KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ BẢO QUẢN BUỒNG TRỨNG LÊN QUÁ TRÌNH TẠO PHÔI BÒ in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ BẢO QUẢN
BUỒNG TRỨNG LÊN QUÁ TRÌNH
TẠO PHÔI BÒ in vitro

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: LÊ VĂN HUY TIN EM

Niên khóa

: 2009 – 2013

Tháng 06/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ BẢO QUẢN
BUỒNG TRỨNG LÊN QUÁ TRÌNH

TẠO PHÔI BÒ IN VITRO

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. CHUNG ANH DŨNG

LÊ VĂN HUY TIN EM

KS. NGUYỄN CHÍ HIẾU

Tháng 06/2013


LỜI CẢM ƠN
Ngay từ thuở nhỏ tôi đã có một ước mơ được trở thành một kĩ sư công nghệ sinh
học. Chung tay với bạn bè bước tiếp con đường của các bậc tiền bối và kiến tạo những
thành tựu khoa học mới để được góp một phần nhỏ bé vào sự nghiệp phát triển đất
nước. Ngày nay, tôi đã hoàn thành đề tài tốt nghiệp của mình, dù là rất nhỏ nhưng đó
là tất cả tâm huyết và sức lao động của tôi. Trong quá trình học tập, nghiên cứu và
hoàn thành khóa luận tốt nghiệp tôi đã nhận được sự giúp đỡ rất lớn từ phía nhà
trường, bộ môn CNSH, giáo viên hướng dẫn, gia đình và bạn bè. Tôi luôn ghi khắc
những công ơn đó, những tình cảm đó.
Em xin chân thành cảm ơn đếnBan Giám Hiệutrường ĐH Nông Lâm Tp.HCM, đến
quý thầy côBMCông Nghệ Sinh Học, đến thầy Lê Đình Đôn, đến cô Tô Thị Nhã Trầm
đã tạo điều kiện để em được học tập, nghiên cứu và sinh hoạt tại trường. Xin cảm ơn
tất cả quý thầy cô đã đứng lớp. Tuy thời gian học tập không nhiều nhưng các thầy các
cô đã truyền đạt cho chúng em những kiến thức vô cùng quý báu.
Em xin chân thành cảm ơn đến Viện KHKTNN Miền Nam, đến thầy Chung Anh

Dũng đã tạo điều kiện cho em được tiến hành thí nghiệm tại viện,tận tình hướng dẫn
em viết đề cương, bố trí thí nghiệm, giải đáp thắc mắc và chỉnh sửa khóa luận tốt
nghiệp giúp em. Cám ơn anh Nguyễn Chí Hiếu và anh Nguyễn Trường Hận đãtrực
tiếp hướng dẫn, giải đáp thắc mắc, chỉnh sửa khóa luận giúp em.
Con xin cảm ơn cha mẹ đã nuôi nấng dạy dỗ con nên người. Cha mẹ đã truyền cho
con nghị lực, kiên trì, quyết tâm trong công việc và trong cuộc sống. Em xin cảm ơn
các anh chị đã động viên và gánh vác công việc thay em để em có nhiều thời gian cho
học tập và nghiên cứu.
Tôi xin cảm ơn đến tất cả các bạn trong lớp và ngoài lớp đã thăm hỏi, động viên và
tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn và xin chúcnhà trường, bộ môn Công nghệ
Sinh học, giáo viên hướng dẫn, gia đình và bạn bè trong và ngoài lớp được dồi dào sức
khỏe, luôn thành công trong học tập, công việc và cuộc sống.
Tp.Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2013
Lê Văn Huy Tin Em
i


TÓM TẮT
Đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố bảo quản buồng trứng lên quá trình tạo
phôi bò in vitro”được thực hiện tại phòng Công Nghệ Sinh Học thuộc viện Khoa Học
Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam nhằm mục tiêu cải thiện tỉ lệ IVM, tỉ lệ IVF, tỉ lệ
phôi dâu và tỉ lệ phôi nang.
Buồng trứng bò ngay sau khi giết mổ được bảo quản trong nước muối sinh lý (0,9%
NaCl bổ sung penicillin và streptomycin) ở các nhiệt độ 10oC, 24oC hoặc 37oC trong 4
giờ, 8 giờ hoặc 12 giờ để đánh giá tỉ lệ IVM, tỉ lệ IVF, tỉ lệ phôi dâu và tỉ lệ phôi nang.
Trứng được chọc hút và nuôi trưởng thành trong môi trường TCM-199 trong tủ ấm
38,5oC, 5% CO2, độ ẩm trên 90% trong 24 giờ. Trứng trưởng thành được thụ tinh
trong các vi giọt tinh trùng (mỗi giọt chứa 100 l tinh dịch, nồng độ 12×106 tinh
trùng/ml). Sau khi thụ tinh 5 giờ, phôi giả định được nuôi trong các vi giọt môi trường

Cr1aa. Sau đó, thí nghiệm khảo sát hiệu quả của hormone ngựa chửa (PMSG) ở các
nồng độ khác nhau bổ sung vào môi trường TCM-199 được tiến hành trên trứng được
chọc hút từ buồng trứng bảo quản 24oC trong 8 giờ để theo dõi tỉ lệ IVM, tỉ lệ IVF, tỉ
lệ phôi dâu và tỉ lệ phôi nang.
Kết quả cho thấy trứng bò được hút từ những buồng trứng bảo quản trong 8 giờ ở
24oC cho tỉ lệ IVM, IVF, phôi dâu và phôi nang cao và ổn định nhất (tỉ lệ tương ứng
46,95%, 31,71%, 25,64% và 12,82%).
Kết quả thí nghiệm khảo sát nồng độ PMSG bổ sung vào môi trường TCM-199 cho
thấy tỉ lệ IVM và tỉ lệ IVF của trứng ở nghiệm thức 1 (TCM-199 + 10 UI/ml PMSG)
cao hơn so với đối chứng (tương ứng 47,62%, 46,95% và 33,64%, 31,71). Nhưng tỉ lệ
phôi dâu và phôi nang ở nghiệm thức 1 và 2 (TCM-199 + 20 UI/ml PMSG) thấp hơn
so với đối chứng. Sự khác biệt của các tỉ lệ IVM, tỉ lệ IVF, tỉ lệ phôi dâu, tỉ lệ phôi
nang giữa nghiệm thức đối chứng, nghiệm thức 1 và nghiệm thức 2 không có ý nghĩa
thống kê. Như vậy, việc bổ sung PMSG ở nồng độ 10UI/ml và 20UI/l vào môi trường
nuôi trứng trưởng thành không cải thiện được tỉ lệ IVM, tỉ lệ IVF, tỉ lệ phôi dâu và tỉ lệ
phôi nang.

ii


SUMMARY
The thesis “Effects of some ovary storage factors on the in vitro bovine embryos
production”, whose targets are improvement on the rates of IVM, IVF, morula and
blastocyst, was carried out at Biotechnology Department, the Institute of Agricultural
Science for Southern Vietnam.
In the first experiment, slaughtered bovine ovaries were preserved inphysiological
saline (0.9% NaCl combine with penicillin and streptomycin) at 10oC, 24oC or 37oC
for 4, 8 or 12 hours to value the rates of IVM, IVF, morula and blastocyst. Then the
oocytes were aspirated and in vitro matured in TCM-199 medium in the incubator at
38.5oC, 5% CO2 and 90% – 100% humidity for 24 hours. Matured oocytes were

fertilized with spermatozoa in small drops (100 l per drop, 12×106 sperms/ml). Five
hours after fertilization, assumed zygotes were cultured in small drops of Cr1aa
medium. The second experiment tested the effect of TCM-199 medium supplemented
with various concentrations of Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG)on
oocytes aspirated from the ovary was preserved at 24oC in 8 hours to value the rates of
IVM, IVF, morula and blastocyst.
The result of the first experiment indicated that the oocytes of the ovaries preserved
at 24oC in 8 hours give the highest and most stable rates of IVM, IVF, morula and
blastocyst (46.95%, 31.71%, 25.64% and 12.82% respectively).
In the second experiment, IVM and IVF rates in treatment 1(TCM-199 + 10 UI/ml
PMSG) were higher than in the control (47.62%, 46.95% and 33.64%, 31.71%
respectively). In contrast, morula and blastocyst rates the treatment 1 and 2 (TCM-199
+ 20 UI/ml PMSG) were lower than the control. However, the difference of IVM, IVF,
morula and blastocyst rates of the control, treament 1 and treatment 2 was not
statistically significant. Therefore, the supplement of 10UI/ml and 20UI/ml PMSG to
the oocytes matured medium had not improve the rates of IVM, IVF, morula and
blastocyst.
Keywords: ovary storage, bovine embryos, fertilization, IVM, IVF, morula,
blastocyst,PMSG.

iii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ........................................................................................................................i
Tóm tắt ............................................................................................................................ ii
Summary ........................................................................................................................ iii
Mục lục .......................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................ vii

Danh sách các bảng ..................................................................................................... viii
Danh sách các hình ........................................................................................................ ix
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................1
1.2.Yêu cầu của đề tài......................................................................................................2
1.3. Nội dung thực hiện ...................................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................................................3
2.1.Lịch sử phát triển của thụ tinh in vitro ......................................................................3
2.1.1. Lịch sử phát triển IVF trên thế giới .......................................................................3
2.1.2.Lịch sử phát triển IVF tại Việt Nam .......................................................................4
2.2.Thụ tinh in vitro .........................................................................................................5
2.2.1.Định nghĩa ..............................................................................................................5
2.2.2.Sinh lý sinh sản bò cái ............................................................................................6
2.2.2.1.Cơ quan sinh sản bò cái .......................................................................................6
2.2.2.2.Chu kỳ động dục bò cái .......................................................................................8
2.2.2.3.Sự hình thành và phát triển nang trứng ...............................................................9
2.2.2.4.Sự rụng trứng .....................................................................................................10
2.2.3.Sinh lý sinh sản bò đực .........................................................................................12
2.2.3.1.Cơ quan sinh sản bò đực....................................................................................12
2.2.3.2.Sự hình thành tinh trùng ....................................................................................13
2.2.4.Sinh lý thụ tinh .....................................................................................................13
2.2.4.1. Quá trình thụ tinh..............................................................................................13
2.2.4.2.Phản ứng cực đầu ..............................................................................................14
2.2.4.3.Xuyên màng trong suốt .....................................................................................14
iv


2.2.4.4.Sự hòa nhập tinh trùng – trứng ..........................................................................14
2.2.4.5.Hoạt hóa trứng ...................................................................................................14
2.2.4.6.Phản ứng vỏ và các cơ chế ngăn chặn đa thụ tinh .............................................15

2.2.4.7.Sự hình thành tiền nhân và sự hòa nhập nhân ...................................................15
2.2.5.Sự phát triển của phôi ...........................................................................................16
2.2.5.1.Sự phân chia và biệt hóa của phôi giai đoạn sớm .............................................16
2.2.5.2.Sự phân cắt đơn thuần .......................................................................................17
2.2.5.3.Sự hình thành phôi dâu và phôi nang ................................................................17
2.2.6.Các yếu tố ảnh hưởng đến IVF .............................................................................18
2.2.6.1.Yếu tố bò mẹ .....................................................................................................18
2.2.6.2.Sự trưởng thành của trứng .................................................................................18
2.2.6.3.Kích thước tế bào trứng .....................................................................................18
2.2.6.4.Giống của bò cho trứng .....................................................................................19
2.2.6.5.Yếu tố bò cho tinh .............................................................................................19
2.2.7.Khả năng ứng dụng của IVF ................................................................................19
2.3.Nghiên cứu bảo quản buồng trứng phục vụ cho IVF ..............................................20
2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của PMSG trong IVF ........................................................23
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................24
3.1.Thời gian và địa điểm nghiên cứu ...........................................................................24
3.2.Vật liệu ....................................................................................................................24
3.3.Phương pháp nghiên cứu .........................................................................................26
3.3.1.Bố trí thí nghiệm ...................................................................................................26
3.3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian bảo quản buồng trứng lên tỉ lệ
IVM, tỉ lệ IVF và tỉ lệ phát triển phôi............................................................................26
3.3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của PMSG bổ sung vào môi trường TCM-199 lên tỉ lệ
IVM, tỉ lệ IVF và tỉ lệ phát triển phôi............................................................................27
3.3.2.Các bước tiến hành ...............................................................................................27
3.3.2.1.Thu mẫu buồng trứng bò tại lò mổ ....................................................................27
3.3.2.2.Chọc hút trứng tại phòng thí nghiệm.................................................................28
3.3.2.3. Nuôi trứng trưởng thành ...................................................................................29
3.3.2.4.Thụ tinh trong ống nghiệm ................................................................................30
3.3.2.5.Nuôi và kiểm tra trứng thụ tinh .........................................................................30
v

3.4.Xử lý số liệu ............................................................................................................31
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................32
4.1. Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ lên tỉ lệ IVM, tỉ lệ phát triển phôi .................32
4.1.1.Ảnh hưởng của thời gian, nhiệt độ lên tỉ lệ trưởng thành của trứng ....................32
4.1.1.1. Ảnh hưởng của thời gian lên quá trình trưởng thành của trứng .......................32
4.1.1.2.Ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình trưởng thành của trứng .........................34
4.1.2.Ảnh hưởng của thời gian, nhiệt độ lên sự tạo phôi in vitro ..................................36
4.1.2.1.Ảnh hưởng của thời gian lên sự phát triển phôi ................................................37
4.1.2.2.Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phát triển phôi .................................................39
4.2.Ảnh hưởng ảnh hưởng của PMSG bổ sung vào môi trường TCM-199 lên tỉ lệ IVM,
tỉ lệ IVF và tỉ lệ phát triển phôi .....................................................................................43
4.2.1.Ảnh hưởng của nồng độ PMSG lên sự trưởng thành của trứng ...........................43
4.2.2.Ảnh hưởng của PMSG lên sự phát triển phôi ......................................................43
4.3.Thảo luận ..................................................................................................................44
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................46
5.1.Kết luận....................................................................................................................46
5.2.Đề nghị ....................................................................................................................46
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................47
PHỤ LỤC

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BO

:Brackett – Oliphant

BSA

:Bovine Serume Albumin

buCFF

:Cystic Folucuiar Fluid For Buffalo

cAMP

:Cyclic Adenosine Monophosphate

CS

:Calf Serum

ctv

:cộng tác viên

D – PBS

:Dubelco’s Phosphate Buffer Saline

FBS

:Fetal Bovine Serum

FSH

:Follicle Stimulating Hormone

GDF – 9

:Growth Differentiation Factor 9

GnRH

:Gonadotropin Releasing Hormone

HCG

:Human Chorionic Gonadotropin

ICM

:Inner Cell Mass

IVF

:in vitro Fertilization

IVM

:in vitroMaturity

LH

:Luteinizing Hormone

LIF

:Leukemia Inhibitory Ractor

NST

:Nhiễm Sắc Thể

PGF2

:Prostaglandin

Kxđ

:Không Xác Định

Pt4-8, PC10-24

:Prob

PMSG

:Pregnant Mare Serum Gonadotropin

TCM-199

:Tissue Culture Media

TGF

:Transforming Growth Factor

UI

:International Unit

VEGF

:Vascular Endothelial Growth Factor

ZP1, ZP2, ZP3

:Zona Pellucida 1, 2, 3

vii

F2


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1Thành tựu về IVF ở động vật có vú..................................................................3
Bảng 2.2Các thành tựu IVF trên động vật có vú ở Việt Nam.........................................5
Bảng 3.1Thiết bị cần thiết sử dụng trong thí nghiệm ...................................................24
Bảng 3.2Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm ..........................................................25
Bảng 3.3Các loại môi trường ........................................................................................26
Bảng 3.4Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ ...................26
Bảng 4.1 Tỉ lệ IVM của trứng ở các thời gian bảo quản khác nhau .............................32
Bảng 4.2Tỉ lệ IVM của trứng khi bảo quản ở 10oC trong các khoảng thời gian ..........33
Bảng 4.3Tỉ lệ IVM của trứng khi bảo quản ở 24oC trong các khoảng thời gian ..........33

Bảng 4.4Tỉ lệ IVM của trứng khi bảo quản ở 37oC ở các khoảng thời gian ................33
Bảng 4.5 Tỉ lệ IVM của trứng ở các nhiệt độ bảo quản khác nhau ..............................34
Bảng 4.6Tỉ lệ IVM của trứng sau 4 giờ bảo quản ở các mức nhiệt độ khác nhau........34
Bảng 4.7Tỉ lệ IVM của trứng sau 8 giờ bảo quản ở các mức nhiệt độ khác nhau........35
Bảng 4.8 Tỉ lệ IVM của trứng sau 12 giờ bảo quản ở các mức nhiệt độ khác nhau.....35
Bảng 4.9 Tỉ lệ IVF, tỉ lệ phôi dâu và tỉ lệ phôi nang ở các thời gian khác nhau ..........37
Bảng 4.10 Tỉ lệ IVF, tỉ lệ phôi dâu và tỉ lệ phôi nang của trứng bảo quản ở 10oC ......37
Bảng 4.11 Tỉ lệ IVF, tỉ lệ phôi dâu và tỉ lệ phôi nang của trứng bảo quản ở24oC .......38
Bảng 4.12Tỉ lệ IVF bảo quản ở 37oC trong các khoảng thời gian khác nhau ..............39
Bảng 4.13 Tỉ lệ IVF, tỉ lệ phôi dâu và tỉ lệ phôi nang ở các thời gian khác nhau ........39
Bảng 4.14Tỉ lệ IVF, tỉ lệ phôi dâu và tỉ lệ phôi nang của trứng sau 4 giờ bảo quản ....40
Bảng 4.15Tỉ lệ IVF, tỉ lệ phôi dâu và tỉ lệ phôi nang của trứng sau 8 giờ bảo quản ....41
Bảng 4.16Tỉ lệ IVF, tỉ lệ phôi dâu và tỉ lệ phôi nang của trứng sau 12 giờ bảo quản ..42
Bảng 4.17Tỉ lệ IVM ở các nồng độ khác nhau của PMSG ...........................................43
Bảng 4.18Tỉ lệ IVF, tỉ lệ phôi dâu, tỉ lệ phôi nangkhi bổ sung PMSG.........................43

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1Cơ quan sinh sản bò cái ....................................................................................6
Hình 2.2Sự phát triển của trứng trên buồng trứng bò .....................................................7
Hình 3.1 Quy trình thí nghiệm ......................................................................................28
Hình 3.2Phân loại trứng. ...............................................................................................29
Hình 4.1Tế bào trứng trưởng thành được chụp dưới kính hiển vi soi nổi.. ..................32
Hình 4.2Sự phát triển phôi chụp dưới kính hiển vi soi ngược......................................36

ix

Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay, cuộc sống của người Việt Nam ngày càng được nâng cao thì nhu cầu cải
thiện dinh dưỡng, cải thiện chất lượng bửa ăn ngày càng được chú trọng. Nhu cầu của
xã hội càng được đẩy lên cao khi nước ta có dân sốrất đông. Do đó đã tạo sức ép rất
lớn lên ngành chăn nuôi nói chung, ngành chăn nuôi bò lấy thịt và lấy sữa nói riêng.
Ngành chăn nuôi bò của nước ta vẫn còn phát triển chậm. Trở ngại lớn nhất kìm
hãm sự phát triển của ngành chăn nuôi là con giống. Công tác giống của nước ta còn
lạc hậu, chưa có nhiều kinh nghiệm cũng như chưa có nhiều nghiên cứu về chọn tạo
giống gia súc. Bò là loài động vật đơn thai, có khoảng cách thế hệ dài và chế độ chăm
sóc thiếu thốn của nông dân thì việc thiết lập được một trang trại có quy mô lớn, đàn
bò có sức khỏe tốt và năng suất cao là một việc vô cùng khó khăn. Đặt biệt, ngành
chăn nuôi bò sữa còn nhiều hạn chế. Nguyên nhân là do con giống chủ yếu nhập từ
nước ngoài nên khá đắt tiền, không thích ứng được điều kiện khí hậu trong nước, kĩ
thuật chăm sóc, chế độ dinh dưỡng không phù hợp… nên năng suất thấp.
Để giải quyết các hiện trạng đó đòi hỏi chúng ta phải áp dụng các thành tựu khoa
học hiện đại vào trong chăn nuôi mà cụ thể là trong chọn giống gia súc. Sự phát triển
của công nghệ hỗ trợ sinh sản nói chung và kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF in vitro Fertilization) nói riêng đã đem lại nhiều ứng dụng không những về mặt khoa
học mà còn về mặt kinh tế. Ở nước ta trong những năm gần đây, nhiều nghiên
cứutrong lĩnh vực IVF trên bò đã được triển khai nhằm tăng nhanh đàn bò để thực hiện
“Chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020” do Thủ Tướng chính phủ đề ra.
Tuy nhiên, các nghiên cứu này còn gặp nhiều khó khăn do nguồn buồng trứng bò
tận thu từ lò mổ không ổn định, chất lượng giảm trong quá trình vận chuyển và bảo
quản.Vì vậy việc nghiên cứu bảo quản buồng trứng bò thu từ lò mổ là việc vô cùng
cần thiết, giúp cho việc nghiên cứu dễ dàng, thuận tiện, chủ động thời gian làm việc.
Trên các cơ sở đó đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố bảo quản buồng trứng
lên quá trình tạo phôi bò in vitro” được thực hiện.

1

1.2. Yêu cầu của đề tài


Xác định thời gian và nhiệt độ bảo quản buồng trứng bò tối ưu cho sự phát triển

của phôi bò in vitro.


Xác định nồng độ thích hợp của huyết thanh ngựa chửa(PMSG – Pregnant

Mare Serum Gonadotropin) bổ sung vào môi trường nuôi trứng trưởng thành (môi
trường TCM-199) nhằm cải thiện tỉ lệ IVM, từ đó cải thiện được tỉ lệ IVF, tỉ lệ phôi
dâu và tỉ lệ phôi nang.
1.3. Nội dung thực hiện


Khảo sát sự ảnh hưởng của ba mức nhiệt độ bảo quản buồng trứng bò: 10oC,

24oC và 37oC lên sự trưởng thành của trứng và sự phát triển của phôi bò in vitro.


Khảo sát sự ảnh hưởng của ba khoảng thời gian bảo quản buồng trứng bò: 4

giờ, 8 giờ và 12 giờ lên sự trưởng thành của trứng và sự phát triển của phôi bò in vitro.


Từ kết quả nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản

buồng trứng bò lên sự trưởng thành của trứng và sự phát triển phôi bò in vitro.Tiến
hành lựa chọn tế bào trứng ở nghiệm thức bảo quản tối ưu để khảo sát ảnh hưởng của
PMSG bổ sung vào môi trường TCM-199 lên sự trưởng thành của trứng và sự phát
triển của phôi bò in vitro.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Lịch sử phát triển của thụ tinh in vitro
2.1.1. Lịch sử phát triển IVF trên thế giới
Bảng 2.1Thành tựu về IVF ở động vật có vú
Tác giả

Đối tượng

Kết quả đạt được

Chang (1959)

Thỏ

Đẻ con

Dauzler và Thibault (1959)

Cừu

Tiền nhân

Yanagimachi và Chang (1964)

Chuột đồng

Thâm nhập, tiền nhân và phân

Trung Quốc

chia tế bào

Whittingham (1968)

Chuột

Phân chia tế bào và thai

Pickworth và Chang (1969)

Chuột đồng

Thâm nhập và tiền nhân

Trung Quốc
Edwards và ctv (1969)

Người

Thâm nhập và tiền nhân

Hammer và ctv (1970)

Mèo

Phân chia tế bào

Yanagimachi (1972)

Chuột lang

Thâm nhập, tiền nhân và phân
chia tế bào

Gould và ctv (1973)

Khỉ Rhesus

Tiền nhân và phân chia tế bào

Miyamoto và Chang (1973)

Chuột

Thâm nhập và tiền nhân

Iritani và ctv (1975)

Lợn

Thâm nhập, tiền nhân và phân
chia tế bào

Mahi và Yanagimachi (1976)

Chó

Thâm nhập (mở rộng đầu)

Iritani và Niwa (1977)

Bò

Thâm nhập và tiền nhân

Hanada và Chang (1978)

Cheo cheo

Thâm nhập và tiền nhân

Hanada và Tsutsumi

Dê

Thâm nhập
(Nguyễn Chí Hiếu, 2009)

Lịch sử phát triển của thụ tinh trong ống nghiệm (In vitro Fertilization-IVF) và cấy
truyền phôi (Embryo Transfer-ET) bắt đầu vào những năm 1890. Khi Walter Heape –
một giáo sư, bác sĩ của Đại học Cambridge đã nghiên cứu về sự sinh sản ở một số loài
động vật và sau này ông đã báo cáo cấy ghép phôi thỏ thành công.Tuy nhiên, mãi cho

đến năm 1959, Chang lần đầu tiên thành công trong việc thụ tinh giữa tinh trùng và
3


trứng của thỏ trong điều kiện phòng thí nghiệm.Đây được xem là thành tựu quan trọng
nhất trong lịch sử phát triển của IVF vì nó chứng minh được rằng trứng và tinh trùng
hoàn toàn có thể thụ tinh ở bên ngoài cơ thể. Từ sau nghiên cứu này, IVF được nghiên
cứu trên nhiều loài động vật khác nhau, kể cả người. Do đó nhiều thành tựu của IVF
trên nhiều loài động vật đã được công bố sau đó.Edwards là một nhà khoa học người
Anh, là một trong những nhà khoa học tiên phong trong việc nghiên cứu IVF trên
người. Năm 1966, Edwards đến Mỹ và cùng tham gia với một nhóm nghiên cứu đứng
đầu là giáo sư Haward Jones, lần đầu báo cáo rằng đã thu được tế bào trứng người
bằng kĩ thuật phẫu thuật nội soi.Năm 1976, Menezo lần đầu tiên phát triển môi trường
nuôi cấy B2. Môi trường này mô phỏng lại môi trường của nang trứng, ống dẫn trứng
và môi trường tử cung của cừu, thỏvà con người.Cũng trong năm này, Steptoe và
Edwards đã báo cáo chuyển phôi thành công nhưng đáng tiếc đó lại là thai ngoài tử
cung. Ngày 25 tháng 7 năm 1978 tại Anh, đứa trẻ đầu tiên trên thế giới được sinh ra
bởi sự hổ trợ của kĩ thuật IVF. Năm 1987 thụ tinh tế bào trứng của con người bằng vi
tiêm đưa một tinh trùng duy nhất xuyên màng trong suốt.Năm 2000, Oktay và
Karlikaya là người đầu tiên báo cáo về cấy ghép mô buồng trứng sau khi bảo quản
đông lạnh.Năm 2007, Báo cáo từ Trung tâm sinh sản McGill, Canada và Bệnh viện Vô
sinh Maria Seoul, Hàn Quốc sinh được cháu bé từ việc chuyển nang con người có
nguồn gốc từ tế bào trứng trưởng thành trong ống nghiệm.
2.1.2. Lịch sử phát triển IVF tại Việt Nam
Do nhiều hạn chế về cơ sở vật chất, kĩ thuật và nhân sự nên IVF ở nước ta chỉ mới
bắt đầu những năm giữa cuối thế kỉ XX.Những năm gần đây, bộ môn cấy truyền phôi
thuộc viện chăn nuôi Việt Nam đã tiến hành nghiên cứu tạo phôi bò in vitro và cấy
truyền phôi. Bước đầu đạt được kết quả khả quan: 74,7% số phôi thu được có thể cấy
truyền. Tỉ lệ thụ thai 40,7% khi sử dụng phôi tươi và 40,4% đối với phôi đông lạnh.
Từ năm 2000–2002,Sở Khoa Học và Công Nghệ Tp.HCM đã thực hiện đề tài

“Nghiên cứu, ứng dụng công nghệ sản xuất và truyền phôi nhằm tăng nhanh giống bò
sữa cao sản ở Tp. HCM. Kết quả tỷ lệ cấy phôi thụ thai là 27,45% đối với phôi tươi và
29,51% từ phôi đông lạnh ngoại nhập.
Năm 2007–2008, Phòng Công Nghệ Sinh Học,Viện Khoa Học Kĩ Thuật Nông
Nghiệp Miền Nam, lần đầu tiên sử dụng tinh trùng X sau phân tách để sản xuất phôi
bò in vitro xác định trước giới tính. Quy trình thí nghiệm theo hướng dẫn của Nhật
4


Bản (National Livestock Breeding Center – NLBC). Kết quả bước đầu cho thấy, trứng
bò được bảo quảntốt trong điều kiện 25oC trong 4 giờ. Tỷ lệ thụ tinh trong vi giọt đạt
23,1% tỷ lệ phát triển đến phôi nang là 19,6% (tinh đông lạnh bình thường) và 29,9%
và 35,0% theo thứ tự đối với tinh phân tách (Chung Anh Dũng và ctv, 2008).
Từ năm 2006 đến năm 2009, Sở Khoa Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chi Minh tài
trợ cho đề tài “tạo phôi bò sữa bằng công nghệ thụ tinh trong ống nghiệm từ nguồn tế
bào trứng cao sản nhập nội và tinh trùng nội giống tốt”. kết quả cuối cùng đã có hai bê
con ra đời bằng IVF (Phan Kim Ngọc và ctv, 2009).
Bảng 2.2Các thành tựu IVF trên động vật có vú ở Việt Nam
Nghiên cứu

Năm

Nghiên cứu cấy truyền phôi ở thỏ

1978

Nghiên cứu cấy truyền phôi bò

1980

Con bê đầu tiên ở nước ta ra đời từ cấy truyền phôi

1986

Cấy 50 phôi đông lạnh (giúp đỡ của 2 chuyên gia Cuba)

1980

Bò sinh đôi trong đó 1 bê do trứng rụng tự nhiên và 1 bê do
cấy truyền phôi

1994

150 phôi đông lạnh cấy trên bò miền Nam và Hà Nội. Những
bê sinh ra sinh trưởng, phát triển, sinh sản bình thường, cho

1996 – 1997

sữa vượt toàn đàn 20–30%
(Nguyễn Chí Hiếu, 2009)
Đối với lĩnh vực IVF trên người,19/8/1997 bộ trưởng bộ y tế ký quyết định cho
phép bệnh viện Từ Dũ thực hiện những trường hợp IVF đầu tiên. Ngày 30/4/1998 ba
em bé từ thành công của IVF đã trào đời. Từ năm 1997 đến nay IVF ở Việt Nam phát
triển sâu rộng. Hàng loạt các trung tâm nghiên cứu và thực hành về IVF được ra đời.
Tính đến thời điểm năm 2010, cả nước có 13 trung tâm IVF (Hồ Mạnh Tường và ctv, 2011).
2.2. Thụ tinh in vitro
2.2.1. Định nghĩa
Thụ tinh trong ống nghiệm (In vitroFertilization-IVF) là quá trình kết hợp giữa tinh
trùng với trứng để tạo ra hợp tử được thực hiện bên ngoài cơ thể mẹ. Tuy xảy ra ngoài
cơ thể, nhưng các điều kiện cho quá trình IVF như môi trường, nhiệt độ, độ ẩm, độ

nhớt… cùng các chỉ tiêu sinh học khác phải giống như trong cơ thể mẹ.
5


2.2.2. Sinh lý sinh sản bò cái
2.2.2.1. Cơ quan sinh sản bò cái

Hình 2.1 Cơ quan sinh sản bò cái
( />Chức năng của các bộ phận sinh dục:
Âm hộ (vulva) – âm vật (clitoris) là nơi vào âm đạo và là nơi cảm giác. Âm hộ rất
nhạy cảm với sự thay đổi nồng độ estrogen. Bò cái động dục thường có âm hộ sưng,
căng phồng, hơi ướt bóng, các lông xung quanh âm hộ cách xa nhau và dựng đứng lên
so với các ngày thường.
Âm đạo (vagina): là cơ quan giao cấu, tiết chất nhày bôi trơn giúp giao phối thuận
tiện, là ống dẫn thai đi ra khi sinh, phân tiết chất dẫn dụ sinh học cái. Ngoài ra âm đạo
còn đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật xâm
nhiễm bởi dịch tiết từ biểu mô âm đạo và dịch cổ tử cung. Âm đạo bò thường dài
khoảng 20 – 30cm.
Tử cung (uterus) là cơ quan có chức năng co cơ đẩy tinh trùng từ tử cung lên ống
dẫn trứng, giúp tống thai và nhau thai ra ngoài khi đẻ, là nơi hoạt hóa tinh trùng chuẩn
bị cho thụ tinh và là nơi cung cấp dinh dưỡng cho phôi và thai phát triển.

6


Buồng trứng (ovary): Mỗi bò cái đều có hai buồng trứng, là cơ quan hình bầu dục
nằm ở hai bên, cạnh tử cung. Các buồng trứng nằm lọt trong các dây chằng rộng và nối
với tử cung bởi dây chằng riêng của buồng trứng.
Kích thước buồng trứng bò trưởng thành dài khoảng 3 – 4 cm đường kính 1,5 – 2
cm. Trọng lượng của chúng thay đổi trong chu kỳ động dục.

Trên buồng trứng quá trình phát triển từ trứng sơ cấp lên trứng thứ cấp theo hướng
từ trong ra ngoài. Khi nang trứng càng phát triển, chúng càng hiện rõ trên bề mặt
buồng trứng. Tùy vào giai đoạn trong chu kì động dục mà trên buồng trứng có các cấu
trúc như trứng sơ cấp, trứng thứ cấp,trứng nang và hoàng thể. Buồng trứng có chức
năng tiết hormone oestrogen (từ trứngcó nang), progesteron (từ hoàng thể) và sản xuất
tế bào trứng. Hình dạng và kích thước của buồng trứng biến đổi tùy theo loài và tùy
vào giai đoạn của chu kì động dục cũng như theo tuổi, cá thể, chế độ dinh dưỡng… Ở
bề mặt của buồng trứng có một lớp liên kết được bao bọc bởi lớp biểu mô hình khối.
Bên dưới lớp áo là lớp vỏ chứa các nang trứng. Khi nang trứng càng lớn chúng càng
hiện rõ trên bề mặt của buồng trứng (Chung Anh Dũng, 2011).

Hình 2.2Sự phát triển của trứng trên buồng trứng
bò( />7


2.2.2.2. Chu kỳ động dục bò cái
 Giai đoạn tiền động dục (proestrous phase)
Cuối giai đoạn hoàng thể, nếu không có tín hiệu đã mang thai vào ngày thứ 17 – 18,
prostaglandin được phân tiết. Lúc này, thể vàng tiêu biến dần có nghĩa là progesterone
giảm. Với sự giảm nồng độ của progesterone sẽ làm tăng GnRH và lànguyên nhân
kích thích LH và FSH phân tiết. FSH gây ra sự trưởng thành của nang qua giai đoạn
hang vị. Các nang trội sẽ được chọn và giữ lại để phát triển các nang không được chọn
sẽ tiêu biến dần. Các nang phát triển sẽ sản xuất estrogen nhờ tế bào hạt. Estrogen gây
ra các dấu hiệu động dục ở bò. Estrogen tiết ra mạnh nhất trước khi động dục và nó tạo
nên đỉnh LH. Sở dĩ các nang nhỏ bị tiêu biến vì inhibin cũng được sản xuất bởi các
nang phát triển và ngăn chặn các nang nhỏ hơn khác. Sự ức chế các nang nhỏ hơn đảm
bảo lựa chọn một nang duy nhất để rụng.
 Giai đoạn động dục (estrous phase)
Trong thời gian động dục estrogen và FSH được giảm, LH lên đỉnh. Lúc này con
cái sẽ đứng yên chấp nhận cho bò đực giao phối. Động dục kéo dài 18 – 20giờ. Rụng

trứng xảy ra 12–18giờ sau khi động dục kết thúc. Hoàng thể hình thành và bắt đầu sản
xuất progesterone, ức chế LH và FSH tiết ra.
 Giai đoạn sau động dục (metestrous phase)
Giai đoạn này kéo dài khoảng 3 – 4 ngày. Đây là thời gian cần thiết để trứng có thể
di chuyển tới sừng tử cung. Tế bào trứng được hứng bởi vòi trứng. LH là yếu tố để
hình thành các tế bào mới, hoàng thể và làm gián đoạn sự phát triển các nang trứng
mới. Dưới tác động của LH hoàng thể được hình thành và phân tiết progesterone.
Progesterone ngăn cản sự phân tiết FSH dẫn đến không có nang trứng mới phát triển.
 Giai đoạn nghỉ ngơi (diestrous phase)
Đây là giai đoạn dài nhất của chu kỳ động dục, thường kéo dài từ ngày thứ 5 đến
ngày thứ 16 – 18. Hoàng thể thành thục và tiết progesterone ảnh hưởng lên đường sinh
dục. Nội mạc tử cung dày lên. Chất nhầy âm đạo trở nên dính và ít. Cổ tử cung dãn nở.
Nếu trứng không được thụ tinh và không có thai làm tổ thì hoàng thể chỉ tồn tại
trongvòng 10 – 12 ngày. Do hàm lượng progesterone cao sẽ gây ra phân tiết
prostaglandin (PGF2) từ lớp nội mạc tử cung. Prostaglandin (PGF2) tác động lên
buồng trứng gây thoái hóa hoàng thể và vì vậy làm giảm hàm lượng progesterone.

8


Điều này dẫn dến sự phân tiết FSH và tái lập một chu kì động dục mới với sự phát
triển của các nang trứng mới.
Nếu trứng được thụ tinh thì hoàng thể tiếp tục phát triển tồn tại và tiết ra
progesterone. Sự chấp nhận phôi thai ở cơ thể mẹ sẽ kiềm hãm sự tiết prostaglandin
(PGF2). Progesterone làm dãn nở cổ tử cung và làm tăng sự phát triển lớp nội mạc tử
cung và nôi dưỡng phôi thai. Progesterone của hoàng thể rất quan trọng trong việc duy
trì bào thai trong suốt 2/3 giai đoạn đầu phát triển của quá trình mang thai. Sau đó có
sự đóng góp progesterone của nhau thai và tuyến thượng thận.
2.2.2.3. Sự hình thành và phát triển nang trứng
Sinh trứng là một quá trình phức tạp, xảy ra ở buồng trứng, bao gồm sự hình thành,

phát triển và sự trưởng thành của trứng. Quá trình này bắt đầu từ giai đoạn phôi thai,
tiếp tục duy trì cho tới sau khi sinh và hoạt động nhịp nhàng ở tuổi trưởng thành (trong
chu kỳ động dục). Trong quá trình sinh trứng có sự phát triển đang xen hỗ trợ của ba
thành phần: trứng, nang trứng và buồng trứng. Trong đó, nang trứng được xem là đơn
vị cơ bản trong sinh lý sinh sản của giới cái, mỗi nang có chứa một trứng. Các nang
trứng nằm vùi trong mô kẽ phần vỏ của buồng trứng.
Buồng trứng bò dài khoảng 3 – 4cm, đường kính khoảng 1,5 – 2cm. Ở bê cái sơ
sinh, buồng trứng có khoảng 100.000 nang trứng nguyên thủy. Tuy nhiên chỉ có vài
nang phát triển đến mức trưởng thành gọi là nang Graaf. Từ khi sơ sinh đến trước khi
thành thục các nang trên buồng trứng trong giai đoạn kiềm hãm. Giai đoạn rất ngắn
trước thành thục, các nang trứng mới tăng trưởng và phát triển mạnh do sự kích thích
mạnh của hormone sinh dục.
Nang trứng nguyên thủy nhỏ nhất và được bao bọc bởi một lớp tế bào vảy. Nang
trứng bậc một được bao bọc bởi một lớp tế bào nang. Nang trứng bậc hai có hai hay
nhiều lớp tế bào nang nhưng không có xoang. Nang Graaf là nang trứng bậc ba trong
xoang có dịch nang và chuẩn bịcho xuất trứng.
Khi nang trứng được phóng thích từ nơi dự trữ, tế bào trứng và nang của nó lớn lên.
Sự phát triển của tế bào trứng hầu như hoàn toàn trong khoảng thời gian thành lập
xoang và trải qua một số giai đoạn phát triển. Trứng bậc một được giảm phân khi còn
trong giai đoạn phôi. Trứng bậc hai được tạo trong lúc nang trứng trưởng thành.
Không phải tất cả các nang trứng đều phát triển thành nang trứng bậc hai, chỉ có một
số nang trứng được tuyển chọn để phát triển thành nang Graaf.
9


2.2.2.4. Sự rụng trứng
Các tế bào cumulus có sự biệt hóa khác so với các tế bào hạt lớp thành trong việc
đáp ứng với các xung LH, chúng có rất ít các thụ thể LH (LH receptor - LH-R). Do đó,
thay vì đáp ứng trực tiếp với LH, các tế bào cumulus nhận các tín hiệu kích thích sự
rụng trứng một cách gián tiếp thông qua các yếu tố có tính lan tỏa như EGF – like

ligand từ các tế bào hạt lớp thành. Hơn nữa các tín hiệu FSH thông qua các receptor
của FSH hiện diện trên các cumulus kết hợp với các con đường truyền tín hiệu
cAMP/PKAvà PI3K xuất hiện làm biểu hiện các gene quan trọng trong việc rụng
trứng. Prostaglandin được xem là nhân tố điều hòa quan trọng trong quá trình rụng
trứng. Đặc biệt là prostaglandin E2 được sinh ra từ các tế bào cumulus thông qua cảm
ứng biểu hiện gene cyclooxygenase-2 (COX-2). Prostaglandin E2 sau đó có vai trò
kích thích 7TMR có cùng bản chất với nó để truyền tín hiệu thông qua con đường
Gs/andenylase/cAMP trong việc làm tăng sự biểu hiện các nhân tố điều hòa sự rụng
trứng. Interleukin-1 có thể được tiết từ các tế bào bạch cầu, có vai trò trong việc cảm
ứng các tế bào cumulus tổng hợp các chất nền ngoại bào. Tế bào trứng có vai trò quan
trọng trong việc tiết nhân tố tăng trưởng TGF gồm GDF-9 và BMP-5, có vai trò trong
việc biệt hóa hình dạng các tế bào cumulus và cho phép các tế bào cumulusthực hiện
chức năng đáp ứng với các nhân tố gây rụng trứng. Cùng với hệ thống nội tiêt và các
thành phần khác nhau của nang trứng sản sinh ra các chất nền ngoại bào giữa các tế
bào cumulus trong quá trình niêm hóa. Quá trình niêm hóa còn gọi là quá trình mở
rộng các tế bào cumulus. Quá trình này được xem là quá trình quan trọng nhất trong
quá trình rụng trứng thành công và thụ tinh.
Chất nền ngoại bào cumulus bao gồm các chuỗi hyaluronan được tổng hợp bởi
hyaluronan systhase-2. Các chuỗi hyaluronan được nối với nhau bằng cầu nối protein
thu nhận từ các thành phần khác nhau. Bao gồm pentraxin 3, đây là nhân tố được xem
là cần thiết trong việc ổn định và giữ lại chất nền sau khi trứng rụng. Và ADAMTS-1
là một loại protease liên quan đến việc tái hình thành chất nền.
Phức hợp trứng chưa trưởng thành với thành phần các tế bào cumulus nén chặc bao
quanh. Lúc này trứng đang trong giai đoạn nghỉ (prophase I). sự trưởng thành của
trứng đòi hỏi phải có đáp ứng các luồng xung gonadotrophin, dưới một loạt các tín
hiệu sinh ra trong quá trình đáp ứng với các luồng xung, các tế bào cumulus mở rộng

10

và thấy rõ thể cực thứ nhất (metaphase II). Giai đoạn này trứng có khả năng thụ tinh
khi gặp tinh trùng.
Quá trình giảm phân của trứng sẽ dừng lại tại đây cho tới khi có sự xâm nhập của
tinh trùng thì các quá trình còn lại của giảm phân II mới được hoàn thành. Quá trình
trưởng thành của trứng là quá trình rất quan trọng và bắt buộc cho sự thụ tinh. cAMP
được xem là nhân tố truyền tín hiệu quan trọng trong việc trưởng thành của trứng. Tuy
nhiên cơ chế phân tử truyền tín hiệu này chưa được biết đến một cách chính xác và rõ
ràng. Trong những quan niệm trước đây cho rằng nồng độ cAMP khá cao do hoạt
động của GPR3 làm ứng chế sự trưởng thành của trứng. Xung tín hiệu LH/FSH trong
quá trình đáp ứng sẽ làm giảm nồng độ cAMPdohoạt động của enzyme
phosphodiesterase theo sau đó làm giảm các chất ức chế cAMP, kết quả là trứng tiếp
tục giảm phân để trưởng thành chuẩn bị cho sự thụ tinh.
Có lẽ quan trọng nhất trong quá trình rụng trứng là tạo lỗ hổng trên bề mặt buồng
trứng được gọi là vết nứt pellucida hay stigma. Thông qua lỗ này mà tế bào trứng và
một lượng lớn tế bào cumulus bao quanh trứng được phóng thích ra khỏi nang trứng.
LH có tác dụng trực tiếp lên sự hình thành các lỗ stigma. Trong quá trình đáp ứng với
các luồng xung LH, nang trứng trước khi rụng sẽ sản sinh ra progesterone và
prostaglandin cả hai yếu tố này đều có vai trò qua trọng trong việc hình thành stigma.
Nhiều bằng chứng cho thấy việc thiếu đi sự hiện diện của PR, COX-2 hay PPAR sẽ
dẫn đến sự khiếm khuyết trong quá trình rụng trứng. Một bằng chứng cho thấy sự tổn
thương có liên quan đến PR, COX-2 hay PPAR đều không gây rụng trứng mặc dù
trứng đã trưởng thành. COX-2 được xem như là tín hiệu ligand cho việc hoạt hóa
PPAR, mà theo sau đó là một loạt các cảm ứng các yếu tố kích thích gây rụng trứng
bao gồm endothelin-2, interleukin-6, cGMP-dependent protein kinase II. Hơn nữa,
cùng với các tín hiệu liên quan đến việc tái cấu trúc lại tế bào lớp vỏ được điều hòa bởi
các nhân tố tăng trưởng thần kinh và tyrosin kinase receptor (TrKA). Hai yếu tố này
cảm ứng trong tế bào lớp vỏ nhằm đáp ứng lại các xung LH. Sự tương tác của chúng
dẫn đến làm giảm tính liên kết của gian bào và dẫn đến sự tạo thành khoảng trống giữa
các tế bào lớp vỏ và cuối cùng dẫn đến sự phóng thích tế bào trứng. Ngoài việc tái cấu
trúc lại các tế bào lớp vỏ để hình thành stigma. Các tế bào lớp vỏ còn phải trải qua sự

thay đổi sự hình thành mạch máu nhằm đáp ứng lại các tín hiệu LH. Nhân tố tăng
trưởng biểu bì mạch máu (VEGF) cần thiết cho việc hình thành mạch máu nang trứng
11


trong suốt quá trình hình thành và phát triển nang antral. Kết quả nghiên cứu trên động
vật hữu nhũ cho thấy rằng VEGF có vai trò trong việc hình thành mạch máu trong
nang trứng. VEGF điều hòa thay đổi tính thấm thành mạch máu cho phép sự trao đổi
qua lại các thành phần nội tiết bao gồm LH và FSH. Các tế bào miễn dịch bao gồm
macrophage, các bạch cầu được phân bố đến lớp tế bào vỏ đều thông qua hệ thống
mạch máu và giải phóng các cytokine và protease và các gốc tự do điều khiển sự hình
thành của thành nang trứng (Chung Anh Dũng, 2011).
2.2.3. Sinh lý sinh sản bò đực
2.2.3.1. Cơ quan sinh sản bò đực
Cơ quan sinh dục con đực bao gồm: bao dịch hoàn, dịch hoàn, phụ dịch hoàn
(epididymus), ống dẫn tinh, các tuyến sinh dục phụ và dương vật.
Bao dịch hoàn: Bao dịch hoàn ở bò là một túi da nằm ở vùng bẹn, nơi chứa dịch
hoàn. Bao dịch hoàn của bò dài và thõng, cổ thon, có rãnh giữa phân chia. Bao dịch
hoàn cùng với thừng dịch hoàn có vai trò điều hoà nhiệt độ trong dịch hoàn. Điều này
duy trì nhiệt độ bên trong dịch hoàn luôn thấp hơn nhiệt độ cơ thể từ 4oC – 7oC, có lợi
cho việc sản xuất tinh trùng trong dịch hoàn với số lượng và chất lượng tốt hơn (Đinh
Văn Cải và Nguyễn Ngọc Tấn, 2007).
Dịch hoàn (testis): Còn gọi là tinh hoàn, là nơi sản xuất ra tinh trùng và hormone
sinh dục đực testosterone. Dịch hoàn chứa các ống sinh tinh được xếp ngoằn ngoèo
trong dịch hoàn, chiều dài tổng cộng của chúng tới 5000m. Những tế bào kẽ (tế bào
Leydig) nằm giữa các ống sinh tinh sản sinh ra hormone testosterone. Những tế bào
Sertoli và tế bào mầm trong ống sinh tinh biệt hoá thành tinh trùng.
Phụ dịch hoàn (epididymus): Ống dẫn tinh từ dịch hoàn ra ngoài, nằm trên bề mặt
dịch hoàn. Đỉnh dịch hoàn phụ gồm nhiều ống nhỏ gom tinh vào một ống lớn phía đáy
dịch hoàn phụ. Dịch hoàn phụ cũng là nơi cất trữ tinh trùng trong thời gian đợi phóng

tinh. Trong phụ dịch hoàn, tinh trùng lớn lên về kích thước và hoàn thiện về chức
năng. Ở những bò đực giống giao phối tự nhiên thì thời gian tinh trùng lưu trữ và vận
chuyển trong dịch hoàn phụ từ 9 – 11ngày. Tại đây tinh trùng có thể duy trì sức sống
và năng lực thụ tinh tới 60 ngày.
Ống dẫn tinh: Bắt đầu từ đuôi dịch hoàn phụvào xoang bụng và đổvào ống dẫn niệu.
Phía cuối phình ra tạo thành một túi chứa lớn có dạng nhưmột cái ampule. Có nhiệm
vụhứng lấy tinh trùng và dẫn tinh trùng đổvề ống niệu.
12


Các tuyến sinh dục phụ,bao gồm: tuyến tinh nang (tuyến túi), tuyến tiền liệt
(prostate) và tuyến cầu niệu đạo. Các tuyến này nằm dọc theo niệu quản, chúng tiết ra
dịch lỏng đổ vào niệu quản, hỗn hợp với tinh trùng thành tinh dịch trước khi xuất tinh.
Dịch tiết của chúng làm tăng thể tích tinh dịch, cung cấp chất dinh dưỡng cho tinh
trùng họat động, cung cấp chất đệm phosphate và carbonate để duy trì pH của tinh
dịch, đảm bảo cho sức sống, sự vận động và khả năng thụ tinh của tinh trùng.
Dương vật: Có dạng cong hình chữ S, bình thường dương vật nằm trong bao dương
vật, khi được kích thích thì dương vật cương lên và phần cong hình chữ S được làm
thẳng ra. Dương vật có chức năng dẫn tinh trùng vào đường sinh dục con cái.
2.2.3.2. Sự hình thành tinh trùng
Hoạt động sinh tinh là một trong hai chức năng quan trọng của tinh hoàn. Ngoài
chức năng sản sinh testosterone, quá trình sinh tinh diễn ra trong lòng ống sinh tinh.
Bao gồm quá trình phân bào và biệt hóa các tế bào sinh tinh trong thành ống sinh tinh.
Các tế bào sinh tinh này có nguồn gốc từ tế bào mầm sinh dục nguyên thủy. Vào
khoảng tuần thứ 4 – 6 của bào thai các tế bào mầm sinh dục nguyên thủy ở gờ sinh dục
bắt đầu tăng sinh. Một số tế bào sẽ thoái hóa, số còn lại sẽ biệt hóa thành tiền tinh
nguyên bào và ngưng phát triển ở giai đoạn này. Một thời gian khá dài nghỉ ngơi các tế
bào này tiếp tục biệt hóa thành tinh nguyên bào và tăng sinh bằng nguyên phân. Đến
tuổi trưởng thành các tinh nguyên bào sẽ giảm phân để tạo tinh trùng.Quá trình sinh
tinh bào gồm ba giai đoạn chính là giai đoạn tinh nguyên bào, giai đoạn tinh bào và

giai đoạn tinh tử. Các giai đoạn này diễn ra liên tục và đồng thời nên bất cứ khi nào
kiểm tra mô tinh hoàns, người ta đều thấy các tế bào sinh tinh ở các giai đoạn khác
nhau (Hồ Mạnh Tường và ctv, 2011).
2.2.4. Sinh lý thụ tinh
2.2.4.1. Quá trình thụ tinh
Thụ tinh là hiện tượng kết hợp giữa tinh trùng và trứng để tạo thành hợp tử có bộ
NST 2n. Đây là quá trình phức tạp, được bắt đầu từ khi tinh trùng tiếp xúc với màng
trong suốt của trứng và kết thúc khi có sự hòa nhập của hai tiền nhân. Quá trình thụ
tinh có thể chia làm sáu giai đoạn: [1] tiếp xúc giữa tinh trùng với màng trong suốt; [2]
phản ứng cực đầu; [3] xâm nhập qua màng trong suốt; [4] hòa màng của trứng và tinh
trùng; [5] hoạt hóa trứng; [6] sự hình thành và hòa nhập của hai tiền nhân.

13


Màng trong suốt được cấu tạo chủ yếu bởi các glycoprotein. Trong đó gồm 3 lớp:
ZP1, ZP2, ZP3. ZP3 chính là nơi gắn kết với tinh trùng và là nơi khởi phát phản ứng
cực đầu. Sau khi phản ứng cực đầu xảy ra, ZP2 sẽ thay thế ZP3 tiếp tục cho tinh trùng
gắn kết vào, để từ đó tinh trùng dễ chui qua màng trong suốt để vào khoang quanh
trứng. Nhiều nghiên cứu cho thấy việc tiếp xúc và gắn kết của tinh trùng với ZP3 trên
màng trong suốt của trứng có tính đặc hiệu loài. Nghĩa là chỉ có tinh trùng và trứng
cùng loài mới gắn kết được (Hồ Mạnh Tường và ctv, 2011).
2.2.4.2. Phản ứng cực đầu
Thể cực đầu (acrosome) nằm ở phần đầu của tinh trùng. Chiếm 1/2 đến 2/3 thể tích
đầu tinh trùng. Thể cực đầu tương đối rộng có nguồn gốc từ thể golgi và một tiểu thể
giống lysozome. Đây là nơi chứa các enzyme quan trọng giúp tinh trùng tiêu hủy và
chui qua màng trong suốt của trứng. Khi tinh trùng gắn với ZP3, phản ứng cực đầu sẽ
xảy ra. Đây là một phản ứng quan trọng trong quá trình thụ tinh của tinh trùng vì chỉ
có những tinh trùng nào đã xảy ra phản ứng cực đầu mới có khả năng chui qua màng
trong suốt và hòa nhập với màng bào tương của trứng. Khi phản ứng cực đầu khởi

phát, màng ngoài thể cực đầu sẽ hòa với màng bào tương của tinh trùng để giải phóng
các enzyme.
2.2.4.3. Xuyên màng trong suốt
Khi phản ứng cực đầu xảy ra, tinh trùng vẫn gắn với màng trong suốt tại vị trí ZP2.
Tiếp theo tinh trùng sẽ phải xuyên qua màng trong suốt để đến và hòa với màng bào
tương. Hoạt động xuyên màng có được là do sự kết hợp của sự tăng động của tinh
trùng và hoạt động li giải của enzyme. Đuôi tinh trùng tạo lực đẩy tới, đồng thời độ lắc
đầu lớn của tinh trùng giúp tinh trùng chui qua màng. Hai khả năng này của tinh trùng
có được là do sự hoạt hóa tinh trùng trước đó.
2.2.4.4. Sự hòa nhập tinh trùng – trứng
Sau khi xuyên qua màng trong suốt, màng bào tương của trứng và màng bào tương
của tinh trùng sẽ hòa nhập tại đoạn xích đạo hẹp ở đầu tinh trùng. Theo sau là một quá
trình sát nhập của tinh trùng vào trứng theo cơ chế tương tự cơ chế thực bào. Tất cả
các thành phần của tinh trùng, ngoại trừ DNA sẽ hòa với bào tương của trứng.
2.2.4.5. Hoạt hóa trứng
Trong quá trình thụ tinh, sự xâm nhập của tinh trùng vào trứng ngoài việc cung cấp
các thành phần di truyền còn gây ra hàng loạt các phản ứng sinh hóa giúp trứng hoàn
14