroid được sản xuất ở các tế bào từ các sterol lanosterol (động vật và nấm)
hoặc từ cycloartenol (thực vật). Cả lanosterol và cycloartenol lấy từ

cyclization của triterpene squalene.Steroid là nhóm hợp chất tự nhiên phân bố
rộng rãi trong giới động vật và thực vật, với cấu trúc tổng quát là hệ thống
vòng cyclopentanohydrophenanthrenehoặc trong một vài trường hợp hiếm
gặp là dạng biến đổi của vòng nói trên.

Hình 1.2. Cấu tạo khung steroid
Ví dụ về các steroid bao gồm các chất béo ăn cholesterol, hormon sinh
dục estradiol và testosterone, và thuốc chống viêm dexamethasone. Các
steroid khác nhau đối với từng nhóm chức năng...Một trong các steroid được
biết đến sớm nhất là cholesterol (2). Hợp chất này được phân lập lần đầu tiên
vào năm 1770 nhưng mãi đến tận những năm 1920 mới xác định được cấu
trúc của nó [10].


-7-

(4)


-8-

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
Cây Thạch vĩ được thu hái tại Thị trấn Lâm Thao – Huyện Lâm Thao –
Tỉnh Phú Thọ vào tháng 6/2015. Tên cây được xác định bởi nhà thực vật học
Đỗ Văn Hài. Mẫu tiêu bản kí hiệu QHT-02 được lưu giữ tại Viện Sinh thái và
Tài nguyên Sinh vật-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Hình 2.1. Cây Thạch vĩ (tại Lâm Thao)

2.2 Nguyên vật liệu và thiết bị
2.2.1 Nguyên vật liệu
Dung môi được sử dụng như n-hexane, CH2Cl2, EtOAc, MeOH, Acetone
đều là các hóa chất kỹ thuật của Việt Nam, Hàn Quốc được chưng cất lại
trước khi sử dụng. Các dung môi có độ phân cực tăng dần từ n-Hexan đến
MeOH như trong bảng sau [8]:


-9-

Bảng 2.1: Độ phân cực một số dung môi thông dụng
Dung môi

Nhiệt độ sôi

Độ phân cực

n-Hexan

69◦c

0,001

Diclomethan

41◦c

0,815

Etylacetat

77◦c

8,7

Methanol

65◦c

100

Nước

100◦c

100

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu
Mẫu cây được đem ngâm chiết trong các bình thủy tinh có dung tích 5
lít( trong thời gian 24h). Sau khi ngâm,dung môi được lọc qua vải thô và giấy
lọc. Sau đó được cô đặc bằng máy cấtquay chân không IKA®RV 10 của Anh(
tùy mỗi loại dung môi mà nhiệt độ cất quay khác nhau).

Hình 2.2. Máy cất quay chân không
Việc tinh chế các hỗn hợp sản phẩm được thực hiện bằng sắc ký cột
silica gel và sắc ký lớp mỏng. Với sắc ký cột silica gel thì tùy vào lượng mẫu
chất ta sử dụng các cột sắc ký có kích cỡ khác nhau: 1; 2; 2,5; 4; 10.
Chất nhồi cột sắc ký là silica gel 60 (0,063 – 0,200 mm) (70 – 230 mesh astm)

-10-

đều là của Merck. Khối lượng silica gel nhồi cột gấp khoảng 30 lần lượng
chất (ví dụ: mchất=1g thì msilica gel=30g). Còn sắc ký lớp mỏng sử dụng bình sắc
ký lớp mỏng Camag của Đức và bản mỏng sắc ký tráng silicagel 60 F 254 trên
tấm nhôm 20 × 20 cm của Đức. Các lớp chất sẽ được thể hiện thông qua các
vệt màu trên bản mỏng nhờ thuốc thử Ceri sunfat (các vệt chất hiện màu
giống nhau sau khi nướng) hoặc thuốc thử Vanilin (các vệt chất hiện màu đặc
trưng).

Hình 2.3. Cột sắc ký với kích thước khác nhau
Dung môi sử dụng được chưng cất bằng bộ chưng cất dung môi của hãng
IKA: dung môi được cho vào bình chưng cất (thêm đá bọt) sau đó được làm
lạnh bằng hệ thống sinh hàn, ngưng tụ và chảy xuống eclen.

Hình 2.4. Bộ chưng cất dung môi


-11-

Hiện màu dưới bước sóng UV 254nm( bước sóng ngắn), 366nm( bước
sóng dài) được thực hiện trên hệ thống đèn UV CAMAG:

Hình 2.5. Máy soi UV
Hộp thủy tinh chạy bản mỏng:

Hình 2.6: Hộp thủy tinh chạy bản mỏng
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp ngâm chiết
Nguyên tắc tổng quát của phương pháp ngâm chiết là lựa chọn dung môi

và quy trình phù hợp để chiết tách hợp chất ra khỏi mẫu cây, điều này tùy
thuộc vào đặc tính của chất thứ cấp có trong cây mà người khảo sát mong
muốn tách cô lập: cấu trúc hóa học đa dạng, tính chất phân cực khác biệt, …
Muốn chiết hợp chất ra khỏi cây cần chọn dung môi phù hợp (các dung môi
thường sử dụng: n-Hexane, CH2Cl2, EtOAc, MeOH, …), sử dụng kỹ thuật
chiết tách phù hợp bằng cách ngâm ngập mẫu cây trong dung môi trong


-12-

khoảng thời gian 24h sau đó lọc lấy dung dịch (lọc bằng vải thô sau đó lọc lại
bằng giấy lọc để loại bỏ hoàn toàn phần bã). Sau khi lọc, phần bã cây hoặc
sinh khối còn lại được lọc bỏ. Dung môi sau khi lọc được đem cô cạn bằng
máy cẩt quay chân không ở nhiệt độ thấp khoảng 30-45oC vì thực hiện ở nhiệt
độ cao có thể làm hư hại một vài hợp chất kém bền nhiệt [4]. Cao chiết được
bảo quản trong tủ mát ở nhiệt độ dưới 3oC, độ ẩm khoảng 13%.

Hình 2.7.Sơ đồ chung của phương pháp ngâm chiết
2.3.2 Phương pháp sắc ký
2.3.2.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng


-13-

a: Quãng đường di chuyển của dung môi
b: Quãng đường di chuyển của chất
Hình 2.8. Minh họa sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng dùng để khảo sát thành phần và sắc ký lớp mỏng điều
chế đều được thực hiện trên bản mỏng đế nhôm tráng sẵn Silica gel 60 F254
của hãng Merck có độ dày 0,25 mm. Dung môi triển khai là 1 hoặc hỗn hợp

một số dung môi thông dụng như n-hexane, CH2Cl2, EtOAc, Acetone, MeOH.
Thuốc thử hiện màu được sử dụng là Ceri sulfate, Vanalin.
Cách thực hiện: dùng cappira chấm các chấm nhỏ (mẫu chất được hòa
tan bằng dung môi) lên một điểm đã được cố định trên bản mỏng. Pha hệ
dung môi phù hợp, rồi chạy bản mỏng bằng hộp thủy tinh. Khi dung môi chạy
gần đến mép trên của bản mỏng thì dừng lại.
Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký silica gel nói chung là dựa trên
khả năng hấp phụ khác nhau của các chất trên silica gel (pha tĩnh) sẽ được
dung môi rửa giải (pha động) khi đi lên theo lực mao quản sẽ phân tách (giải
hấp) ở các vị trí khác nhau trên đường đi của dung môi. Chất có độ phân cực
kém hơn sẽ đi lên nhanh hơn chất có độ phân cực cao hơn.
Độ linh động của chất được đánh giá thông qua hệ số Rf.

Trong trường hợp minh họa trên:Rf(A) =

; Rf(B) =


-14-

Hai chất A, B được coi là tách riêng khỏi nhau khi triển khai sắc ký
TLC, Rf(A) ≠ Rf(B). Từ hệ dung môi khi khảo sát TLC làm cơ sở để lựa chọn
hệ dung môi cho sắc ký cột silica gel.
2.3.2.2 Phương pháp sắc ký cột

Hình 2.9. Minh họa sắc ký cột
Sắc ký cột thường, với pha tĩnh là silica gel 60, cỡ hạt 0,063-0,200 mm
(70- 230 mesh astm) của hãng Merck, dung môi rửa giải chủ yếu dùng các hệ
dung môi như n-hexane/CH2Cl2, n-hexane/EtOAc, n-hexane/Acetone,
CH2Cl2/MeOH,… với tỉ lệ thích hợp.

Cách thực hiện: Cột được tráng sạch bằng Aceton. Lót dưới đáy cột một
lớp bông mỏng. Silica gel sau khi được ngâm trương nở được đưa lên cột. Để
cột ổn định từ 1-2h sau đó đưa mẫu chất lên. Lưu ý: không để dung môi cạn
qua phần silica gel.
Nguyên lý của phương pháp sắc ký cột silica gel cũng tương tự phương
pháp sắc ký lớp mỏng ở trên; chỉ khác là trong sắc ký cột silica gel dung môi
được di chuyển từ trên đỉnh cột đi xuống và hệ dung môi được lựa chọn từ
TLC sẽ được tăng dần độ phân cực hoặc có thể chỉ là một dung môi duy nhất.
Chất có độ phân cực kém hơn sẽ được rửa giải trước rồi đến chất có độ phân
cực cao hơn, đối với sắc ký bản mỏng thì ngược lại.


-15-

Kích cỡ của cột sắc ký tùy thuộc vào lượng mẫu chất cần phân tích.
2.3.3 Phương pháp phổ hồng ngoại
Phương pháp phân tích phổ hồng ngoại nói ở đây là vùng phổ nằm trong
vùng có số sóng 4000 - 400 cm-1.
Vùng này cung cấp cho ta những thông tin quan trọng về các dao động
của các phân tử do đó là các thông tin về cấu trúc của các phân tử

Trục tung: biểu thị số sóng (cm-1)
Trục hoành: biểu thị cường độ hấp thụ qua độ truyền quang T(%)
Ví dụ: C=C: khoảng 1600cm-1
C-H(no): khoảng 2900cm-1
2.3.4 Phương pháp phổ khối lượng
Phương pháp phổ khối là một kĩ thuật dùng để đo đạc tỉ lệ khối lượngtrên-điện tích của ion; dùng thiết bị chuyên dụng là khối phổ kế. Kĩ thuật này
có nhiều ứng dụng, bao gồm: Mô hình cơ bản của một khối phổ kế.
• Xác định các hợp chất chưa biết bằng cách dựa vào khối lượng của
phân tử hợp chất hay từng phần tách riêng của nó

• Xác định kết cấu chất đồng vị của các thành phần trong hợp chất
• Xác định cấu trúc của một hợp chất bằng cách quan sát từng phần tách
riêng của nó


-16-

• Định lượng lượng hợp chất trong một mẫu dùng các phương pháp khác
(phương pháp phổ khối vốn không phải là định lượng)
• Nghiên cứu cơ sở của hóa học ion thể khí (ngành hóa học về ion và
chất trung tính trong chân không).
• Xác định các thuộc tính vật lí, hóa học hay ngay cả sinh học của hợp
chất với nhiều hướng tiếp cận khác nhau.
Một khối phổ kế là một thiết bị dùng cho phương pháp phổ khối,
cho ra phổ khối lượng của một mẫu để tìm ra thành phần của nó. Có thể ion
hóa mẫu và tách các ion của nó với các khối lượng khác nhau và lưu lại thông
tin dựa vào việc đo đạc cường độ dòng ion. Một khối phổ kế thông thường
gồm 3 phần: phần nguồn ion, phần phân tích khối lượng, và phần đo đạc.
2.3.5 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân(NMR)
Cộng hưởng từ hạt nhân được miêu tả lần đầu vào năm 1938 bởi Isidor
Rabi, sau đó được phát triển lên nhờ các thí nghiệm của Stern-Gerlach. Khi
đó phổ NMR dựa trên sự ghi lại quá trình cộng hưởng từ sinh ra bởi các hạt
nhân spin khác 0 được kích thích bởi năng lượng của tần số sóng radio RF
dưới tác đông của từ trường Bo bên ngoài. Quá trình này sẽ tạo ra sự khác biệt
về trạng thái spin của các hạt nhân và mức năng lượng tương ứng của chúng.
Ngày nay, cùng với sự kế thừa và phát huy thì cơ sở lý thuyết của
phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân dựa trên tương tác của hạt nhân có
từ tính (1H, 13C, …) với từ trường ngoài[7]. Một số hạt nguyên tử có từ tính
tương tác với môi trường ngoài để lại một số tín hiệu. Những tín hiệu đó được
gọi là phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Tùy thuộc mỗi loại hạt cộng hưởng từ ở

giá trị khác nhau.
Phổ cộng hưởng từ nhân proton (1H-NMRProton nuclear magnetic
resonance spectroscopy):
- Số lượng tín hiệu (vạch phổ), vị trí vạch phổ (độ chuyển dịch hóa học,
H) xác nhận các loại proton khác nhau và môi trường bao quanh mỗi proton
trong phân tử.


-17-

- Vị trí của tín hiệu cho biết proton thuộc loại proton nào: thơm, béo, bậc
một, bậc hai, bậc ba,… Các proton khác nhau này có các môi trường electron
bao quanh khác nhau, và chính môi trường electron bao quanh xác định
proton hấp thụ ở đâu trong miền phổ.
Trên phổ 1H-NMR sự sai khác của tần số của 2 proton so với tần số của
máy được gọi là độ chuyển dịch hóa học. Tín hiệu các proton được ghi nhận
thông qua độ chuyển dịch hóa học  ( = /0= Hz/MHz = 106 ppm), trong
đó chất nội chuẩn (chất làm chuẩn để đo độ chuyển dịch hóa học) TMS
(Si(CH3)) được gán TMS = 0 ppm.

Hình 2.10. Độ chuyển dịch hóa học của proton
Ví dụ: từ hình 2.9 ta có:
H-Cno có độ chuyển dịch nhỏ hơn 2
Hal-Cno có độ chuyển dịch nằm trong khoảng (3 ;5)...
- Cường độ tín hiệu cho biết số proton cùng loại.
- Sự tương tác (tách vạch phổ) và hằng số tương tác spin – spin (J) cho
biết proton nào tương tác với proton nào.
+ Sự tách vạch phổ gây nên bởi sự tương tác tương tác J. Sự tách vạch
phản ánh môi trường bao quanh của các proton đang hấp thụ không phải đối
với các electron mà đối với các proton khác ở gần bên cạnh. Số vạch phổ