NỘI DUNG 1: MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN CÀNH GIÂM CÂY HOA LÀI (Jasmine sambac L.) NỘI DUNG 2: TẠO PHÔI VÀ TẠO CHỒI CÂY HOA LÀI (Jasmine sambac L.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NỘI DUNG 1: MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG
ĐẾN CÀNH GIÂM CÂY HOA LÀI (Jasmine sambac L.)
NỘI DUNG 2: TẠO PHÔI VÀ TẠO CHỒI
CÂY HOA LÀI (Jasmine sambac L.)

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: HỒ NAM VIỆT
Niên khóa: 2006 – 2010

Tháng 07/2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NỘI DUNG 1: MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG
ĐẾN CÀNH GIÂM CÂY HOA LÀI (Jasmine sambac L.)
NỘI DUNG 2: TẠO PHÔI VÀ TẠO CHỒI
CÂY HOA LÀI (Jasmine sambac L.)

Hướng dẫn khoa học:

Sinh viên thực hiện:

ThS. NGUYỄN THỊ KIM LINH

HỒ NAM VIỆT

Tháng 7/2010


LỜI CẢM ƠN
Xin tạ ơn gia đình, tất cả những người thân, những người luôn đồng hành, yêu
thương, nuôi nấng và giúp đỡ tôi.
Cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm, Tp Hồ Chí Minh.
Chân thành cảm ơn đến bộ môn Công nghệ Sinh học, tất cả quý thầy cô bộ môn
và quý thầy cô đã tham gia hướng dẫn tôi trong suốt khóa học.
Chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Thị Kim Linh đã hướng dẫn tôi hoàn thành
luận văn tốt nghiệp này.
Luôn ghi nhớ công ơn của TS. Lê Đình Đôn, trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh
học trường Đại Học Nông Lâm, Tp Hồ Chí Minh.
Gởi lời cảm ơn đến quý thầy cô và các bạn làm việc tại phòng nuôi cấy mô Bộ
môn, đặc biệt là KS. Tô Thị Nhã Trầm.
Mãi nhớ về tập thể lớp DH06SH, đặc biệt là các bạn trong nhóm học tập.
Xin gởi lời cảm ơn đặc biệt đến bạn Lê Thụy Thúy Phượng đã luôn giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian học tập và làm khóa luận tốt nghiệp.
Xin gởi đến mọi người những lời chúc tốt đẹp nhất!

Tháng 7 năm 2010.
Hồ Nam Việt

iii

TÓM TẮT
Lài là loài thân bụi thường được thấy ở những vùng ấm áp trên thế giới. Mùi
hương của lài được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp nước hoa, mỹ phẩm và trong
y học. Ở Việt Nam, lài đã được trồng từ nhiều năm nay nhưng chúng ngày càng bị
thoái hóa giống. Vì thế chúng tôi nghiên cứu đến khả năng phát triển của cành giâm,
nghiên cứu khả năng tạo chồi và tạo phôi từ mô sẹo, khả năng phát sinh chồi ngủ từ
những đoạn thân mang chồi nách của cây hoa lài Jasmine sambac.
Ở thí nghiệm ảnh hưởng của chất trồng đến cành giâm hoa lài, tuy không tạo
được những kết quả tối ưu, song với thí nghiệm này thì chất trồng gồm đất, xơ dừa, tro
trấu theo tỉ lệ 1:1:1 là cho kết quả khả quan.
Thí nghiệm ảnh hưởng của kích thích sinh trưởng 2,4-D lên khả năng ra rễ của
cành giâm hoa lài, cho kết quả tốt ở 3 nghiệm thức có nồng độ từ 10 mg/l, 20 mg/l và
30 mg/l. Trong đó, dung dịch có nồng độ 30 mg/l cho kết quả tốt nhất.
Trong thí nghiệm ảnh hưởng của BA lên khả năng tạo chồi và tạo phôi từ mô
sẹo lá cây hoa lài, chưa có kết quả nào được ghi nhận.
Khảo sát ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng lên khả năng đánh thức
chồi ngủ từ đoạn thân cây hoa lài. Ở nghiệm thức có nồng độ BA 5 mg/l và nghiệm
thức có sự kết hợp BA 3 mg/l và Kinetin 2 mg/l cho kết quả khả quan.

iv


SUMMARY
The thesis title:
Content 1: The effect of some factors on the Jasmine cutting.

Content 2: Investigation on the embryogenesis and shoot regeneration of
Jasmine sambac.
Jasmine sambac is a shrub, distributed in the warmer parts of the world. The
odour of jasmine flower is used widely in perfume, cosmetic industry and

pharmacological field. Jasmine have been planted in Vietnam for many years.
However, quality of plant had been declined recently. Thus, we investigate the ability
of callus formation and shoot regeneration of Jasmine sambac explants in vitro. As a
result, we succeed in forming callus from the leaf and stem explants but forming
shoots is needed to be studied further.
In the investigation the influence of planting materials on the survival rate and
development of jasmine cutting, although we can’t make the best results, but planting
materials such as soil, coconut fiber, ash of rice husk mixed with 1:1:1 rate made a
satisfactory result.
Besides, the rooting of Jasmine cutting in the effect of 2,4-D growth regulator
succeed at 3 treatments in 10 mg/l, 20 mg/l and 30 mg/l. Among them, the third
concentration is best.
The shoot induction from nodal segment explants have not emerged in the
medium supplemented with BA.
Investigate the effect of growth regulator in shoot induction from segment
explants. After carrying out this, the concentration with 5 mg/l of BA and the mix of 3
mg/l of BA and 2 mg/l of Kinetin made a satisfactory result.

v


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN............................................................................................................................iii
TÓM TẮT ................................................................................................................................. iv
SUMMARY .............................................................................................................................. iv
MỤC LỤC ................................................................................................................................. vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................................viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH ........................................................................................................ ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG ....................................................................................................... x

Chương 1 MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................................ 1
1.2. Yêu cầu ............................................................................................................................... 1
1.3. Nội dung thực hiện .............................................................................................................. 2
Chương 2 TỒNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................................... 3
2.1. Cây hoa lài ........................................................................................................................... 3
2.1.1. Nguồn gốc và phân bố ...................................................................................................... 3
2.1.2. Đặc điểm hình thái............................................................................................................ 3
2.1.3. Giá trị sử dụng .................................................................................................................. 5
2.2. Quá trình tái sinh mô sẹo thành cây hoàn chỉnh .................................................................. 6
2.2.1. Mô sẹo .............................................................................................................................. 6
2.2.2. Yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành mô sẹo ................................................................... 6
2.3. Quá trình tạo phôi soma từ mô sẹo ...................................................................................... 6
2.3.1. Phôi soma ......................................................................................................................... 6
2.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành phôi soma ........................................................ 8
2.4. Phương pháp giâm cành ...................................................................................................... 9
2.4.1. Giâm cành ......................................................................................................................... 9
2.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến cành giâm ............................................................................... 9
2.4.3. Các bước giâm cành ....................................................................................................... 10
2.5. Phương pháp nhân giống ................................................................................................... 10
2.5.1. Nhân giống ex vitro ........................................................................................................ 10
2.5.2. Nhân giống in vitro ......................................................................................................... 10
2.5.2.1. Nuôi cấy đỉnh phân sinh .............................................................................................. 10
2.5.2.2 Ghép chồi đỉnh hay vi ghép .......................................................................................... 11
2.5.2.3. Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây ....................... 11_Toc266752234
2.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro .................................................................. 13
2.6.1. Mẫu nuôi cấy .................................................................................................................. 13
vi

2.6.2. Môi trường nuôi cấy ....................................................................................................... 14
2.6.3. Loại mẫu nuôi cấy .......................................................................................................... 15
2.6.4. Các chất sinh ra từ mẫu cấy ............................................................................................ 16
2.6.5. Hiện tượng thủy tinh thể ................................................................................................. 16
2.6.6. Khống chế điều kiện môi trường .................................................................................... 17
2.6.7. Sử dụng ưu thế lai trong nhân giống in vitro .................................................................. 18
2.6.8. Giá thành cây nuôi cấy in vitro ....................................................................................... 18
2.7. Thành phần và vai trò các chất dùng trong nuôi cấy mô ................................................... 19
2.7.1. Các chất khoáng ............................................................................................................. 19
2.7.1.1. Các nguyên tố đa lượng ............................................................................................... 19
2.7.1.2. Các nguyên tố vi lượng................................................................................................ 21
2.7.2. Các vitamin ..................................................................................................................... 22
2.7.3. Các chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy .................................................................... 23
2.7.4. Các chất điều hòa sinh trưởng ........................................................................................ 24
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................. 26
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................................................... 26
3.2. Vật liệu .............................................................................................................................. 26
3.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................................... 27
3.3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của thành phần chất trồng đến cành giâm ............................ 27
3.3.2. Thí Nghiệm 2: Ảnh hưởng nồng độ 2,4-D lên cành giâm cây hoa lài ........................... 28
3.3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của BA lên khả năng tạo chồi .............................................. 29
3.3.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của BA lên khả năng tạo phôi .............................................. 30
3.3.5. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng ............................................ 31
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................. 33
4.1. Nội dung 1: Một số yếu tố ảnh hưởng đến cành giâm cây hoa lài .................................... 33
4.1.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của thành phần chất trồng đến cành ..................................... 33
4.1.2. Thí Nghiệm 2: Ảnh hưởng nồng độ 2,4-D lên cành giâm cây hoa lài ........................... 35
4.2. Nội dung 2: Tạo phôi và tạo chồi cây hoa lài .................................................................... 37
4.2.1. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của BA lên khả năng tạo chồi từ mô sẹo lá hoa lài.............. 37
4.2.2. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của BA lên khả năng tạo phôi từ mô sẹo hoa lài ................. 38

4.2.3. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng lên khả năng ..................... 40
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 43
5.1. Kết luận ............................................................................................................................. 43
5.2. Đề nghị .............................................................................................................................. 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................ 44
PHỤ LỤC

vii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D

: 2,4 – dicholorophenoxy acetic acid

BAP (BA) : 6 – benzylaminopurine, Benzyladenine
N – (phenylathyl)-1H-purine (e)-6-amine
Kinetin

: 6-furfurylaminopurine
N-(2-furfurylmethyl)-1H-purone(e)-6-amine

kg
GA

: Kilogam
: Gibberellic acid

viii

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Jasmine sambac....................................................................................................... 3
Hình 2.2 Một số hình ảnh hoa lài thu thập được........................................................................ 4
Hình 2.3 Một số sản phẩm được sản xuất từ tinh dầu hoa lài .................................................... 5

Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 ...................................................................................... 27
Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 ...................................................................................... 28
Hình 4.1 Ảnh hưởng của thành phần chất trồng ...................................................................... 34
Hình 4.2 Rễ cành giâm hoa lài sau 40 ngày hom cành ............................................................ 34
Hình 4.3 Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng 2,4-D.................................................... 36
Hình 4.4 Sự ra rễ cành giâm hoa lài sau 40 ngày xử lý ........................................................... 36
Hình 4.5 Ảnh hưởng của BA lên khả năng tạo chồi từ mô sẹo lá ........................................... 38
Hình 4.6 Ảnh hưởngcủa BA đến khả năng phát sinh phôi từ mô sẹo ..................................... 39
Hình 4.7 Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng lên khả năng tái sinh chồi .................... 41

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bàng 3.1 Thành phần giá thể................................................................................................ 27
Bảng 3.2 Thành phần nghiệm thức...................................................................................... 28
Bảng 3.3 Thí nghiệm ảnh hưởng BA đến khả năng tạo chồi ................................................... 29
Bảng 3.4 Thí nghiệm ảnh hưởng BA đến khả năng tạo phôi ................................................... 30
Bảng 3.5 Thí nghiệm ảnh hưởng kích thích sinh trưởng ......................................................... 31
Bảng 4.1 Ảnh hưởng của thành phần chất trồng đến cành giâm hoa lài .................................. 33
Bảng 4.2 Ảnh hưởng của thành phần chất trồng đến số cành giâm hoa lài tạo rễ ................... 33
Bảng 4.3 Ảnh hưởng nồng độ 2,4-D lên sự ra rễ cành giâm cây hoa lài ................................. 35
Bảng 4.4 Ảnh hưởng của 2,4-D đến sự ra rễ của cành giâm cây hoa lài ................................. 35
Bảng 4.5 Ảnh hưởng của BA lên khả năng tạo chồi từ mô sẹo lá ........................................... 37

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của BA lên khả năng tạo phôi từ mô sẹo lá ........................................... 39
Bảng 4.7 Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng lên khả năng tái sinh chồi.................... 40

x


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Cuộc sống ngày càng hiện đại, nhu cầu của con người cũng ngày càng cao hơn
và đa dạng hơn. Những sản phẩm mới ra đời nhằm phục vụ cho đời sống tinh thần và
vật chất của con người như mỹ phẩm, thực phẩm, thuốc trị bệnh ngày càng tăng về
mặt số lượng cũng như chất lượng,… Để có được những sản phẩm này đòi hỏi những
nghiên cứu sâu rộng để tạo ra một nguồn nguyên liệu dồi dào. Công nghệ sinh học ra
đời đã giúp con người bước gần hơn đến điều đó.
Việt Nam là một nước nông nghiệp vùng nhiệt đới, cây trồng đa dạng, phân bố
khắp mọi vùng miền với nhiều loại cây mang lại giá trị kinh tế cao. Một trong số đó là
cây hoa Lài. Hoa Lài không chỉ được dùng làm nước hoa, ướp trà mà còn được biết
đến như là một loại dược liệu được sử dụng phổ biến trong Đông và Tây y, …Để đáp
ứng đủ nguồn cung nguyên liệu, diện tích trồng cây Lài không ngừng tăng lên trong
những năm gần đây. Điều này đồng nghĩa với việc cần một nguồn cung cấp giống lớn,
tốt và sạch bệnh. Tuy nhiên, những giống lài đang trồng ở nước ta hiện đang bị thoái
hóa, năng suất hoa thu được ngày một thấp dần. Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là
cách giải quyết tốt nhất hiện nay, việc ứng dụng nuôi cấy mô và tế bào thực vật trong
công tác giống ở cây hoa Lài còn giúp chúng ta chủ động được nguồn giống cũng như
cây giống luôn tươi trẻ, điều này đem lại năng suất cao cho người nông dân. Bên cạnh
đó cần có nhiều nghiên cứu hơn về những hoạt chất có trong lá cây hoa lài, điều này
mở ra triển vọng mới về khả năng ứng dụng của lá hoa lài.
Song để giải quyết tình hình cấp thiết hiện nay, chúng ta cũng cần có những
nghiên cứu về cách giâm cành hoa lài cung cấp giống cho người nông dân, trước khi
những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây hoa lài trở nên rõ ràng và có thể sản xuất đại trà.

1.2. Yêu cầu
Tìm hiểu những yếu tố ảnh hưởng đến khả năng ra rễ cành giâm cây hoa lài như
tỉ lệ đất, xơ dừa, tro trấu, nồng độ và thời gian xử lý của hóa chất.

1


Ở nội dung 2, xác định các thành phần, nồng độ các chất kích thích sinh trưởng
bổ sung vào môi trường dùng tái sinh chồi và phôi, từ mô sẹo đã được tạo từ mẫu lá.
Bên cạnh đó là thí nghiệm về quá trình đánh thức chồi ngủ từ đoạn thân cây hoa lài.
1.3. Nội dung thực hiện
Trước khi thực hiện các nội dung chính của đề tài, quá trình tạo sẹo từ mẫu lá cây
hoa lài được thực hiện (Theo quy trình Điền Thị Tuyết Nhung, 2009). Mục đích của
thí nghiệm nhằm tạo mẫu phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
Những môi trường có khả năng tạo sẹo từ lá cây hoa lài được nghiên cứu nhằm
thu sẹo phù hợp cho mục đích tái sinh chồi và phôi từ mô sẹo.
Nội dung 1:
Ảnh hưởng của thành phần chất trồng đến cành giâm cây hoa lài.
Ảnh hưởng nồng độ 2,4-D lên cành giâm cây hoa lài.
Nội dung 2:
Ảnh hưởng của BA lên khả năng tạo chồi từ mô sẹo lá cây hoa lài.
Ảnh hưởng của BA lên khả năng phát sinh phôi từ mô sẹo lá cây hoa lài.
Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng lên khả năng tái sinh chồi từ
đoạn thân cây hoa lài mang chồi ngủ.

2


Chương 2 TỒNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Cây hoa lài

2.1.1. Nguồn gốc và phân bố
Cây hoa lài (trích dẫn bởi Điền Thị
Tuyết Nhung, 2009):
Ngành: (ngọc lan) Magnoliophyta
Lớp: (ngọc lan) Magnolibosida
Bộ: Lamiales
Họ: Oleaceae
Giống: Jasminium
Hình 2.1 Jasmine sambac flower.
Cây hoa Lài (Jasminum) có khoảng 200 loài, sống chủ yếu ở vùng nhiệt đới và
những vùng có khí hậu ẩm thuộc Châu Âu, Châu Á, Châu Phi. Tại Việt Nam, cây hoa
lài cũng đã xuất hiện rất lâu ở làng hoa Ngọc Hà (Hà Nội), làng hoa Gò Vấp, Hóc Môn
(Thành Phố Hồ Chí Minh) (Điền Thị Tuyết Nhung, 2009).
Jasminum officinale mọc ở chân núi Hymalayas và vùng đồng bằng Ganges,
được trồng thương mại ở vùng có khí hậu ôn hòa. Ấn Độ hiện nay là một trong những
nơi trồng nhiều nhất, đặc biệt là ở Uttar Pradesh và Andhra Pradesh. J. officinale còn
là loại lài rất nổi tiếng và ưa chuộng tại Anh, có hương thơm vô cùng quyến rũ (trích
dẫn bởi Điền Thị Tuyết Nhung, 2009).
Ở miền nam nước Pháp có hai loại lài Jasminum officinale và Jasminum
grandiflorum. J. grandiflorum thường được gọi là lài Tây Ban Nha, được dùng để
chiết xuất tinh dầu tự nhiên, đã có mặt ở vùng Grasse của Pháp khoảng 200 nãm.
2.1.2. Đặc điểm hình thái
Lài là loài cây thân gỗ nhỏ, thường thấy ở những vùng có khí hậu ấm áp trên
thế giới. Cây lài mọc thành bụi, có nhánh phát triển vươn dài tạo thành dây leo, cao
khoảng 0,5 đến 3 m. Tại Việt Nam lài ra hoa nhiều vào mùa nắng.

3


Lài có lá bóng cả hai mặt, phiến lá hình bầu dục, mọc đối. Kẻ lá có gân phụ,

mỗi bên 5 đến 6 gân phụ, lồi ở giữa cong đột ngột ở mép, gân con hình mạng lưới
(Trịnh Thị Phi Ly, 2005). Lài có ba lá chét (lá kép) hay có hình lông chim, tối đa có 9
lá chét.
Hoa thường màu trắng, một số có màu vàng, mọc thành cụm ở nách lá hay ngọn
cây, tràng hoa có 5 đến 6 thùy. Hoa lài có mùi hương nồng nàng và kéo dài, thường nở
vào mùa hè và mùa xuân.
Jasminum anodontum Gagn: dạng dây leo, không lông, lá có phiến hình bầu
dục thon dài (4 đến 7 cm), gân phụ rất mãnh (3 đến 4 cặp gân phụ), mang 2 đến 7 hoa
ở nách lá và ngọn nhánh (Phạm Hoàng Độ, 2003).

4


Hình 2.2 Một số hình ảnh hoa lài thu thập được.
2.1.3. Giá trị sử dụng
Hiện nay, giá 1 kg hoa lài dao động từ 20.000 đến 100.000 đồng. Theo tính toán
của nông dân, 1000 m2 trồng hoa lài lãi khoảng 50.000 đồng/ngày. Như vậy một năm
cây hoa lài cho hiệu quả kinh tế khá cao và ổn định (Chu Trinh, 2007).
Hoa lài, còn gọi là hoa nhài, theo y học cổ truyền hoa lài có tính ẩm giúp điều
hòa chức năng gan, hệ tiêu hóa, giải cảm,…Theo các nhà khoa học thuộc trường đại
học Wheeling Jesiut (Mỹ), nếu có một ít hương lài trong phòng ngủ sẽ giúp giấc ngủ
ngon hơn. Tinh dầu hoa lài còn dùng để làm dầu massage hoặc pha loãng để tắm làm
giảm căng thẳng thần kinh. Ngoài ra, tinh dầu hoa lài còn làm tăng tính đàn hồi của da
và vết nhăn do sẹo, xoa dịu cơn ho, khan giọng, viêm thanh quản, giảm đau nhức cơ và
bong gân.
Trong mỹ phẩm chỉ có một số ít loại hoa lài được sử dụng, những loại này được
gọi là thượng đẳng hoa, có mùi thơm ngọt ngào, dịu dàng và quyến rũ.
Hoa lài còn được dùng để ướp trà. Hiện nay có rất nhiều loại trà lài phổ biến và
được nhiều người ưa chuộng. Ở nước ta hiện nay, hoa lài chủ yếu được dùng để ướp
trà, tuy nhiên lượng cung cấp vẫn còn chưa đủ so với nhu cầu tiêu dùng.

Jasmine Sambac Lovers
Body Oil 4oz-120ml

Jamine Sambac Absolute

5

Pure Natural Alcohol Free
Jasmine Sambac Oil


Hình 2.3 Một số sản phẩm được sản xuất từ tinh dầu hoa lài.
2.2. Quá trình tái sinh mô sẹo thành cây hoàn chỉnh
2.2.1. Mô sẹo
Mô sẹo là khối tế bào phát sinh vô tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan
đã phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt như vết thương, xử lý các chất điều hòa sinh
trưởng thực vật,...(Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên, 2003). Các tế bào từ các
mô hoặc cơ quan này, trừ các tế bào của mô phân sinh, phải chịu một sự phản phân
hóa trước lần phân chia đầu tiên (Halperin, 1969). Sự phản phân hóa rất quan trọng, nó
cho phép một tế bào trưởng thành trở lại trạng thái trẻ. Sự trẻ hóa này sẽ giúp tế bào tái
lập khả năng phân chia và tạo phôi soma trong điều kiện thích hợp (Pierik, 1978).
Quá trình hình thành mô sẹo phụ thuộc vào nồng độ kích thích sinh trưởng
auxin và cytokinin có trong môi trường và mẫu. Cần quan tâm đến nồng độ các chất
này trong mẫu để lựa chọn môi trường cho phù hợp. Thông thường mẫu có chứa lượng
auxin lớn mô sẹo sẽ hình thành dễ dàng hơn. Việc tạo vết thương trên mẫu nuôi cấy
cũng ảnh hưởng đến số lượng sẹo được hình thành trong quá trình nuôi cấy.
2.2.2. Yếu tố ảnh hưởng đến sự hình cây từ mô sẹo
Trong nhân giống in vitro, nếu tái sinh trực tiếp cây từ mẫu nuôi cấy thì ta có
thể nhanh chóng thu được số lượng lớn cây đồng nhất về mặt di truyền. Tuy nhiên,

trong quá trình nuôi cấy mẫu thường không phát sinh chồi ngay mà phải trải qua giai
đoạn hình thành mô sẹo sau đó mới phát sinh thành cây mới, mô sẹo thường có vật
liệu di truyền không ổn định so với mẫu nuôi cấy và càng tăng hệ số biến đổi khi số
lần cấy chuyền càng tăng. Vì vậy, cần sử dụng mô sẹo sơ cấp (mô sẹo mới phát sinh)
để tái sinh cây nhằm hạn chế thấp nhất khả năng biến dị về mặt di truyền.
2.3. Quá trình tái tạo phôi soma từ mô sẹo
2.3.1. Phôi soma
Phôi vô tính là phôi được hình thành từ tế bào soma. Do vậy, cây từ phôi vô
tính giống hệt với cây mẹ về cấu trúc di truyền và các tính trạng sinh học khác trừ
trường hợp có biến dị tế bào soma. Phôi vô tính còn gọi là phôi soma (somatic
embryo), hay phôi sinh dưỡng (vegetative embryo), ở cây có múi còn gọi là phôi
nucellar hay phôi tâm.

6


Trong quá trình nuôi cấy, việc tế bào phân chia vô tổ chức thường tạo thành mô
sẹo, có thể thay đổi hướng phát triển của chúng để thu được phôi vô tính với các bước
phát sinh hình thái giống phôi hữu tính. Điểm khác nhau cơ bản giữa phôi hữu tính và
phôi vô tính là phôi hữu tính luôn luôn đi kèm với nội nhũ là cơ quan dự trữ năng
lượng và chất dinh dưỡng phục vụ cho quá trình nảy mầm, còn ở phôi vô tính hoàn
toàn không có nội nhũ. Khả năng tạo phôi vô tính trong nuôi cấy mô thực vật, ngoài
các điều kiện vật lý, hóa học thuận lợi cho sự tạo phôi, còn phụ thuộc rất lớn vào loài,
giống và dòng trong cùng một loài.
Nhân giống bằng phôi vô tính có các ưu điểm chính sau:
+ Hệ số nhân giống cao. Các mô và tế bào sinh dưỡng nuôi cấy in vitro có thể
tạo ra phôi vô tính một cách trực tiếp hoặc thông qua giai đoạn trung gian là mô sẹo.
Tế bào mô sẹo có thể phân chia theo cấp số nhân và khi phân hoá thành phôi vô tính sẽ
tạo ra số lượng phôi vô tính khổng lồ trong thời gian ngắn. Ví dụ, ở cà phê người ta có
thể tạo được 600.000 phôi vô tính từ 1 gram sinh khối ban đầu trong vài tháng với tỷ lệ

tái sinh cây từ phôi vô tính đạt 47% (Ducos và cs, 1993).
+ Phôi vô tính chứa một lượng chất dinh dưỡng tương tự với nội nhũ của phôi
hữu tính, có mầm chóp rễ và chồi đỉnh. Do vậy, phôi có thể nảy mầm trực tiếp thành
cây (Ammirrato, 1983).
+ Phôi vô tính sau khi tạo hạt nhân tạo có thể bảo quản và lưu giữ dài hạn.
+ Khả năng công nghiệp hoá và tự động hoá quá trình nhân giống quy mô lớn,
đặc biệt là nhân giống bằng bioreactor (Takayama và Akita, 1994).
Các yếu tố di truyền, đặc tính của mô nuôi cấy, thành phần môi trường và các
yếu tố hoá lý khác nhau có tác động mạnh mẽ lên quá trình phân hoá tế bào thành phôi
vô tính. Thidiazuron là một chất có hoạt tính cực mạnh đối với tạo phôi vô tính ở một
số cây trồng, đặc biệt là cây lâm nghiệp và cây ăn quả (Huetteman và Preece, 1993),
cây chè (Sandal và cs, 2001). Kỹ thuật tạo phôi vô tính đã được áp dụng thành công
trong nhân nhanh hàng loạt cây trồng, ví dụ: nhân giống xoan ấn Độ (Murthy and
Saxena, 1998), thông (Garin và cs, 1998), đu đủ (Jordan và Velozo, 1996; Castllo và
cs, 1998), loa kèn (Tribulato và cs, 1997)...
Ở phôi hữu tính, sự kết hợp giao tử đực và cái cho ra hợp tử (zygote). Hợp tử
phân chia nhiều lần tạo nên phôi hữu tính có cấu trúc hai cực: rễ và ngọn. Khi hợp tử

7


phát triển, miền sinh trưởng rễ và miền sinh trưởng ngọn cùng phát triển và cuối cùng
tạo thành cây hoàn chỉnh, qua các giai đoạn phôi học như sau:
+Trường hợp cây hai lá mầm: dạng cầu → dạng thủy lôi → dạng có lá mầm.
+ Trường hợp cây một lá mầm: dạng cầu → dạng scutellar → dạng diệp tiêu.
Ở trường hợp phôi vô tính, các cá thể nhân giống có cực tính bắt nguồn từ các
tế bào soma. Chúng rất giống phôi hữu tính ở hình thái, quá trình phát triển và sinh lý,
nhưng do không phải là sản phẩm của sự thụ tinh giữa giao tử đực và giao tử cái, và vì
vậy không có quá trình tái tổ hợp di truyền các phôi vô tính có nội dung di truyền
giống hệt với các tế bào soma đã sinh ra chúng.

2.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành phôi soma
Những tế bào trong phôi hợp tử có khả năng biểu hiện được gen cần thiết cho
quá trình phát triển phôi. Giai đoạn trước khi hình thành tế bào phôi soma được gọi là
tế bào tiền phôi. Tế bào tiền phôi phân chia để phát sinh thành hệ thống tế bào phôi
trực tiếp gọi là sự phát sinh tế bào phôi trực tiếp.
Có nhiều tế bào hình thành phôi từ mô sẹo, quá trình này gọi là sự phát sinh
phôi soma gián tiếp. Nhiều loại tế bào phát sinh tế bào phôi không cần chất kích thích
sinh trưởng, cũng có những tế bào cần auxin để tiến hành phân bào trước khi phát sinh
tế bào phôi.
Những tế bào ở mô có quan hệ với sự sinh sản như hạt phấn, chồi mầm có khả
năng phát sinh hệ thống phôi dễ dàng hơn tế bào ở những mô trưởng thành. Khi mô có
chứa tế bào phôi, kích thích tế bào phân chia trong giai đoạn này là cần thiết để duy trì
trạng thái dạng phôi và giúp cho sự hình thành phôi soma.
Chất kích thích sinh trưởng cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát
sinh phôi. Tế bào bình thường được nuôi cấy trên môi trường có auxin và có thể không
có cytokinin, sẽ phát sinh tế bào phôi. Lượng cytokinin trong tế bào càng cao khả năng
phát sinh phôi càng thấp. Sự lặp đi lặp lại chu kỳ phát sinh phôi có thể bị phá vỡ do sự
giảm hoặc không có auxin trong môi trường nuôi cấy. Tuy auxin có vai trò quan trọng
trong quá trình phát sinh phôi, nhưng khi thu nhận tế bào phôi, sự có mặt của auxin sẽ
gây tổn hại đến sự phát triển bình thường của phôi. Ngoài ra, tỉ lệ ammonium và
nitrate trong môi trường, pH thấp, … cũng ảnh hưởng đến sự phát triển bình thường
của phôi.
Sự hình thành phôi thông qua hai con đường:
8


+ Tế bào tiền phôi (PEDC, Preembryogenic determined cell).
+ Tế bào phát sinh phôi (IEDC, induced embryogenic determined cell).
PEDC là con đường phát sinh phôi không qua quá trình tạo mô sẹo.
IDEC là con đường phát sinh phôi thông qua quá trình tạo mô sẹo.

Có hai bước dẫn đến hình thành hệ thống phôi (EC, Embryogenic cell):
1. Sự biệt hóa của tế bào có khả năng phát sinh phôi.
2. Sự phát triển của những hệ thống tế bào phôi mới.
Ở hai bước hình thành hệ thống phôi, cần thiết dùng mỗi loại môi trường nuôi
cấy khác nhau: (1) môi trường cần cho sự phát sinh tế bào phôi; (2) môi trường cần
cho sự phát triển những tế bào này thành những tế bào có khả năng phát sinh phôi.
Bước một của quá trình hình thành hệ thống phôi cần có auxin, bước hai
phải giảm thấp hay không có auxin.
Hai yếu tố quan trọng trong phát sinh phôi soma là auxin và nitơ.
Phôi soma có tính toàn thế, việc tạo phôi soma giúp khảo sát toàn bộ tiến trình
biệt hóa của tế bào cũng như cơ chế thể hiện tính toàn năng của tế bào thực vật.
2.4. Phương pháp giâm cành
2.4.1. Giâm cành
Giâm cành là một quá trình nhánh được cắt ra khỏi cây mẹ trồng trên giá thể.
Sau một thời gian cành giâm ra chồi, ra rễ (do vết cắt phản ứng tự tạo sẹo, tạo rễ) phát
triển thành cây mới.
2.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến cành giâm
Không phải loại cây nào cành giâm cũng sống được, điều này tùy thuộc vào
lượng tinh bột có trong thân cây. Cây càng nhiều tinh bột khả năng tạo rễ càng cao.
Nếu cây có nhiều nhựa mủ, cần cắt khúc cho ráo mủ mới đem giâm cành. Sự ra rễ của
cành giâm còn phụ thuộc vào loại cành được chọn, cành chính hay cành bánh tẻ, cành
trưởng thành, già cõi hay non, cành mọc từ thân khỏe hay yếu. Vết cắt cành giâm cũng
đóng vai trò quan trọng, vết cắt phải nguyên vẹn không bị dập, dùng kéo bén để cắt,
khoảng cách từ vết cắt tới mắt đầu tiên thường từ 4 đến 5 cm, trên vết cắt thường chọn
mắt thật khỏe.
Quá trình ra rễ của cành giâm chủ yếu do yếu tố bên trong cành giâm. Ở giai
đoạn này vai trò của giá thể không cao, tuy nhiên, giá thể trồng sẽ ảnh hưởng tới sự
sinh trưởng của cành giâm. Giá thể thông thoáng sẽ giúp cành dễ ra rễ hơn là giá thể
9

kém thoát nước. Ngoài ra, sau khi cành bắt đầu ra rễ thì giá thể tốt sẽ giúp rất nhiều
cho sự sinh trưởng cành giâm, nếu không cây sẽ kém phát triển dẫn đến chất lượng
cành giâm không tốt.
Ngày nay, nhiều loại chất kích thích như antonik, chất kích thích ra rễ cực
mạnh,… có tác dụng rất lớn trong giâm cành. Việc lựa chọn nồng độ và thời gian xử lý
đóng vai trò quyết định đến kết quả đạt được.
Cành giâm cần được che nắng vì thời gian này cành rất yếu, nếu nắng nhiều sẽ
làm cành khô và héo. Độ ẩm của vườn ươm cũng rất cần thiết, độ ẩm càng cao thì khả
năng ra rễ và chồi của cành càng tốt. Độ ẩm bên trên (phần trên mặt đất) và bên dưới
(dưới mặt đất) đóng vai trò quyết định đến sự ra rễ của cành giâm, để thành công cần
duy trì độ ẩm cả hai phần cao và ổn định.
2.4.3. Các bước giâm cành
Giâm cành đã trở nên rất phổ biến trong nông nghiệp hiện nay. Đầu tiên cần
chuẩn bị giá thể, phối trộn các thành phần cho thích hợp, làm tơi xốp (có thể ủ để tiêu
diệt bớt mầm bệnh), cho vào bầu đất và tưới thật đẫm. Tiếp theo cần chuẩn bị cành
giâm. Chọn những cành khỏe, trưởng thành cắt thành từng đoạn khoảng 2 đến 4 mắt
trên đoạn, dùng kéo thật sắc tránh làm xay xát vết cắt. Cắt lá ở mắt cạnh vết cắt, tỉa bớt
lá ở các mắt phía trên.
Xử lý cành giâm bằng dung dịch kích thích ra rễ, thời gian thích hợp, để cành
giâm khô nước và tiến hành giâm. Dùng 1 hoặc 2 nhánh, cắm xéo vào bầu đất sau cho
mắt đầu tiên được cắm sâu vào đất, ém chặt và tiến hành tưới nước cả vườn. Tưới định
kỳ sao cho bảo đảm độ ẩm của vườn ươm được tốt.
2.5. Phương pháp nhân giống
2.5.1. Nhân giống ex vitro
Nhân giống ex vitro bao gồm các phương pháp nhân giống vô tính và hữu tính.
Nhân giống hữu tính là quá trình sử dụng phôi được tạo thành do quá trình thụ tinh tạo
thành hạt, đem gieo trồng ngoài tự nhiên. Nhân giống vô tính được chia ra làm hai
loại, theo phương pháp nông học gồm giâm cành, chiết cành, ghép cành hoặc nhân
giống theo cấu trúc tự nhiên như dạng căn hành, dạng căn hành nhỏ, dạng giò, dạng

củ, thân bò, …
2.5.2. Nhân giống in vitro
2.5.2.1. Nuôi cấy đỉnh phân sinh
10


Mô phân sinh đỉnh chứa những tế bào đỉnh sinh trưởng và được bao bọc bởi
một lớp vỏ bề mặt có cấu tạo cutin hạn chế thấp nhất quá trình thoát nước và lớp cutin
này bao bọc cả chồi đỉnh.
Mô đỉnh sinh trưởng là mô duy nhất sạch virus. Do đó, đây là một vật liệu nuôi
cấy mô tế bào được sử dụng trong tạo giống cây sạch bệnh.
Limmasets và Cornuet (1949) phát hiện ở các cây nhiễm bệnh virus, virus phân
bố không đồng nhất trên cây và thường không thấy ở vùng đỉnh sinh trưởng. Phát hiện
đó là cơ sở để Morel và Martin (1952) tạo được cây sạch bệnh virus từ 6 giống khoai
tây qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Năm 1960, Morel thực hiện bước ngoặt khi áp dụng
thành công kỹ thuật này trong nhân nhanh các loài địa lan thông qua protocorm.
2.5.2.2. Ghép chồi đỉnh hay vi ghép
Phương pháp phổ biến để tạo cây giống cam quýt sạch bệnh là chọn lọc cây con
có nguồn gốc từ tế bào nucellar. Tuy nhiên, những cây này có giai đoạn chưa thành
thục kéo dài trước khi bước vào giai đoạn sinh sản. Việc xử lý nhiệt để loại trừ bệnh
như exocortis và xyloporosis thường không hiệu quả. Hiện nay, vi ghép chồi là kỹ
thuật tạo cây sạch bệnh được sử dụng thành công ở nhiều phòng thí nghiệm.
Murashige và cộng sự (1972) dùng vi ghép đỉnh sinh trưởng để tạo vật liệu sạch
bệnh ở cây cam quýt. Cây con tái sinh sạch các tác nhân gây bệnh micoplasma và
exocortis.
Năm 1975, Navarro và cộng sự đã hoàn thiện quy trình vi ghép chồi đỉnh cây có
múi in vitro. Bằng kỹ thuật này, khoảng 90 loại cây có múi khác nhau được làm sạch
bệnh (Navarro và cs, 1988). Kỹ thuật vi ghép đã loại trừ được hàng loạt bệnh khỏi
nguồn gen cây có múi, ví dụ như tristeza do virus, psorosis; stubborn spiroplasma;
exocortis viroid; tác nhân gây bệnh chảy gôm, cristacortis cũng bị loại trừ.

2.5.2.3. Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây
a. Nuôi cấy chồi bất định
Đỉnh chồi bất định mới có thể phát triển hoặc trực tiếp trên mẫu vật hoặc gián
tiếp từ mô sẹo, mà mô sẹo này hình thành trên bề mặt vết cắt của mẫu vật. Một số loại
mẫu vật được dùng như: đoạn thân, mảnh lá, cuống lá, các bộ phận của hoa, nhánh củ,
đoạn mầm, …
Sự phát sinh chồi bất định trực tiếp bắt đầu bằng các tế bào nhu mô nằm ở trong
biểu bì hoặc ngay phía dưới bề mặt của thân, một số tế bào này trở thành mô phân sinh
11


và các túi nhỏ gọi là thể phân sinh phát triển. Các thể phân sinh này rõ ràng có nguồn
gốc từ các tế bào đơn. Tuy nhiên, chiều hướng phản ứng của thực vật cũng tùy thuộc
vào nồng độ phytohormone. Nghiên cứu sự tạo chồi ở mô nuôi cấy của cây linh sam
Douglas cho thấy cytokinin (BAP 5 μM) cần thiết cho sự phát sinh chồi bất định,
nhưng có ba kiểu phản ứng khác nhau có kết quả tùy thuộc vào nồng độ của auxin
được cung cấp. Nồng độ auxin thấp (NAA < 5 μM) chỉ có chồi phát triển. Khi nồng độ
auxin cao hơn (NAA > 5μM) lá mầm tạo ra cả mô sẹo và nhiều chồi. Khi cung cấp chỉ
riêng auxin (NAA 5 μM) thì chỉ có mô sẹo được tạo thành.
b. Nhân giống thông qua giai đoạn mô sẹo
Trong nhân giống in vitro nếu tái sinh được cây hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu vật
nuôi cấy ban đầu thì không những nhanh chóng thu được cây mà các cây cũng khá
đồng nhất về mặt di truyền. Tuy nhiên, nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh
cây ngay phát triển thành khối mô sẹo. Tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ
không ổn định về mặt di truyền. Để tránh tình trạng đó nhất thiết phải sử dụng loại mô
sẹo vừa phát sinh, tức là mô sẹo sơ cấp để tái sinh cây sẽ thu được cây tái sinh đồng
nhất. Thông qua giai đoạn mô sẹo còn có thể thu được những cá thể sạch virus.
c. Nhân giống thông qua giai đoạn phát sinh phôi vô tính
Phôi vô tính là các cá thể nhân giống có cực tính bắt nguồn từ các tế bào soma.
Chúng rất giống phôi hữu tính ở hình thái, quá trình phát triển và sinh lý, nhưng do

không phải là sản phẩm của sự thụ tinh giữa giao tử đực và giao tử cái, và vì vậy
không có quá trình tái tổ hợp di truyền các phôi vô tính có nội dung di truyền giống hệt
với các tế bào soma đã sinh ra chúng.
Năm 1958, Street và Reinert là hai tác giả đầu tiên mô tả sự hình thành phôi vô
tính từ các tế bào đơn của cà rốt (Daucus carota). Đến năm 1977, Murashige cho rằng
sự tạo phôi vô tính có thể trở thành một biện pháp nhân giống in vitro. Ở một số loài,
sự phát sinh phôi vô tính hình thành trực tiếp từ những phôi bất định nằm trong phôi
tâm. Đến nay, công nghệ phôi vô tính được coi là công nghệ rất có triển vọng cho
nông nghiệp trong thế kỷ 21.
d. Nhân giống thông qua nồi phản ứng sinh học
Trước đây, các nồi phản ứng sinh học hay còn gọi là nồi lên men (fermentor)
chủ yếu được dùng cho công nghệ vi sinh. Trên cơ sở các thiết bị đó, với một số cải

12


tiến, nhiều tác giả đã nhân giống thành công nhiều loại phôi vô tính và các thể chồi,
cụm chồi hoặc củ nhỏ.
Phôi vô tính cà phê được sản xuất thành công ở Brasil trên các nồi phản ứng
sinh học dung tích từ 2 đến 4 lít. Mỗi mẻ thu được 4 đến 5 triệu phôi vô tính cà phê.
Ở Indonesia, cụm chồi dứa được đưa vào sản xuất thành công với nồi lên men
10 lít. Dịch lỏng nuôi cấy (môi trường mới) được bơm vào nồi và hút ra (môi trường
cũ) theo chu kỳ ngắn, nhờ vậy mô và tế bào thực vật có đủ oxy và chất dinh dưỡng để
phát triển mạnh.
2.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro
2.6.1. Mẫu nuôi cấy
Khi tiến hành nuôi cấy in vitro, quá trình chọn mẫu và xử lý mẫu là khâu quan
trọng đầu tiên. Các nhân tố quan tâm khi tiến hành chọn mẫu gồm: kiểu gen, cơ quan
được chọn, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, tình trạng của mẫu.
+ Kiểu gen: ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy, số lượng chồi tạo được,

sự khác nhau về tăng sinh chồi, sự khác nhau về khả năng phát sinh phôi. Người ta
cũng ghi nhận kiểu di truyền ảnh hưởng đến số lượng và đường kính của mô sẹo qua
nuôi cấy hạt phấn cà chua.
+ Chọn cơ quan: hầu hết các loại cơ quan và mô đều có khả năng sử dụng nuôi
cấy in vitro. Ở những loài khác nhau có thể cần sử dụng những loại mẫu khác nhau, có
thể dùng chồi đỉnh để nuôi cấy đối với cây hoa màu, chồi mầm thích hợp làm mẫu
nuôi cấy ở các cây nảy mầm từ hạt. Nuôi cấy thân mầm để tạo protoplast có khả năng
phát sinh phôi. Nuôi cấy lát cắt mỏng ở mô lá cây thuốc lá có thể tái sinh các cơ quan
khác nhau như hoa, chồi và rễ phụ thuộc vào lớp mỏng tế bào ở bộ phận nào của cây
được nuôi cấy và các kích thích sinh trưởng sử dụng. Có thể thu nhận những cây cúc
có kiểu hoa và màu hoa khác với cây mẹ khi nuôi cấy những phần của mẫu hoa.
+ Tuổi và sinh lý: tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong năm của
mẫu nuôi cấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hóa tế bào và tuổi sinh lý. Thành
phần cơ quan có cấu tạo thấp không thể nuôi cấy in vitro do không thể sử dụng thành
phần khoáng trong môi trường. Rễ phát sinh trên lá non cây lunaria và không phát
sinh trên lá già. Khả năng tái sinh cao ở lá cây trưởng thành so với lá cây còn non.
Ngược lại mẫu non cắt cành của Hedorahelix dễ tái sinh hơn so với mẫu trưởng thành
và nuôi cấy lá non phát sinh cơ quan tốt hơn so với nuôi cấy lá trưởng thành.
13


+ Mẫu in vitro: khả năng tái sinh cao hơn mẫu lấy từ cây mẹ trên đồng ruộng
hay trong vườn ươm. Nuôi cấy mẫu in vitro cho thấy nâng cao khả năng nhân giống
cắt đốt. Đạt tỉ lệ thành công cao khi nuôi cấy túi phấn cây trên đồng ruộng.
+ Sức sống của mẫu: mẫu cây mẹ có ảnh hưởng rất quan trọng đến nuôi cấy in
vitro. Những cây bị nhiễm virus cũng có thể tạo ra cây sạch bệnh nhờ nuôi cấy đỉnh
sinh trưởng.
2.6.2. Môi trường nuôi cấy
Môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) được sử dụng phổ biến nhất trong
nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Nhưng các loài khác nhau có thể cần môi trường nuôi cấy

khác nhau. Samartin (1989) đã dùng 6 công thức muối đa lượng khác nhau đối với cây
trà Camelia japonica và thấy rằng môi trường MS cho tốc độ sinh trưởng nhanh nhất
khi thu mẫu từ cây non. Môi trường MS không thích hợp cho mẫu lấy từ cây già, trong
khi môi trường muối loãng hơn (Heller, 1953) lại cho kết quả khá tốt.
Tính độc của môi trường MS cũng được quan sát ở một số loài (Sommer, 1982;
Vieitez, 1983). Môi trường này chứa hàm lượng muối đa lượng cao, có thể gây độc
cho tế bào in vitro, nhất là protoplast.
Trong số các muối đa lượng, muối nitơ có ý nghĩa quyết định đến sự tái sinh
chồi. Welander (1985) cho biết khi nồng độ NH4NO3 và KNO3 trong MS giảm đi một
nữa, đỉnh sinh trưởng của dâu tây phát triển khá hơn, rễ tái sinh mạnh hơn. Giảm muối
khoáng trong một số trường hợp có tác dụng tốt đối với sự ra rễ ở một số loài
(Murashige, 1977; Hasegawa, 1980; Drew, 1987) như trường hợp chồi hoa hồng ra rễ
tốt hơn khi nồng độ nitơ tổng số giảm (Hyndman và cs, 1982).
Nguồn carbon cũng rất quan trọng đối với nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Nồng độ
đường 1 đến 3 % được sử dụng phổ biến. Nồng độ đường sucrose cao hơn 3 % tỏ ra
độc ở một số trường hợp (Rublue và Kartha, 1985). Chong và Pua (1985) đã sử dụng
sucrose, glucose, fructose và sorbitol nồng độ từ 1 đến 7 % trong nuôi cấy đỉnh sinh
trưởng giống táo Ottawa 3 và thấy rằng nồng độ sucrose 3% là tối ưu cho sinh trưởng,
100% chồi tạo rễ và chất lượng cây con khỏe mạnh.
Trạng thái vật lý của môi trường cũng có ý nghĩa quan trọng trong nuôi cấy
đỉnh sinh trưởng. Đa số các trường hợp người ta sử dụng môi trường agar nhưng khi
nuôi cấy đỉnh sinh trưởng một số loài, môi trường lỏng tỏ ra tốt hơn (Mellor và Stace
Smith, 1969).
14


Nồng độ các chất kích thích sinh trưởng thấp trong môi trường có thể làm giảm
các biến dị tế bào soma (Grosser và Gmitter, 1990). Tế bào mô sẹo phôi hoá ở cây có
múi có thể nuôi cấy và bảo quản lâu dài trong môi trường không có chất kích thích
sinh trưởng.

Người ta nhấn mạnh tầm quan trọng của việc sử dụng auxin và cytokinin trong hệ
thống vi nhân giống, sự phối hợp của 2,4-D và NAA có ảnh hưởng đến sự hình thành
mô sẹo cũng như tái sinh cây. GA (Gibberellic acid) được sử dụng trong môi trường
nuôi cấy để kích thích vươn thân, đặc biệt trong trường hợp có hàm lượng cytokinin
cao dẫn đến hình thành các cụm chồi có cấu trúc đặc.
Thành phần chất khí trong bình nuôi cấy có ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây
in vitro. Khí O2, CO2 và etylen là những chất được khảo sát nhiều. Khí carbonic có thể
bị giới hạn trong bình nuôi cấy và sử dụng nắp bình có lổ thông khí. Sử dụng bình có
bổ sung CO2 và làm giàu CO2 trong phòng dưỡng cây có thể hạ giá thành vi nhân
giống. Giàu CO2 và cường độ ánh sáng cao giúp cho quá trình quang hợp xảy ra nhanh
hơn và nâng cao tốc độ vi nhân giống. Khí oxi có giới hạn trong nuôi cấy mô. Etylen
xem như là chất làm giảm sinh trưởng trong nuôi cấy mô. Auxin hưởng đến sự phóng
thích etylen, nâng cao hàm lượng etylen làm giảm sinh trưởng mô sẹo.
2.6.3. Loại mẫu nuôi cấy
Có hai tác nhân làm hư mẫu nuôi cấy in vitro:
+ Bị virus hay thể giống như virus xâm chiếm, không hoại mẫu nhưng có ảnh
hưởng về sau. Có sự xâm nhiễm của nhiều vi sinh vật như: Agrobacterium, Bacillus,
Erwinia và Pseudomonas vào nhu mô dẫn truyền sự hoại mẫu khi tế bào bắt đầu phân
chia. Sử dụng mẫu nuôi cấy là nhu mô phân sinh đỉnh để giảm tác nhân gây nhiễm.
+ Bị vi sinh vật hủy hoại, có thể khử trùng mẫu trước khi cấy vào môi trường.
Những loại mẫu khi nuôi cấy thường bị vi sinh vật hoại mẫu nên đưa vào trồng
trong môi trường mát và khô vài tuần trước khi lấy mẫu nuôi cấy sẽ giảm sự hoại mẫu.
Sử dụng thuốc kháng sinh, nhằm hạn chế sự hoại mẫu của vi sinh vật như
amphotoricin B, nystelin, kanamicin, vancomicin và penicillin khử được vi khuẩn
Gram (-) Gram(+), nấm mốc… sử dụng từng đơn chất hay phối hợp. Nồng độ khử
trùng 5 đến 100 g/l phụ thuộc vào vật liệu nuôi cấy và loại kháng sinh sử dụng. Mô
thực vật rất nhạy cảm với tác động của kháng sinh và có những phản ứng khác nhau
lên kiểu di truyền do đó nên cẩn thận khi sử dụng (Trần Thị Dung, 2003).
15