NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA NẤM Lecanicillium spp. LÊN RỆP Rhopalosiphum maidis GÂY HẠI TRÊN NGÔ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA NẤM
Lecanicillium spp. LÊN RỆP Rhopalosiphum maidis
GÂY HẠI TRÊN NGÔ

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : ĐỖ KHẮC SÁNG
Niên khóa

: 2010 – 2014

Tháng 12/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA NẤM
Lecanicillium spp. LÊN RỆP Rhopalosiphum maidis
GÂY HẠI TRÊN NGÔ

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. TRẦN THỊ VÂN

ĐỖ KHẮC SÁNG

Tháng 12/2013


 

LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM,
ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong
thời gian học tập vừa qua.
Chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các
thầy cô đã trực tiếp giảng dạy, truyền đạt cho em kiến thức và kinh nghiệm trong suốt
bốn năm qua.
Chân thành cảm ơn ThS. Trần Thị Vân đã tận tình hướng dẫn, giải đáp các thắc
mắc và động viên em trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp.
Chân thành cảm ơn TS. Tôn Bảo Linh và KS. Võ Khánh Hưng, những người đã
hết lòng quan tâm dìu dắt, chăm lo cho em và tập thể lớp DH10SH trong quá trình học
tập và trong cuộc sống.
Chân thành cảm ơn anh Nguyễn Phan Thành, anh Huỳnh Đăng Sang đã hỗ trợ,
giúp đỡ và giải thích các thắc mắc cho em trong quá trình làm đề tài.
Chân thành cảm ơn các anh chị phụ trách phòng Bệnh cây thuộc Viện Nghiên
cứu Công Nghệ Sinh học Môi trường, trường Đại học Nông Lâm TP. HCM.

Chân thành cảm ơn chị Trần Thị Tú Ngân, anh Phan Công Nhật cùng các anh chị,
các bạn thực tập trong phòng thí nghiệm A203 Viện Nghiên cứu Công Nghệ Sinh học
Môi trường, trường Đại học Nông Lâm TP. HCM.
Chân thành cảm ơn tập thể lớp DH10SH thân yêu đã luôn đồng hành, chia sẻ vui
buồn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm đề tài.
Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều
kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường.

i

 


 

TÓM TẮT
Rệp (Aphidoidae) là côn trùng gây hại thường gặp trên rau và nhiều cây trồng
nông nghiệp khác. Nó là một trong những nguyên nhân làm giảm năng suất và giá trị
của cây trồng. Bên cạnh đó, nhiều loài rệp đã được báo cáo có khả năng kháng thuốc
trừ sâu. Việc vừa kiểm soát chúng vừa đáp ứng các giới hạn an toàn do dư lượng thuốc
trừ sâu trong các loại nông sản và môi trường gặp nhiều khó khăn. Đề tài “Nghiên cứu
khả năng gây bệnh của nấm Lecanicillium spp. lên rệp Rhopalosiphum maidis gây hại
trên ngô” được thực hiện nhằm đánh giá hiệu quả kiểm soát rệp của Lecanicillium
spp..
Thí nghiệm thực hiện khảo sát đặc điểm hình thái để tuyển chọn ra các mẫu nấm
Lecanicillium spp. và định danh mẫu nấm tuyển chọn được bằng phương pháp sinh
học phân tử. Đồng thời, để kiểm tra khả năng diệt rệp của nấm Lecanicillium spp., thí
nghiệm thực hiện phun trực tiếp bào tử nấm Lecanicillium spp. với các nồng độ 104,
105, 106, 107 bào tử/ml lên rệp trên trái ngô trong điều kiện phòng thí nghiệm và với
các nồng độ 106, 107, 108 bào tử/ml lên rệp trên cây ngô trong điều kiện nhà lưới.

Kết quả định danh hình thái cho thấy ba trong bốn mẫu nấm được khảo sát có đặc
điểm hình thái tương đồng với Lecanicillium spp. là VPH - HM1, VPH – HM2 và
VPH – HM3. Trong quá trình định danh các mẫu nấm bằng phương pháp sinh học
phân tử, nấm được li trích DNA, chạy PCR và đọc trình tự gen vùng ITS1, 5,8S, ITS2,
một phần vùng 18S và 28S với độ đài 939 bp. Trình tự trên vùng đọc trình tự của cả 3
mẫu nấm giống nhau 100%. Khi so sánh trình tự gen của các mẫu nấm trên với trình tự
gen trên ngân hàng gen bằng công cụ BLAST, kết quả cho thấy cả 3 mẫu có sự tương
đồng 95% với Lecanicillium fusisporum.
Hiệu lực diệt rệp của các mẫu nấm sau 7 ngày theo dõi trong điều kiện phòng thí
nghiệm và trong điều kiện nhà lưới đạt khá cao. Trong điều kiện phòng thí nghiệm,
mẫu nấm VPH – HM3 có hiệu lực diệt rệp cao nhất (đạt 94,0%) tại nồng độ 5 x 107
bào tử/ml. Trong khi đó, mẫu nấm VPH - HM1 có hiệu lực diệt rệp cao nhất trong điều
kiện nhà lưới với hiệu lực đạt 79,0% tại cùng nồng độ bào tử.
Từ khóa: Lecanicillium spp., Rhopalosiphum maidis, PCR.
ii

 


 

SUMMARY
“Efficacy of Lecanicillium spp. for controlling of Rhopalosiphum maidis on corn”
Aphids are common pests on vegetables and other crops. They damage crops
directly, wilting and distorting leaves and flowers as they feed. In addition, many
species of aphids were reported they were resistant to pesticides. To control the pest is
not easy in term of food safety due to pesticide residue in agricultural products and
environment. The aim of this study is to evaluate the control efficacy of Lecanicillium
spp. on corn aphids.
Fungal samples were identified by sequencing the genome conservation regions

ITS1, ITS2, 5,8S rDNA full sequence and regions 18S, 28S partial sequence. At the
same time, to examine the possibility control aphid of Lecanicillium spp., experiments
were conducted directly injection Lecanicillium spp. with concentrations of 104, 105,
106, 107 spores/ml to a Rhopalosiphum maidis on the corncob in laboratory conditions
and with concentrations of 106,107, 108 spores/ml to a Rhopalosiphum maidis on the
corn leaf surface in a greenhouse conditions.
The result of morphological identification, three fungal samples (VPH - HM1,
VPH - HM2 and VPH - HM3) were selected. Their morphological characteristics is
similar to Lecanicillium spp. In the process of identifying the fungi based on molecular
biology method, fungal DNA was extracted, amplified via PCR and sequenced with
primer ITS1-F, ITS4. When comparing the gene sequence of the isolates with the gene
sequences on GenBank by BLAST tools, the results show that the sequence of three
isolates were similar for 95% to Lecanicillium fusisporum.
Efficacy of Lecanicillium spp. for controlling of corn aphids was high in both
laboratory and greenhouse conditions. In laboratory conditions, fungal VPH - HM3 is
the highest effective to control corn aphids (reaching 94.0 %) at concentrations of
5 x 107 spores/ml. Besides, fungal VPH – HM1 was the highest effective to control
corn aphids in greenhouse conditions (reached 79.0 %) at the same concentration
spores.
Key words: Lecanicillium spp. , Rhopalosiphum maidis, PCR.
iii

 


 

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................. i 

TÓM TẮT....................................................................................................................... ii 
SUMMARY...................................................................................................................iii 
DANH SÁCH BẢNG...................................................................................................vii 
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................viii 
Chương 1 MỞ ĐẦU ...................................................................................................... 1 
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................ 1 
1.2. Yêu cầu .................................................................................................................... 2 
1.3 Nội dung thực hiện .................................................................................................. 2 
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 3 
2.1. Khái quát tình hình sâu hại ngô ............................................................................... 3 
2.2. Khái quát chung về rệp họ Aphididae .................................................................... 3 
2.2.1. Vị trí phân loại họ rệp Aphidiae ........................................................................... 3 
2.2.2. Đặc điểm chung họ rệp ......................................................................................... 4 
2.3. Rệp ngô Rhopalosiphum maidis .............................................................................. 5 
2.3.1. Sự phân bố và kí chủ của rệp Rhopalosiphum maidis .......................................... 5 
2.3.2. Triệu chứng, mức độ gây hại của rệp Rhopalosiphum maidis trên ngô ............... 5 
2.3.3. Một số đặc điểm hình thái của rệp Rhopalosiphum maidis .................................. 6 
2.3.4. Tập tính sống và quy luật phát sinh gây hại của Rhopalosiphum maidis............. 7 
2.3.5. Biện pháp phòng trừ rệp Rhopalosiphum maidis ................................................. 8 
2.4. Giới thiệu về nấm ký sinh côn trùng ....................................................................... 8 
2.5. Nấm Lecanicillium spp. ........................................................................................... 9 
2.5.1. Vị trí phân loại chi nấm Lecanicillium ................................................................. 9 
2.5.4. Một số nghiên cứu về Lecanicillium .................................................................. 11 
2.5.5 Tổng quan về ITS - rDNA .................................................................................. 13 
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 14 
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................................... 14 
3.2. Vật liệu .................................................................................................................. 14 
iv

 

 

3.2.1. Nguồn gốc mẫu thí nghiệm ................................................................................ 14 
3.2.2. Thiết bị, hóa chất và môi trường ........................................................................ 14 
3.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................... 15 
3.3.1. Quan sát đặc điểm hình thái của các mẫu nấm................................................... 15 
3.3.2. Định danh mẫu nấm bằng phương pháp sinh học phân tử ................................. 16 
3.3.3. Hiệu lực gây chết của Lecanicillium spp. lên rệp trong phòng thí nghiệm ........ 18 
3.3.4. Hiệu lực gây chết của Lecanicillium spp. lên rệp trong nhà lưới ....................... 19 
3.3.5. Phân lập nấm trên cơ thể rệp sau chủng nấm ..................................................... 19 
3.3.6 Phương pháp thu thập, xử lý số liệu và phân tích thống kê ............................... 19 
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 21 
4.1. Khảo sát đặc điểm hình thái của nấm Lecanicillium spp. .................................... 21 
4.1.1. Một số hình ảnh tản nấm nấm thu được trong quá trình phục hồi giống gốc ... 21 
4.1.2. Khảo sát đặc điểm hình thái nấm ....................................................................... 22 
4.1.3. Khảo sát tốc độ tăng trưởng nấm........................................................................ 26 
4.2. Kết quả định danh nấm bằng phương pháp sinh học phân tử ............................... 26 
4.2.1. Kết quả nhân sinh khối nấm trong môi trường PG............................................. 26 
4.2.2. Kết quả ly trích DNA và khuyếch đại trình tự ITS các mẫu nấm ...................... 26 
4.2.3. Kết quả giải trình tự gen của các mẫu nấm ........................................................ 27 
4.3. Hiệu lực của nấm Lecanicillium spp. trên rệp trong phòng thí nghiệm ................ 31 
4.4. Hiệu lực của nấm Lecanicillium spp. trên rệp trong điều kiện nhà lưới ............... 34 
4.5. Phân lập nấm trên rệp sau chủng nấm ................................................................... 37 
4.6. Thảo luận ............................................................................................................... 38 
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................... 41 
5.1. Kết luận.................................................................................................................. 41 
5.2 Đề nghị .................................................................................................................. 41 
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 42 

v

 


 

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Hình thái rệp ngô Rhopalosiphum maidis .................................................. 7
Hình 2.2 Hình thái nấm Lecanicillium..................................................................... 11
Hình 4.1 Một số tản nấm nấm thu được sau khi phục hồi ............................. 21
Hình 4.2 Đặc điểm hình thái mẫu VPH – HM1 quan sát dưới kính hiển vi.................. 24
Hình 4.3 Đặc điểm hình thái mẫu VPH – HM2 quan sát dưới kính hiển vi.................. 24
Hình 4.4 Đặc điểm hình thái mẫu VPH – HM3 quan sát dưới kính hiển vi.................. 25
Hình 4.5 Đặc điểm hình thái mẫu BW – CC quan sát dưới kính hiển vi ................ 25
Hình 4.6 Sự tăng trưởng của các mẫu nấm trên môi trường PGA .......................... 26
Hình 4.7 Kết quả kiểm tra DNA tổng số của 4 mẫu nấm ............................ 27
Hình 4.8 Sản phẩm PCR điện di các mẫu nấm Lecanicillium spp. ......................... 27
Hình 4.9 Bản đồ cây sinh dòng của 3 mẫu nấm với các mẫu nấm tham khảo ........ 30
Hình 4.10 Tỉ lệ phần trăm tương đồng của các mẫu nấm ........................................ 31
Hình 4.11 Một số hình ảnh thí nghiệm chủng nấm trong phòng thí nghiệm .. 34
Hình 4.12 Một số hình ảnh thí nghiệm chủng nấm trong nhà lưới ................ 37
Hình 4.13 Đặc điểm hình thái của các mẫu nấm thu nhận từ cơ thể rệp ....................... 38
Hình 4.14 Đặc điểm hình thái tản nấm của các mẫu nấm phân lập từ rệp .................. 38

vi

 

 

DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Nguồn và địa điểm phân lập của các mẫu nấm ........................................... 14
Bảng 3.2 Thành phần trong 1 lít môi trường PGA .................................................... 15
Bảng 3.3 Thành phần trong 1 kg môi trường gạo ...................................................... 15
Bảng 3.4 Primer sử dụng khuếch đại trình tự ITS của nấm ....................................... 17
Bảng 3.5 Các nguồn nấm dùng trong so sánh trình tự ............................................... 18
Bảng 4.1 Đặc điểm hình thái tản nấm trên môi trường nuôi cấy ............................... 22
Bảng 4.2 Đặc điểm hình thái của 4 mẫu nấm quan sát dưới kính hiển vi ................. 23
Bảng 4.3 Hiệu lực (%) của các mẫu nấm đối với rệp ngô trong phòng thí nghiệm .. 33
Bảng 4.4 Hiệu lực (%) của các mẫu nấm đối với rệp ngô trong nhà lưới ................ 36

vii

 


 

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BLAST:

Basic Local Alignment Search Tool

BYDV:

Barley yellow dwarf virus

CRD:

Complete Randomized Design

Ctv:

Cộng tác viên

MYB:

Molasses Yeast Broth

NCBI:

National Center for Biotechnology Information

NT:

Nghiệm thức

PCR:

Polymerase Chain Reaction

SD:

Standar Deviation

viii

 


 

Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Côn trùng gây hại luôn là mối đe dọa cho nền sản xuất nông nghiệp. Đối với các
quốc gia dựa vào nền nông nghiệp thì sự nguy hại đó càng ngiêm trọng. Vì vậy, chúng
trở thành đối tượng được quan tâm trong nhiều nghiên cứu nhằm tìm giải pháp hiệu
quả phục vụ kiểm soát côn trùng gây hại.
Qua nhiều thập kỉ, người ta đã sử dụng các biện pháp hóa học để diệt côn trùng,
biện pháp này tỏ ra khá hiệu quả. Tuy nhiên, bên cạnh lợi ích, biện pháp này cũng bộc
lộ nhiều nhược điểm như gây xáo trộn hệ sinh thái, làm thoái hóa đất và làm ô nhiễm
môi trường. Bên cạnh đó, việc sử dụng thuốc hóa học còn gây hiện tượng kháng thuốc
trên sâu bệnh. Quá trình sử dụng thuốc bảo vệ thực vật trên cây trồng với liều lượng
cao và thời gian cách ly không hợp lý sẽ để lại dư lượng lớn thuốc trên nông sản gây
ảnh hưởng xấu tới sức khỏe con người. Theo quan điểm đó, xây dựng nền nông nghiệp
sản xuất bền vững thông qua các kỹ thuật quản lý dịch hại thân thiện môi trường đang
được quan tâm và thực hiện. Một trong những biện pháp quản lý dịch hại thân thiện
với môi trường là sử dụng các tác nhân từ vi sinh vật gồm vi khuẩn, nấm, virus và
tuyến trùng.
Rệp (Aphidoidae) là nhóm côn trùng chích hút nhựa cây phổ biến nhất trên thế
giới, kí sinh trên hơn 11000 loài cây thuộc 243 họ khác nhau, trong đó có nhiều cây
trồng quan trọng như bông, cải, cải dầu, các loại đậu, cà chua, khoai tây, ngũ cốc.
Hàng năm, rệp cùng với các côn trùng khác gây thiệt hại 15% sản lượng cây trồng trên
toàn thế giới (Vũ Xuân Đạt, 2011). Do tính chất nguy hại của rệp, việc sử dụng các
biện pháp phòng trừ rệp là cần thiết.

Trong số các loài nấm kí sinh gây bệnh cho côn trùng phổ biến có thể kể đến một
số loài nấm trong chi nấm Lecanicillium. Theo Goettel và ctv (2008), chi nấm
Lecanicillium là tác nhân gây bệnh côn trùng rất quan trọng, một số loài trong chi nấm
này được thương mại hóa thành thuốc trừ sâu sinh học. Lecanicillium lecanii,
Lecanicillium attenuatum, Lecanicillium longisporum có tiềm năng trong kiểm soát
rệp nhờ vào khả năng tăng trưởng và tạo bào tử mạnh. Bên cạnh đó, theo Park (2010),
1

 


 

trong số các nấm kí sinh côn trùng, Lecanicillium spp. được biết như là một nhân tố có
khả năng kiểm soát các côn trùng chích hút như ruồi trắng và rệp.
Tuy nấm Lecanicillium spp. đã được các nước trên thế giới sử dụng từ khá lâu
nhưng ở Việt Nam, những nghiên cứu về loài nấm này vẫn còn khá mới mẻ. Vậy nên,
việc đánh giá tác động của nấm này trong điều kiện thực tiễn ở Việt Nam là điều cần
thiết. Từ thực tiễn đó, đề tài: “Nghiên cứu khả năng gây bệnh của Lecanicillium spp.
lên rệp Rhopalosiphum maidis gây hại trên ngô” được tiến hành thực hiện.
1.2. Yêu cầu
Tìm hiểu đặc điểm sinh học của nấm Lecanicillium spp., trên cơ sở đó áp dụng
điều kiện nuôi cấy cho nấm thích hợp. Sử dụng kết hợp một số phương pháp sinh học
phân tử để định danh các mẫu nấm kí sinh côn trùng.
Đánh giá hiệu lực gây bệnh của nấm Lecanicillium spp. lên rệp Rhopalosiphum
maidis, tạo cơ sở áp dụng tạo chế phẩm thuốc sinh học có hiệu quả cao trên rệp
Rhopalosiphum maidis trong sản xuất nông nghiệp, đáp ứng một phần nhu cầu trong
công tác bảo vệ thực vật và sản xuất nông sản sạch hiện nay.
1.3 Nội dung thực hiện
- Khảo sát đặc điểm hình thái của các mẫu nấm

- Định danh các mẫu nấm bằng phương pháp sinh học phân tử
- Đánh giá khả năng gây bệnh của Lecanicillium spp. lên Rhopalosiphum
maidis trong điều kiện phòng thí nghiệm
- Đánh giá khả năng gây bệnh của Lecanicillium spp. lên Rhopalosiphum
maidis trong điều kiện nhà lưới.

2

 


 

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Khái quát tình hình sâu hại ngô
Cây ngô được trồng ở nước ta từ khoảng năm 1723, hiện nay ngô là cây lương
thực quan trọng đứng thứ hai sau lúa (Nguyễn Văn Đĩnh và ctv, 2012). Sản lượng ngô
của nước ta ngày một tăng, chỉ tính từ năm 1995 đến năm 2010 sản lượng đã tăng gần
hai lần và đạt 4,6 triệu tấn (Tổng cục thống kê, 2011).
Cho tới nay có khoảng hơn 100 loài côn trùng gây hại trên ngô. Hầu hết các loài
sâu hại ngô đã phát hiện ở nước ta là những côn trùng ăn rộng. Một số ít loài sâu hại
ngô là những côn trùng ăn hẹp chuyên phá hoại trên các cây hòa thảo. Chúng có đặc
tính phá hoại khác nhau, do đó có những loài xuất hiện vào những giai đoạn sinh
trưởng nhất định của cây ngô như sâu xám, dế chũi chỉ thấy trong các thời kì cây con
hoặc có những loài phá hoại gần hết thời kì sinh trưởng của cây như rệp ngô phá hoại
từ cây con cho tới khi thu hoạch (Nguyễn Đức Khiêm, 2006).
Theo kết quả điều tra gần đây nhất của Cục BVTV, cây ngô trồng ở nước ta bị
một số loài gây hại phổ biến và thường xuyên là sâu xám (Agrotis ypsylon), sâu đục
thân ngô (Otrinia binalis), sâu cắn lá ngô (Mythimna separata), sâu xanh đục ngô
(Helicoverpa armigera) và rệp ngô (Rhopalosiphum maidis) (Nguyễn Văn Đĩnh và

ctv, 2012).
Từ trước tới nay, các tài liệu ở nước ta chỉ nhắc đến loài rệp hại ngô
Rhopalosiphum maidis. Tuy nhiên theo Nguyễn Thị Kim Oanh (1996), trên cây ngô ở
nước ta có bốn loài rệp gây hại là Rhopalosiphum maidis, Rhopalosiphum padi, Aphis
gossy và Myzus spersicae. Trong bốn loài rệp kể trên thì đối tượng gây hại chủ yếu tại
các vùng trồng ngô của nước ta vẫn là Rhopalosiphum maidis (Nguyễn Văn Đĩnh và
ctv, 2012).
2.2. Khái quát chung về rệp họ Aphididae
2.2.1. Vị trí phân loại họ rệp Aphidiae

3

 


 

Họ rệp Aphidiae thuộc siêu họ Aphidoidea, bộ Homoptera, lớp Insecta, ngành
Arthropoda, giới Animalia. Một số tên thường gọi của rệp trên thế giới là Greenfly,
Blackfly, Plant-lice (Smith và ctv, 1979). Ở nước ta, một số tên gọi của rệp thuộc họ
Aphidiae là rệp mềm, rệp đen, rệp muội, rệp vừng.
2.2.2. Đặc điểm chung họ rệp
Theo Day (1996), rệp là loài côn trùng có kích thước cơ thể nhỏ, mềm. Màu cơ thể
đa dạng tùy theo loài và loại cây mà chúng ăn. Một vài loài có phủ lớp sáp hoặc lông
mịn. Hầu hết các loài đều có hai ống bụng và hai ống mông ở cuối cơ thể, đây là đặc
điểm đặc trưng để nhận dạng rệp với các loại côn trùng khác. Nhìn chung, thành trùng
rệp ở dạng không cánh, dạng có cánh xuất hiện khi gặp điều kiện bất lợi, mật số cao,
thiếu thức ăn.
Rệp có nhiều thế hệ trong năm. Phần lớn sinh sản vô tính, ấu trùng có 4 tuổi. Một
vài loài giao phối, đẻ trứng trong mùa thu và mùa đông (Flint, 1998). Theo Johnson

(2003), rệp sống trên cây thuộc họ Phong lan có 6 giai đoạn bao gồm giai đoạn trứng,
4 giai đoạn ấu trùng và giai đoạn thành trùng kéo dài trong 7 ngày phụ thuộc vào từng
loài rệp mềm, điều kiện môi trường, đặc biệt là yếu tố nhiệt độ. Khi các điều kiện trên
thích hợp cho rệp, chúng có thể sinh sản từ 15 đến 40 thế hệ trong một năm.
Hầu hết rệp ở vùng khí hậu ôn hòa của California sinh sản vô tính, rệp cái trưởng
thành sau khoảng 12 ngày tuổi. Vào thời điểm này, chúng có khả năng sinh sản mà
không cần giao phối. Rệp con sau khi được đẻ ra phải trải qua khoảng bốn lần lột xác
trước khi trở thành rệp trưởng thành. Một số loài rệp sinh sản vào mùa thu và mùa
đông. Trong một số trường hợp, rệp đẻ trứng lên lá cây để duy trì nòi giống qua mùa
đông. Khi thời tiết ấm áp, rệp con phát triển thành rệp trưởng thành trong khoảng 8
ngày. Mỗi con rệp trưởng thành có thể đẻ 80 trứng trong một tuần (Flint, 2013).
Năm 2004, trong khi Bartlett nghiên cứu về cách gây hại của rệp ở Liên Bang
Mỹ và Canada, nhận thấy có sự tác động tương hỗ giữa rệp và kiến. Trong quá trình
chích hút dịch cây, một số cây tiết ra dịch ngọt tạo nguồn thức ăn dồi dào cho kiến.
Kiến được coi là “kẻ bảo vệ” của rệp, chúng di chuyển rệp từ cây này sang cây khác
khi nguồn thức ăn không đủ hoặc giữ trứng rệp dưới ngực trong thời gian qua đông.
4

 


 

Theo Day và ctv (2002), các thiên địch trong tự nhiên đóng một vai trò rất quan
trọng trong việc kiểm soát rệp. Bọ cánh cứng, một số côn trùng ký sinh, chim và nấm
là các sinh vật giúp kiểm soát sự phát triển của rệp. Trong quá trình canh tác nên tránh
sử dụng thuốc trừ sâu gây hại cho sinh vật có lợi trong vườn và chăm sóc cây trồng,
đảm bảo cây khỏe mạnh để chống lại sự phá hoại của rệp.
2.3. Rệp ngô Rhopalosiphum maidis
2.3.1. Sự phân bố và kí chủ của Rhopalosiphum maidis

Rệp ngô phân bố ở các nước Nhiệt đới và Á nhiệt đới. Ở Việt Nam, rệp có ở khắp
các vùng trồng ngô trên miền Bắc, từ đồng bằng, trung du cho tới cả các vùng núi cao
(Nguyễn Đức Khiêm, 2006). Rệp ngô là loài ăn rộng, sống trên nhiều loại cây trồng và
cây dại thuộc họ hòa thảo bao gồm ngô, đại mạch, lúa mì, lúa nước, mía, kê, cao
lương, cây hoa và cây cảnh (Nguyễn Đức Khiêm, 2006). Theo Boucher (2007), ngoài
các cây trồng kể trên, Rhopalosiphum maidis còn sống trên nhiều loại cỏ (Echinochloa
colona, Ciria và Setaria geniculata) và một số cây ngũ cốc khác như lúa mạch, lúa
mạch đen, kiều mạch, lúa mì.
2.3.2. Triệu chứng, mức độ gây hại của Rhopalosiphum maidis trên ngô
Rệp ngô hút nhựa ở nõn ngô, bẹ lá, bông cờ, lá bi, làm cho cây ngô già yếu, bắp
bé đi, chất lượng hạt kém, ngô bị hại lúc còn non không thể ra được bắp. Rệp phá hoại
làm năng suất và phẩm chất ngô giảm đi rõ rệt (Nguyễn Đức Khiêm, 2006). Bên cạnh
đó, rệp ngô còn là một loài trung gian môi giới truyền virus gây bệnh khảm lùn và đốm
lá gây ảnh hưởng tới khả năng sinh trưởng và phát triển của cây ngô (Nguyễn Văn
Đĩnh và ctv, 2012).
Theo báo cáo của Bellcock (2002), tại những cánh đồng ngô ở Galva (tiểu bang
Iowa, Mỹ) có tới 20 - 25% cây ngô khi trổ cờ bị bao phủ bởi rệp ngô. Đây được coi là
nguyên nhân làm cho khoảng 5% cây ngô trong các cánh đồng bị cằn cỗi. Chúng làm
cho lá ngô bị héo, xoăn và bị đổi sang màu vàng do lá bị nhiễm các sinh vật gây bệnh
trong quá trình chúng chích hút. Bên cạnh đó, rệp bao phủ và tiết chất tiết lên râu và
vỏ bắp ngô làm gián đoạn quá trình thụ phấn của cây.

5

 


 

Rhopalosiphum maidis là một trong những loài gây hại ngô nghiêm trọng nhất ở

Ai Cập (Eryan, 2004). Trong nghiên cứu đánh giá thiệt hại năng suất và trong quá
trình xây dựng mô hình dự báo sản lượng ngô của Eryan, kết quả năng suất ngô ghi
nhận vào cuối mùa cho thấy tỉ lệ thiệt hại về năng suất trong bốn giai đoạn của cây ngô
(cây ngô có 10 lá, trổ cờ, bắt đầu nuôi hạt và chín sáp) là 14,6%; 22,9%; 35,3% và
36,0% tương ứng với mật độ rệp nhiễm trung bình khoảng 100, 1000, 2000 và 3000
con/cây. Như vậy, kết quả nghiên cứu của tác giả cho thấy rệp ngô gây hại trong nhiều
giai đoạn phát triển của ngô, khi mật độ rệp càng cao thì năng suất của ngô càng giảm.
Bên cạnh ngô, Rhopalosiphum maidis có khả năng phá hoại trên cây lúa mì và
cây lúa mạch với khả năng gây thiệt hại năng suất lên đến 30%. Một nghiên cứu trên
khắp vùng Nam Tây Úc cho thấy thiệt hại năng suất của các loại ngũ cốc do rệp ngô
gây ra dao động từ 400 - 1800 kg/ha. Việc sụt giảm sản lượng có thể do hai yếu tố là
rệp hút nhựa cây trực tiếp và nhiễm virus vàng lùn lúa mạch (BYDV) (Theo
www.herbiguide.com).
2.3.3. Một số đặc điểm hình thái của rệp Rhopalosiphum maidis
Rệp ngô có sáu chân, màu sắc thân thay đổi từ xanh đậm, xám tới màu xanh lá
cây, bụng thường được bao phủ bởi một lớp bột trắng mịn. Rệp tồn tại ở hai dạng có
cánh và không cánh (Boucher, 2007).
Theo Nguyễn Văn Đĩnh và ctv (2012), rệp ngô có màu xanh nhạt, rệp cái không
có cánh có chiều dài cơ thể là 1,98 ± 0,07 mm, chiều rộng cơ thể là 1,02 ± 0,15mm.
Mép trước trán phẳng, râu đầu có sáu đốt, độ dài phần ngọn đốt râu cuối dài gấp hai
lần phần gốc râu. Ống bụng dài gấp 1,5 lần phần đuôi. Phần đuôi và ống bụng có màu
sẫm hơn màu cơ thể.

6

 


 

1)

2)

1 mm

Hình 2.1 Hình thái rệp ngô Rhopalosiphum maidis. (1) Rệp cái trưởng thành
và rệp con (Christine, 2002); (2) (a) Rệp ngô đực trưởng thành; (b) Rệp ngô cái
có cánh trưởng thành; (c) Rệp ngô cái không có cánh trưởng thành
(ipm.ncsu.edu).

2.3.4. Tập tính sống và quy luật phát sinh gây hại của Rhopalosiphum maidis
Trong vòng đời của rệp ngô không có giai đoạn trứng và không có con đực. Ấu
trùng trưởng thành sau khi đẻ sáu ngày. Ở miền Bắc nước Mỹ, một năm rệp có thể
sinh sản được 9 thế hệ (Boucher, 2005). Rệp ngô sinh sản chủ yếu theo lối đơn tính và
đẻ con. Trong quần thể rệp thường thấy nhiều loại hình, bao gồm rệp cái không cánh,
rệp cái có cánh và rệp con. Chúng sống thành quần thể trên các bộ phận bẹ lá, nõn ngô,
hoa cờ, lá bao, có chỗ rệp sống lẻ tẻ 5 - 7 con, có chỗ phát triển thành từng đám dày
đặc (Nguyễn Đức Khiêm, 2006).
Vào vụ ngô đông xuân, rệp cái có cánh từ các kí chủ dại bay tới các ruộng ngô.
Ở đây, rệp cái có cánh sinh sản ra nhiều rệp con. Những rệp con này về sau trở thành
rệp cái không cánh và tiếp tục sinh sản theo lối đơn tính nhiều thế hệ trên cây ngô. Khi
quần thể rệp ở một bộ phận nào đó của cây đã phát triển tương đối dày đặc thì xuất
hiện nhiều cá thể rệp có cánh. Những con rệp có cánh này lại bay tới các ruộng ngô
khác, đẻ con và hình thành quần thể rệp ở đó. Đến cuối vụ ngô, khi cây đã già, điều
kiện thức ăn không còn thích hợp với rệp nữa thì trong quần thể rệp xuất hiện nhiều
loại hình có cánh. Những loài rệp có cánh này di chuyển tới các kí chủ khác, đẻ ra rệp
con, tiếp tục phát triển quần thể trên những kí chủ này cho tới vụ ngô sau đó. Rệp ngô
7

 


 

thường xuất hiện trên đồng ruộng vào khoảng tháng 10 – 11, phát triển nhiều trong
tháng 1 – 2 (khoảng thời gian môi trường sống có độ ẩm không khí cao). Từ tháng 4
trở đi số lượng rệp giảm dần (Nguyễn Văn Đĩnh và ctv, 2012).
2.3.5. Biện pháp phòng trừ rệp Rhopalosiphum maidis
Việc phòng trừ rệp ngô cần thực hiện kết hợp nhiều biện pháp khác nhau. Theo
Nguyễn Đức Khiêm (2006), có thể giảm tác động của rệp cho cây ngô bằng các biện
pháp canh tác như bảo đảm chế độ phân bón một cách cân đối, mật độ trồng không
quá dày làm đồng ruộng thông thoáng, thu dọn cỏ dại, các cây cối vụ trước còn lại
trước khi trồng mới. Theo Nguyễn Văn Đĩnh và ctv (2012), ngoài biện pháp vệ sinh
đồng ruộng và trồng cây với mật độ vừa phải thì cần trồng xen ngô với đậu tương để
tăng cường hoạt động của các thiên địch tự nhiên. Một số thiên địch của rệp ngô
thường thấy trên đồng ruộng như các loài bọ rùa Coccinella repanda, Chilomene
quadriplagiata Swarlz và ấu trùng ruồi Sirphus balteatus. Những loài thiên địch này
có vai trò quan trọng trong việc hạn chế rệp ngô sinh sống trong tự nhiên.
Ngoài ra, rệp ngô có thể bị diệt trừ theo các cơ chế tự nhiên như mưa với cường
độ lớn, kéo dài. Rệp ngô bị nhiều loài ăn thịt và ký sinh như ấu trùng, thành trùng bọ
rùa, bọ cánh lưới, ruồi ăn rệp, ong ký sinh. Mật số rệp ngô có thể giảm nhanh do tác
động của nhiều yếu tố như điều kiện thức ăn thiếu, quần thể quá đông và sự phát triển
của thành trùng có cánh.
2.4. Giới thiệu về nấm ký sinh côn trùng
Thuật ngữ “nấm côn trùng” (insect-pathogenic fungi hay entomopathogenic
fungi) dùng để chỉ những loài nấm có khả năng lây nhiễm côn trùng khỏe mạnh, gây
hại hoặc tiêu diệt ký chủ của nó (Samson và ctv, 1988). Nấm côn trùng là thiên địch
phổ biến của các loài chân khớp trên khắp thế giới và được xem như là các đối tượng
kiểm soát sinh học (Hajek và Leger, 1994).

Cũng như vi khuẩn, nhiều loài nấm có quan hệ cộng sinh hoặc hoại sinh với côn
trùng, trong đó có nhiều loài nấm thực sự là ký sinh, gây hiện tượng bệnh lý và dẫn
đến tiêu diệt côn trùng. Nấm gây bệnh côn trùng có ý nghĩa rất lớn vì có thể gây chết
thường xuyên với tỉ lệ gây chết cao cho nhiều loài côn trùng gây hại và là những tác
8

 


 

nhân điều hòa tự nhiên rất hiệu quả. Côn trùng chết do nấm rất dễ nhận biết bằng mắt
thường vì các sợi nấm mọc qua vỏ cơ thể và bao phủ toàn bộ bề mặt ngoài của cơ thể
côn trùng. Cơ thể côn trùng bị chết do nấm không bị tan rã mà thường giữ nguyên hình
dạng ban đầu, toàn bộ bên trong cơ thể chứa đầy nấm (Trần Văn Mão, 2008).
Bào tử của nấm này tấn công bên ngoài hoặc bên trong ruột côn trùng. Sau đó
bào tử này nảy mầm và sợi nấm xâm nhập vào xoang dịch của côn trùng. Cái chết có
thể là kết quả của sự sản sinh độc tố của nấm hoặc sau khi sử dụng dịch cơ thể. Tiếp
theo là các chất dự trữ của côn trùng sẽ được sử dụng, hệ sợi nấm hình thành bào tử để
duy trì sự sống (Trần Văn Mão, 2008).
Sự sinh sản của nấm làm biến đổi của thành phần dịch thể và làm phá hủy hệ
thống hạch bạch huyết. Do nấm sản sinh nhiều làm tắc hệ tuần hoàn, gây đói sinh lí tế
bào vật chủ, chất độc sinh ra làm thay đổi sinh hóa cơ thể và làm tê liệt thần kinh, từ
đó làm rối loạn cơ năng sinh lí của côn trùng. Côn trùng có biểu hiện hô hấp thất
thường, giảm khả năng sinh sản và bị ức chế sự lột xác (Trần Văn Mão, 2008).
2.5. Nấm Lecanicillium spp.
2.5.1. Vị trí phân loại chi nấm Lecanicillium
Lecanicillium thuộc họ Clavicipitaceae, bộ Hypocreales, lớp Sordariomycetes,
ngành Ascomycota, giới Fungi. Chi nấm Lecanicillium bao gồm 21 loài nấm thuộc
nhóm entomopathogenic và mycopathogenic được tách ra từ chi nấm Verticillium,

trong đó có bao gồm loài nấm được biết đến rộng rãi trước đây là Verticillium lecanii.
Một số loài nấm trong nhóm này có thể kể đến là Lecanicillium longisporum gây bệnh
trên rệp, Lecanicillium muscarium gây bệnh trên ruồi trắng và bọ trĩ (Zare và Gams,
2001).
2.5.2. Quá trình gây bệnh của Lecanicillium spp. trên côn trùng
Theo Goettel và ctv (2008), khi tiếp xúc với cơ thể côn trùng, Lecanicillium spp.
ngay lập tức sử dụng cả khả năng xâm nhập về cơ học và tiết enzyme ly giải để thâm
nhập trực tiếp qua lớp da, sau đó đưa chất độc của nấm qua thành tế bào côn trùng.

Theo Cloyd (1999), Nấm Lecanicillium lecanii khi đi vào cơ thể côn trùng sẽ tiết độc
tố diệt côn trùng cyclodepsipeptide bassianolide và axit dipicolinic, gây độc cho
9

 


 

vật chủ. Sau đó, chúng phát triển và xâm chiếm các tổ chức mô của vật chủ, nhanh
chóng gây ra cái chết cho côn trùng.
2.5.3. Một số đặc điểm hình thái và sinh lý của nấm Lecanicillium spp.
Một số đặc điểm hình thái của một số loài trong chi nấm Lecanicillium được mô
tả trong nghiên cứu của Humber (2005). Nấm Lecanicillium lecanii (Zimmermann)
(Gam và Zare, 2001), bào tử (dài x rộng) 2,5 - 3,5 x 1 - 1,5 µm, thể bình dài
11 - 20 µm; Lecanicillium longisporum (Petch) (Gam và Zare, 2001), bào tử (dài x
rộng) 5 - 10,5 x 1,5 - 2,5 µm, thể bình dài 20 – 40 µm. Nấm Lecanicillium muscarium
(Petch) (Gam và Zare, 2001), bào tử (dài x rộng) 2,5 - 5,5 x 1 - 1,5 - (1,8) µm, thể bình
dài 20 - 35 µm. Nấm Lecanicillium fusisporum W. Gams có bào tử đính hình trụ, dài
4 - 6 µm.
Các dấu hiệu dễ nhận thấy để nhận biết Lecanicillium spp. là thể bình sắp xếp

thành hình vòng, đối xứng theo cặp hoặc sắp xếp đơn lẻ, có hình thon dài và nhỏ dần
về phần ngọn, bào tử đính tập hợp lại thành những hạt nhầy đính ở đầu thể bình (hiếm
khi tập trung thành chuỗi) (Humber, 2005).
Theo Feng và ctv (2000), trên môi trường nuôi cấy lỏng và rắn, Lecanicillium
lecanii tạo ra nhiều kiểu bào tử khác nhau. Bào tử khí sinh của nấm trên môi trường
gạo hấp chín bám thành đám trên thể sinh bào tử (conidiophores), bào tử chìm nằm
phân tán trong môi trường. Bào tử khí sinh thường khá đồng nhất về kích thước, có
kích thước (dài x rộng) khoảng 5,2 - 7,0 x 2,5 - 1,9 µm. Bào tử chìm có sự khác biệt
nhiều về kích thước, có kích thước (dài x rộng) khoảng 4,9 - 5,1 x 1,4 - 2,4 µm. Dưới
kính hiển vi điện tử, bào tử khí sinh có dạng bề mặt gồ ghề và có đặc điểm dễ vỡ, bào
tử chìm có bề mặt trơn nhẵn.

Theo Cloyd (1999), nấm Lecanicillium lecanii hoạt động tốt nhất ở khoảng nhiệt
độ 15 - 25°C và độ ẩm tương đối cao (85 - 90%). Trong quá trình gây bệnh cho côn
trùng, Lecanicillium lecanii cần duy trì độ ẩm cao ít nhất khoảng 10 đến 12 giờ để đạt
hiệu quả gây bệnh tối ưu. Khi gặp điều kiện khí hậu khô, hiệu lực diệt côn trùng của
nấm Lecanicillium lecanii bị giảm đáng kể do độ ẩm không phù hợp. Bên cạnh đó, bào
tử Lecanicillium lecanii bị hư hại do tác động của tia bức xạ cực tím.
10

 


 

Hình 2.2 Hình thái nấm Lecanicillium. (a), (b), (c), (e)
Đám cuống sinh bào tử và cuống sinh bào tử; (d) Đám bào tử

(Humber, 2005).
2.5.4. Một số nghiên cứu về Lecanicillium

Năm 1980, Ekbom và ctv thực hiện thí nghiệm sử dụng Lecanicillium fusisporum
và Lecanicillium lecanii trên Trialeurodes vaporariorum, Myzus persicae (Sulz.),
Rhopalosiphum padi, Brevicoryne brassicae và Laodelphax striatella trong phòng thí
nghiệm và chỉ ra rằng Lecanicillium fusisporum là một nhân tố có tiềm năng gây bệnh
cho côn trùng.
Theo Humber (2005), Lecanicillium fusisporum thường được gặp trên các kí chủ
Trialeurodes vaporariorum, Myzus persicae. Bên cạnh đó, Lecanicillium lecanii
thường gặp trên Agelastica alni, Dendroctonus micans, Alphitobius diaperinus,
Bombyx mori, Coccus viridis, Brevicoryne brassicae.
Sự sản xuất bào tử trong vòng 14 ngày của nấm Lecanicillium lecanii tốt nhất
trong môi trường YPDA ở độ sâu môi trường không đáng kể (Bidochka, 1999). Theo
Talwar (2005), chất dinh dưỡng như bột ngũ cốc có thể vừa làm môi trường vừa làm
chất mang cho bào tử nấm. Ví dụ điển hình là bào tử nấm Lecanicillium lecanii được
phối trộn với bột ngũ cốc có hiệu quả kiểm soát côn trùng tốt hơn so với chỉ phun bào
tử (Kanagaratnam và ctv, 1982).
Năm 2008, Derakhslan và ctv đã tiến hành nghiên cứu đánh giá khả năng sinh
trưởng của Lecanicillium lecanii (Zimm) viegas trên hai dạng môi trường (lỏng và
11

 


 

xốp). Trong các môi trường lỏng, môi trường MYB cho lượng bào tử nấm cao nhất đạt
8,33 x 108 bào tử/ml và sinh khối đạt 746 mg/100 ml. Trong số các loại môi trường
rắn, môi trường cám gạo cho lượng bào tử cao nhất (1,14 g/100 g). Khi nuôi cấy nấm
kết hợp trên môi trường MYB và môi trường cám gạo trong hai giai đoạn (giai đoạn
nuôi cấy lỏng trên môi trường MYB, giai đoạn nuôi cấy bán rắn trên môi trường cám
gạo), lượng bào tử thu nhận được rất cao (1,7 g/100 g).

Trong quá trình định danh các mẫu nấm Lecanicillium spp. bằng phương pháp
giải trình tự gen vùng ITS (497 - 513 bp) và thử nghiệm đánh giá tính độc của các mẫu
nấm này lên Bemisia tabaci, kết quả cho thấy mẫu nấm 4078 (tương đồng 100% với
Lecanicillium fusisporum) có khả năng diệt Bemisia tabaci trong giai đoạn trứng, ấu
trùng, thành trùng tương ứng là 77,7 ± 12,0, 75,6 ± 6,7, 93,3 ± 11,6 %. So với các mẫu
nấm Lecanicillium lecanii, Lecanicillium attenuatum thì Lecanicillium fusisporum có
khả năng diệt Bemisia tabaci ở giai đoạn trứng cao nhất, trên Bemisia tabaci ở giai
đoạn trưởng thành, tính độc của Lecanicillium fusisporum cao tương đương với
Lecanicillium attenuatum (khoảng 95 - 97%) (Park và Kim, 2010). Trong nghiên cứu
sử dụng các mẫu nấm Lecanicillium spp. để kiểm soát rệp hại rau cải, mẫu nấm
Lecanicillium lecanii có khả năng diệt rệp cao nhất so với mẫu còn lại, với hiệu quả
diệt rệp là 67% sau 7 ngày tại nồng độ 3 x 108 bào tử/ml (Vũ Xuân Đạt, 2011). Từ các
thí nghiệm trên cho thấy, mỗi loài nấm có khả năng thể hiện tính độc cao với một số kí
chủ nhất định.
Năm 2013, Saba và ctv thực hiện nghiên cứu sản xuất các enzyme ngoại bào từ
nấm Lecanicillium lecanii. Theo các tác giả, Lecanicillium lecanii là sinh vật có khả
năng sản xuất các enzyme phân giải protein và polysaccharide (amylase, protease, và
lipase) rất hiệu quả. Chỉ số độ hoạt động của các enzyme (EI) sau khi nuôi cấy trên
môi trường thạch có giá trị cao (Protease - 2,19; Amylase - 2,19; Lipase - 2,15).
Trong thí nghiệm kiểm tra tác động của độ ẩm lên sự hình thành bào tử để chuẩn
bị thương mại hóa thương hiệu Vertalec, Lecanicillium lecanii đã được nghiên cứu sử
dụng chống lại rệp Myzus persicae trên ớt bởi Milner và Lutton (1986) trong nhà kính
ở 20°C. Kết quả cho thấy thời gian cần thiết cho nấm xâm nhiễm vào rệp là 36 giờ ở
độ ẩm tương đối (85% - 90%). Sau 96 giờ phun, 94,5% Myzus persicae bị nhiễm bệnh.
12

 


 

2.5.5 Tổng quan về ITS - rDNA
Vùng gen rDNA là nhóm gen mã hóa rRNA của ribosom, đóng vai trò quan trọng
trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài. Vùng gen rDNA được quan tâm nghiên
cứu nhiều vì nó có nhiều bản sao và không mã hóa cho protein nào. Các bản sao của
gen nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hóa. Hơn nữa,
ribosom hầu như tồn tại trong mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc tiến hóa. Phần lớn
phân tử rDNA tương đối bảo tồn nên được xem là cơ sở để tìm ra sự tương đồng và
các khác biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau. Các primer thiết kế dựa trên những
oligonucleotide có tính bảo tồn cao, được sử dụng cho tất cả các vi sinh vật nhằm
khuếch đại các vùng tương đương dùng trong so sánh. Ngoài ra, nhiều primer và probe
cũng được thiết kế dựa trên các vùng không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh
vi sinh vật (Van de Pee và ctv, 1996).
Các đoạn rDNA 5,8S, rDNA 18S và rDNA 28S phiên mã thành các tiền rRNA
riêng rẽ, bao gồm rRNA 5,8S, rRNA 18S và rRNA 28S. Các đoạn rDNA nằm xen kẽ
giữa các vùng phiên mã bên trong (ITS) và các vùng phiên mã bên ngoài (ETS). Giữa
các nhóm gen gồm nhiều bản sao lặp lại là vùng không phiên mã. Kích thước của mỗi
vùng lặp lại nằm trong khoảng 7,7 - 24 kb (Guarro, 1999).
Trình tự vùng gen rDNA 5,8S có kích thước rất nhỏ và ít có sự biến đổi nhưng
đây là thành phần không thể thiếu của trình tự nu-LSU-rRNA, có vai trò ổn định cấu
trúc ribosom và thúc đẩy quá trình tổng hợp protein (Szymanski và ctv, 2001). Vùng
gen rDNA 18S và vùng gen rDNA 28S mặc dù ít có sự biến đổi nhưng lại rất có ý
nghĩa trong phân loại (Guarro, 1999).
Vùng ITS là vùng có rất nhiều sự biến đổi cao hơn các vùng gen khác của vùng
gen rDNA. Đây là vùng gen thường được sử dụng trong nghiên cứu tiến hóa và phân
bố theo địa lý của vi sinh vật, tuy nhiên phần lớn các so sánh trong vùng này chỉ
thường sử dụng ở mức độ xác định các biệt hóa trong cùng loài (Guarro, 1999). Trong
vùng gen ITS, vùng gen ITS1 có sự biến đổi cao hơn vùng gen ITS2 (Boysen và ctv,
1996; Kuninaga và ctv, 1997).

13

 


 

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 7 năm 2013 đến tháng 12 năm 2013 tại Viện
nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Tp. HCM.
3.2. Vật liệu
3.2.1. Nguồn gốc mẫu thí nghiệm
- Nguồn nấm ký sinh
Mẫu nấm Lecanicillium spp. sử dụng trong nghiên cứu được trình bày trong
bảng 3.2. Các mẫu nấm này được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm vi sinh, Viện nghiên
cứu Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Tp. HCM.
Bảng 3.1 Nguồn phân lập và địa điểm phân lập của các mẫu nấm thử nghiệm
Mẫu nấm

Vật chủ

Nơi thu nhận

VPH - HM1

Rầy nâu

Hóc Môn - Tp. HCM.

VPH - HM2

Rầy nâu

Hóc Môn - Tp. HCM.

VPH - HM3

Rầy nâu

Hóc Môn - Tp. HCM.

BW - CC

Sâu

Củ Chi - Tp. HCM.

- Nguồn Rhopalosiphum maidis
Rệp Rhopalosiphum maidis được thu thập trên lá và trái ngô tại các vườn ngô ở
Bình Dương và Đồng Nai. Sau đó rệp được đem về phòng thí nghiệm nuôi trên những
trái bắp tươi để tiếp tục sinh sản. Tuyển chọn những con rệp còn nhỏ, có kích thước
(dài x rộng) khoảng 0,7 - 0,8 x 0,2 - 0,3 mm làm nguồn rệp sử dụng để chủng nấm.

3.2.2. Thiết bị, hóa chất và môi trường
3.2.2.1. Thiết bị và dụng cụ
- Dụng cụ thu thập mẫu rệp
14

 

 

- Một số dụng cụ cơ bản trong phòng thí nghiệm vi sinh và phòng thí nghiệm sinh
học phân tử
- Dụng cụ nuôi rệp trong phòng thí nghiệm và trong nhà lưới.
3.2.2.2. Hóa chất và môi trường
- Hóa chất li trích DNA và điện di: Nitơ lỏng, Phenol, Chloroform, Isoamyl
alcohol, Tris HCl, EDTA, NaCl, SDS, NaAc, TE, Isopropanol, Ethanol 70%,
Agarose 1,5%, TBE 0.5 X, Loading dye 6 X, nước cất hai lần.
- Môi trường PGA
Bảng 3.2 Thành phần trong 1 lít môi trường PGA
Thành phần môi trường
Khoai tây
Glucose
Agar

Hàm lượng
200 g
20 g
15 g

- Môi trường gạo
Bảng 3.3 Thành phần trong 1 kg môi trường gạo
Thành phần môi trường
Gạo
NaNO3
K2HPO4
MgSO4

Nước cất

Hàm lượng
1000 g
0,9 g
0,15 g
0,15 g
300 ml

(Vũ Xuân Đạt, 2011).

3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Quan sát đặc điểm hình thái của các mẫu nấm
Các mẫu nấm nguồn Lecanicillium spp. được phục hồi bằng cách cấy chuyền qua
môi trường PGA trên đĩa petri. Môi trường được tiệt trùng 1210C trong 30 phút trong
nồi hấp, đổ vào đĩa đã tiệt trùng, làm lạnh và cấy vào đó một khoanh tản nấm trong
điều kiện vô trùng. Sau đó, các đĩa nấm được ủ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm (26°C).
Tiến hành quan sát và ghi nhận các đặc điểm hình thái bằng mắt thường (hình
dáng, kích thước, màu sắc tản nấm mặt trên, mặt dưới, dạng mép tản nấm, giọt tiết) và
quan sát hình thái sợi nấm, cuống sinh bào tử bằng kính hiển vi. Lấy một mảng nhỏ sợi
15