THỬ NGHIỆM ĐỘC LỰC CHỦNG Aeromonas hydrophila ĐỘT BIẾN NHẰM ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VACCINE NGỪA BỆNH NHIỄM TRÙNG HUYẾT CHO CÁ TRA

 

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THỬ NGHIỆM ĐỘC LỰC CHỦNG Aeromonas hydrophila
ĐỘT BIẾN NHẰM ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU
SẢN XUẤT VACCINE NGỪA BỆNH
NHIỄM TRÙNG HUYẾT
CHO CÁ TRA

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: CHAU PHI RINNE

Niên khóa

: 2009– 2013

Tháng 06/2013
 
 

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THỬ NGHIỆM ĐỘC LỰC CHỦNG Aeromonas hydrophila
ĐỘTBIẾNNHẰM ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU
SẢN XUẤT VACCINE NGỪABỆNH
NHIỄM TRÙNGHUYẾT
CHO CÁ TRA

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. VŨ THỊ THANH HƯƠNG

CHAU PHI RINNE

Tháng 06/2013
 
 
 


LỜI CÁM ƠN
 

Với tất cả lòng kính trọng, tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường

Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ
Sinh Học đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.
Cảm ơn các thầy cô trong Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, đặc biệt là cô Tô Thị
Nhã Trầm, các thầy cô trong và ngoài trường đã tận tình giảng dạy truyền đạt mọi kiến
thức và kinh nghiệm quý báo cho tôi trong suốt quá trình học tại trường.
Xin gửi lời tri ân sâu sắc đến cô Vũ Thị Thanh Hương đã tận tình hướng dẫn,
giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa luận.
Xin cảm ơn các anh, chị công tác tại Phòng Công Nghệ Sinh Học Thủy Sản,
Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Thành Phố Hồ Chí Minh, đặc biệt là anhLê Văn
Hậu,chị Trương Ngọc Thùy Liên đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập tại
Trung Tâm.
Cảm ơn các anh, chị và các bạn cùng thực tập tại Phòng Công Nghệ Sinh Học
Thủy Sản, Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Thành Phố Hồ Chí Minh đã khuyến
khích, ủng hộ, giúp đỡ tôi thực hiện tốt khóa luận này.
Gửi lời cảm ơn đến các bạn bè thân yêu lớp DH09SH và những người bạn thân
yêu khác của tôi, các bạn đã luôn ở bên cạnh, động viên, ủng hộ, giúp đỡ, chia sẽ
những vui buồn cùng tôi suốt thời gian qua.
Con xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến ba mẹ và các thành viên trong gia đình đã
quan tâm, chăm sóc, luôn làm chỗ dựa vững chắc cho con vượt qua mọi khó khăn.
Sinh viên thực hiện

CHAU PHI RINNE

i


TÓM TẮT
Vi khuẩn Aeromonas hydrophila được xác định là nguyên nhân chính gây bệnh
nhiễm trùng huyết trên cá Tra, hàng năm gây thiệt hại lớn về sản lượng nuôi trồng thủy
sản nói chung. Sản xuất vaccine phòng bệnh nhiễm trùng huyết (bệnh đốm đỏ)là một

biện pháp được đánh giá cao vì những lợi ích về kinh tế và môi trường. Đáp ứng nhu
cầu trên đề tài “Thử nghiệm độc lực chủng Aeromonas hydrophila đột biến nhằm ứng
dụng trong nghiên cứu sản xuất vaccinengừa bệnh nhiễm trùng huyết cho cá Tra” đã
được đề ra phục vụ cho nghiên cứu “Tạo chủng Aeromonas hydrophila nhược độc có
tiềm năng làm vaccine ngừa bệnh nhiễm trùng huyết trên cá Tra” của Trung tâm Công
nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh.
Cá Tra thử nghiệm được tiêm chủng A. hydrophilađột biếnvà chủng A.
hydrophilahoang dại với nồng độ từ 103 – 107 cfu/ml.Sau đó, đánh giá hiệu quả bảo vệ
của chủng A. hydrophilađột biến, nhược độc thông qua hệ số RPS.
Kết quả: chủng A. hydrophila hoang dại có độc lực cao, ở nồng độ 103 cfu/ml
gây chết 60% cá, ở nồng độ 107 gây chết 100% cá.Chủng A. hydrophila đột biến bị
giảm độc lực ở nồng độ 105, 106 cfu/ml không gây chết cá (so với chủng A. hydrophila
hoang dại gây chết lần lượt 91%, 93% cá), 107 cfu/ml gây chết 40% cá (so với chủng
A. hydrophila hoang dại gây chết 100% cá).

ii


SUMMARY
 

Thesis “Experimental Aeromonas hydrophila strains virulent mutants to study
applications in vaccine production for septicemia of catfish”.
BacteriaAeromonas hydrophila were identified as the main cause of septicemia
of catfish, causing major damage each year in aquaculture productionl. Vaccine
production sepsis is a measure of appreciation for the economic benefits and
environmentalbenefits. Meeting the needs of the project "Experimental Aeromonas
hydrophila strains virulent mutants to study applications in vaccine production for
septicemia of catfish" has been proposed for the study "Creating Aeromonas
hydrophila strain disadvantages toxic potential vaccine septicemia of catfish "of the

Biotechnology Center of Ho Chi Minh city.
Catfish immunized test A. hydrophila mutant and strains of A. hydrophilawild
with a concentration of 103-107 cfu/ml. Then evaluate the protective effect of strain A.
hydrophila mutant, attenuated through the RPS.
The strains of A. hydrophila virulent wild high concentration of 103 cfu/ml
caused 60% of the fish died, at a concentration of 107 100% lethal fish. Strains of A.
hydrophila mutant was attenuated in a concentration 105, 106 cfu/ml did not cause fish
kills (compared with wild-type strains of A. hydrophila lethal 91%, respectively, 93%),
107 cfu/ml 40% lethal fish (compared with wild-type strains of A. hydrophila caused
100% mortality of fish).
Key word: virulent strains A. hydrophila mutant,
hydrophilawild.

iii

virulent strains A.


MỤC LỤC
Trang
Lời cám ơn ........................................................................................................................ i
Tóm tắt .............................................................................................................................ii
Summary ........................................................................................................................ iii
Danh sách các chữ viết tắt .............................................................................................. vi
Danh sách các bảng .......................................................................................................vii
Danh sách các hình ...................................................................................................... viii
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1
1.2 Yêu cầu đề tài ............................................................................................................ 2
1.3Nội dung thực hiện ..................................................................................................... 2

2.1. Tổng quan về Aeromonas hydrophila ...................................................................... 3
2.1.1 Vị trí phân loại ........................................................................................................3
2.1.2 Đặc điểm chung .....................................................................................................3
2.1.3 Môi trường phân lập ..............................................................................................4
2.1.4. Tình hình nghiên cứu vaccine phòng bệnh nhiễm trùng huyết ở cá Tra ...............4
2.1.4.1 Nghiên cứu trên thế giới ......................................................................................4
2.1.4.2 Nghiên cứu trong nước ........................................................................................6
2.2. Sơ lược về bệnh xuất huyết trên cá do vi khuẩn A. hydrophila ...............................6
2.2.1 Đối tượng lây nhiễm ...............................................................................................6
2.2.2 Triệu chứng lâm sàng khi xâm nhiễm ....................................................................7
2.2.3 Điều kiện phát sinh bệnh ........................................................................................8
2.2.4 Chẩn đoán ...............................................................................................................8
2.2.5 Điều trị và khống chế bệnh .....................................................................................9
2.3 Các hình thức cấp vaccine trong nuôi trồng thủy sản .............................................10
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 13
3.1Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................................ 13
3.2. Vật liệu ................................................................................................................... 13
3.2.1Đối tượng thí nghiệm.............................................................................................13
3.2.2Thiết bị, dụng cụ ....................................................................................................13
iv


3.2.3Hóa chất .................................................................................................................13
3.2.4Môi trường .............................................................................................................15
3.3.Phương pháp nghiên cứu .........................................................................................15
3.3.1Phương pháp kiểm tra cá nhiễm A. hydrophilatrước khi thí nghiệm ....................16
3.3.2Phương pháp tiêm cá. ............................................................................................17
3.3.3Phương pháp phân lập A. hydrophila từ các mẫu bệnh phẩm. ..............................18
3.3.4Phương pháp nhuộm Gram....................................................................................18
3.3.5Phương pháp PCR khuẩn lạc .................................................................................19

3.3.6Phương pháp chuẩn bị chủng A. hydrophila .........................................................20
3.3.7Phương pháp thử nghiệm độc lực chủng A. hydrophila hoang dại, đột biến ........22
3.3.8Đánh giá tỉ lệ sống của cá sau khi tiêm chủng A. hydrophila đột biến ................22
3.3.9Xử lý số liệu. .........................................................................................................23
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ....................................................................... 24
4.1 Kiểm tra cá nhiễm vi khuẩn A. hydrophila trước khi thử nghiệm .......................... 24
4.2. Thử nghiệm độc lực chủng A. hydrophilahoang dại. ............................................. 26
4.2.1 Chuẩn bị chủng A. hydrophila hoang dại .............................................................26
4.2.2 Thử nghiệm độc lực chủng A. hydrophila hoang dại bằng phương pháp tiêm. ...27
4.3. Thử nghiệm độc lực chủng A. hydrophila đột biến ................................................31
4.3.1 Chuẩn bị chủng A. hydrophila đột biến ................................................................32
4.3.2 Thử nghiệm độc lực chủng A. hydrophila đột biến bằng phương pháp tiêm .......32
4.4. Đánh giá tỉ lệ sống của cá sau khi tiêm chủng A. hydrophila đột biến ..................33
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 37
5.1 Kết luận.................................................................................................................... 37
5.2 Kiến nghị ................................................................................................................. 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 38
PHỤ LỤC

 

 

v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
 

BHIA

:Môi trường Brain heart infusion agar.

CFU

: Colony Forming Unit.

DNA

: Deoxyribo NucleicAcid.

ĐC (-)

: Đối chứng âm.

ĐC (+)

: Đối chứng dương.

LB

: Môi trường Luria Bertani.

LD50

: Medium Letalisdosis.

NA

: Môi trường Nutrient Agar.

NMSL 0,65% : Nước muối sinh lý, nồng độ 0,65%.
OD

: Optical Density.

PBG

: Môi trường Peptone beef - extract glycogen.

PCR

: Polymerase Chain Reaction.

RPS

: Relative Percentage Survival.

RS

: Môi trường Rimler Shotts.

TAE

: Tris – Acetate – EDTA.

TBE

: Tris – Borate – EDTA.

TSA

: Môi trường Trypticase soy agar.

UV

: Ultraviolet radiation.

VASEP

: Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers.

 
 

 

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR ................................................................................ 12
Bảng 3.2 Chu trình nhiệt cho cập mồi aroA_F4/aroA_R4 ............................................... 21
Bảng 3.6 Thành phần phản ứng PCR .............................................................................. 22
Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát độc lưc bằng phương pháp tiêm cá ......................... 25
Bảng 4.1 Kết quả ương cá Tra giống từ cá bột ................................................................. 27
Bảng 4.2Số cá chết sau 7 ngày khi tiêm chủng A. hydrophila hoang dại ......................... 32
Bảng 4.3 Kết quả xử lý trắc nghiệm phân hạng số liệu cá chết qua 6 ngày theo dõi ....... 33
Bảng 4.4Tỷ lệ cá chết sau 72 giờ tiêm chủng A. hydrophilađột biến. .............................. 35
Bảng 4.5 Tỉ lệ cá chết sau khi tiêm A. hydrophila hoang dại, đột biến ............................ 38

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
 

Hình 2.1Vi khuẩn A. hydrophilaquan sát dưới kính hiển vi ............................................ 3
Hình 2.2 Cá Tra có biểu hiện bệnh nhiễm trùng huyết ..................................................... 5
Hình 3.1 Thang DNA dùng trong điện di ......................................................................... 12
Hình 3.3 Thử nghiệm độc lực chủng A. hydrophilahoang dại và đột biến....................... 14
Hình 3.4 Đánh giá tỷ lệ sống của cá thông qua hệ số RPS ............................................... 15
Hình 3.5 Kỹ thuật tiêm cá thí nghiệm............................................................................... 19
Hình 3.6Phương pháp pha loãng dịch vi khuẩn................................................................ 23
Hình 3.7 Đánh giá tỷ lệ sống của cá sau khi tiêm chủng A. hydrophilaWT,M25 ............. 26
Hình 4.1Mẫu máu cá cấy trên môi trường RS. ................................................................. 28
Hình 4.2Khuẩn lạc phân lập được từ mẫu nước trước và sau khi thay nước. .................. 29
Hình 4.3 Kết quả điện di trên gel agarose 1,2% sản phẩm PCR khuẩn lạc ...................... 30
Hình 4.4 Cá chết sau khi tiêmchủng A. hydrophilahoang dại .......................................... 33
Hình 4.6 Vi khuẩn A.hydrophila mọc trên môi trường RS............................................... 34
Hình 4.8Hình thái khuẩn lạc dưới vật kính x100.............................................................. 34
Hình 4.9 Cá chết sau khi tiêm chủng A. hydrophilahoang dại ......................................... 38
Hình 4.10 Các dạng khuẩn lạc mọc trên môi trường RS .................................................. 38
 

viii


Chương 1MỞ ĐẦU
 

1.1 Đặt vấn đề
Ngành nuôi trồng thủy sản đã và đang đóng góp một lượng ngoại tệ lớn cho
nền kinh tế quốc dân. Theo VASEP, dự báo kim ngạch xuất khẩu thủy sản năm 2012
sẽ đạt con số hơn 6,8 tỷ USD, tăng 19% so với giá trị xuất khẩu thủy sản năm
2011(Nguồn: />phẩm thủy sản được dùng làm thực phẩm là chủ yếu, ngày càng được ưa chuộng trên
khắp thế giới. Vấn đề nuôi trồng thủy sản còn gặp rất nhiều khó khăn trong việc kiểm
soát dịch bệnh, gây sụt giảm năng suất, chất lượng trầm trọng. Vì vậy, yêu cầu cấp
bách là cần có những biện pháp phòng ngừa dịch bệnh ngay từ ban đầu.
Cá Tra là loài cá được nuôi trồng nhiều ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long
với diện tích nuôi cá lớn, tính đến tháng 6 năm 2011 vào khoảng 3,980 ha, tăng 385
ha so với cùng kỳ năm 2010 và năng suất bình quân 309 tấn/hecta (Lê Đình Minh
Phương, 2011). Việc nuôi cá Tra thường gặp rất nhiều khó khăn trong việc kiểm soát
dịch bệnh do diễn biến thời tiết phức tạp, dịch bệnh thường xảy ra ở quy mô lớn khó
kiểm soát, ảnh hưởng đến năng suất, chất lượng dẫn đến sụt giảm kim ngạch xuất
khẩu. Bệnh nhiễm trùng huyết, bệnh gan mủ thận, bệnh trắng gan, trắng mang là
những bệnh khá phổ biến ở cá Tra hiện nay. Trong đó, tỷ lệ chết do bệnh nhiễm trùng
huyết gây ra hơn 80%, tỷ lệ chết do bệnh gan thận mủ gây ra từ 60 – 80%, tỷ lệ chết
do bệnh trắng gan, trắng mang gây ra là 70 – 80% (Trần Anh Dũng, 2005).
Hiện nay, các biện pháp điều trị bệnh nhiễm trùng huyết trên cá Tra do vi
khuẩn Aeromonas hydrophila chủ yếu là dựa vào kháng sinh. Tuy nhiên, việc dùng
kháng sinh để điều trị sẽ tác động đến nhiều yếu tố gây bất lợi như: phải dùng một
lượng lớn kháng sinh, ô nhiễm môi trường nước, dư lượng kháng sinh có trong sản
phẩm sau khi thu hoạch. Vì vậy, sản xuất vaccine phòng bệnh xuất huyết do vi khuẩn
Aeromonas hydrophilađược xem là một giải pháp hiệu quả và kinh tế nhất.
Đáp ứng nhu cầu trên, Trung tâm Công nghệ sinh học Tp. Hồ Chí Minh đã
nghiên cứu, tạo thành công chủngAeromonas hydrophilađột biến.Tuy nhiên, cần phải
nghiên cứu con đường xâm nhập của vi khuẩn vào cá hiệu quả và ít ảnh hưởng đến cá
1

Tra. Chính vì vậy, đề tài “Nghiên cứu phương pháp lây nhiễm chủngAeromonas
hydrophila nhược độc có tiềm năng làm vaccine ngừa bệnh nhiễm trùng huyết cho cá
Tra” được tiến hành phục vụ cho đề tài“Tạo chủng Aeromonas hydrophila nhược độc
có tiềm năng làm vaccine phòng bệnh nhiễm trùng huyết trên cá Tra” của Trung tâm.
Tuy nhiên, trong quá trình thực hiện đề tài gặp rất nhiều khó khăn, đăc biệt là
tốn rất nhiều thời gian để nuôi cá Tra bột thành cá Tra giống (3 tháng) và kiểm tra sự
sạch bệnh của cá trước thí nghiệm, với thời gian thực tập 6 tháng không đủ để làm các
công việc trên. Vì vậy, chúng tôi quyết định đổi tên đề tài thành “Thử nghiệm độc lực
chủng Aeromonas hydrophila đột biến nhằm ứng dụng trong nghiên cứu sản xuất
vaccinengừa bệnh nhiễm trùng huyết cho cá Tra” so với dự kiến đề tài có tên “Nghiên
cứu phương pháp lây nhiễm chủngAeromonas hydrophila nhược độc có tiềm năng
làm vaccine ngừa bệnh nhiễm trùng huyết vào cá Tra”.
1.2 Yêu cầu đề tài
Thử nghiệm độc lực chủng Aeromonas hydrophila đột biến trên cá Tragiống.
1.3 Nội dung thực hiện
1.

Thử nghiệm độc lực chủng A. hydrophila hoang dại trên cá Tra giống.

Các bước thực hiện bao gồm: Ương nuôi cá bột-cá hương-cá giống, chuẩn bị chủng A.
hydrophila hoang dại, thử nghiệm độc lực chủng A. hydrophila hoang dại bằng
phương pháp tiêm vào cá, theo dõi tỷ lệ cá chết (%) cá Tra thử nghiệm sau 7 ngày.
2.

Thử nghiệm độc lực chủng A. hydrophila đột biến trên cá Tra giống.

Các bước thực hiện bao gồm: Ương nuôi cá bột-cá hương-cá giống, chuẩn bị chủng A.
hydrophilađột biến, thử nghiệm độc lực chủng A. hydrophila đột biến bằng phương
pháp tiêm vào cá,theo dõi tỷ lệ cá chết (%) cá Tra thử nghiệm sau 7 ngày.

3.

Đánh giá hiệu quả bảo vệ của chủng A. hydrophila nhược độc đột biến

trên cá Tra giống thông qua hệ số RPS.
 

 

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 
2.1. Tổng quan về Aeromonas hydrophila
2.1.1 Vị trí phân loại
Giới:

Bacteria

Ngành:

Proteobacteria

Lớp:

Grammaproteobacteria

Bộ:

Aeromonadales

Chi:

Aeromonas

Loài:

Aeromonas hydrophila

 

Hình 2.1 Vi khuẩn Aeromonas
hydrophilaquan sát dưới kính hiển
vi. . 

2.1.2 Đặc điểm chung

Aeromonas hydrophila là trực khuẩn gram âm, hình que, có kích thước khoảng
0,8 – 1,0 x 1,0 – 3,5 µm, A. hydrophila di động nhờ 2 loại tiên mao là tiên mao mọc ở
cực khi bơi trong dung dịch và tiên mao mọc khắp cơ thể khi di chuyển trên các bề
mặt. Tác nhân chính gây bệnh sơ cấp, thứ cấp và bệnh cơ hội của nhiều loài động vật
dưới nước, trên cạn trong đó có con người. Độc tố haemolytic của vi khuẩn A.
hydrophilalà nguyên nhân chính gây bệnh xuất huyết(Janda và ctv, 1996;Baba và ctv,
1988).
A. hydrophilalà một vi khuẩn hiếu khí khá phổ biến ở các ao hồ nước ngọt, đặc
biệt là khi có sự hiện diện của nồng độ muối cao của các chất hữu cơ. Ngoài ra, nó
còn là một vi khuẩn phổ biến của đường tiêu hóa của cá. Sự hiện diện của A.
hydrophila trong đường ruột của cá Rô phi nuôi và trong tự nhiên lần lượt là 10% và
2,5%. Còn đối với cá Karmout (Claries lazera) tỷ lệ này lần lượt là 18,75% và 6,25%
(Huizinga và ctv, 1979).

Oxidase và catalase dương tính, có khả năng lên men hiếu khí và kị khí. Tất cả
đều cho phản ứng arginin dihydrolase và lysine decarboxylase dương tính nhưng
ornithine decarboxylase âm tính. Không sinh ureaza nhưng sinh gelatinaza và indol,
sử dụng đường glucose và manitol (có hoặc không sinh hơi) nhưng không sử dụng
đường inositol, sorbitol, rhamnose và arabinose, kháng với hợp chất vibriostastic
3


agent 0/129 (2,4-diamino,6,7-di-isopropyl pteridine), có khả năng chuyển nitrate
thành nitrite (Bùi Quang Tề, 2006).
Hiện tại trên Wedsite của National Center for Biotechnology Information
(NCBI), cung cấp2 chủngA. hydrophilađã được giải trình tự toàn bộ bộ gen đó là
chủng A. hydrophila subsp. Hydrophila ATCC 7966 và chủng Aeromonas hydrophila
ML09 – 119. Trung tâm Công nghệ sinh học Tp. Hồ Chí Minh đang sử dụng chủng A.
hydrophila subsp. Hydrophila ATCC 7966 vàgây đột biến gen aroA để tạo chủng A.
hydrophilanhược độc trong nghiên cứu sản xuất vaccine phòng bệnh nhiễm trùng
huyết do A. hydrophilagây ra.
2.1.3 Môi trường phân lập
A. hydrophila có thể được phân lập trên môi trường không chọn lọc như môi
trường dinh dưỡng NA hoặc TSA hay phân lập trên môi trường có chọn lọc như RS
hoặc PBG và ủ trong 20 – 30oC trong 18 – 36 giờ. Khuẩn lạc A. hydrophila có thể
mọc trong môi trường TSA ở 28oC trong 18 – 24 giờ, khuẩn lạc thường có hình tròn,
màu sắc từ vàng kem đến vàng sáng, lồi, kích thước khuẩn lạc từ 2 – 3 mm. Khuẩn lạc
phát triển trên môi trường RS có màu vàng. Khuẩn lạc A. hydrophila có thể phát triển
trên môi trường BHIA cho khuẩn lạc tròn, nhẵn, lồi, có màu vàng. Hầu hết tất cả các
môi trường chọn lọc đều sử dụng ampicilin, carbohydrat, peniciline, kanamycin như
là tác nhân chọn lọc (Palumbo và ctv, 1985).
Hiện tại, tại Trung tâm công nghệ sinh học Tp. Hồ Chí Minh đang sử dung môi
trường RS để phân lậpvàLuria Bertani (LB) để tăng sinh chủng A. hydrophila. Đối với
chủng A. hydrophila hoang dại có bổ sung thêm kháng sinh Ampicilin với liều lượng

50µg/ml, đối với chủng A. hydrophila đột biến sử dụng thêm kháng sinh Ampicilin và
Kanamycin với liều lượng mỗi kháng sinh là 50µg/ml.
2.1.4. Tình hình nghiên cứu vaccine phòng bệnh nhiễm trùng huyết cho cá Tra
do vi khuẩn A. hydrophila gây ra
2.1.4.1 Nghiên cứu trên thế giới về vaccine phòng bệnh nhiễm trùng huyết cho cá Tra
Nhiều công trình nghiên cứu đã được thực hiện để phát triển một vaccine hiệu
quả chống lại A. hydrophila (Huizinga và ctv, 1979;Rahmanvà ctv, 2000; Leung và
ctv, 1997;Lamers và ctv, 1985; Baba và ctv 1988).Tác dụng của vaccine bất hoạt toàn
tế bào đã được báo cáo, ví dụ: Như sự gia tăng hàm lượng kháng thể trong huyết
4


thanh chống lại A. hydrophilađối với cá chép ngâm trong dung dịch vaccine A.
hydrophila được bất hoạt.
Sự gia tăng nồng độ protein huyết thanh khi cá chép được chủng ngừa bằng A.
hydrophilabất hoạt bằng formol (Kusuda và ctv, 1987). Cá Hồi vân được chủng ngừa
bằng cách tiêm, ngâm, cho ăn bằng chủng A. hydrophila bất hoạt, đã tạo được kháng
thể trong huyết thanh, da, mật, dịch nhầy, ruột và cơ (Loghothetis và ctv, 1994).
Vaccine đa giá kết hợp giữa mầm bệnh A. hydrophila bị giết bằng nhiệt và các sản
phẩm ngoại bào của A. hydrophila bất hoạt bằng formol được thử nghiệm trên cá trôi
Ấn Độ và cá Trôi mrigal, nhưng nó không cho được kết quả bảo vệ cá chống lại vi
khuẩn công cường độc thực nghiệm (Chandran và ctv, 2002). Các tác giả này nhận
định tuy hàm lượng kháng thể trong máu của nhóm được chủng ngừa cao nhưng tỷ lệ
bảo hộ thấp có thể là do tác động của các yếu tố stress hoặc các kháng thể tao ra
không có tác dụng bảo vệ cá chống lại mầm bệnh.
Lớp mỏng chitin dùng để bọc bên ngoài kháng nguyên có nguồn gốc từ vi
khuẩnA. hydrophila đã được sử dụng như một loại vaccine cho ăn để tránh sự tác
động của môi trường acid trong dạ dày (Azad và ctv, 1999). Cá Trê (Clarias
batrachus),cho ăn với vaccine màng sinh học như vậy cho thấy hàm lượng kháng thể
trong huyết thanh và hiệu quả bảo hộ miễn dịch cao hơn so với chỉ dùng vaccine bất

hoạt thông thường khi công cường độc với A. hydrophila(Nayak và ctv, 2004).
Các protein màng ngoài của A. hydrophila đã làm tăng sự bảo vệ chống lại A.
hydrophila và cho rằng vaccine dựa trên việc lựa chọn kháng nguyên protein lớp
màng có thể có tác dụng (Rahman và ctv, 2000). Hướng phát triển vaccine nhược độc
phòng bệnh do A. hydrophila gây ra cũng được nghiên cứu. Chủng A. hydrophila gây
đột biến gen aroA đã cho hiệu quả bảo hộ trên cá Hồi vân (Moral và ctv, 1998).
Mặc dù tất cả các vaccine được báo cáo đã cho thấy mức độ khác nhau của sự
gia tăng miễn dịch và hiệu quả bảo vệ. Tuy nhiên, vaccine thương mại không có sẵn
cho A. hydrophila(Loghothetis và ctv, 1996; Rahman và ctv, 2000; Fang và ctv,
2004). Do sự không đồng nhất kiểu huyết thanh và kiểu hình của vi khuẩn. Trong thực
tế, người ta phát hiện được gần 100 kiểu huyết thanh trong nhóm Aeromonas di động
(Janda và ctv, 1996; Nielsen và ctv, 2001). Các biện pháp phòng ngừa như vệ sinh tốt,

5


tránh tình trạng nuôi với mật độ quá dày và giảm tối đa các thao tác bằng tay dễ gây
stress và các biện pháp phòng ngừa tốt nhất.
2.1.4.2 Nghiên cứu trong nước về vaccine phòng bệnh nhiễm trùng huyết cho cá Tra
Đối với nước ta, vaccine cho cá vẫn chưa đượcsử dụng, đây là một vấn đề khá
mới. Cho tới thời điểm hiện nay vẫn chưa có một loài vaccine nào được cấp phép lưu
hành và sử dung cho cá nuôi Việt Nam.
Tuy nhiên trong những năm gần đây đã có một số công trình nghiên cứu và
phát triển vaccine cho thủy sản ở Việt Nam: Năm 2000, tập đoàn Intervet Nobio – Hà
Lan phối hợp với Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản III đánh giá khảo nghiệm 4
sản phẩm vaccine phòng bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm sú nhưng kết quả cho thấy
vacinne này không hiệu quả.
Năm 2006, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II đã kết hợp với Công ty
Thuốc Thú y Trung Ương II (NAVETCO) nghiên cứu phòng bệnh vaccine gan thận
mủ cho cá Tra. Kết quả hiệu quả bảo hộ tốt của vaccine phòng bệnh gan thận mủ trên

cá Tra có thể kéo dài trong 2 tháng. Sự hợp tác nghiên cứu giữa công ty Pharmaq – Na
Uy và Bayer Việt Nam trong nghiên cứu vaccine phòng bệnh gan thận mủ do E.
Ictaluri trên cá Tra. Kết quả Vaccine ALPHAJECT® Panga1 tiêm vào xoang bụng cá
Tra đã kích thích hình thành miễn dịch đặc hiệu chống lại vi khuẩn E.ictaluri và bảo
hộ được cá khi bệnh xảy ra trong thời gian thí nghiệm. Gần đây nhất công trình
nghiên cứu tạo chủng E. ictaluriđột biến bằng phương pháp tái tổ hợp gen nhằm sử
dụng làm vaccinephòng bệnh gan thận mủ cho cá Tra của Trung tâm Công nghệ sinh
học Tp. Hồ Chí Minh đã thực hiện. Kết quả chủng E.ictaluri đột biến gen wzz có tiềm
năng sử dụng trong nghiên cứu sản suất vaccine phòng bệnh mủ gan đã được đăng ký
patent vào năm 2011. Đây là một thành công lớn của các nhà khoa học tại Trung tâm
Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh, là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo
liên quan đến gây đột biến bằng phương pháp tái tổ hợp gen.
2.2. Sơ lược về bệnh xuất huyết trên cá do vi khuẩn A. hydrophila
2.2.1 Đối tượng lây nhiễm
Các căn bệnh do vi khuẩn này chủ yếu ảnh hưởng đến loài cá nước ngọt như cá
Chép, cá Rô phi, cá da trơn và nhiều loại cá nhiệt đới hoặc cá cảnh. Bên cạnh đó nó
cũng có thể ảnh hưởng đến loài cá nước lạnh. Phân lập được A. hydrophila từ vết
6


thương của 4 loài cá nước lợ bao gồm: Cá Ngát (Platosus anguillaris), cá Chẽm (lates
calcarifer), cá Mú (Epinephelus megachir), cá Rohu (Labeo ruhita).A. hydrophila
không chỉ phân lập được từ cá biển tươi hoặc đã chế biến mà còn phân lập được từ các
vùng đánh bắt cá. (Bùi Quang Tề, 2006).
2.2.2 Triệu chứng lâm sàng khi xâm nhiễm
Karunasagar (1989) phân chia dấu hiệu lâm sàng của bệnh gây ra bởi A.
hydrophila thành 4 nhóm: cấp, nhiễm khuẫn nhanh chóng, với những triệu chứng
sưng rõ rệt; dạng nhiễm bệnh cấp với triệu chứng phù, phồng giộp, áp xe và tróc vẩy;
dạng loét mạn tính với sự nổi nhọt và áp xe và dạng tiềm ẩn không triệu chứng.

Hình 2.2 Cá Tra có biểu hiện nhiễm trùng huyết

Các dấu hiệu lâm sàng của sự xâm nhiễm A. hydrophila được phân chia thành
3 nhóm khi gây nhiễm nhân tạo trên cá nheo: MAS (sự xâm nhiễm toàn thân, có dấu
hiệu của bệnh), da (nhiễm bệnh được giới hạn trên da và các lớp cơ bên dưới da), tiềm
ẩn (nhiễm bệnh toàn thân mà không biểu hiện bệnh ra ngoài) (Grizzle và ctv, 1993).
Nhìn chung các dấu hiệu gây bệnh lâm sàng cơ bản khi nhiễm A. hydrophila là
sự hiện diện của những tổn thương nhỏ trên bề mặt (dẫn đến sự bỏng tróc vẩy), xuất
huyết cục bộ ở mang, các vết loét, áp xe, lồi mắt, bụng phình to và thường xuất hiện
phù nể ở bụng. Jeney (1995) quan sát thấy các dấu hiệu bên ngoài hoài tử và phủ nề
cá Rô phi ở sông Nil bị nhiễm A. hydrophila.
Cũng như các dấu hiệu đã được mô tả, nhiều dấu bệnh khác cũng được nhận
thấy ở nội tạng của các loài cá khác, ví dụ: Gan và thận cũng bị phá hủy hoàn toàn ở
cá hồi bị nhiễm A. hydrophila (Jeney và ctv, 1995). Hoại tử lan rộng trong một vài cơ
7


quan nội tạng và sự hiện diện của các đại thực bào chứa melanin trong máu cũng được
quan

sát

thấy

khi

A.

hydrophilanhiễm

vào

cá

Nheo

Mỹ(Ictalurus

punctatus)(Vivekanandhan và ctv, 2002).
2.2.3 Điều kiện phát sinh bệnh
Các nhân tố môi trường như nhiệt độ nuôi cấy thời gian ủ (Ko và ctv, 2003)và
môi trường sống (Vivas và ctv, 2005) có thể làm biến đổi sự biểu hiện của các yếu tố
gây bệnh của A. hydrophila, ví dụ: sự hiện diện của heamagglutin bề mặt xuất hiện
tùy thuộc môi trường các dòng A. hydrophila sống trong môi trường lỏng cho thấy sự
tăng cường hoạt động heamagglutination so với các dòng sống trên môi trường rắn
(Dixon và ctv, 1993).Sự tăng hoặc giảm nhiệt độ của nước cũng tăng khả năng gây
bệnh của vi khuẩn trên cá nuôi (Ventura và ctv, 1987). Các tác giả này nhận thấy rằng
sự thay đổi nhiệt độ của nước cùng với sự gia tăng của mật độ chất tan là một nhân tố
chính trong sự diễn tiến của sự bùng phát bệnh do A. hydrophila trên cá Tra. Các tác
nhân khác bao gồm cho ăn quá mức và sục giảm nồng độ muối (Eissa và ctv,
1994).Chất mang A. hydrophila cũng đóng vai trò trong sự lây nhiễm, sự nhiễm trên
cá được quan sát khi cho ăn với luân trùng mang vi khuẩn. Thêm vào đó, các vi khuẩn
A. hydrophila bị thiếu chất dinh dưỡng (nuôi cấy trên môi trường nước khử trùng
chứa 0,60 % NaCl, 0,50 % KCl, 0,10% CaCl2.2H2O và 0,20% MgCl2.6H2O) cũng cho
thấy tính độc cao trên họ cá Chép so với khi nuôi trên môi trường LB (Ventura và ctv,
1987).
Một vài nghiên cứu cũng cho thấy khả năng gây bệnh của A. hydrophila phụ
thuộc nó là tác nhân sơ cấp, thứ cấp hay cơ hội do tổn thương hay stress của vật chủ
(Khalil và ctv, 1997). Sự xâm nhiễm sơ cấp bởi một tác nhân gây bệnh khác và A.
hydrophilatham gia gây bệnh như một tác nhân thứ cấp, ví dụ: các chấn thương gây ra

bởi bệnh đốm trắng Ichthyophthirius multifiliis sẽ là cổng xâm nhập của A.
hydrophilatrong nước, và theo cách đó giúp cho sự xâm nhập thuận lợi hơn (Mitchell
và ctv, 1980). Tương tự ở cá Nheo Mỹ (Ictalurus punctatus), Edwardsiella Ictaluri là
tác nhân sơ cấp, còn A. hydrophila là tác nhân thứ cấp (Nusbaum và ctv, 2002).
2.2.4 Chẩn đoán

8


Nếu như các biện pháp quan sát hình thái khuẩn lạc không chính xác, phân tích
sinh hóa và miễn dịch mất nhiều thời gian thì phương pháp phân tử với ưu điểm
nhanh, chính xác được khuyến cáo dùng để nhận biết A. hydrophila.
Sugita (1994) đưa ra phương pháp lai DNA để nhận biết A. hydrophila, trong
khi khuyếch đại một gen cụ thểbằng PCR được khuyên dùng để phát hiện vi khuẩn.
Thêm vào đó, phương pháp xác định nhanh được phát triển bằng cách giải trình tự
DNA 16S ribosomal của A. hydrophila(khuyếch đại đoạn gen 16S rDNA và gen
earolysin để phát hiện các dòng gây bệnh của A. hydrophila). Một phương pháp nữa
kết hợp miễn dịch và kỹ thuật sinh học phân tử cũng được phát triển cung cấp một
cách thức nhanh chóng, nhạy để phát hiện A. hydrophila(Zervosen và ctv, 2001).
Trong nghiên cứu này, đoạn gen DNA 16S ribosomal được khuyếch đại bằng
phương pháp PCR dùng để định danh A. hydrophila(Rahman và ctv, 2001).
2.2.5 Điều trị và khống chế bệnh
Kháng sinh là tác nhân chính để điều trị A. hydrophila(Huizinga và ctv, 1979).
Các chất được nhận thấy có tác dụng gồm furan (Nusbaum và ctv,2002), sunfonamide
(Del Corral và ctv, 1990), chloraphenical, neomycin, sulfamethoxazole –
trimethoprim, treptomycin, naladixic acid, oxolinic acid, neomycin, xarafloxacin
(Landre và ctv, 2000), rifampicin(Ansary và ctv, 1992), cephamycins và moxalactam
(Zervosen và ctv, 2001), ciprofloxacin (Krovacek và ctv, 1989), amoxycilin và
enrofloxacin penicillin G, erythromycin and gentamicin (Dixon và ctv, 1993). A.
hydrophila cũng nhạy cảm với các Hydroxamate của amino acid (Walter và ctv, 1999)

và hydrogen peroxide (H2O) (Liu và ctv, 2004).
Mặc dù điều trị bằng kháng sinh là phương pháp chính, nhưng thực tế cho thấy
các vi khuẩn gây bệnh trở nên kháng với các chất hóa học khi dùng một thời gian kéo
dài (Nusbaum và ctv, 2002;Vivekanandhan và ctv, 2002). Một số dòng A. hydrophila
được nhận thấy kháng với các chất kháng sinh sau: ampicillin, carbenicillin,
erythromycin, gentamicin, penicillin, tetracycline, nitrofuradantoin, ormetoprimsulfadimethoxine, sulfamethoxazole-trimethoprim vàtriple sulfa (Nusbaum và ctv,
2002;Vivekanandhan và ctv, 2002;Ansary và ctv, 1992;Dixon và ctv, 1993; Yamashita
và ctv, 1990).

9


Do những tác hại của việc sự dụng kháng sinh như: phải dùng một lượng lớn
kháng sinh, dư lượng kháng sinh có trong sản phẩm sau khi thu hoạch ảnh hưởng tới
chất lượng sản phẩm thủy sản, ô nhiễm môi trường nước, tác hại xấu đến hệ sinh thái,
việc sử dụng kháng sinh ồ ạt không kiểm soát dễ xảy ra hiện tượng kháng kháng sinh
của một số vi khuẩn gây bệnh. Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất vaccine để phòng
bệnh xuất huyết gây ra bởi A. hydrophilalà hết sức cần thiết.
2.3 Các hình thức cấp vaccine trong nuôi trồng thủy sản
Năm 1976 vacxin ngâm cho cá Hồi để phòng bệnh do Vibriosis và Yersiniosis
mới được sản xuất thành công. Sau đó 5 năm ra đời vaccine đơn và đa giá dạng tiêm
(dung môi nước) phòng bệnh lở loét. Năm 1990 xuất hiện vaccine ngâm và tiêm cho
cá Vược và cá Tráp biển Địa Trung Hải. Đến tận năm 1998, vaccine dạng trộn vào
thức ăn cho cá mới được giới thiệu ở Nhật Bản. Năm 2005, lần đầu tiên vaccine DNA
cho cá Hồi được áp dụng tại Canađa.
Trong thủy sản để cấp vaccine cho cá người ta thường áp dụng các hình thức sau:
o Tiêm: Vaccine được tiêm trực tiếp vào cơ thể cá, có thể tiêm ở dưới gốc vẩy
lưng hoặc có thể tiêm vào xoang bụng của cá. Ở các nước phát triển người ta đã chế
tạo ra những máy tiêm tự động để bơm thuốc theo một hệ thống dẫn truyền, với công
suất khoảng 1000 cá/giờ, dùng để tiêm vaccine cho cá giống trước khi thả nuôi. Ưu

điểm: Đây là phương pháp hiệu quả nhất, có thể kích thích sản xuất kháng thể toàn
thân cũng như cho hiệu quả bảo hộ tối ưu, đồng thời nó cho phép kết hợp được nhiều
kháng nguyên trong một loài vaccine đơn lẻ. Hiện nay, đã có vaccine bảo vệ chống lại
6 loại mầm bệnh cùng lúc (5 bệnh do vi khuẩn và 1 bệnh do virus) được tiêm vào cá.
Nhược điểm: Phương pháp tiêm khó thực hiện khi cá còn nhỏ và phải cần nhiều nhân
công lao động vì số lượng cá thả nuôi nhiều, đòi hỏi kĩ thuật tiêm tốt, việc gây mê và
bắt giữ đối tượng thủy sản khi tiêm vaccine dễ dàng gây sốc và tổn thương cho đối
tượng thủy sản, có thể ảnh hưởng đến tỷ lệ chết, vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể không
giống với ngoài tự nhiên.
 Ngâm: Dùng vaccine hòa tan trong nước có thể tích nhỏ, ngâm trực tiếp cá
trong khoảng một thời gian ngắn từ 30 – 60 giây. Đối với phương pháp này vaccine sẽ
đươc hấp thụ qua da, mang, đường bên, và một ít qua miệng. Cơ chế hấp thụ kháng
nguyên chưa biết được chắt chắn, nhưng người ta thấy răng mang là con đường chính
10


để hấp thụ kháng nguyên. Bên cạnh đó thì da và các cơ quan đường bên cũng tham
gia vào qua trình hấp thu đường bên.Ưu điểm: Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể cá
giống tự nhiên, ít gây stress cho cá, cảm nhiễm được số lượng lớn cá trong một lúc, dễ
dàng áp dụng với cá nhỏ, thời gian thực hiện ngắn.Nhược điểm: Phải phá vỡ các rào
cản vật lý bên ngoài của cá để vi khuẩn xâm nhập vào cá.
 Tắm: Nhằm hạn chế làm gây sốc cho cá theo phương pháp ngâm, người ta sử
dụng phương pháp tắm vaccine cho cá bằng cách cho vaccine vào bể cá. Tuy nhiên,
phương pháp này đòi hỏi một lượng lớn vaccine và thơi gian tắm là khoảng 1 giờ.Ưu
điểm: Ít gây sốc cho cá nhất, dễ dàng áp dụng với cá nhỏ, thời gian thực hiện
ngắn.Nhược điểm: Tốn một lượng kháng sinh khá lớn, dễ gây hại cho môi trường sinh
thái.
 Phun: Đây là phương pháp được phát triển đồng thời với phương pháp ngâm.
Vaccine được phun hoặc được dẫn vào hệ thống bán tự động thông qua băng chuyên
chảy dưới vòi phun vaccine. Phun vaccine có thể gây sốc cá và kết quả có thể rất thay

đổi.Ưu điểm: Dễ áp dụng đối với cá nhỏ, thời gian ngắn, có thể áp dụng cho số lượng
cá nhiều.Nhược điểm: Gây stress cho cá, mặc khác hiệu quả đáp ứng miễn dịch và
bảo hộ miễn dịch thường không cao.
 Cho ăn: Đây là phương pháp dễ làm nhất, vaccine được trộn vào thức ăn và
cho cá ăn. Phương pháp này đơn giản dễ thực hiện ít tốn kém do không cần phải sử
dụng nhân công lao động, ít gây stress cho cá. Tuy nhiên, hiêu quả đáp ứng miễn dịch
thường kém và thường không đồng điều vì có cá thể ăn ít có cá thể ăn nhiều. Do thức
ăn qua đường miệng vào đường tiêu hóa nên kháng nguyên dễ bị pH của dạ dày hoặc
các men tiêu hóa làm hư hại. Hiện nay, đối với các kháng nguyên nhạy cảm các
phương pháp đóng gói sinh học đang được thử nghiệm, trong trường hợp này các loại
thức ăn sống như ấu trùng Artemia, giáp xác chân chéo hoặc luân trùng sẽ được nuôi
trong một môi trường chứa huyền dịch vaccine, sau đó chúng được sử dụng làm thức
ăn cho tôm cá, vì đây là các loài sinh vật không ăn chon lọc nên chúng sẽ tích lũy các
kháng nguyên trong đường tiêu hóa của chúng và chúng trở thành các viên nang siêu
nhỏ để đưa vaccine vào cơ thể tôm cá.Ưu điểm: Áp dụng đối với mỗi lứa tuổi của cá,
ít tốn kém, dễ làm.Nhược điểm: Phụ thuộc sức ăn cũng như hệ tiêu hóa của cá khả
năng xâm nhiễm của vi khuẩn vào mỗi con cá là khác nhau.
11


12


Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU
 

3.1

Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện trong 6 tháng từ tháng ngày 15 tháng 12 năm 2012 đến

ngày 15 tháng 06 năm 2013. Tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử 1, 2và trại thực
nghiệm, Phòng Công nghệ sinh học Thủy sản thuộc Trung tâm Công nghệ sinh học
thành phố Hồ Chí Minh.
3.2.

Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu
Cá Tra giống và cá Tra bột (Pangasius hypophthalmus) do Phòng Công nghệ
sinh học Thủy sản, Trung tâm Công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh cung cấp.
Chủng Aeromonas hydrophilahoang dại và chủng Aeromonas hydrophilađột
biến do Phòng Công nghệ sinh học Thủy sản, Trung tâm Công nghệ sinh học thành
phố Hồ Chí Minh cung cấp.
3.2.2 Thiết bị, dụng cụ dùng trong nghiên cứu
Tủ lắc 28oC, tủ ủ 28 oC, tủ cấy vi sinh, tủ âm 80oC, máy ly tâm lạnh Centrifuge
5810R (Eppendorf),máy PCR (MasterCycler gradient) (Eppendorf), bộ điện di DNA
Power Pac200 (Biorad), cân điện tử, ống nghiệm, kim tiêm, đĩa petri, que cấy vòng,
que cấy thẳng, đèn cồn, lame, eppendorf 1,5 ml, 0,2 ml, cuvette 2 ml, bể composite 2
đến 3 m3 và thùng composite100 lít, kính hiển vi quang học, bộ dùng cụ giải phẩu cá,
vortex, hệ thống sục khí Oxy và một số các dụng cụ liên quan khác.
3.2.3 Hóa chấtdùng trong nghiên cứu
Hóa chất dùng cho phản ứng PCR: Thành phần cần thiết cho phản ứng PCR
của nhà sản xuất Fementasđược cung cấp bởi Trung tâm Công nghệ sinh học gồm:
Taq DNA polymerase, dNTP, MgCl2, Taq buffer 10X. Thành phần phản ứng PCR
được liệt kê trong bảng 3.1.
 Hóa chất dùng cho điện di DNA: Agarose (BioLab_Việt Nam), Tris base
(Promega_China), Acid acetic (Merck_Việt Nam), Bromophenol blue (Merck_Việt
Nam), Ethidium Bromide (Merck_Việt Nam).

13


Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR
Thành phần

Nồng độ đầu

Nồng độ cuối

Thể tích sử dụng

10X

1X

2,5 µl

Dntp

25mM

0,2mM

0,2 µl

MgCl2

25mM

1mM

1,0 µl

Taq Polymerase

5 U/µl

0,04U/µl

0,2 µl

aroA_F

10 mM

0,2 mM

0,5 µl

aroA_R

10 mM

0,2 mM

0,5 µl

DNA mẫu

-

-

1,0 µl

H2O không DNAase

-

-

19,1 µl

Buffer

Tổng thể tích

25,0 µl

 Thang DNA: được sử dụng trong thí nghiệm của nhà sản xuất Fermentas, cung
cấp bởi Trung tâm Công nghệ sinh học Tp. Hồ Chí Minh.

Hình 3.1 Thang DNA dùng trong điện di.(a) Thang DNA 100 bp; (b)
Thang DNA 1 kb; (c) Thang DNA 1 kb plus. 

-

Primers

Primer đặc hiệu cho chủng A. hydrophila hoang dại là aroA_F4/R4, cho sản phẩm
khuếch đại 683 bp. Trình tự primer aroA_F4/R4:
aroA_F4: 5’- GGAGCCGGTCAATCTGTTCC- 3’
aroA_R4: 5’- CGGGGATGTGGTTCATGTCC- 3’
14


3.2.4 Môi trường dùng trong nghiên cứu
Môi trường Luria Bertani (LB) gồm các thành phần sau:Trypton 10g, Yeast
extract 5 g, NaCl 10 g,nước cất vừa đủ1.000 ml.
Môi trường tăng sinh cho chủng A. hydrophilahoang dại: môi trường LB có bổ
sung kháng sinh Ampicilin 50 µl/ml.Môi trường tăng sinh cho chủng A. hydrophila
đột biến là môi trường LB có bổ sung kháng sinh Ampicilin 50 µl/mlvà Kanamycin
50 µl/ml.
Môi trường Rimler Shott (RS) là môi trường đặc hiệu, phân lập vi khuẩn A.
hydrophila. Thành phần bao gồm:Agar 13,5g,Na2S2O3.5H2O 6,8g,L-Ornithine HCl
6,5g,NaCl

5,0g,L-Lysine·HCl

5,0g,maltose3,5g,yeast

extract

3,0g,sodium

deoxycholate 1,0g,ferric ammonium citrate 0,8g;L-Cysteine·HCl 0,3g,bromthymol
Blue 0,03g,novobiocin solution 10,0 ml, điều chỉnh pH 7,0 ± 0,2 ở 25°C.
Novobiocin Solution:Composition per 10,0 ml,Novobiocin 5,0mg.
3.3.

Phương pháp nghiên cứu
Ương nuôi cá bột-cá hương-cá
giống (2,5 – 3tháng tuổi)

Chuẩn bị chủng A. hydrophila
hoang dại

Chuẩn bị chủng A. hydrophila
đột biến

Thử nghiệm độc lực chủng A.
hydrophila hoang dại, tìm LD50

Thử nghiệm độc lực chủng A.
hydrophila đột biến.

Theo dõi tỉ lệ cá chết trong 1 tuần
Xác định tỉ lệ chết của cá, kiểm tra
sự hiện diện của A. hydrophila đột
biến bằng phản ứng PCR.

Xác định tỉ lệ chết của cá, kiểm tra
sự hiện diện của A.
hydrophilahoang dại bằng PCR.
Xác định LD50.

Hình 3.2.Thử nghiệm độc lực chủng A. hydrophilahoang dại, đột biến

15