TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO PROTEIN VỎ VP19, VP26 CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG HỆ THỐNG TẾ BÀO VI KHUẨN E.coli

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỐ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO PROTEIN VỎ
VP19, VP26 CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV)
TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG HỆ THỐNG
TẾ BÀO VI KHUẨN E.coli

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: HAM MÁT
Niên khóa: 2006 - 2010

Tháng 07 năm 2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỐ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO PROTEIN VỎ
VP19, VP26 CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV)
TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG HỆ THỐNG
TẾ BÀO VI KHUẨN E.coli

Hướng dẫn khoa học:

Sinh viên thực hiện:

ThS. LÂM VỸ NGUYÊN

HAM MÁT

ThS. NGUYỄN VŨ PHONG

Tháng 07 năm 2010


LỜI CẢM ƠN
Chân thành cảm ơn:
• Ban Giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
• Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học.
• Ban Giám Đốc Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Thành Phố Hồ Chí Minh.
• Các anh chị công tác tại phòng Công Nghệ Sinh Học Thủy Sản và phòng Công
Nghệ Sinh Học Y Dược của Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Thành Phố Hồ Chí
Minh.
Đặc biệt em xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến:
• ThS. Lâm Vỹ Nguyên đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn em thực hiên đề tài .
• ThS. Trần Vân Anh, ThS. Trần Hạnh Triết…đã giúp đỡ và truyền đạt cho em
những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình em thực hiện đề tài.
• ThS. Nguyễn Vũ Phong công tác tại Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học
Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
• Xin chân thành cảm ơn các bạn trong và ngoài lớp đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong
suốt quá trình thực hiện khóa luận.
• Con xin gởi lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ đã sinh thành, nuôi dưỡng, dạy dỗ và
luôn bên con trong mọi thời điểm.
Sinh viên

HAM MÁT

i


TÓM TẮT
Ngành nuôi tôm tại Việt Nam đang phải đối mặt với các dịch bệnh của tôm, nhất là
các loại bệnh do virus, virus gây bệnh đốm trắng làm tôm chết sau 3 – 7 ngày bị nhiễm
bệnh gây ra tổn thất nặng nề cho người nuôi trồng cũng như cho nền kinh tế.Việc chẩn
đoán nhanh bệnh virus của tôm và đưa ra thị trường các kit test nhanh bằng giấy thử
(phương pháp miễn dịch học: kháng nguyên – kháng thể) thì rất cần thiết.
Nghiên cứu được thực hiện dựa trên sự tạo dòng của gen vp19 và gen vp 26, sau đó
thông qua sự biểu hiện của protein do hai gen này mã hóa để bước đầu tạo ra một bộ
kháng nguyên và kháng thể đa dòng chống lại virus WSSV gây nguy hiểm trên tôm sú ở
Việt Nam nhằm thử nghiệm khả năng sử dụng các kháng thể này vào trong các nghiên
cứu cơ bản cũng như nghiên cứu ứng dụng trên virus tôm và nhằm sản xuất ra những kit
kiểm tra hiện diện virus trong tôm với giá thành rẻ. Mặt khác, chúng ta có thể sử dụng các
kháng thể này cho các nghiên cứu chuyên sâu về virus tôm sau này.
Những kết quả đạt được:
chúng tôi đã thu thập được mẫu tôm nhiễm bệnh WSSV và từ đó tạo dòng thành
công dòng gen vp19 và vp26. Tiến hành biến nạp được gen này vào vi khuẩn E.coli BL21
DE3 và cuối cùng thì chúng tôi đã biểu hiện được các protein VP19, VP26 mặc dù hàm
lượng vẫn chưa cao.

ii


SUMMARY
“CLONING AND EXPRESSION THE ENVELOPE PROTEINS VP19 AND VP26

OF THE WHITE SPOT SYNDROME VIRUS (WSSV) INFECTED IN SHRIMP
(Penaeus monodon) USING THE E.coli SYSTEM”
Shrimp culture industry in Vietnam is facing shrimp epidemic diseases, especially
viral diseases, cause severe loss for farmer, as well as for the economics, typically
shrimps infected with WSSV died after 3 – 7 days after that. Quick diagnosis of viral
diseases on shrimps is one of the issues that shrimp culturing centers especially pay
attention to. However, in Vietnam, there are just some detection kits by PCR and one
kind of kit based on immunology used for white spot virus detection. Performing PCR
tests needs appropriate equipments and some knowledge of molecular biology, and just
can only be done in provincial laboratories. Bringing out to the market kits for quick test
using test strip (immunology method: antigen – antibody) or ELISA kit (Enzyme Linked
Immunosorbent Assay) is not only the dream of shrimp producers but also the dream of
detection kit manufacturers.
This study perform cloning and expression the envelope proteins vp19 and vp26 of
the white spot syndrome virus (wssv) as the first step to initially create an ELISA kit for
quick detection of dangerous viral diseases on shrimp (White Spot Syndrome) in Vietnam
in order to test the capacity of applying these antibodies into basic research as well as
applied research on shrimp virus and to produce virus detection kits for shrimps with
cheap price. On the other hand, we can also use these antibodies for further study of virus
on shrimps.
Results:
Successfully cloning vp19 and vp26, transformed these genes into E.coli BL21
DE3 and over-expressed protein VP19, VP26, although the concentration of these protein
is low.

iii


MỤC LỤC
Nội dung

trang

Lời cảm ơn ................................................................................................................... i
Tóm tắt ........................................................................................................................ ii
Summary .................................................................................................................... iii
Mục lục ...................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt ......................................................................................... vii
Danh sách các bảng ................................................................................................. viii
Danh sách các hình .................................................................................................... ix
Chương 1 Mở đầu ...................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................ 1
1.2. Mục tiêu đề tài ..................................................................................................... 2
1.3. Nội dung thực hiện ................................................................................................ 2
Chương 2 Tổng quan tài liệu ...................................................................................... 3
2.1. Tình hình sản xuất tôm trong nước ..................................................................... 3
2.2. Các bệnh thường gặp trên tôm ............................................................................. 5
2.2.1. Cơ chế lây nhiễm chung của virus ..................................................................... 6
2.2.2. Một số loại virus gây bệnh trên tôm ................................................................... 6
2.3. Đặc điểm sinh học của WSSV............................................................................... 9
2.3.1. Hình thái cấu trúc .............................................................................................. 9
2.3.2. DNA bộ gen ..................................................................................................... 11
2.3.3. Protein cấu trúc ................................................................................................ 12
2.4. Protein VP19 ...................................................................................................... 12
2.5. Protein VP26 ...................................................................................................... 12
2.6. Một số phương pháp phát hiện bệnh WSSV ....................................................... 13
2.6.1. phương pháp chẩn đoán mô học ...................................................................... 13
2.6.2. Các phương pháp lai ........................................................................................ 14

iv

2.6.3. phương pháp PCR ............................................................................................ 14
2.6.4. Phương pháp miễn dịch ................................................................................... 15
2.7. Sự tạo dòng ......................................................................................................... 15
2.8. Kỹ thuật điện di .................................................................................................. 17
2.9. Plasmid ............................................................................................................... 19
2.9.1. Plasmid pET30a+ ............................................................................................. 20
2.9.2. Hệ thống T7 ..................................................................................................... 21
2.10. Sự biến nạp ở vi khuẩn E.coli .......................................................................... 21
2.11. Chọn lọc vi khuẩn đã được biến nạp ................................................................ 22
2.12. Giải trình tự ...................................................................................................... 22
Chương 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ........................................................ 24
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ............................................................... 24
3.2. Vật liệu ............................................................................................................... 24
3.3. Dụng cụ và hóa chất ........................................................................................... 24
3.3.1. Dụng cụ ............................................................................................................ 24
3.3.2. Hóa chất ........................................................................................................... 24
3.3.3. Các dung dịch .................................................................................................. 25
3.4. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 25
3.4.1. Thu thập mẫu virus ........................................................................................... 25
3.4.2. Quy trình tạo dòng các đoạn gen mục tiêu ....................................................... 25
3.4.2.1. Tạo dòng các đoạn gen mục tiêu ................................................................... 26
3.4.2.2. Biến nạp các gene mục tiêu vào E.coli DH5 α ............................................. 27
3.4.2.3. Kiểm tra kết quả biến nạp bằng PCR khuẩn lạc ........................................... 28
3.4.2.4. Kiểm tra kết quả biến nạp bằng cắt enzyme giải trình tự ............................. 30
3.4.2.5. Chuyển gene mục tiêu vào pET30a+ và biến nạp vào E.coli BL21 DE3 .... 33
3.4.2.6. Cảm ứng biểu hiện các gene mục tiêu .......................................................... 35
Chương 4 Kết quả và thảo luận ................................................................................ 37
4.1. Thu thập mẫu tôm bệnh ...................................................................................... 37

4.2. Tạo dòng gen mã hóa cho protein vỏ VP19, VP26 của WSSV. ........................ 37

v


4.2.1. Gen mục tiêu.................................................................................................... 38
4.2.2. Thiết kế mồi và khuếch đại gen mục tiêu ....................................................... 38
4.2.3. Tạo dòng gen mục tiêu vào vector pGEMT Easy ........................................... 39
4.3. Tạo dòng gen mục tiêu vào vector biểu hiện pET30a+...................................... 41
4.4. Biểu hiện các gen mục tiêu ................................................................................. 43
Chương 5 Kết luận và đề nghi ................................................................................... 46
5.1. Kết luận............................................................................................................... 46
5.2. Đề nghị ............................................................................................................... 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 47

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Amp ................................................................................................. Ampicillin.
Bp ....................................................................................................... base pair.
BLAST .................................................... Basic Local Alignment Search Tool.
CBB ........................................................................... Coomassie brilliant blue.
dNTP .................................................................deoxynucleoside triphosphate.
ELISA .................................................. Enzyme linked immunosorbent assay.
E.coli ....................................................................................... Escherichia coli.
EtBr ...................................................................................... ethidium bromide.
EDTA ............................................................ ethylen diamine tetraacetic acid.
G ............................................................................................................... gram.
HPV .................................................................... Hepatopancreatic parvovirus.

IHHNV ............... Infectious Hypodermal And Hematopoietic Necrosis Virus.
IPTG ...................................................Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside.
Kb ....................................................................................................... .kilobase.
Μl ......................................................................................................microlitre.
Ml ....................................................................................................... millilitre.
mM .................................................................................................. millimolar.
M ............................................................................................................. molar.
MBV............................................................................. Monodon Baculovirus.
NCBI ...................................... National Center of Biotechnology Information.
PAGE .......................................................... Polyacrymide gel elestrophoresis.
SDS ............................................................................. Sodium dodecylsulfate.
TSV ...............................................................................Taura Syndrome Virus
TAE .................................................................................. Tris-Acetate-EDTA.
WSSV.................................................................. White Spot Syndrome Virus.
YHV .................................................................................. Yellow Head Virus.

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Sự phân tách DNA trong gel acrylamine .................................................. 18
Bảng 2.2 Sự phân tách các đoạn DNA trong gel agrose ........................................... 18
Bảng 3.1 Thành phần PCR xác định nhiệt độ tối ưu cho từng cặp mồi.................... 26
Bảng 3.2 Chu trình PCR xác định nhiệt độ tối ưu từng cặp mồi ............................. 27
Bảng 3.3 Thành phần phản ứng nối ......................................................................... 28
Bảng 3.4 Thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc kiểm tra kết quả biến nạp ............ 29
Bảng 3.5 Chu trình phản ứng PCR khuẩn lạc kiểm tra kết quả biến nạp ............... 30
Bảng 3.6 Thành phần phản ứng cắt enzyme cắt hạn chế .......................................... 32
Bảng 3.7 Thành phần phản ứng nối bằng enzyme T4 ligase .................................... 35
Bảng 4.1 Trình tự các cặp mồi gen vp19 và vp26 ..................................................... 38

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Cơ chế lây nhiễm chung của virus ...................................................................... 6
Hình 2.2 Tôm bệnh đốm trắng WSSV............................................................................... 6
Hình 2.3 Tôm bệnh còi MBV ............................................................................................ 7
Hình 2.4 Tôm bệnh đầu vàng YHV ................................................................................... 8
Hình 2.5 Virus WSSV dưới kính hiển vi điện tử .............................................................. 10
Hình 2.6 Virus nhuộm gram âm trong huyết tương tôm sú nhiễm WSSV....................... 10
Hình 2.7 DNA genome của WSSV .................................................................................. 11
Hình 2.8 Plasmid pET30a(+) ............................................................................................ 20
Hình 4.1 Kết quả kiểm tra sự hiện diện của WSSV bằng PCR. ....................................... 37
Hình 4.2 Kết quả kiểm tra các cặp mồi tạo dòng cho vp19, vp26 .................................... 38
Hình 4.3 Kết quả PCR khuẩn lạc kiểm tra sự hiện diện vp19, vp26 ............................... 39
Hình 4.4 Kết quả kiểm tra pGEMT::vp19, pGEMT::vp26, bằng BamHI, HindIII ......... 40
Hình 4.5 Kết quả cắt pGEMT ::vp19, pGEMT ::vp26 pET30a+ bằng BamHI, HindIII . 42
Hình 4.6 Kiểm tra kết quả biến nạp vào pET30a+ dùng mồi clone ................................. 42
Hình 4.7 Kiểm tra kết quả biến nạp vào plasmid pET30a+ sử dụng mồi T7 .................. 42
Hình 4.8 Kết quả cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp.................................................... 43
Hình 4.9 Kết quả kiểm tra khả năng hòa tan của các protein tái tổ hợp ........................... 44

ix


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ngành nuôi tôm tại Việt Nam đang phải đối mặt với các dịch bệnh của tôm, nhất là
các loại bệnh do virus, gây ra tổn thất nặng nề cho người nuôi trồng cũng như cho nền

kinh tế. Tại hội thảo về bệnh trong nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là bệnh ở tôm sú nuôi,
được tổ chức tại Trạm nghiên cứu nuôi trồng thủy sản nước lợ ở Quý Kim, Hải Phòng vào
cuối tháng 2/2004, các báo cáo kết qủa nghiên cứu thủy sản năm 2003 đã nêu một vài con
số như sau: cả nước có 546.757 ha nuôi tôm nước lợ thương phẩm, trong đó diện tích có
tôm nuôi bị bệnh và chết là 30.083 ha. Các tỉnh thành ven biển từ Đà Nẵng đến Kiên
Giang có tới 29.200 ha nuôi tôm bị chết nhiều, chiếm 97,06% diện tích có tôm nuôi bị
chết trong cả nước ( Các
bệnh của tôm nuôi chủ yếu là bệnh do virus đốm trắng (WSSV), do virus còi MBV
(Monodon Baculovirus), virus Taura (TSV) và virus đầu vàng (YHV).
Virus gây Hội chứng Đốm trắng trên tôm (Virus Đốm trắng – WSSV) là loại virus gây
hại rất nguy hiểm cho tôm nuôi. Tôm có thể chết hàng loạt chỉ sau 3 - 7 ngày nhiễm bệnh.
Việc chẩn đoán nhanh bệnh đốm trắng trên tôm nhằm kịp thời xử lý ao nuôi là một trong
những vấn đề được các cơ sở nuôi tôm đặc biệt quan tâm. Song, trên thị trường Việt Nam
hiện tại chỉ tồn tại một số kit chẩn đoán bệnh bằng PCR và một loại kit chẩn đoán bệnh
bằng miễn dịch học cho virus đốm trắng. Việc thực hiện các test bằng PCR cần có những
trang thiết bị và hiểu biết về sinh học phân tử nhất định, chỉ thực hiện được trong các
phòng thí nghiệm cấp tỉnh. Việc đưa ra thị trường các kit test nhanh bằng phương pháp
miễn dịch học: kháng nguyên – kháng thể hoặc kit ELISA

(Enzyme-Linked

ImmunoSorbent Assay) không chỉ là mơ ước của các nhà sản xuất tôm mà còn của các
nhà sản xuất các kit chẩn đoán.
Đề tài này được đề ra nhằm bước đầu tạo ra kháng thể đa dòng kháng virus WSSV để
từ đó tạo kit ELISA giúp chẩn đoán nhanh loại virus gây bệnh nguy hiểm trên tôm này
với giá thành rẻ.
1


1.2. Mục tiêu đề tài

Nhân dòng và biểu hiện được các protein vỏ VP19 và VP26 của virus WSSV ở dạng
hòa tan và hàm lượng cao.
1.3. Nội dung thực hiện
Trước hết ta thu nhận mẫu tôm bị nhiễm bệnh WSSV. Tiến hành tạo dòng các đoạn
gen mục tiêu , biến nạp các gen mục tiêu vào vector nhân dòng, sau đó kiểm tra kết quả
biến nạp.
Biến nạp gen mục tiêu vào vector biểu hiện và chuyển vào tế bào E.coli BL21 DE3,
sau đó tiến hành cảm ứng và biểu hiện gen mục tiêu.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tình hình sản xuất tôm trong nước
Tôm là một trong những hải sản quan trọng nhất, có giá trị kinh tế cao trên thế giới
(25% tổng thu nhập từ thuỷ sản), với sản lượng tăng 175% trong hai thập kỷ qua (1980 1998) và đạt đến 35 triệu tấn vào năm 2000. Tại Việt Nam, nhờ các điều kiện địa lý phù
hợp, nuôi tôm đang là một mũi nhọn không chỉ trong ngành thuỷ sản nói riêng mà trong
sự phát triển của nền kinh tế nói chung. Năm 2004, sản lượng nuôi tôm của Việt Nam
đứng thứ hai trên thế giới (350.000 tấn, tương đương khoảng 1,7 tỷ USD) với thu nhập
ngoại tệ từ tôm ước tính trên nửa tỷ USD.
Đầu năm 2008, xuất khẩu thuỷ sản của cả nước đạt 1.054.600 tấn, trị giá 3,828 tỷ
USD, tăng 39,4% về lượng và 24,4% về giá trị so với cùng kỳ năm ngoái. Xuất khẩu
trong tháng 10 đạt 124.328 tấn, trị giá 478,23 triệu USD, tăng 30% về khối lượng và giá
trị so với tháng 10/2007. Tôm đông lạnh, cá tra, basa và mực, bạch tuộc đông lạnh - 3 mặt
hàng chính - vẫn duy trì tốc độ tăng trưởng cao. Tôm đông lạnh chiếm tỷ trọng cao nhất
35,4% với 158.527 tấn, trị giá 1,354 tỷ USD trong 10 tháng đầu năm, tăng 22,5% và
10,4% so với cùng kỳ ( />Hiện diện tích nuôi ở Việt Nam đã lên trên 600.000 ha, trong đó Đồng bằng sông
Cửu Long (ĐBSCL) đã chiếm gần 90% diện tích nuôi tôm của cả nước, nhiều gấp đôi
năm 1995. Trong đó, tôm sú có 538.800 ha, tập trung ở các tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu, Kiên

Giang… ( />Tuy nhiên, ngành nuôi tôm tại Việt Nam đang phải đối mặt với các dịch bệnh của
tôm, nhất là các loại bệnh do virus, gây ra tổn thất nặng nề cho người nuôi trồng cũng như
cho nền kinh tế. Tại hội thảo về bệnh trong nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là bệnh ở tôm sú
nuôi, được tổ chức tại Trạm nghiên cứu nuôi trồng thủy sản nước lợ ở Quý Kim vào cuối

3


tháng 2/2004, các báo cáo kết qủa nghiên cứu thủy sản năm 2003 đã nêu một vài con số
như sau: cả nước có 546.757 ha nuôi tôm nước lợ thương phẩm, trong đó diện tích có tôm
nuôi bị bệnh và chết là 30.083ha. Các tỉnh thành ven biển từ Đà Nẵng đến Kiên Giang có
tới 29.200ha nuôi tôm bị chết nhiều, chiếm 97,06% diện tích có tôm nuôi bị chết trong cả
nước ( Các bệnh của tôm
nuôi chủ yếu là bệnh do virus đốm trắng (WSSV), do virus còi MBV (Monodon
Baculovirus), virus Taura (TSV) và virus đầu vàng (YHV).
Báo cáo của ngành thủy sản các tỉnh ĐBSCL cho biết, tôm sú hiện vẫn tiếp tục chết
tại nhiều tỉnh ven biển trên diện tích hàng ngàn hécta, nâng diện tích tôm chết từ đầu năm
đến nay trên 120.000 ha, nhiều gần 3 lần tháng 3 - 2008, tập trung tại Cà Mau với 57.789
ha, Kiên Giang 40.000 ha, Bạc Liêu 19.000 ha. Tỷ lệ tôm chết từ 20% – 75%, làm người
nuôi thiệt hại hàng chục tỷ đồng ( />Trong năm 2007, Trung tâm Khuyến ngư tỉnh Bạc Liêu đã xét nghiệm 10.737 mẫu
tôm giống nhưng phát hiện đến 6.176 mẫu nhiễm bệnh (trên 60%). Trong đó, có gần
5.000 mẫu bị nhiễm bệnh còi (virus MBV, 81%), 579 mẫu bị bệnh đốm trắng (9%)
( />Từ kết quả này cho thấy tỷ lệ tôm giống lưu thông trên thị trường bị nhiễm bệnh rất
cao, chưa được kiểm soát chặt chẽ. Chính tôm giống kém chất lượng là một trong những
nguyên nhân làm cho người nuôi tôm bị lỗ. Trong 9 tháng đầu năm 2008, người nuôi tôm
tại Bạc Liêu tự lấy hơn 1.762 mẫu tôm, gần 2.000 mẫu nước nuôi tôm đưa đi xét nghiệm.
Kết quả có 25% số mẫu tôm nhiễm bệnh đốm trắng, trên 50% mẫu nhiễm bệnh MBV
(còi),

gần

25%

nhiễm

đầu

vàng...

và

1.040

mẫu

nước

nhiễm

khuẩn

( Tỷ lệ tôm nhiễm bệnh ngày càng cao
cho thấy tình hình dịch bệnh do virus gây ra cho tôm đang ngày càng lan rộng và gây thiệt
hại lớn cho người nuôi tôm.
Ngoài ra, bệnh của tôm không chỉ tồn tại ở tôm thương phẩm mà còn hiện diện ngay
cả trong tôm giống và tôm bố mẹ. Việc chẩn đoán nhanh bệnh virus của tôm trong suốt

4

quá trình nuôi là một trong những vấn đề được các cơ sở nuôi tôm đặc biệt quan tâm.
Trên thị trường Việt Nam hiện tại chỉ tồn tại một số kit chẩn đoán bệnh bằng PCR và một
loại kit chẩn đoán bệnh bằng miễn dịch học cho virus đốm trắng. Việc thực hiện các test
bằng PCR cần có những trang thiết bị và hiểu biết về sinh học phân tử nhất định, chỉ thực
hiện được trong các phòng thí nghiệm cấp tỉnh. ELISA là phương pháp ưu việt cho virus
RNA. Việc xét nghiệm mẫu bệnh do virus RNA bằng phản ứng RT-PCR đòi hỏi chi phí
cao cho bước tách chiết RNA và sử dụng enzyme reverse trancriptase có giá thành cao.
Phản ứng ELISA với giá thành rẻ và độ nhạy đủ cao để phát hiện virus gây bệnh trong
mẫu xét nghiệm. Việc đưa ra thị trường các kit test nhanh bằng giấy thử (phương pháp
miễn dịch học: kháng nguyên – kháng thể) hoặc kit ELISA (Enzyme-Linked
ImmunoSorbent Assay) không chỉ là mơ ước của các nhà sản xuất tôm mà còn của các
nhà sản xuất các kit chẩn đoán.
2.2. Các bệnh thường gặp trên tôm
Bệnh do môi trường: như bệnh chậm lột xác do pH và độ mặn thấp, bệnh bọt khí …
Bệnh do Vi khuẩn: bệnh Vibriosis do vi khuẩn Vibrio gây ra, làm tổn thương và hoại
tử mô, dị dạng ở tôm, chậm phát triển.
Bệnh do nấm: như bệnh đen mang, tổn thương mô do nấm Fusarium solani trên tôm
P. vannamei và P. stylirostris hay do nấm Fusarium oxysporum trên tôm P. duodarum.
Bệnh do Protozoa: Một vài loại protozoa phổ biến là: Zoothanmium, Voricela,
Anophrys, acineta sp Epistylic, lagenophrys.
Bệnh do nguyên sinh động vật sống bám: nhớt thân, đóng rong hay mang bẩn, bệnh
viêm gan do bào tử đơn bội Haplsporidium, bệnh trắng lưng do Agmasoma penaei.
Ngoài ra còn có bệnh do một số virus gây ra rất nguy hiểm làm tôm chết nhanh sau
vài ngày bị nhiễm bệnh.

5


2.2.1. Cơ chế lây nhiễm chung của virus

Ký chủ
trung gian
Sống sót

Chết

LÂY NHIỄM TIỀM ẨN
Bố mẹ
Tôm giống

LÂY NHIỄM BIỂU HIỆN
Bệnh

Trứng
Tôm bột

Ăn thịt lẫn nhau

Ấu trùng
Hình 2.1 Cơ chế lây nhiễm chung của virus.
2.2.2. Một số loại virus gây bệnh trên tôm
a. Virus gây bệnh đốm trắng (WSSV – White Spot Syndrome Virus):

Hình 2.2 Tôm bệnh đốm trắng.

WSSV thuộc họ Nimaviridae, có cấu trúc virion có dạng hình trụ đến elip hoặc
hình trứng, rộng khoảng 121 ± 9 nm, dài khoảng 276 ± 26 nm, có vỏ bọc, không có thể
vùi. Bộ gen của virus này là DNA sợi đôi với kích thước khoảng 305 kb.

6

Đây là loại virus gây chết tôm nhiều nhất, nhanh nhất và có khả năng lây nhiễm cao.
Khi thâm nhập vào cơ thể vật chủ, virus này cư trú ở nhiều bộ phận như mô nội bì, mô dạ
dày, mang, buồng trứng (hay tinh hoàn), hệ thống thần kinh, mắt, chân bơi … Khi nhiễm
bệnh, tôm có màu đỏ hồng, đốm trắng ở vỏ giáp đầu ngực, với tỷ lệ tôm chết khi nhiễm
bệnh lên đến 80 - 100%.
b. Virus gây bệnh còi (MBV – Monodon Baculovirus)

Hình 2.3 Tôm bệnh còi MBV.

MBV thuộc nhóm Baculovirus, có kích thước khoảng 70 x 300 nm, có vỏ bao
nucleocapsid. Vật liệu di truyền của virus này là DNA sợi đôi.
MBV gây nhiễm ở tất cả các giai đoạn phát triển của tôm.Bệnh còi không gây tôm
chết ồ ạt nhưng làm cho tôm chậm lớn.
c. Virus gây bệnh gan tụy (HPV – Hepatopancreatic parvovirus)
HPV thuộc họ Parvoviridae, với cấu trúc hình khối 20 mặt, không có màng bao với
kích thước 18 x 26 nm. Bộ gen của loại virus này là DNA sợi đơn (3,9 – 5,9 kb).
IHHNV và HPV là 2 loại virus cùng thuộc 1 họ, có sự tương tự nhau về cấu trúc và hình
dạng virion, nhưng chúng có vị trí xâm nhiễm khác nhau. HPV cư trú ở tế bào biểu bì gan
tụy, trong khi IHHNV cư trú ở tất cả các cơ quan có nguồn gốc ngoại bì và trung bì.
7


Tôm giai đoạn mid-juvenile rất dễ nhiễm HPV. Tôm nhiễm HPV có gan teo, hoại tử,
tăng trưởng chậm, biếng ăn, nhiều vi khuẩn và nấm bám bên ngoài và ở mang, có thể chết
100% trong vòng 4 – 8 tuần.
d. Virus gây bệnh đầu vàng (YHV – Yellow Head Virus)

Hình 2.4 Tôm bệnh đầu vàng YHV.

YHV thuộc họ Roniviridae, giống Okavirus. YHV có cấu trúc hình que với kích
thước 173 x 44 nm. Vật liệu di truyền là RNA sợi đơn dương (ssRNA (+)) với kích thước
khoảng 22 kb.
Sau khi được phát hiện lần đầu tiên ở Thái Lan (1993), YHV đã gây nhiều thiệt hại
nghiêm trọng cho ngành nuôi tôm ở Châu Á. YHV xâm nhiễm ở nhiều loài, nhưng chủ
yếu là Penaeus monodon. Tôm nhiễm YHV có các triệu chứng gan tụy sưng to, xuất hiện
màu vàng ở phần vỏ đầu ngực và phần mang, gây chết cấp tính 100% từ 5 đến 7 ngày sau
khi nhiễm.
e. Virus gây hội chứng Taura (TSV – Taura Syndrome Virus)
Thuộc nhóm Picornavirus, họ Picoranviridae. Bộ gen ssRNA, chiều dài 10,2 kb,
cấu trúc capsid có 3 phần (55, 40 và 24 kDa) và một đoạn polypeptide phụ (58 kDa).

8


Hội chứng virus Taura (TSV) hay còn gọi là bệnh đỏ đuôi được các nhà khoa học
đưa ra năm 1992 khi bệnh này xuất hiện tại châu Mỹ- quê hương của con tôm thẻ chân
trắng. Bệnh TSV trên tôm thẻ chân trắng rất khó phát hiện bằng mắt thường do đường
kính của bệnh phẩm rất nhỏ và trôi nổi lơ lửng trong môi trường nuôi (hội chứng này do
một tổ hợp mầm bệnh gồm 1 loài vi khuẩn Vibrioharveae và 3 loại virus gây nên). Hội
chứng Taura gây các triệu chứng: thân tôm có màu đỏ nhạt, tôm yếu, tôm chậm lớn. Loại
bệnh này có thể bị lây nhiễm sang tôm sú.
2.3. Đặc điểm sinh học của WSSV
2.3.1. Hình thái cấu trúc
WSSV thuộc họ Nimaviridae, có cấu trúc virion có dạng hình trụ đến elip hoặc
hình trứng, rộng khoảng 121 ± 9 nm, dài khoảng 276 ± 26 nm, có vỏ bọc, không có thể
vùi. Bộ gen của virus này là DNA sợi đôi với kích thước khoảng 305 kb.
Đây là loại virus gây chết tôm nhiều nhất, nhanh nhất và có khả năng lây nhiễm cao.
Khi thâm nhập vào cơ thể vật chủ, virus này cư trú ở nhiều bộ phận như mô nội bì, mô dạ

dày, mang, buồng trứng (hay tinh hoàn), hệ thống thần kinh, mắt, chân bơi, … Khi nhiễm
bệnh, tôm có màu đỏ hồng, đốm trắng ở vỏ giáp đầu ngực, với tỷ lệ tôm chết khi nhiễm
bệnh lên đến 80 - 100%.
Virus WSSV có kích thước khá lớn, dưới kính hiển vi điện tử có thể quan sát thấy các
virion của WSSV gần như đối xứng, đường kính 120 – 150 nm, chiều dài 270 – 290 nm.
Một số virion hình trứng có phần phụ nhọn ở một đầu, có vẻ như được kéo dài từ vỏ virion.
Nucleocapsid: quan sát thấy ở nhiều trạng thái khác nhau như dạng không có vỏ,
dạng có vỏ và dạng hình que, kích thước 65 – 70 x 300 – 350 nm. Dạng nucleocapsid có
lõi được bao vỏ phân đoạn (dày khoảng 23 nm, phân cắt với nhau bởi dãi đệm đậm đặc
điện tử rộng khoảng 6 nm). Ngoài ra còn có một dạng khác lớn hơn , có phần xoắn chồi ra
như một cái đuôi.

9


Hình 2.5 Virus WSSV dưới kính hiển vi điện tử: a) virion của WSSV b) nucleocapsid:
A-Bản gel điện di của WSSV (1 – marker; 2 – protein của tôm sống không nhiễm bệnh; 3 – virus
WSSV; 4 – Nucleocapsid của WSSV); B – mô hình cấu tạo Whispovirus (theo Just M. và ctv,
2002).

Hình 2.6 Virus nhuộm gram âm ở trong huyết tương của tôm sú nhiễm bệnh
WSSV, một số thể virus có đuôi, ảnh kính hiển vi điện tử (vạch kẻ a = 240,
b = 150, c = 100 nm) (theo Graindorge & Flegel, 1999).

10


2.3.2. DNA bộ gen
Virus WSSV có DNA bộ gen vòng lớn, mạch đôi. Kích thước của bộ gen khoảng
300 - 320 kb. Dựa trên những phân tích các trình tự đặc biệt của WSSV, người ta nhận

thấy rằng có sự sai khác về gen của virus WSSV có nguồn gốc khác nhau. Điều này cũng
lý giải các kết luận khác nhau được đưa ra khi phân tích cấu trúc protein của virus WSSV
ở các vùng khác nhau.
Những nghiên cứu sâu hơn về bộ gen của virus WSSV (có nguồn gốc từ Thái Lan)
cho thấy: ở dạng mạch vòng, kích thước của gen là 292967 bp, chứa 184 khung đọc mở
ORF, tỷ lệ của 2 loại acid nucleic A và T là 58,9%. Tại Việt Nam, chưa có tài liệu nghiên
cứu nào về vấn đề này được công bố.

Hình 2.7 DNA genome của WSSV.

11


2.3.3. Protein cấu trúc
Virion WSSV có 5 loại protein cấu trúc chính, được gọi tên dựa theo trọng lượng
phân tử khi điện di trên gel SDS-PAGE, là VP15 (15 kDa), VP24 (24 kDa), VP26 (26
kDa), VP19 (19 kDa), VP28 (28 kDa). Trong đó, VP28 và VP19 hiện diện tại vỏ của
virus, VP15, VP24, VP26 hiện diện tại nucleocapsid.
2.4. Protein VP19
Protein VP19 được tìm thấy tại vỏ của virus WSSV. Gene mã hóa cho protein VP19
gồm 365 Nu. Protein này gồm 121 acid amin, có trọng lượng phân tử trên lý thuyết là
13,2 kDa nhưng khi điện di trên gel SDS-PAGE lại thấy có trọng lương phân tử là 19
kDa, được mã hóa bởi ORF182 trên gen, tại vị trí 290363 – 289998 (mã số trên Genebank
AF 369029).
Những nghiên cứu về protein này cho biết điểm đẳng điện của VP19 là 4,2, có tính
acid. Trên gen, vị trí mã hóa cho protein VP19 chỉ cách vị trí mã hóa cho VP28 khoảng
2604 nucleotid và chỉ phân biệt nhờ 2 khung đọc mở có chức năng chưa xác định
(ORF183 và ORF184). Người ta cũng không tìm thấy cystein trong VP19, như vậy,
không có khả năng hình thành các cầu nối disunfid nội và ngoại phân tử ở protein này.
Hiện nay, trong ngân hàng gen chưa có trình tự acid amin nào tương đồng với trình

tự acid amin của VP19.
2.5. Protein VP26
Gene mã hóa cho VP26 gồm 615 Nu. Mã số trên Genebank là EU931452.1
Protein VP26, sản phẩm dịch mã của gen WSV311, là một trong những protein cấu
trúc lớn của virus WSSV.
Ban đầu, VP26 được xem như nucleocapsid protein. Sau đó người ta cho rằng VP26
là một envelope protein. Một nghiên cứu sau này cho thấy VP26 là một linker protein,
12


đóng vai trò nối lớp vỏ ngoài và lớp vỏ trong của virus (protein tegument). VP26 có sự
tương đồng cao với protein VP28, một trong các protein cấu trúc chính của WSSV.
Một điều thú vị là VP26, VP28 đều có kích thước gen tương tự nhau nhưng lại cho
kết quả điện di SDS-PAGE khác nhau. Giả thiết ban đầu là do quá trình biến đổi sau dịch
mã. Cũng như VP28, VP26 cũng được các nhà khoa học tìm hiểu về các đặc điểm cơ bản
để từ đó nghiên cứu tạo kháng thể.
2.6. Một số phương pháp phát hiện bệnh WSSV
Dấu hiệu lâm sàng để nhận biết bệnh ở tôm được quan sát qua hiện tượng tôm bỏ ăn,
xuất hiện nhiều đốm trắng ở mặt trong lớp vỏ kitin, đặc biệt là mặt trong lớp vỏ đầu ngực
và đốt bụng thứ sáu, đôi khi đi kèm với đỏ thân. Các đốm trắng có đường kính khoảng
0,5 – 2 mm, dưới kính hiển vi quang học thấy trên đốm trắng có nhiều vòng tròn đồng
tâm, dày ở trung tâm và mỏng dần ở mép; phần vỏ đầu ngực có thể bóc vỏ dễ dàng.
Các phương pháp thông dụng để phát hiện bệnh đốm trắng ở tôm bao gồm:
-

Phương pháp chẩn đoán mô học.

-

Phương pháp lai.

-

Phương pháp miễn dịch.

-

Phương pháp PCR.

2.6.1. Phương pháp chẩn đoán mô học
Phương pháp chẩn đoán mô học giúp chẩn đoán bệnh dựa trên những biến đổi bất
thường của cấu trúc tế bào, mô và cơ quan. Để phát hiện bệnh WSSV, người ta cũng có
thể sử dụng phương pháp phân tích mô học bằng cách cố định mẫu làm tiêu bản mô học
nhuộm với Hematoxylin và Eosin, sau đó quan sát thể vùi (Inclusion body) bên trong

13


nhân tế bào, hoặc chẩn đoán nhanh bằng cách lấy mẫu ép mỏng, cố định trong methanol
và nhuộm với Giemsa, quan sát thể vùi xuất hiện trong nhân tế bào.
Đặc điểm mô học quan sát thấy là nhân phồng to do sự phát triển và tích lũy virion
bên trong, đây là một dấu hiệu đặc trưng của bệnh. Các thể vùi (Inclusion body-IB) ưa
kiềm có mặt trong nhân tế bào biểu bì, ruột trước, mang và hệ bạch huyết. Mô đích của
virus là những mô có nguồn gốc ngoại bì (ectodermal, gồm biểu bì, da, thần kinh, tuyến
anten…) và trung bì (mesodermal, gồm cơ, gan, tụy và hệ tiêu hóa).
2.6.2. Phương pháp lai
Để phát hiện WSSV, người ta có thể sử dụng các phương pháp lai như Dot blot,
southern blot, lai tại chỗ. Trong các phương pháp này, người ta sử dụng một trình tự DNA
chuyên biệt của WSSV. Dò tìm sự hiện diện của trình tự DNA này trên mẫu tôm nghi
bệnh. Kết quả của phương pháp này cho phép kết luận mẫu tôm có bệnh hay không.

Tuy nhiên, phương pháp này không tỏ ra hữu hiệu do rất tốn thời gian và cho độ
nhạy thấp hơn phương pháp PCR và phương pháp miễn dịch.
2.6.3. Phương pháp PCR
Là phương pháp dùng để khuếch đại một đoạn DNA mà đã biết trước trình tự của
nó và là phương pháp thông dụng nhất.
Phản ứng PCR phụ thuộc vào khả năng tách đôi của mạch DNA đơn và sự bắt cặp
bổ sung trong điều kiện được kiểm soát. Yếu tố thứ hai ảnh hưởng đến quá trình phản ứng
PCR là đoạn mồi (primer), đoạn oligonucleotide có độ dại khoảng từ 18 đến 20 base. Hai
đoạn mồi này sẽ bắt cặp bổ sung với đoạn DNA đích cần khuếch đại đã được biến tính.
Nhiệt độ ủ bắt cặp của chúng lạ từ 50 – 60oC. Sau khi đoạn mồi bắt cặp với đoạn DNA
mẫu thì sẽ được tiếp tục kéo dài nhờ vào các deoxynucleotide (dNTPs) và DNA
polymerase chịu nhiệt có trong hỗn hợp phản ứng, enzyme này được gọi là Taq
polymerase có khả năng giữ hoạt tính ở 95oC trong quá trình DNA duỗi thẳng và quá

14