Khảo sát sự ổn định chủng e coli và bacillus cereus trên nền mẫu và điều kiện bảo quản khác nhau

B
TR

NG

GIÁO D C VÀ ÀO T O
IH CM

TP. H

CHÍ MINH

BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P

Tên đ tài:

Kh o sát s

n đ nh ch ng E.coli và Bacillus cereus trên

n n m u và đi u ki n b o qu n khác nhau.

KHOA CÔNG NGH SINH H C
CHUYÊN NGHÀNH: VI SINH ậ SINH H C PHÂN T
GVHD: Th.S Nguy n V n Hòa
Th.S Tr n Th Ánh Nguy t
SVTH: Nguy n Kim Hoàng
MSSV: 1053012253
Khóa: 2010 ậ 2014

Tp. H Chí Minh, tháng 05 n m 2014

Kh o sát s

n đ nh c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m u và các đi u ki n b o qu n
khác nhau.

L IC M

N

u tiên em xin g i l i c m n chân thành đ n th y Nguy n V n Hòa, th y
Nguy n V n Minh, cô D

ng Nh t Linh, cô Ph m Vân An, ThS. Tr n Th Ánh

Nguy t, ThS. V Di u Thu, ThS. Chu Nguyên Thanh và CN. Nguy n Th Ng c Thùy
đã t n tình h

ng d n, giúp đ em trong su t th i gian th c t p và khóa lu n t t

nghi p.
Em xin c m n Ban giám đ c Trung tâm k thu t tiêu chu n đo l

ng ch t l

ng

3 - QUATEST 3 và các nhân viên Phòng Vi sinh - GMO đã luôn t o đi u ki n t t
nh t, truy n đ t các ki n th c khoa h c và kinh nghi m qúy báu cho em đ em có

th t tin cho công vi c trong t

ng lai.

Cu i cùng, em xin c m n Ban giám hi u Tr

ng

i h c M Thành ph H Chí

Minh, các th y cô Khoa Công Ngh Sinh H c cùng gia đình và các b n sinh viên
l p Công Ngh Sinh H c khóa 010 đã h t lòng quan tâm h tr , t n tâm d y d và
đ ng viên em đ em hoàn thành t t khóa lu n t t nghi p này.
Thành ph H Chí Minh, tháng 05 n m 2014
Sinh viên
Nguy n Kim Hoàng

2


Kh o sát s

n đ nh c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m u và các đi u ki n b o qu n
khác nhau.

M CL C
TV N

............................................................................................................... 6

M c tiêu......................................................................................................................... 6
PH N 1: T NG QUAN ............................................................................................... 7
1.1. T ng quan v Trung tâm k

thu t tiêu chu n đo l

ng ch t l

ng 3 -

QUATEST 3.................................................................................................................. 7
1.1.1. Gi i thi u chung v Trung tâm ........................................................................... 7
1.1.2 Phòng vi sinh & GMO ....................................................................................... 11
1.2.

ic

ng v Bacillus cereus và Escherichia coli............................................... 11

1.2.1

ic

ng v Bacillus cereus............................................................................. 11

1.2.2.

ic

ng v Escherichia coli .......................................................................... 16

PH N 2: V T LI U VÀ PH

NG PHÁP NGHIÊN C U .................................... 21

2.1. Th i gian vƠ đ a đi m th c hi n........................................................................... 21
2.2. V t li u ................................................................................................................. 21
2.2.1. Thi t b và d ng c ............................................................................................ 21
2.2.2. Hóa ch t vƠ môi tr

ng ..................................................................................... 21

2.2.3. V t li u thí nghi m ............................................................................................ 21
2.3. Ph

ng pháp th c hi n......................................................................................... 22

PH N 3: K T QU NGHIÊN C U VÀ TH O LU N .......................................... 35
3.1. K t qu ki m tra đ nhi m khu n c a m u ......................................................... 35
3.2. K t qu t ng sinh ch ng vi sinh v t .................................................................... 35
3.3. Kh o sát s

n đ nh c a Bacillus cereus trên n n m u g o ................................. 36

3.4. Kh o sát s

n đ nh c a Escherichia coli trên n n m u rau s y.......................... 40

PH N 4: K T LU N VÀ

NGH ......................................................................... 43

4.1. K t lu n ................................................................................................................ 43
4.2.

ngh ................................................................................................................. 43

TÀI LI U THAM KH O........................................................................................... 44
PH L C .................................................................................................................... 46

3


Kh o sát s

n đ nh c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m u và các đi u ki n b o qu n
khác nhau.

DANH SÁCH CÁC CH

VI T T T

1) AOAC:

Association of Official Analytical Chemists

2) B.cereus:

Bacillus cereus

3) DSM:

Difco Sporulation Medium

4) E.coli:

Escherichia coli

5) EMB:

Eosin Methylene Blue Lactose

6) GMO:

Genetically Modified Organism

7) IEC:

The International Electrotechnical Commission

8) ISO :

International organization for standardization

9) LT:

Heat Labile

10) MYP:

Mannitol-egg-yolk-polymyxin

11) PCA:

Plate count agar.

12) ST:

Heat Stable

13) TBSD:

T bƠo sinh d

14) TBX:

Tryptone-bile-glucuronic medium

15) TCVN:

Tiêu chu n Vi t Nam

16) TSB :

Trypticase (tryptic) soy broth

17) VSV:

Vi sinh v t

ng

4


Kh o sát s

n đ nh c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m u và các đi u ki n b o qu n
khác nhau.

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BI U
Hình 1: Vi khu n Bacillus cereus.
Hình 2: Bào t Bacillus cereus ch p d

i kính hi n vi đi n t .

Hình 3: C u trúc bào t ch ng B. cereus S69 không ho t đ ng quan sát d

i kính

hi n vi đi n t .
Hình 4 :Bào t Bacillus cereus ch p d

i kính hi n vi 100X.

Hình 5: Vi khu n Escherichia coli.
Hình 6: K t qu th nghi m IMViC c a Escherichia coli.
Hình 7: M u g o sau khi s y khô.
Hình 8: Khu n l c Escherichia coli trên mô tr

ng TBX.

Hình 9: Khu n l c c a Bacillus cereus trên MYP.
Hình 10: Khu n l c Bacillus cereus có vòng phân gi i h ng c u trên th ch máu.
Bi u đ 3.1: K t qu m t đ bào t Bacillus cereus trên môi tr

ng TSB

các nhi t

đ 20oC, 30oC, 41,5oC t i các th i đi m khác nhau.
Bi u đ 3.2: K t qu m t đ bào t Bacillus cereus trên môi tr

ng DSM

các

nhi t đ 20oC, 30oC, 41,5oC t i các th i đi m khác nhau.

DANH SÁCH CÁC B NG
B ng 3.3.1: M t đ ch ng Bacillus cereus sau khi b o qu n (CFU/g).
B ng 3.3.2: M t đ bƠo t Bacillus cereus sau khi b o qu n (CFU/g).
B ng 3.4: M t đ ch ng Escherichia Coli sau khi b o qu n (CFU/g).

5


Kh o sát s

n đ nh c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m u và các đi u ki n b o qu n

khác nhau.

TV N
Vi sinh v t lƠ các c th s ng vô cùng nh bé có các đ c tính sinh lí, sinh hóa
khó n đ nh qua th i gian dài. Các vi sinh v t có th phát tri n m nh h n ho c b
ch t đi do tác đ ng c a các đi u ki n b o qu n, v n chuy n, y u t ngo i c nh khác
nhau. Vì v y, vi c t o ra m t m u chu n (reference material) có ch a m t đ vi sinh
v t n đ nh trong th i gian dài là r t khó kh n.

chính xác c a các k t qu phân

tích và thao tác c a k thu t viên là h t s c quan tr ng trong các nghiên c u khoa
h c công ngh c ng nh trong ki m tra, đánh giá ch t l

ng s n ph m. Trên th c

t , có r t nhi u phòng thí nghi m vi sinh r t c n các m u chu n có ch a vi sinh v t
m c tiêu có m t đ

n đ nh. Các m u chu n này s giúp các phòng thí nghi m có

th t ki m tra tay ngh c a nhân viên, nâng cao hi u qu ki m soát ch t l
ki m soát quy trình thí nghi m, ki m tra giá tr s d ng c a ph

ng,

ng pháp th

nghi m và ch ng minh n ng l c k thu t c a phòng thí nghi m đ i v i các bên
quan tâm.

Hi n nay, trên th tr

ng, các r t nhi u nhà cung c p các m u chu n vi sinh

(APLAC, CMS, LGC,ầ) nh ng v i giá c khá cao (kho ng 6,5 tri u/m u). V n đ
nƠy gơy khó kh n cho các phòng thí nghi m đ th c hi n công tác đ m b o ch t
l

ng. VƠ đơy c ng lƠ đòi h i c a c quan qu n lỦ nhƠ n

c trong vi c công nh n

phòng th nghi m, phòng xét nghi m và phòng thí nghi m theo ISO/IEC 17025. T
nhu c u trên, tôi xin ti n hƠnh đ tƠi “Kh o sát s

n đ nh c a c a E.coli và

Bacillus cereus trên n n m u và đi u ki n b o qu n khác nhau.”.
xây d ng các m u th ch a vi sinh v t m c tiêu cho ch

tài nh m

ng trình ki m tra đánh giá

tay ngh c a ki m nghi m viên ho c s d ng làm m u ki m soát ch t l
v quá trình ki m soát quy trình phân tích t i phòng thí nghi m.

ng ph c

tài th c hi n

trên E.coli và Bacillus cereus.
 M c tiêu
Kh o sát s

n đ nh c a c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m u vƠ đi u ki n

b o qu n khác nhau.

6


Kh o sát s

n đ nh c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m u và các đi u ki n b o qu n
khác nhau.

PH N 1: T NG QUAN
1.1. T ng quan v Trung tâm k thu t tiêu chu n đo l

ng ch t l

ng 3 -

QUATEST 3 [17]:
1.1.1. Gi i thi u chung v Trung tâm
QUATEST 3 là t ch c khoa h c công ngh thu c T ng c c Tiêu chu n
l

ng Ch t l

ng ậ B Khoa h c và Công ngh , đ

1976 trên c s Vi n

nh chu n Qu c gia tr

t v n, đƠo t o đ

ng theo tiêu chu n ISO 9001;

c công nh n phù h p v i tiêu chu n ISO/IEC 17025, l nh

v c giám đ nh hàng hóa đ
ch ng nh n s n ph m đ

c thành l p t tháng 5 n m

c đơy.

QUATEST 3 áp d ng h th ng qu n lý ch t l
l nh v c thí nghi m đ

c công nh n phù h p v i ISO/IEC 17020, l nh v c

c công nh n phù h p v i ISO/IEC Guide 65 và l nh v c

c ch ng nh n phù h p v i ISO 9001.

Qua 30 n m ho t đ ng, QUATEST 3 đư đ

c bi t đ n nh m t đ n v hƠng đ u

t i Vi t Nam trong l nh v c cung c p d ch v k thu t v tiêu chu n, đo l
ch t l

o

ng. QUATEST 3 có đ i ng chuyên viên, k thu t viên đ

ng và

c đƠo t o

chuyên sâu và có nhi u kinh nghi m, h th ng phòng thí nghi m v i trang thi t b
hi n đ i theo chu n m c qu c t .
V i n l c nơng cao n ng l c k thu t c a các phòng th nghi m đ đ

c th a

nh n qu c t và khu v c, Phòng Th nghi m Vi sinh - GMO c a QUATEST 3 đ
các n

c ASEAN ch n là phòng th

Laboratory ậ ARL) theo ch
đ

c các n

c

nghi m đ i ch ng (ASEAN Reference

ng trình EC - ASEAN và Phòng Th nghi m

i n

c ASEAN th a nh n k t qu th nghi m đ i v i các s n ph m đi n

gia d ng theo th a thu n th a nh n l n nhau trong l nh v c th nghi m đi n vƠ đi n
t ( ASEAN EE MRA). Ngoài ra, QUATEST 3 đang tri n khai ch

ng trình m

r ng s th a nh n c a khu v c và qu c t cho các l nh v c th nghi m khác.
Các l nh v c ho t đ ng chính c a trung tâm:
 D ch v th nghi m
Các phòng th nghi m c a QUATEST 3 đ u đ

c công nh n phù h p v i tiêu

chu n ISO/IEC 17025, phòng th nghi m th c ph m và phòng th nghi m vi sinh-

7


n đ nh c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m u và các đi u ki n b o qu n
khác nhau.

Kh o sát s

GMO c ng đ

c công nh n b i t

ch c công nh n c a Na Uy (Norway

Accreditation Body).
Các l nh v c th nghi m chính bao g m:
-

C khí và không phá h y

-

Hàng tiêu dùng

-

g gia d ng

-

V t li u xây d ng
i n & đi n t

-

T

ng thích đi n t

-

Hóa ch t

-

Môi tr

-

D u khí

-

Th c ph m

-

Vi sinh - sinh v t bi n đ i gen

ng

 D ch v đo l

ng

QUATEST 3 cung c p d ch v đo l

-

dài

-

Kh i l

-

C

-

Dung tích-L u l

-

i n

-

Nhi t

-

Hoá lý

ng trong các l nh v c:

ng

ng

 D ch v giám đ nh
it

ng giám đ nh s phù h p bao g m:

-

Hàng hóa

-

Công ngh

-

Môi tr

-

Công trình

-

An toàn công nghi p

ng

8


n đ nh c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m u và các đi u ki n b o qu n
khác nhau.

Kh o sát s

 Ki m tra:
-

Thép tròn cán nóng và thép d

-

M b o hi m cho ng

-

X ng, d u diesel

i đi xe máy

ch i tr em

-

ng l c,

Th c ph m, ph gia, nguyên li u, ch t h tr ch bi n th c ph m và bao bì
th c ph m

-

Th y s n, s n ph m th y s n

-

Th c n gia súc, nguyên li u th c n gia súc, phơn bón, thu c b o v th c
v t

-

Dơy đi n b c nh a PVC, s n ph m đi n gia d ng

-

Xim ng Pooc l ng các lo i, t m l p fibro-xim ng, d m bêtông c t thép ng
l c tr

-

c PPB

S n ph m b o h lao đ ng

 Ch ng nh n
Ho t đ ng ch ng nh n s n ph m c a QUATEST 3 đ

c công nh n phù h p v i

chu n m c qu c t ISO/IEC Guide 65.
QUATEST 3 là t ch c ch ng nh n (bên th ba) th c hi n vi c ch ng nh n s
phù h p c a s n ph m v i tiêu chu n qu c gia, tiêu chu n qu c t ho c quy chu n
k thu t trong nhi u l nh v c: đi n - đi n t , c khí, hóa ch t, xây d ng, hàng tiêu
dùng, d u, khí, th c ph m, rau an toàn s n xu t theo quy trình VietGAP...
D u ch ng nh n c a QUATEST 3 xác nh n s n ph m đáp ng yêu c u v ch t
l

ng và an toàn, t o thu n l i cho doanh nghi p nơng cao uy tín th

gia đ u th u, đ a s n ph m ra th tr

ng hi u, tham

ng đ ng th i là d u hi u giúp ng

i tiêu dùng

l a ch n khi mua s n ph m.
 D ch v t v n
V i đ i ng h n 40 chuyên gia t v n có nhi u n m kinh nghi m đ
chuyên sâu trong n

c vƠ n

c ngoƠi trong l nh v c qu n lý ch t l

c đƠo t o

ng, môi tr

ng

vƠ an toƠn, QUATEST 3 đư cung c p d ch v t v n h th ng qu n lý cho g n 1000
t ch c, doanh nghi p và tr thành m t trong nh ng đ n v hƠng đ u trong n

cv
9


Kh o sát s

n đ nh c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m u và các đi u ki n b o qu n
khác nhau.

cung c p d ch v t v n các h th ng quán lý. H u h t các chuyên gia t v n c a
QUATEST 3 đ u có ch ng ch chuyên gia đánh giá bên ngoƠi c a IATCA (Hi p
h i công nh n vƠ đƠo t o đánh giá viên qu c t ) ho c IRCA (t ch c ch ng nh n
chuyên gia đánh giá viên qu c t ). H th ng qu n lý ch t l
cho ho t đ ng t v n đ

ng c a QUATEST 3

c ch ng nh n phù h p v i tiêu chu n ISO 9001.

QUATEST 3 cung c p d ch v t v n cho các t ch c, doanh nghi p mu n xây
d ng và áp d ng các h th ng qu n lý: Ch t l

ng - ISO 9001, Môi tr

ng - ISO

14001, An toàn th c ph m - ISO 22000, An toàn thông tin - ISO/IEC 27001, Qu n
lý phòng thí nghi m - ISO/IEC 17025, An toàn s c kh e ngh nghi p - OHSAS
18001, Trách nhi m xã h i - SA 8000... và m t s h th ng qu n lý chuyên ngành
khác nh : HACCP, GMP, GLP... ho c áp d ng các công c c i ti n n ng su t - ch t
l

ng nh : 5S, SPC, COQ, Kaizen, TQM, TPM, QCC, QFD, Benchmarking...
 D ch v đƠo t o bao g m:
-

Ơo t o v h th ng qu n lý

-

Ơo t o công c c i ti n n ng su t - ch t l

-

Ơo t o nghi p v tiêu chu n đo l

-

Ơo t o k thu t thí nghi m

-

Ơo t o chuyên gia t v n

ng

ng ch t l

ng

 Thông tin vƠ tiêu chu n
QUATEST 3 cung c p thông tin và các tài li u liên quan đ n tiêu chu n, đo
l

ng, ch t l

ng theo yêu c u cu t ch c, doanh nghi p và cá nhân:

-

Các tiêu chu n Vi t Nam (TCVN)

-

Các quy chu n k thu t trong n

-

Các tiêu chu n n

-

Các tiêu chu n qu c t : ISO, IEC, CODEX, OIMLầ

-

Các tiêu chu n c a các hi p h i chuyên ngành: ASTM, AOAC, AOCS,

c (QCVN)

c ngoƠi: JIS, GOST, BS, IS, AS, DIN, NF, ANSI, KSầ

APHA, ASME, API, AWS,ầ
-

Các t p chí ho c tài li u chuyên ngành khác.

 Mư s - mư v ch

10


Kh o sát s

n đ nh c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m u và các đi u ki n b o qu n
khác nhau.

QUATEST 3 là Chi nhánh phía Nam c a T ch c GS1 Vi t Nam (mã s - mã
v ch) v i các nhi m v :
Ti p nh n các yêu c u đ ng kỦ s d ng mã s - mã v ch c a t ch c, doanh nghi p.
Cung c p d ch v ki m tra ch t l

ng mã s - mã v ch.

T v n vƠ đƠo t o tri n khai ng d ng mã s - mã v ch, các gi i pháp nh n d ng
đi n t khác theo các tiêu chu n qu c t v qu n lỦ vƠ đi u hành s n xu t - kinh
doanh ậ d ch v , các công c h tr qu n lý chu i cung ng s n ph m và d ch v ,
truy xu t ngu n g c s n ph m.
 D ch v trang b
S n xu t và cung c p chu n đo l
l

ng, ph

ng ti n đo ki m nh : chu n kh i

ng, chu n dung tích, thi t b ki m đ nh đ ng h đo n

c l nh, thi t b ki m đ nh

công t đi n, cân bàn, cân ô tô...
Cung c p các ch t chu n, thi t b , ph

ng ti n đo ki m, thi t b và d ng c thí

nghi mầ
Cung c p d ch v b o trì, b o d

ng và s a ch a các ph

ng ti n đo ki m, thi t

Phân tích vi sinh trong th c ph m, nông s n, m ph m, n

c, th c n ch n nuôi,

b phòng thí nghi m.
1.1.2 Phòng vi sinh & GMO
 N ng l c k thu t chính
đ u ng, phân vi sinh, ch ph m sinh h c và các s n ph m tiêu dùng khác.
Phơn tích đ nh tính vƠ đ nh l

ng sinh v t bi n đ i gen (GMO) có trong các lo i

s n ph m có ngu n g c t th c v t, các lo i h t gi ng, các lo i th c n dƠnh cho gia
súcầ
 Ph

ng pháp th nghi m

TCVN, APHA, USFDA, BS, ISO, GS, AOAC,ầ
1.2.
1.2.1

ic
ic

ng v Bacillus cereus và Escherichia coli
ng v Bacillus cereus.

B.cereus là tr c khu n k khí, gram d

ng, r ng kho ng 1 m, dài kho ng 3-

4 m, có kh n ng sinh nha bƠo, bƠo t d ng hình ovan có th s ng sót khi x lý
nhi t và hóa ch t [2], chúng có kh n ng thích nghi v i m t lo t các đi u ki n môi
11


Kh o sát s

tr

n đ nh c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m u và các đi u ki n b o qu n
khác nhau.

ng, nó đ

c phân ph i r ng rãi trong t nhiên nh trong b i, đ t,

đ ng v t khác nhau, th

các loài

ng th y trong nh ng h t ng c c, g o, b t ho c th c ph m

khô l n l n chung v i nhau nh g o, mì, khoai, ngô...do b nhi m t đ t trong quá
trình tr ng tr t và thu ho ch [8].

Hình 1: Vi khu n Bacillus cereus [16]


c đi m nuôi c y:

 Là lo i vi khu n d m c trên các môi tr
 T ng tr

ng đ

c trong kho ng nhi t đ 5-500C, t i u

 pH 4,5-9,3, thích h p
 Trên môi tr

ng nuôi c y vi khu n thông th

ng

35-400C

pH 7-7,2

ng th ch MYP vƠ môi tr

ng th ch Mossel (cereus selective

agar) vi khu n B. cereus m c t o thành d ng khu n l c có màu h ng ph n
chung quanh có vòng sáng.


Tính ch t sinh hóa:

 Trên môi tr

ng đ ng: lên men glucose trong đi u ki n hi u khí và k khí.

 Kh nitrat thành nitrit.
 Phân gi i Tyrosin
 Catalase (+), Citrate (+)
 Theo phân lo i qu c t B.cereus :
 Ngành (phylum) Firmicutes
 Thu c gi i Bacteria
 L p (class) Bacilli
12


Kh o sát s

n đ nh c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m u và các đi u ki n b o qu n
khác nhau.

 B (order) Bacillales
 H (family) Bacillaceaem
 Chi (genius) Bacillus
 Loài (species) Cereus
 Bào t Bacillus cereus:
Bào t vi khu n là các t bƠo đ c bi t, đ
trong đi u ki n b t l i. Chúng đ
đó đ

c hình thƠnh đ vi khu n có th t n t i

c hình thành bên trong các t bào vi khu n và do

c g i là n i bào t . Có nhi u lo i t bào chuyên bi t đ

vi khu n đ t n t i trong các đi u ki n nghèo dinh d

c hình thành t các

ng và kh c nghi t khác nhau,

nh ng n i bào t c a vi khu n là nh ng t bào có kh n ng t n t i b n v ng và dài
nh t.
C u trúc c a bào t r t khác so v i c u trúc c a t bào vi khu n sinh d
th

ng bình

ng. Bào t không ho t đ ng trao đ i ch t và có kh n ng ch ng l i đi u ki n

b t l i nh môi tr

ng s ng nghèo dinh d

ng, nhi t đ cao, b c x ion hóa, dung

môi hóa ch t, ch t t y r a, các enzym th y phơn, đ

m th p, thay đ i pH và kháng

sinh.

Hình 2: Bào t Bacillus cereus ch p d

i kính hi n vi đi n t . Bào t Bacillus

cereus có l p exosporium nhìn nh m t l p màng l ng l o bao xung quanh [13].
C u trúc c a bào t Bacillus cereus g m [13,14]:
 Màng exosporium:

nhi u loài vi khu n, áo bào t đ

c bao quanh b i m t

c u trúc màng l ng l o g i là exosporium (Hình 2). Màng exosporium r t quan

13


n đ nh c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m u và các đi u ki n b o qu n
khác nhau.

Kh o sát s

tr ng đ i v i tính k n

c và tính k t dính c a bào t . T lâu, đư phát hi n th y

bào t B. cereus và B.anthracis có l p màng exosporium ch a các kháng nguyên
quan tr ng có th phát hi n và nh n d ng; ngoài ra còn có ch a m t s enzyme,
m t s trong đó có th liên quan đ n vi c n y m m.

 Áo bào t : là m t c u trúc protein ph c t p g m ba l p riêng bi t. Áo bào t
b o v l p v peptidoglycan c a bào t kh i các enzyme t n công. H n n a, áo
bào t có liên quan đ n kh n ng ch ng b c x tia UV t môi tr

ng và nhi u

lo i hóa ch t bao g m các ch t oxy hóa. Tuy nhiên, áo bào t không có kh n ng
ch ng l i h p

t. Áo bào t có ch a các enzyme nh t đ nh, ch ng h n nh

laccases, m t enzyme có th ho t đ ng ngay c khi lõi bào t không có các ho t
đ ng trao đ i ch t. Các l p bên trong c a l p áo bào t ch a m t enzyme phân
h y, giúp làm tan v bào t trong quá trình n y m m.
 V bào t : là l p vách t bào khá dày g m l p peptidoglycan, r t quan tr ng
cho vi c duy trì tr ng thái m t n

c và tr ng thái ti m sinh c a lõi bào t . Nó

nh m t c u trúc t nh giúp duy trì tình tr ng m t n
bào t đ

c. C u trúc c th c a v

c b o t n gi a các loài và có th đóng vai trò quan tr ng trong kh

n ng ch u nhi t c a bào t , m c dù m i t
t và kh n ng ch u nhi t ch a đ

ng quan rõ ràng gi a c u trúc v bào

c tìm th y. Trong quá trình n y m m, các l p

v peptidoglycan nhanh chóng b phân h y b i các enzyme

l p áo bào t .

 Lõi bào t : ch a t bào ch t v i các thành ph n gi ng t bƠo sinh d

ng, nh

protein, ribosome và DNA. Tuy nhiên, tr ng thái c a t bào ch t trong lõi bào t
khác xa so v i t bào ch t c a t bƠo bình sinh d
50%, còn t bƠo sinh d

ng, hàm l

ng là 70-88%. Tr ng thái m t n

ng n

c ch 30-

c nƠy đóng m t vai

trò quan tr ng trong tu i th , kh n ng ti m sinh và s c đ kháng c a bào t . pH
trong lõi bào t là 6,3-6,5, th p h n nhi u so v i đ pH c a t bào ch t c a các t
bào sinh d
cao th

ng. T bào ch t c a bào t thi u h u h t các h p ch t n ng l

ng đ

ch a s l

c tìm th y trong t bào ch t c a các t bào sinh d

ng

ng và ch

ng l n m t lo i protein, g i là SASP (small acid soluble proteins).

Nh ng protein này t o m t ph c h p v i các DNA c a bào t , bu c các DNA
t nt i

tr ng thái nén đ c bi t, giúp b o v DNA ch ng l i nhi u lo i tác đ ng
14


Kh o sát s

n đ nh c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m u và các đi u ki n b o qu n
khác nhau.

c a môi tr

ng. Protein trong t bào ch t c a bào t b t đ ng và t bào ch t c a

bào t ch a m t l

ng r t l n c a các ion d

ng hóa tr hai, ch y u là canxi, có

th t o ph c v i Pyridine-2,6-dicarboxylic acid (dipicolinic axit ho c DPA).
DPA k t h p v i lõi m t n
kháng UV. S l
l

c, đóng m t vai trò trong kh n ng ch u h p

t và

ng DPA trong lõi là r t cao, kho ng 5-15% c a t ng tr ng

ng bào t .

Hình 3: C u trúc bào t ch ng B. cereus S69 không ho t đ ng quan sát d

i kính

hi n vi đi n t [14].
Bào t c a B.cereus có kh n ng bám vƠo các t bào Caco-2 (t bào bi u mô c a
ng

i). Sau khi bám vào, các bào t này n y m m m t cách nhanh chóng (trong

vòng 1h), hình thành t bào B.cereus sinh d

ng trên đ nh c a các t bào bi u mô,

ti p đó lƠ s n sinh ra đ c t , n u đ c t này xu t hi n trong đ
đ

ng ru t s t p trung khoanh vùng

ng ru t, đ c t

vùng ngo i biên c a ng ru t s t ng cao

h n vƠ vì v y gây nên m i nguy l n h n vƠ gơy b nh m t cách tr m tr ng, th i gian
b nh s lâu h n [9].

15


n đ nh c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m u và các đi u ki n b o qu n
khác nhau.

Kh o sát s

Hình 4 : BƠo t c a B.cereus ch p d

i kính hi n vi 100X

Ngoài gây ng đ c th c ph m B.cereus còn gây b nh
viêm n i nhãn sau ch n th

m t trong tr

ng h p

ng có th d n đ n m t kh n ng nhìn n u không đ

đi u tr k p th i. Vi c nhi m B.cereus c ng xu t hi n dù không đ c hi u
ng

c

nh ng

i b ung th , suy gi m mi n d ch và m t s b nh khác. B.cereus c ng lƠ m t

trong nh ng nguyên nhân gây viêm vú và s y thai
1.2.2.

ic

gia súc, và m t s b nh khác.

ng v Escherichia coli [1,2]

E.coli là vi sinh v t hi u khí tùy nghi, hi n di n trong đ

ng ru t c a ng

i và

các loƠi đ ng v t máu nóng. H u h t các dòng E.coli không gây h i vƠ đóng vai trò
quan tr ng trong vi c n đ nh sinh lí đ

ng ru t.

Các loài E.coli hi n di n r ng rưi trong môi tr
h u c , phát tri n và t n t i r t lơu trong môi tr
minh đ

c r ng E.coli c ng hi n di n

ng b ô nhi m phân hay ch t th i
ng. G n đơy ng

nh ng vùng n

i ta còn ch ng

c m, không b ô nhi m

ch t h u c . Do s phân b r ng rãi trong t nhiên nên E.coli d dàng nhi m vào
th c ph m t nguyên li u hay thông qua ngu n n

c trong quá trình s n xu t hay

ch bi n. Các dòng E.coli gây b nh gây ra các tri u ch ng r i lo n đ

ng tiêu hóa.

Bi u hi n lơm sang thay đ i t nh đ n r t n ng, có th gây ch t ng

i ph thu c

vào m c đ nhi m, dòng gây nhi m và kh n ng đáp ng c a t ng ng

i.

16


Kh o sát s

n đ nh c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m u và các đi u ki n b o qu n
khác nhau.

Hình 5: Vi khu n Escherichia coli [15]
E.coli thu c gi ng Escherichia, h Enterobacteriaceae, là tr c khu n Gram âm,
có kích th

c dài hay ng n tùy thu c môi tr

ng nuôi c y. Hai đ u tròn, m t s l i

b t đ ng, m t s di đ ng nh tiêm mao, không sinh bào t , t o giáp mô m ng, trong
b nh ph m có khi b t mƠu l

ng c c.

Nhi t đ nuôi c y thích h p là 370C, tuy nhiên có th t ng tr
M c d dàng trên Mac Conkey, EMB,ầ Trên môi tr

ng t 10 ậ 460C.

ng EMB khu n l c có màu

tím ánh kim. M t s hóa ch t c ch s phát tri n c a E.coli nh chlorine và d n
xu t, mu i m t, brilliant green, sodium deoxycholate, sodium tetrathionate,
selenite,ầ


Tính ch t sinh hóa:

E.coli lên men nhi u lo i đ

ng nh : glucose, lactose, mantose, mannitol,

xylose, glycerol, sorbitol, arabinoseầ ; không lên men dextrin và inositol, kh
nitrat thƠnh nitrit.

phân bi t E.coli v i các vi khu n khác, ng

i ta th

ng dùng

th nghi m IMViC (Indole, Methyl red, Voges ậ Proskauer, Citrate).
-

Indole: Trong môi tr

ng có trytophane, E.coli nh có tryptophanase s ly

gi i tryptophan thƠnh Indole.

nh n di n Indol, nh vào vài gi t thu c th

Kovacs, h p ch t indole s t o v i thu c th h p ch t mƠu đ : Indole (+).

17


Kh o sát s

-

n đ nh c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m u và các đi u ki n b o qu n
khác nhau.

Methyl red (MR): Trong môi tr

ng có glucose, E.coli phân gi i glucose t o

acid làm pH gi m. Cho thu c th methyl red vƠo thì môi tr

ng chuy n sang

mƠu đ : MR (+)
-

Voges ậ Proskauer(VP): tùy lo i enzyme vi khu n có đ

c mà quá trình lên

men glucose s cho ra s n ph m cu i dùng khác nhau. M t trong s đó lƠ
acetoin, se t o ph c h p mƠu đ v i thu c th

- naphthol và KOH. E.coli

có ph n ng VP (-) (không có mƠu đ ).
-

Citrate: Trong môi tr

ng Simmons Citrate, ngu n C duy nh t là citrate. Vi

khu n s d ng citrate s làm ki m hóa môi tr

ng lƠm đ i mƠu môi tr

ng

t màu xanh l c sang mƠu l . E.coli có ph n ng Citrate (-) (không đ i màu).

Hình 6: K t qu th nghi m IMViC c a Escherichia coli


V kháng nguyên, E.coli có c u trúc kháng nguyên khá ph c t p. D a vào

tính ch t kháng nguyên, ng

i ta phân chia các vi khu n cùng lo i thành các típ

huy t thanh khác nhau.
Kháng nguyên thân O (somatic antigen) là kháng nguyên c a vách t bào, c u t o
b i lipopolysaccharide, có trên 150 lo i.

c tính c a kháng nguyên O là:

-

Ch u nhi t, không b phân h y khi đun nóng 1000C trong 2 gi .

-

Kháng c n, không phân h y khi ti p xúc v i c n 50%.

18


Kh o sát s

n đ nh c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m u và các đi u ki n b o qu n
khác nhau.

-

B phân h y b i fomol 5%

-

R t đ c, ch c n 0,05mg đ đ gi t chu t nh t trong vòng 24 gi

Kháng nguyên O g p kháng huy t thanh t

ng ng s x y ra ph n ng ng ng k t

O. Kháng nguyên O gi vai trò nh t đ nh đ i v i kh n ng gây b nh c a dòng vi
khu n và có tính ch t chuyên bi t cho t ng lo i v t ch .
Kháng nguyên lông H (flagellar antigen): có trên 50 lo i khác nhau, c u t o b i
protein và có tính ch t không ch u nhi t, b phân h y c n 50% và các proteinase,
không b phân h y b i formaol 5%. Khi kháng nguyên H g p kháng th t
s x y ra hi n t

ng ng

ng ng ng k t H.

Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen): có h n 100 lo i khác nhau và n m
ngoài kháng nguyên O. Kháng nguyên K là polysaccharide hay là protein. N u
kháng nguyên K che ph hoàn toàn thân vi khu n thì s ng n c n ph n ng ng ng
k t O. Kháng nguyên giáp mô K giúp E.coli bám vào bi u mô tr
đ

ng tiêu hóa hay đ

c khi xâm l n

ng ti t ni u.

Kháng nguyên tiên mao F (fimbrial antigen) có d ng hình s i, dài kho ng 4

mycrom, th ng hay xo n, đ

ng kính 2,1 ậ 7 nm, giúp vi khu n bám vào t bào

niêm m c ru t nên r t quan tr ng trong kh n ng gơy b nh c a vi khu n.
Hi n nay có h n 700 tuỦp huy t thanh c a E.coli t s t h p các nhóm kháng
nguyên O, H, K, F. D a vƠo đó, ng


ct đ

i ta có th đ nh danh vi khu n.

ng ru t:

c t c a E.coli: lo i có giáp mô gơy đ c m nh h n lo i không có giáp mô.
c t g m có hai lo i: n i đ c t và ngo i đ c t . N i đ c t gây tiêu ch y,
ngo i đ c t tan huy t, phù th ngầ
Ngo i đ c t g m hai lo i: lo i ch u nhi t ST và lo i không ch u nhi t LT.
D a vào h i ch ng b nh vào h i ch ng b nh và tính ch t gây b nh c a E.coli,
ng

i ta chia chúng thành 5 nhóm:
-

EAEC (Enteroaggregative E.coli): E.coli k t t p

ru t.

-

EHEC (Enterohemorrhagic E.coli): E.coli gây xu t huy t

-

EPEC (Enteropathogenic E.coli): E.coli gây b nh đ

-

ETEC (Enterotoxigenic E.coli) E.coli sinh đ c t ru t.

ru t.

ng ru t

19


Kh o sát s

n đ nh c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m u và các đi u ki n b o qu n
khác nhau.

-

EIEC (Enteroinvasive E.coli) E.coli xâm l n niêm m c ru t.



Kh n ng gơy b nh c a E.coli:

- Nhi m khu n huy t: Khi s c đ kháng c a c th gi m, vi khu n vào máu gây
nhi m khu n máu. G p
- Nhi m khu n đ

tr s sinh vƠ sau khi nhi m khu n đ

ng ti u: 90% tr

ng h p nhi m khu n đ

ng ti u.

ng ti u l n đ u

ph n là do E.coli, v i các tri u ch ng: ti u l t nh t, ti u đau, ti u ra máu,
ti u ra m .
- Viêm màng não: E.coli chi m kho ng 40% tr

ng h p viêm màng não

tr

s sinh, 75 % trong s đó có kháng nguyên K1
- Tiêu ch y: nh ng ch ng E.coli th

ng liên uan đ n tiêu ch y thu c các nhóm

sau: EPEC, ETEC, EIEC, VTEC(Verocytotoxin ậ producing E.coli).

20


n đ nh c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m u và các đi u ki n b o qu n
khác nhau.

Kh o sát s

PH N 2: V T LI U VÀ PH

NG PHÁP NGHIÊN C U

2.1. Th i gian vƠ đ a đi m th c hi n
Th i gian th c hi n đ tài t 05/11/2013 đ n 17/05/2014.
N i l y m u và th c hi n thí nghi m: Phòng Vi sinh - GMO ậ Trung tâm k
thu t tiêu chu n đo l

ng ch t l

ng 3 - QUATEST 3.

2.2. V t li u
2.2.1. Thi t b và d ng c
 D ng c :
Bình tam giác, ng đong hình tr 100 mL, pipetman, ng nghi m, h p đ a petri,
đèn c n, bao PE vô trùng, mu ng, khay kim lo i, ng đông khô.
 Thi t b :
Cân phân tích, máy d p m u, máy đông khô, máy l c, n i h p, t c y an toàn
m, b đi u nhi t, t đông sơu -400C.

sinh h c, t s y, t

2.2.2. Hóa ch t vƠ môi tr

ng

 Hóa ch t:
- N

cc t

- Polymycin B solution
- Eggyolk emulsion 50%
 Môi tr

ng:

- Môi tr

ng Skim milk 10%.

- Môi tr

ng đ m phosphate.

- Môi tr

ng Plate count agar.

- Môi tr

ng Mannitol-egg-yolk-polymyxin (MYP agar).

- Môi tr

ng th ch máu c u.

- Môi tr

ng Tryptone-bile-glucuronic medium (TBX medium).

- Môi tr

ng Trypticase (tryptic) soy broth (TSB)

2.2.3. V t li u thí nghi m
i v i ch ng Bacillus cereus: th c hi n b o qu n trên m u g o.

21