NHỮNG BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI SINH LÝ CỦA PHONG LAN ĐAI CHÂU (RHYNCOSTYLIS GIGANTE) NUÔI CẤY MÔ GIAI ĐOẠN RA NGÔI VÀ TRONG VƯỜM ƯƠM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐÀO THỊ KIM TRANG

NHỮNG BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI SINH LÝ CỦA
PHONG LAN ĐAI CHÂU (RHYNCOSTYLIS GIGANTE)
NUÔI CẤY MÔ GIAI ĐOẠN RA NGÔI VÀ TRONG
VƯỜM ƯƠM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành: Sư phạm Sinh học

ii

Phú Thọ, 2016


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ. Trước hết, tôi
xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng tới thầy giáo hướng dẫn TS.
Cao Phi Bằng, đã tận tình hướng dẫn, động viên, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm
cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi làm và hoàn thành
luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong trung tâm nghiên cứu Công
nghệ Sinh học, bộ môn Sinh học và bộ môn Hóa học, Khoa Khoa học Tự nhiên –
Trường Đại học Hùng Vương đã tạo điều kiện cho tôi được học tập, nghiên cứu và
hoàn thành luận văn.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới gia đình, người thân
và toàn thể bạn bè đã cổ vũ, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và
nghiên cứu.

Phú Thọ, ngày 12 tháng 5 năm 2016
Tác giả

Đào Thị Kim Trang

ii


MỤC LỤC
Trang bìa phụ
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục bảng

Trang
i
ii
iii
v

Danh mục hình

vi

Danh mục các cụm từ viết tắt

vii

MỞ ĐẦU...................................................................................................................1
Chương 1: Tổng quan tài liệu nghiên cứu

1.1. Giới thiệu chung về phong lan Đai châu.........................................................3
1.1.1. Nguồn gốc và vị trí phân loại...................................................................3
1.1.2. Vị trí phân bố...........................................................................................3
1.1.3. Đặc điểm hình thái..................................................................................4
1.1.4. Đặc điểm sinh thái...................................................................................4
1.1.5. Giá trị của phong lan Đai châu...............................................................7
1.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật.......................................................8
1.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô - tế bào thực vật...................................8
1.2.2. Các giai đoạn của nuôi cấy mô – tế bào thực vật..................................10
1.3. Các nghiên cứu về phong lan Đai châu.........................................................12
1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới..................................................................12
1.3.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam....................................................................14
1.3.3. Các nghiên cứu về giai đoạn luyện cây..................................................15
Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu.................................................................16
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................16
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu...............................................................................16
2.2. Nội dung nghiên cứu.....................................................................................16
2.3. Phương pháp nghiên cứu...............................................................................16
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu hình thái........................................................16
2.3.2. Xác định các chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh...................................................17
iii


Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận
3.1. Sự biến đổi hình thái cây phong lan Đai châu trong giai đoạn ra ngôi và trong
vườn ươm.............................................................................................................22
3.1.1. Sự biến đổi hình thái về lá cây phong lan Đai châu...............................22
3.1.2. Sự biến đổi hình thái về thân cây phong lan Đai châu...........................23
3.1.3. Sự biến đổi hình thái về rễ cây phong lan Đai châu..............................25

3.2. Các chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh của cây phong lan Đai châu giai đoạn ra ngôi và
giai đoạn trong vườn ươm....................................................................................26
3.2.1. Khảo sát hàm lượng nước của cây.........................................................26
3.2.2. Hàm lượng chất khô của cây.................................................................28
3.2.3. Khảo sát cường độ thoát hơi nước của mô lá........................................30
3.2.4. Sự biến đổi hàm lượng sắc tố quang hợp của cây..................................32
3.2.5. Hoạt độ peroxydase của cây..................................................................34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................37
TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................38
PHỤ LỤC ẢNH

iii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Sự tăng trưởng của lá cây phong lan Đai châu ........................................22
Bảng 3.2. Sự tăng trưởng của thân cây phong lan Đai châu ....................................24
Bảng 3.3. Sự tăng trưởng của rễ cây phong lan Đai châu ........................................25
Bảng 3.4. Hàm lượng nước của cây lan Đai châu qua các giai đoạn trong quá trình ra
ngôi và trong vườn ươm ..........................................................................................27
Bảng 3.5. Hàm lượng chất khô của cây lan Đai châu giai đoạn ra ngôi và trong vườn
ươm ......................................................................................................................... 29
Bảng 3.6. Cường độ thoát hơi nước của mô lá cây lan Đai châu giai đoạn ra ngôi và
trong vườn ươm ......................................................................................................30
Bảng 3.7. Hàm lượng sắc tố quang hợp của cây phong lan Đai châu giai đoạn ra ngôi
và trong vườn ươm ..................................................................................................32
Bảng 3.8. Hoạt độ peroxydase của cây phong lan Đai châu giai đoạn ra ngôi và trong
vườn ươm ................................................................................................................ 34

v

DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1. Biểu đồ thể hiện sự tăng trưởng của lá cây lan Đai châu .........................22
Hình 3.2. Biểu đồ thể hiện sự tăng trưởng của thân cây phong lan Đai Bảng .........24
Hình 3.3. Biểu đồ thể hiện sự tăng trưởng của rễ cây phong lan Đai châu ..............26
Hình 3.4. Biểu đồ thể hiện hàm lượng nước của cây phong lan Đai châu qua các giai
đoạn trong quá trình ra ngôi và trong vườn ươm .....................................................27
Hình 3.5. Biểu đồ thể hiện hàm lượng chất khô của cây phong lan Đai châu giai đoạn
ra ngôi và trong vườn ươm ......................................................................................29
Hình 3.6. Cường độ thoát hơi nước của mô lá cây lan Đai châu giai đoạn ra ngôi và
trong vườn ươm ......................................................................................................31
Hình 3.7. Biểu đồ thể hiện hàm lượng sắc tố quang hợp của cây phong lan Đai châu
giai đoạn ra ngôi và trong vườn ươm ......................................................................33
Hình 3.8. Biểu đồ thể hiện hoạt độ peroxydase của cây phong lan Đai châu giai đoạn ra
ngôi và trong vườn ươm ..........................................................................................35

vi


DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT
AC
CD
CR
D
ĐK
Kn
MS
NXB
PLB

PGS
TDZ
TS
Tr (p)
VW

Than hoạt tính
Chiều dài
Chiều rộng
Ngày (day)
Đường kính
Kinetin
Môi trường Murashige và Shoog
Nhà xuất bản
Protocom
Phó giáo sư
Thidiazuron
Tiến sĩ
Số trang (page)
Môi trường Vancin và Went

vii


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Phong lan Đai châu (Rhynchostylis gigantea) là một trong những loài lan bản
địa, quý của Việt Nam. Hoa lan Đai châu tên thường được gọi là Ngọc điểm, Nghinh
Xuân, thuộc họ Phong lan (Orchidaceae), bộ Măng tây (Asparagales), lớp Một lá mầm
(Monocotyledoneae) [15].

Đây là một loài lan có hoa đẹp, thường được trồng để trang trí, làm cảnh nên
được trồng rộng rãi và có giá trị kinh tế cao. Để đáp ứng được nhu cầu của con người
với số lượng lớn, chất lượng tốt thì việc nhân giống loài lan này bằng công nghệ nuôi
cấy mô tế bào thực vật (in vitro) đã mang lại hiệu quả [14].
Trong công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, cây sống trong môi trường nhân
tạo, được cung cấp tối ưu các chất dinh dưỡng, các loại phytohoocmon, đường, các
nguyên tố khoáng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển [4]. Độ ẩm của môi trường
nuôi cấy rất lớn, có thể lên tới 100% nên hàm lượng trong nước mô rất cao. Nhưng khi
cây đến giai đoạn ra ngôi và chuyển ra ngoài vườn ươm, cây ít được cung cấp các chất
dinh dưỡng cần thiết nên phải thích nghi với với sự thay đổi đột ngột của môi trường
sống trong một thời gian ngắn. Có thể cơ thể chúng sẽ có những biến đổi về hình thái,
sinh lý, hóa sinh rất đáng chú ý để thích nghi với môi trường mới. Tuy nhiên, những
nghiên cứu về sự biến đổi trên ở thực vật còn ít được thực hiện, đặc biệt là cây phong
lan Đai châu.
Với mong muốn nghiên cứu những biến đối hình thái sinh lý của cây phong lan
Đai châu, tìm ra những biện pháp luyện cây hiệu quả phù hợp, nâng cao năng xuất
nhân giống, tôi đã lựa chọn đề tài:
“Những biến đổi hình thái sinh lý của phong lan Đai châu (Rhynchostylis
gigantea) nuôi cấy mô giai đoạn ra ngôi và trong vườn ươm.”
2. Mục tiêu nghiên cứu đề tài
- Xác định những biến đổi hình thái của cây phong lan Đai châu có nguồn gốc
in vitro trong giai đoạn ra ngôi và trong vườn ươm.

1


- Xác định hàm lượng nước, động thái tích lũy chất khô và cường độ thoát hơi
nước của mô lá của cây phong lan Đai châu có nguồn gốc in vitro trong giai đoạn ra
ngôi và trong vườn ươm
- Xác định hàm lượng sắc tố quang hợp và hoạt tính peroxidase của cây phong lan

Đai châu có nguồn gốc in vitro trong giai đoạn ra ngôi và trong vườn ươm.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả của đề tài cung cấp các dẫn liệu khoa học về sự biến đổi hình thái, động
thái sinh lý, hóa sinh của phong lan Đai châu giai đoạn ra ngôi dưới tác động của môi
trường tự nhiên ex vitro.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu có thể dùng làm tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu nhân
giống cây lan Đai châu trong nuôi cấy mô thực vật và luyện cây trong vườn ươm.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU
1.1. Giới thiệu chung về phong lan Đai châu
1.1.1. Nguồn gốc và vị trí phân loại
Vào khoảng cuối thập niên 1800 loài lan này đã được tìm thấy bởi Carl Blume
(Đức). Thoạt tiên cây lan được xếp vào loài Sacolabium và sau đó chuyển sang
Rhynchostylis. Tên này dùng theo tiếng La tinh gồm 2 chữ: Rhynchos = beak = mỏ và
chữ stylos = pillar = cột trụ để tả theo hình dáng của trụ hoa.
Phong lan Đai châu có tên khoa học là Rhynchostylis gigantea, là một trong 3
loài (R. gigantea, R. retura và R. coelestis) thuộc Chi Ngọc điểm (Rhynchostylis), họ
Lan (Orchidaceae), bộ Lan (Orchidales), lớp một lá mầm (Monocotyledone), ngành
Ngọc Lan (Mangoliophyta) [2], [8], [31].
Ở Việt Nam, loài lan này ở mỗi vùng miền khác nhau thì có những tên gọi khác
nhau. Ở miền Bắc thường gọi là lan Đai châu vì hoa thường nở rủ xuống hình chuỗi
ngọc, miền Trung được gọi là lan Nghinh Xuân vì loại lan này này nếu mọc trong tự
nhiên thường nở trước lập xuân trùng vào dịp tết Nguyên Đán, còn miền Nam được gọi
là lan Ngọc Điểm vì hoa có 5 cánh dày dặn và khum lại tạo thành 1 vòng tròn, cánh
hoa màu trắng.

1.1.2. Vị trí phân bố
Họ lan là họ thực vật giàu loài nhất với 750 chi và 20000 – 25000 loài (theo
A.L.Takhtajan), đứng thứ hai sau họ Cúc Asteraccae trong ngành thực vật hạt kín và là
họ lớn nhất trong lớp Một lá mầm. Chính vì thế, hình thái, cấu tạo cũng như hệ thống
phân loại họ này hế sức đa dạng, phong phú [2], [8].
Trên thế giới, chi lan Đai châu có 3 loài với đặc điểm gần giống chi Vanda, phân
bố từ Ấn Độ qua Malaysia đến Philippines. Ba loài phân biệt thông qua các đặc điểm:
cánh môi chia 3 thùy, cụm hoa thẳng hay buông xuống và màu sắc của hoa [2].
Ở Việt Nam, họ lan có khoảng 152 chi, 897 loài, phân bố dọc đất nước từ Bắc
vào Nam. Với số lượng như vậy, chúng ta thấy được sự phong phú của hoa lan ở Việt
Nam [24].

3


Lan Đai châu là loài lan thích nghi với khí hậu nóng ẩm, thường phân bố ở các
khu rừng nhiệt đới của các nước Myanmar, Thailand, Malaysia, Lào, Cambodia, Việt
Nam, Đảo Hải Nam Trung Quốc, Borneo, Bangladesh và Philippines [24].
Ở Việt Nam, lan Đai châu phân bố ở các vùng cao nguyên Nam Trung Bộ , đặc
biệt là các vùng biên giới Lào và Campuchia ở độ cao thấp.
1.1.3. Đặc điểm hình thái
Phong lan Đai châu là loài sống phụ sinh, sống bám trên thân cây ở trong rừng,
cây có hệ rễ khí sinh phát triển mạnh. Mỗi rễ con có một lớp mô xốp bao bọc ở xung
quanh có khả năng hút lấy nước, muối khoáng và các chất dinh dưỡng trên bề mặt vỏ
cây gỗ. Rễ Đai châu khá to, đường kính khoảng 0,5 - 0,8 cm, dài có thể tới 1 mét. Do
vậy, giúp cây bám chặt vào bề mặt giá thể để giữ cây khỏi bị đổ, hoặc gió cuốn đi,
ngoài ra rễ còn chống đỡ cho cây mọc cao, vươn ra chỗ có nắng [5].
Lan Đai châu thuộc loại lan đơn thân, tăng trưởng theo chiều cao thẳng đứng,
thân ngắn và được bao bọc kín bởi các bẹ lá.
Đai châu có lá mọc cách, nguyên, hình dải rộng dài 13 - 40 cm, rộng 3 - 7 cm.

Lá có màu xanh đậm nổi các vạch trắng dọc, đỉnh chia hai thùy tròn, gốc có bẹ, lá dày
và rất bền, gân lá song song.
Hoa tập hợp thành cụm hay bông. Hoa lưỡng tính, đối xứng hai bên. Bao hoa
dạng cánh rời nhau xếp thành hai vòng: 3 mảnh vòng ngoài và 2 mảnh vòng trong bé hơn.
Cụm bông lớn, cong xuống, dài khoảng 20 - 30 cm, hoa màu trắng nhiều đốm tím, cánh
môi có vạch tím, đỉnh chia ba thùy nhỏ, cựa ngắn màu trắng [15].
Quả lan thuộc quả nang, nở ra theo 3 - 6 đường nứt dọc, quả có dạng trụ dài đến
hình trụ ngắn phình ở giữa. Khi chín, quả nở ra và mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở
phía đỉnh và phía gốc.
Hạt lan rất nhiều, hạt li ti. Hạt chỉ cấu tạo bởi một lớp chưa phân hoá, trên một
mạng lưới nhỏ, xốp, chứa đầy không khí. Hạt trưởng thành sau 2 - 18 tháng.
1.1.4. Đặc điểm sinh thái
Phong lan Đai châu là loại lan ưa thích khí hậu nóng ẩm vào ban ngày và lạnh
vào ban đêm. Trong rừng thường thường sống gần ngọn những cây có vỏ bị nứt chai.
 Nhiệt độ
4


Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến sự ra hoa ở một số loài lan. Đối với phong lan
Đai châu, để cây ra hoa đẹp, chùm hoa to, dài và thơm, thì đối với mùa hè nhiệt độ tối
ưu cho cây dao động từ 29 – 32ºC và phải có sự cách biệt tối thiểu giữa ngày và đêm là
10ºC. Đối với mùa đông, nhiệt độ ban ngày dao động từ 20 – 23ºC, nhiệt độ ban đêm
không được dưới 16ºC [3].
 Ánh sáng
Đai châu là loại lan ưa sáng khoảng 60%, ánh sáng trực tiếp dễ làm cây bị hỏng
lá, cường độ ánh sáng thay đổi từ 15000-20000 lux/m². Tuy nhiên, nếu cây lan được
trồng trong điều kiện quá tối, cây tăng trưởng chậm và yếu ớt, bộ rễ phát triển kém, cây
khó ra hoa. Nhưng sự ra hoa của cây phong lan Đai châu không phải do ánh sáng nhiều
hay ít mà do thời gian chiếu sáng trong ngày. Vì thế cây phong lan Đai châu thường nở
hoa vào dịp tết Nguyên Đán, tức vào thời điểm trong năm có ngày ngắn, đêm dài [3].

 Độ ẩm
Phong lan Đai châu là loại lan có khả năng chịu hạn khá tốt, nhưng với độ ẩm
cao từ 40 – 70% thì rễ càng mọc nhanh và phát triển tốt. Vào mùa hè, tưới nước từ 2 –
3 lần/ngày nếu trồng trên miếng gỗ, nếu trồng trong chậu với vỏ cây hay than thì chỉ
cần tưới 2-3 lần/tuần nhưng phải để cho khô rễ giữa 2 lần tưới và không được để rễ bị
úng nước trong chậu. Vào mùa đông thì tưới nước rất ít, chỉ 1 lần/tuần và cần phải để
khô lá và rễ trước khi trời tối [3].
 Độ thoáng
Độ thoáng gió là một trong những yếu tố rất cần giúp cây sinh trưởng. Nếu
vườn lan không được thoáng, nhất là độ ẩm cao trên 70%, nhiệt độ cũng tăng dễ làm
cho cây bị bệnh. Ngược lại, nếu vườn lan quá thoáng gió, làm độ ẩm giảm, lượng nước
bốc hơi quá lớn cây dễ héo, kém phát triển. Vì vậy, ở những nơi trồng quá thông
thoáng như sân thượng, đồng trống cần che lưới, trồng cây xung quanh [3].
 Giá thể
Cây phong lan Đai châu ưa nhiều loại giá thể khác nhau như: Than, thân cây, vỏ
cây, vỏ thông, gỗ vụn, rêu, xơ dừa. Than củi là một giá thể tốt giúp cây giữ độ ẩm,
không chứa mầm bệnh, không mục nát và có khả năng hút nước, hấp thụ chất dinh
5


dưỡng cao. Rêu có dạng sợi dài, thoáng xốp, giữ ẩm tốt và hấp thụ chất dinh dưỡng tốt
nhưng giá thành cao. Xơ dừa là giá thể dễ kiếm, giá thành rẻ nhưng nhược điểm là
thoát hơi nước nhanh, chóng mục nên cây dễ bị sâu bệnh… [3].
 Dinh dưỡng
Nhu cầu phân bón: Việc sử dụng phân bón cho lan Đai châu gần giống như
Vanda, tuy nhiên Đai Trâu có mùa nghỉ 3 tháng, từ đầu tháng 2 đến cuối tháng 4. Trong
suốt 3 tháng cây nghỉ, ta chỉ tưới nước 1 lần/ngày và hoàn toàn không cung cấp dưỡng
liệu cho cây. Vào tháng 12 khi cây lan chớm nụ hoa, ta thay phân NPK 30 : 10 : 10
bằng phân 10 : 20 : 20 và một tuần lễ trước khi hoa nở cho đến khi hoa tàn, ta lại thay
phân lần nữa từ phân 10 : 20 : 20 bằng phân 10 : 20 : 30, để tạo cho cây có sức chống

đỡ trong mùa nghỉ [3].
 Sâu bệnh
Cây phong lan Đai châu là loài bản xứ, vì thế khả năng chống chịu của nó rất
cao. Nó có khả năng chống lại hầu hết các loài sâu bệnh. Tuy nhiên một cây lan mới
được mang từ rừng về, được trồng ở nơi có nhiều ánh sáng trực tiếp, sẽ làm cho cây bị
bỏng lá và đây là cửa ngõ xâm nhập của một số loài nấm và virut, làm cho cây yếu và
chết.
 Kỹ thuật trồng
- Trồng cây lan từ chai mô
Khi trồng cây con (cây cấy mô) phải rửa sạch môi trường nuôi cấy dính trên
thân, lá, rễ cây, tránh bị côn trùng cắn phá và nhiễm bệnh. Có thể trồng bằng 1 trong 3
cách: Trồng bằng lưới, khay nhựa với giá thể là xơ dừa hoặc rổ thưa. Tùy vào điều kiện
từng nơi để có cách trồng phù hợp.
- Trồng cây lan từ việc tách cây
Trong phương pháp trồng này, cây được tách ra cần được ghép trên giá thể phù
hợp, thường là thân cây sống hoặc cũng có thể sử dụng thân cây chết (đã qua xử lí diệt
nấm).

6


+ Sử dụng thân cây còn sống, cây lan được trồng ghép phải nhận được ánh sáng
ban mai. Mục đích của việc trồng này nhằm tạo dựng lại một khung cảnh thiên nhiên
thu hẹp, vì thế số lượng giống phải nhiều và rất khó làm nổi bật vẻ đẹp.
+ Hoặc có thể sử dụng thân cây đã chết để trồng. Cách này nên khuyến khích vì
mật độ trồng cao, cây phát triển nhanh, ít bị bệnh.
+ Sử dụng xơ dừa để trồng, buộc một miếng xơ dừa vào thân cây rồi buộc chồng
lên đó gốc lan muốn trồng để giữ độ ẩm cây. Vào mùa mưa hay những nơi thời tiết quá
ẩm không cần dùng xơ dừa. Khi buộc phải để gốc lan nằm lộ ra ngoài không khí, rễ lan
ló ra.

1.1.5. Giá trị của phong lan Đai châu
Hoa lan luôn được con người ngưỡng mộ nhờ có vẻ đẹp rực rỡ, quý phái, hương
thơm kín đáo nhưng lại rất tao nhã và thanh cao. Ngày nay, chơi lan đã được nâng lên
thành nghệ thuật và nghề trồng lan cũng đã được phát triển thành ngành công nghiệp
có lợi nhuận cao.
Hoa lan Đai châu thường nở vào mùa xuân, trong dịp Tết cổ truyền của người
thơm ngát, lan tỏa nên hoa lan Đai châu ngày càng được người tiêu dùng ưa chuộng.
Ngoài việc sử dụng với mục đích làm cảnh, ở một số nước như Banglades, lá lan Đai
châu còn được sử dụng với mục đích chữa bệnh như làm giảm đau, chống viêm [22].
Lan Đai châu không chỉ phục vụ các nhu cầu giải trí, thưởng thức cái đẹp của
con người, đồng thời cũng đã tạo ra được một nguồn lợi kinh tế quan trọng. Theo các
chuyên gia về lan, nghề trồng lan đã đem lại lợi nhuận không nhỏ cho người dân. Nếu
trồng phong lan cắt cành mỗi ha đất trồng có thể thu nhập 500 triệu đến 1 tỷ đồng/năm,
cao hơn nhiều lần so với trồng lúa và một số hoa màu khác [4].
Lan Đai châu là lan nhiệt đới. Trên thế giới, cây phân bố ở Myanma, Thái Lan,
Malaysia, Lào, Campuchia, Việt Nam, Trung Quốc và Philippines…. Hiện nay, lan Đai
châu được sản xuất nhiều nhất ở Thailand và Đài Loan.
Thái Lan và là quốc gia sản xuất và xuất khẩu hoa lan lớn nhất thế giới, 50%
hoa lan ở Thái Lan được trồng để xuất khẩu, 50% còn lại tiêu thụ trong nước. Hàng
năm, Thái Lan sản xuất tới 31,6 triệu cây con. Trong đó gồm các chi Hoàng thảo
7


(Dendrobium), Mokara và lan Đai châu và hoa phong lan Đai châu được coi là một
trong những loài hoa đẹp nhất.
Ở Đài Loan, diện tích trồng hoa lan là 484 ha. Lan Hồ điệp của Đài Loan được
cả thế giới ngưỡng mộ và trở thành nơi sản xuất lan Hồ điệp chủ yếu trên toàn cầu
[38]. Những năm gần đây, Đài Loan cũng đang tập trung phát triển mạnh các loài lan
có giá trị kinh tế cao như Cát lan (Cattleya), lan Hoàng thảo (Dendrobium), lan Vũ
nữ (Oncidium), lan Đai châu (Rhynchostylis). Chất lượng hoa thương phẩm tốt, hoa

lan của Đài Loan đã được tiêu thụ khắp nơi trên thế giới.
Ở Việt Nam, hoa lan tập trung chủ yếu ở 3 vùng: miền Bắc (Hà Nội, Vĩnh Phúc,
Lào Cai, Quảng Ninh), ngoại thành TP. Hồ Chí Minh (Hóc Môn Củ Chi) và Lâm Đồng
(Đà Lạt, Đức Trọng, Lạc Dương, Đơn Dương), với 85% là hoa hồng, cúc và lan. Năm
2010, doanh thu từ xuất khẩu hoa đạt khoảng 60 triệu USD.
Ở miền Bắc, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Nghiên cứu Rau quả, Học viện
Nông nghiệp Việt Nam,... trong những năm vừa qua đã tập trung nghiên cứu phương
pháp nhân giống vô tính in vitro. Kết quả đã sản xuất mỗi năm được hàng vạn giống
hoa lan có giá trị kinh tế cao, trong đó có lan Đai châu.
Lan bản địa nói chung và lan Đai châu nói riêng chủ yếu phát triển nhỏ lẻ và
được nuôi trồng với quy mô hộ gia đình, ở nhiều tỉnh thành trên cả nước. Ở các xã
Đông La, La Phù, La Khê thuộc huyện Hoài Đức, thành phố Hà Nội những năm gần
đây trở nên nổi tiếng với nghề trồng lan, chủ yếu là Tam Bảo Sắc, Phi diệp thuộc chi
Hoàng thảo và lan Đai châu, Đuôi chồn thuộc chi Ngọc điểm
Bên cạnh Đông La, một số địa phương như Gia Lâm, Đông Anh (Hà Nội), Văn
Giang (Hưng Yên), Tiên Du (Bắc Ninh), Phổ Yên (Thái Nguyên) cũng đang có nhiều
hộ gia đình tập trung đầu tư vào sản xuất và nuôi trồng phong lan bản địa, với quy mô
từ 300-500m2, phổ biến là các loài Đai châu, Đuôi cáo, Hoàng thảo, Quế lan hương [6].
Bằng kỹ thuật nhân giống vô tính, hàng năm Trung tâm Giống và Kỹ thuật cây trồng,
thuộc Sở Nông nghiệp và phát triển nông thôn Phú Yên, đã cung ứng 250.000 cây phong lan
cho các doanh nghiệp tại thành phố Hồ Chí Minh để xuất khẩu. Dự kiến, mỗi năm Trung
tâm sẽ cung cấp khoảng 300.000 – 500.000 cây phong lan để xuất khẩu sang Canada, Đài
Loan. Các giống hoa lan bao gồm Hoàng thảo, Đai châu, Monkada…[19].
8


1.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô - tế bào thực vật
Kỹ thuật nhân giống in vitro đã được phát triển trên những cơ sở lý thuyết về tế
bào học và cơ sở sinh lý thực vật.

1.2.1.1. Tính toàn năng của tế bào
Cuối thế kỉ XIX đầu thế kỉ XX, nhà sinh lí thực vật người Đức Haberlandt
(1902) đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả
năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh.
Theo quan niệm sinh học hiện đại thì: “Mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều
mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó. Khi
gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh”.
Đó chính là tính toàn năng của tế bào.
Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt đã nêu ra chính là cơ sở lý luận của
phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật.
Cho đến nay, con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh của
một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [17].
1.2.1.2. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ
quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau thực hiện các chức
năng cụ thể khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ tế bào phôi
sinh.
Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô
chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Tuy nhiên, khi tế bào đã
phân hoá thành mô chức năng chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của
mình. Trong trường hợp cần thiết, điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế
bào phôi sinh và lại phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là sự phản phân hoá tế bào,
ngược lại với sự phân hoá tế bào.
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô - tế bào thực vật thực chất là kết
quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. Kĩ thuật nuôi cấy mô - tế bào xét
cho đến cùng là kĩ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi
9


cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo, vô trùng) một cách định hướng dựa và sự phân hóa

và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật.
Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung
vào trong môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật đó là auxin
và cytokinin. Tỷ lệ hai nhóm chất này trong môi trường sẽ kéo theo sự phát sinh hình
thái khác nhau của thực vật [17].
1.2.1.3. Sự trẻ hóa
Vào thế kỉ XVII, XVIII người ta cho rằng các dòng vô tính bị thoái hóa đi theo
tuổi và chỉ có thể trẻ hóa thông qua sinh sản bằng hạt. Song thực tế cho thấy rằng đời
sống một dòng vô tính là vô hạn nếu nó sống trong một môi trường thích hợp và liên
tục đổi mới bằng sinh trưởng sinh dưỡng. Nguyên nhân thoái hóa chủ yếu là do tác hại
của virus.
Trong nuôi cấy in vitro, khả năng ra chồi, rễ ở các thành phần khác nhau là rất
khác nhau. Vì vậy để chọn mẫu cấy phù hợp phải căn cứ vào trạng thái sinh lý hay tuổi
mẫu: các mẫu non trẻ có sự phản ứng với các điều kiện và môi trường nuôi cấy nhanh,
dễ tái sinh, đặc biệt trong nuôi cấy mô sẹo, phôi. Ngoài ra mô non trẻ mới được hình
thành, sinh trưởng mạnh, mức độ nhiễm mầm bệnh ít hơn. Vì vậy việc trẻ hoá là một
biện pháp quan trọng nhất trong nhân giống sinh dưỡng [17].
1.2.2. Các giai đoạn của nuôi cấy mô – tế bào thực vật
1.2.2.1. Giai đoạn chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Cây mẹ (là cây cho nguồn mẫu nuôi cấy) được đưa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên
để chúng thích ứng với môi trường mới, đồng thời giảm bớt khả năng nhiễm bệnh của
mẫu nuôi cấy và chủ động nguồn mẫu trong công tác nhân giống. Cây mẹ phải sạch
bệnh, đặc biệt là bệnh virut và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Thông thường, cây mẹ là
cây có những tính trạng tốt, đạt tiêu chuẩn của các nhà chọn giống hoặc là những đối
tượng đang có nguy cơ tuyệt chủng. Trong trường hợp cần thiết có thể làm trẻ hoá vật
liệu giống [16].
1.2.2.2. Giai đoạn nuôi cấy khởi động
Là giai đoạn khử trùng và đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Khi đã có nguồn
nguyên liệu nuôi cấy, tiến hành lấy mẫu và xử lý mẫu cấy trong những điều kiện vô
10

trùng. Khi lấy mẫu cần chọn loại mẫu cấy phù hợp: đúng loại mô, đúng giai đoạn phát
triển: người ta thường lấy chồi đỉnh hay chồi nách để nuôi cấy in vitro. Ngoài ra cũng
có thể sử dụng đoạn thân, mảnh lá, ... để tiến hành nuôi cấy. Người ta thường sử dụng
một số loại hoá chất như: HgCl2 0,1%, cồn 700, H2O2, Ca(OCl)2... để khử trùng mẫu
cấy. Để tăng tính linh động của hóa chất diệt khuẩn, người ta thường sử dụng thêm các
chất làm giảm sức căng bề mặt như tween 20, tween 80, teepol... Mẫu sau khi được
khử trùng được cấy vào môi trường nuôi cấy khởi động.
Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm bệnh thấp, tỷ lệ sống cao,
mô tồn tại và sinh trưởng tốt [16].
1.2.2.3. Giai đoạn nhân nhanh
Một trong những ưu thế lớn nhất của phương pháp nhân giống in vitro so với
các phương pháp nhân giống truyền thống là có hệ số nhân cao. Vì vậy giai đoạn nhân
nhanh được coi là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhân giống. Giai đoạn này
sẽ kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua các con
đường: Hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính. Phải xác định được
môi trường dinh dưỡng và môi trường vật lý phù hợp để đạt hiệu quả cao nhất. Vai trò
của các chất điều hòa sinh trưởng, chất phụ gia (nước dừa, khoai tây...) là đặc biệt quan
trọng. Tăng cường chiếu sáng (16 giờ/ngày, cường độ ánh sáng tối thiểu 1000 lux, ánh
sáng tím) là yếu tố quan trọng kích thích mô phân hoá mạnh. Bảo đảm chế độ nhiệt 20
- 300C. Yêu cầu cần đạt được trong giai đoạn này là tạo được hệ số nhân cao [16].
1.2.2.4. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
Đây là giai đoạn các chồi đã đạt kích thước nhất định và được chuyển từ môi
trường ở công đoạn 3 sang môi trường nuôi cấy tạo rễ để hình thành cây hoàn chỉnh. Ở
giai đoạn này môi trường cần giảm lượng cytokinin và tăng lượng auxin để rễ phát
triển (Pierik, 1987). Các chất α - NAA, IBA, IAA thường được sử dụng ở nồng độ 1 - 5
mg/l để tạo rễ cho hầu hết các loài cây trồng. Từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện
rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Lúc này cây con rất nhạy cảm với ẩm độ và bệnh tật do
hoạt động của lá và rễ mới sinh rất yếu, cây chưa chuyển sang giai đoạn tự dưỡng. Yêu

cầu cần đạt được trong giai đoạn này: Cây con tạo ra đủ tiêu chuẩn (chiều cao, số lá, số
rễ) [16].
11


1.2.2.5. Giai đoạn đưa cây mô ra ngoài vườn ươm
Đây là giai đoạn chuyển dần cây con từ ống nghiệm ra nhà kính rồi ra ngoài trời
để tạo điều kiện cho cây con tự dưỡng hoàn toàn và thích nghi dần với môi trường tự
nhiên. Khi cây đủ tiêu chuẩn cứng cáp thì mang trồng. Để đưa cây từ ống nghiệm ra
môi trường bên ngoài đạt tỷ lệ sống cao cần đảm bảo một số yêu cầu:
+ Cây trong ống nghiệm đạt những tiêu chuẩn về hình thái nhất định: chiều cao
cây, số lá, số rễ.
+ Giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể tơi xốp, thoát nước, sạch bệnh.
+ Phải giữ ẩm cho cây khi mới đưa cây từ ống nghiệm ra, cần duy trì độ ẩm trên
50% để cây con không mất nước đặc biệt trong 2 - 3 tuần lễ đầu, tránh ánh sáng quá
mạnh gây cháy lá, tránh nhiễm khuẩn và nấm gây hiện tượng thối nhũn.
Điều kiện môi trường trong giai đoạn này là rất quan trọng, cần tạo điều kiện
cho bộ rễ phát triển, cứng cáp và phòng bệnh cho cây. Đây được xem là công đoạn
quyết định khả năng ứng dụng quy trình này trong thực tiễn sản xuất [16].
1.2.2.6. Giai đoạn luyện cây trong nhân giống in vitro
Đây là giai đoạn quan trọng trong quy trình nhân giống vô tính vì cây con dễ bị
chết do sự khác biệt về điều kiện sống giữa in vitro và ex vitro. Cây in vitro được nuôi
cấy trong điều kiện ổn định dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm nên khi chuyển sang
môi trường mới với điều kiện hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng có
cường độ mạnh, nhiệt độ cao, độ ẩm thấp… cây con dễ bị stress, dễ mất nước và mau
héo dẫn đến hiện tượng chết [9].
Ở giai đoạn này cây con phải chịu nhiều sự thay đổi của môi trường sống để
thích nghi với điều kiện mới thì chúng phải có những biến đổi nhất định về sinh lý thay
đổi các thông số quang hợp đảm bảo khả năng tự dưỡng của cây trồng với tỷ lệ tương
ứng với điều kiện tự nhiên, hàm lượng diệp lục tăng lên giúp cây thích nghi với điều

kiện ánh sáng cao, độ ẩm không khí giảm, bộ rễ phát triển giúp cây hút nước nhờ đó
mà cây tồn tại, sinh trưởng và phát triển được [9].

12


1.3. Các nghiên cứu về phong lan Đai châu
1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới
Phong lan Đai châu là lan đơn thân, vì vậy, không thể nhân giống bằng tách
thân. Hạt lan Đai châu cũng rất khó mọc được trong điều kiện tự nhiên nên phương
pháp nhân giống in vitro là phương pháp tối ưu để nhân giống loại lan này. Các tác giả
trên thế giới đã quan tâm nghiên cứu về phương pháp nhân giống từ hạt trên môi
trường nhân tạo. Các tác giả Zhi-Ying Li and Li Xu (2009) [33] đã nghiên cứu nhân
nhanh giống hoa lan Đai châu đột biến, màu trắng Rhynchostylis gigantean thông qua
protocom (PLB) từ hạt chưa trưởng thành (nuôi cấy phôi 4 tháng tuổi), 75% PLB phát
triển trên môi trường MS với 0,05 mg/l 6-BAP và 0,2 mg/l NAA trong vòng 70 ngày
kể từ ngày chuyển đến môi trường MS với 2,0 mg/l BAP và 1,0 mg/l NAA đã tạo thành
mô sẹo và sau đó phát triển thể chồi với 2 – 4 lá. Môi trường phát sinh chồi là MS có
chứa 100 g/l chuối nghiền, rễ và chồi sinh trưởng thuận lợi. Cây con sau in vitro đạt
95% sống sót.
Tương tự, Dennis Thomas and Alwin Michael (2007) [45] đã nghiên cứu trên
môi trường này có bổ sung 15% nước dừa, cho thấy 93% các mô nuôi cấy tái sinh
thành cây con sau 90 ngày. Cây con được cấy chuyển trên môi trường MS có bổ sung
kinetin (Kn) hoặc thidiazuron (TDZ), có hoặc không có than hoạt tính (AC), cho hình
thành sự đa chồi cao. Số lượng chồi nhiều nhất là 8,2 chồi đã được quan sát trên môi
trường MS có bổ sung 2 TDZ mM và AC. Các chồi được tạo rễ trên môi trường ½ MS
có bổ sung 2 mM axit indole-3-butyric (IBA) và được ra ngôi thành công. Trong số 45
cây con được ra ngôi có 40 cây sống sót. Kết quả của các tác giả rất hữu ích trong nhân
nhanh giống và bảo tồn các loài phong lan quý này.
Năm 2010, Distabanjong [22] đã sử dụng hạt phong lan Rhynchostylis gigantea

được lấy từ quả 7 – 9 tháng và nuôi cấy trên môi trường rắn để làm tăng khả năng nảy
mầm của hạt giống. Tỷ lệ nảy mầm đạt cao nhất của Rhynchostylis thu được trên môi
trường Vacin và Went (VW), có bổ sung 150ml/l nước dừa và 100g/l dịch chiết khoai
tây. Các môi trường nhân nhanh tốt nhất (tăng 1,7 lần so với trọng lượng tươi ban đầu
trong vòng 9 tháng) là VW có bổ sung 150ml/l nước dừa và 1 mg/l phân bón phong lan
(công thức 21-21-21). Việc bổ sung 2 – 4% mannitol là nồng độ tốt nhất cho sự duy trì
13


sinh trưởng, chậm kéo dài trong 12 tháng mà không làm thay đổi môi trường. Tất cả
các cây đều sinh trưởng tốt sau khi chuyển sang môi trường nhân nhanh.
Nhìn chung các biện pháp nhân giống đã được các tác giả trên thế giới nghiên
cứu thành công, từ nuôi cấy hạt chưa trưởng thành, hạt trưởng thành và từ đỉnh sinh
trưởng trong ống nghiệm. Các tác giả cũng đã xác định được môi trường nuôi cấy,
nhân nhanh và tạo cây hoàn chỉnh. Trong đó, có sử dụng cả môi trường hóa sinh và các
chất tự nhiên. Chất lượng cây giống sau nuôi cấy đạt tiêu chuẩn, có thể đáp ứng cho
sản xuất.
Các tác giả trên thế giới cũng đã quan tâm nghiên cứu về quang chu kỳ và kỹ
thuật tác động nhằm tăng khả năng sinh trưởng, phát triển của cây. Kannika Banyai et
al. (2010) [28] đã nghiên cứu ảnh hưởng của quang chu kỳ và axit gibberilic (GA3) đến
sự ra hoa trái mùa của lan Rhynchostylis gigantea. Cây 2,5 năm tuổi đặt trong điều kiện
tự nhiên và trong điều kiện ngày ngắn (10:14h sáng: tối) phun GA3 3000 ppm và đối
chứng không ứng dụng GA3, từ tháng 6 đến tháng 9. Kết quả thấy rằng khi cây chỉ
được xử lý ngày ngắn hoặc chỉ được phun GA3 3.000 ppm và xử lý ngày ngắn với
phun GA3 3.000 ppm cho hoa sớm hơn đáng kể so với đối chứng cây trồng trong điều
kiện tự nhiên.
Watthanasrisong et al. (2010) [42] đã nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện ngày
ngắn với nhiệt độ thấp đến sinh trưởng của lan Rhynchostylis gigantea 3 năm tuổi
trong điều kiện tự nhiên hoặc ngày ngắn (sáng:tối là 10:14 giờ) với nhiệt độ thấp
(18°C) vào các thời điểm khác nhau trong năm (tháng 3, tháng 4 và tháng 5), là 30, 60

và 90 ngày. Kết quả cho thấy, cây hoa lan xử lý trong điều kiện nhiệt độ thấp, trong
tháng 4 và xử lý ngày ngắn 90 ngày cho thời gian ra hoa dài hơn những cây trong điều
kiện tự nhiên khoảng 40 ngày. Những cây trồng trong tháng 5 trong điều kiện ngày
ngắn 30 ngày, cho thời gian ra hoa dài nhất và có ý nghĩa nhất so với các điều kiện
khác. Hoa của những cây được trồng trong tháng tư, xử lý ngày ngắn 30 ngày có ý
nghĩa đáng kể hơn so với những cây phát triển trong điều kiện tự nhiên khoảng 6 ngày.
1.3.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam
Ở Việt Nam, nhân giống in vitro hoa lan cũng đã được phát triển từ khá lâu và
đến nay đã thu được một số kết quả.
14


Năm 2005, trường Đại học Nông nghiệp I - Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu xây
dựng quy trình kỹ thuật sau in vitro cho cây Địa Lan (Cymbidium) của Nguyễn Quang
Thạch và cộng sự cho thấy: giá thể thích hợp nhất để ra cây in vitro là dớn, sau 3 tháng
trồng ở vườn ươm cấp I chuyển sang trồng ở vườn ươm cấp II với giá thể.
Năm 2010, Đặng Văn Đông và cộng sự [7] đã nghiên cứu phương pháp tưới
nước cho lan Đai châu tại Gia Lâm – Hà Nội cho thấy: tưới kết hợp phun sương và tưới
bằng vòi hoa sen cho hiệu quả sinh trưởng mạnh nhất và tỷ lệ ra hoa đạt 90%.
Theo Trần Minh Hiền Trang [18] phương pháp tưới nước cho lan Đai châu bằng
phun sương hạt to là hiệu quả nhất, số rễ đạt 6,17 rễ, chiều dài rễ 27,06 cm, số lá 8,15
lá và chiều dài lá là 22,59 cm, chiều dài cành hoa là 18,12 cm.
1.3.3. Các nghiên cứu về giai đoạn luyện cây
Các nghiên cứu về các đặc điểm hình thái, sinh lí của cây trồng trước những
biến đổi của khí hậu, điều kiện nuôi trồng cũng được quan tâm sâu sắc. Cây có nguồn
gốc in vitro có các đặc điểm không tự nhiên, thích ứng với môi trường nhân tạo có
nhiều đường, phytohormon [40], [41]. Khi chuyển ra môi trường tự nhiên có sự thay
đổi các đặc điểm của cây in vitro. Cây thuốc lá khi chuyển từ trạng thái in vitro sang ex
vitro sau 35 ngày có sự biến đổi về hàm lượng diệp lục, khả năng quang hợp và hàm
lượng tinh bột [26], [30]. Tương tự, cây phong lan Doritaenopsis in vitro cũng có

những sự thay đổi về đặc điểm của hệ sắc tố quang hợp (tăng tỉ lệ carotenoid), hình thái
lá sau 30 ngày luyện cây ex vitro [28]. Trên phương diện hóa sinh, sự giảm hoạt tính
enzym sucrose-p-synthase và sự hoạt hóa ADPG pyrophosphorylase được báo cáo ở
cây Spathiphyllum sau giai đoạn luyện cây [41]. Sự hóa gỗ của cây trong quá trình
luyện ex vitro cũng được nghiên cứu ở cây Sorbus domestica [26], [29], cây dâu [40],
cây dương [36].

15


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Cây phong lan Đai châu (Rhynchostylis gigantea) thuộc họ phong lan
(Orchidaceae), giống Rhynchostylis có nguồn gốc nuôi cấy mô tại trung tâm nghiên
cứu Công nghệ Sinh học, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Hùng Vương.
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu
- Đề tài nghiên cứu hình thái và các chỉ tiêu sinh lý của cây phong lan Đai châu
giai đoạn ra ngôi và trong vườn ươm.
- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 09/2015 đến tháng 05/2016
- Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm nghiên cứu Công nghệ sinh học và Phòng
thực hành Sinh học của khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Hùng Vương – Thị
xã Phú Thọ - Tỉnh Phú Thọ.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu sự thay đổi của hình thái cây phong lan Đai châu giai đoạn ra ngôi
và trong vườn ươm
- Nghiên cứu cường độ thoát hơi nước của mô lá phong lan Đai châu giai đoạn
ra ngôi và trong vườn ươm
- Nghiên cứu hàm lượng nước và hàm lượng tích lũy chất khô của cây phong
lan Đai châu giai đoạn ra ngôi và trong vườn ươm

- Khảo sát hàm lượng sắc tố quang hợp của lá cây phong lan Đai châu giai đoạn
ra ngôi và trong vườn ươm
- Khảo sát hoạt độ của enzym peroxidase của lá cây phong lan Đai châu giai
đoạn ra ngôi và trong vườn ươm
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu hình thái
Trong quá trình luyện cây ex invitro, chọn những cây lan Đai châu trong bình
thí nghiệm to, khỏe, phát triển tốt, có từ 3 - 4 lá và 4 - 5 rễ to dài. Để nghiên cứu hình
thái, ở mỗi mẫu chọn chiếc lá thứ 2 từ trên xuống, rễ thì chọn rễ mập, chắc, khỏe có
sức sống tốt.
16


Các chỉ tiêu về kích thước rễ, thân, lá được xác định bằng thước palmer (Mitutoyo
digimatic micrometer, Nhật) có độ chính xác tới milimet. Bắt đầu đo lần đầu tiên khi
cây vừa được lấy ra từ trong bình thí nghiệm có nguồn gốc in vitro (D0), dùng bút đánh
dấu các vị trí đo ở rễ, thân, lá để làm dấu hiệu cho những lần đo tiếp theo sau khi trồng
trên giá thể 28 ngày (D28) và 84 ngày (D84).
2.3.2. Xác định các chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh
Cây phong lan Đai Châu được sử dụng trong các thí nghiệm nghiên cứu về chỉ
tiêu sinh lý, hóa sinh ở các giai đoạn:
+ D0: Cây trong bình thí nghiệm có nguồn gốc in vitro
+ D7: Cây trong bình thí nghiệm có nguồn gốc in vitro để ngoài cửa sổ 1 tuần
+ D14: Cây cho ra ngoài môi trường, đặt trên giá 1 tuần.
+ D28: Cây trồng trong giá thể ở nhà lưới 1 tháng
+ D84: Cây trồng trong giá thể ở nhà lưới 3 tháng
2.3.2.1. Xác định hàm lượng nước, hàm lượng chất khô [11]
Lấy cây lan Đai châu cân trên cân kỹ thuật được khối lượng tươi (Mt), sau đó cho
vào tủ sấy ở nhiệt độ 105oC trong 2h. Sau đó tiếp tục sấy ở 80oC trong vòng 24h. Cân
tiếp đến khi cây có khối lượng không đổi ta thu được khối lượng khô (Mk).

Hàm lượng nước được tính theo công thức:
Mt – Mk
H (%) =

x 100
Mt

Trong đó: H là hàm lượng nước ( % )
Mt là khối lượng tươi ban đầu của cây (g)
Mk là khối lượng khô của cây (g)
Hàm lượng chất khô của cây tính theo công thức:
Mk
K (%) =

x 100
Mt

Trong đó: K là hàm lượng chất khô của cây (%)
Mt là khối lượng tươi ban đầu của cây (g)
Mk là khối lượng khô của cây (g)
17


2.3.2.2. Cường độ thoát hơi nước của mô lá [11]
Thoát hơi nước làm giảm khối lượng của lá cây. Do đó trong thời gian ngắn (60
phút) có thể đo được cường độ thoát hơi nước của cây theo mức giảm khối lượng của
lá
Lấy lá cây lan Đai châu ra khỏi bình, rửa nhẹ nhàng bằng nước cất, dùng giấy
thấm nước thấm khô. Cho lá lên cân (m1) rồi dùng đồng hồ bấm giờ trong thời gian 60
phút rồi cân lại (m2). Sau đó đặt lá lên tờ giấy A4. Lấy bút chì kim vẽ lại hình của lá.

Lấy kéo cắt theo hình của lá cây lan Đai châu rồi đêm cân (T1). Cắt 1 mảnh giấy có
diện tích 1dm2 rồi đem đi cân (T2)
Cường độ thoát hơi nước theo công thức:
(m1 - m2)x60
I (g/dm2/giờ) =
txS
Trong đó: I là cường độ thoát hơi nước
m1 là khối lượng tươi ban đầu của lá
m2 là khối lượng tươi của lá sau 5 phút thoát hơi nước
t là thời gian thoát hơi nước của lá
S là diện tích của lá cây thí nghiệm
Diện tích của lá cây thí nghiệm tính theo công thức:
T1
2

S (dm ) =
T2
Trong đó: T1 là khối lượng giấy cắt theo hình lá cây lan Đai châu
T2 là khối lượng giấy có diện tích 1dm2
2.3.2.3. Phương pháp định lượng sắc tố quang hợp [11]
Hàm lượng sắc tố quang hợp được đo bằng máy quang phổ hấp phụ UV-VIS
GENESYS 10uv (Thermo Electron Corporation, Mỹ).
Cân 0.2g lá cây rồi nghiền trong cối xứ với 2ml axeton 80%. Sau khi lá đã được
nghiền nhuyễn, thêm 5ml axeton 80% vào tiếp tục nghiền. Sau khi li tâm đổ dung dịch
nghiền được sang ống đong, cho thêm axeton 80% vào tráng cối, rồi lại đổ vào ống
đong đó làm sao cho đạt được đủ10ml.
18