NGHIÊN CỨU PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH TRÊN CÂY DẦU MÈ (Jatropha curcas L.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH
TRÊN CÂY DẦU MÈ (Jatropha curcas L.)

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: LÊ THANH VƯƠNG
Niên khóa: 2006 -2010

Tháng 7 năm 2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH
TRÊN CÂY DẦU MÈ (Jatropha curcas L.)

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. NGUYỄN VŨ PHONG

LÊ THANH VƯƠNG

Tháng 7 năm 2010


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn tất khóa luận này tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô,
bạn bè và gia đình. Sau đây tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
▬

Các thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố

Hồ Chí Minh đã giảng dạy và tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận này.
▬

Thạc sỹ Nguyễn Vũ Phong đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ rất nhiều và động viên

tôi trong suốt thời gian làm đề tài.
▬

Các bạn Huỳnh Thanh Khoa, Nguyễn Thị Bích Liễu, Vũ Thị Nguyệt, Ngô Thị Tú

Trinh, Nguyễn Trung Tuyến và tập thể lớp DH06SH đã động viên và giúp đỡ lúc tôi
khó khăn nhất.
Con xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, người đã luôn bên con, cho con niềm
tin và nghị lực để vượt qua mọi khó khăn.

i

TÓM TẮT
Cây dầu mè Jatropha curcas L. là loại cây rất có triển vọng trong việc cung cấp
nguyên liệu để sản xuất và phát triển nhiên liệu sinh học (biofuel). Hiện nay cây này
được tìm thấy ở nhiều nước trên thế giới có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới. Cây có
nhiều ưu điểm như dễ trồng, tính thích nghi rộng rãi, khả năng chống chịu rất tốt, thời
gian sống có thể đến 50 năm. Trồng cây dầu mè trên quy mô lớn là một việc làm cần
thiết để đảm bảo đủ nguồn vật liệu ban đầu cho hướng sản xuất nhiên liệu sinh học.
Tuy nhiên việc nhân giống từ hạt và giâm cành còn nhiều nhược điểm như chất lượng
giống không đồng đều, phụ thuộc vào mùa vụ... Phát sinh phôi vô tính là một hướng
của kỹ thuật nuôi cấy mô có thể khắc phục những nhược điểm đó. Ở Việt Nam, đã
nhân giống in vitro cây dầu mè thành công từ mẫu chồi và hạt, nhưng chưa thấy công bố
nào về phát sinh phôi vô tính cây dầu mè. Do đó đề tài “Nghiên cứu phát sinh phôi vô
tính trên cây dầu mè (Jatropha curcas L.)” được thực hiện với mục đích tìm ra quy trình
phát sinh phôi vô tính, tạo nguồn nguyên liệu ban đầu cho nhân giống in vitro cây dầu
mè với số lượng lớn và cho các nghiên cứu tiếp theo như chuyển gen, công nghệ hạt
nhân tạo...
Sau thời gian nghiên cứu 4 tháng, ghi nhận kết quả như sau: môi trường tạo mô sẹo
tốt nhất là môi trường MS bổ sung 0,2 mg/L IBA và 1 mg/L BA; mẫu cấy lá và cuống lá
đáp ứng tạo mô sẹo tốt hơn mẫu thân; môi trường MS bổ sung BA hoặc TDZ với nồng
độ 1 mg/L hoặc 1,5 mg/L riêng lẻ hoặc kết hợp với 0,1 mg/L IBA chưa tạo được phôi
sau 1 tháng nuôi cấy mô sẹo.

ii


SUMMARY
Jatropha curcas L. is prospective in providing material to produce and develop
biofuel. It is planted in many tropical and subtropical countries in the world. The
advantages of jatropha are large adaption, good tolerance, easy to plant. Planting
jatropha in large-scale is essential to guarantee initial material for producing biofuel.

However, there are still disadvantages in multiplication such as quatitive seed. Somatic
embryogenesis is a trend of plant tissue culture that can improve these troubles. In
Vietnam, jatropha was successfully multiplicated from shoot and seed, but did not
have any research on jatropha somatic embryogenesis. Somatic embryogenesis is used
to make initial material to raise in vitro jatropha in large-scale and following study
such as gene transformation, artificial seed, etc. Therefore, the study “Research
somatic embryogenesis of Jatropha curcas L.” was carried out to find out somatic
embryogenesis protocol.
After 4 months studying, these results were achieved: suitable medium for callus
induction is MS medium supplemented with 0,2 mg/l IBA and 1mg/l BA; callus from
leaf and stem explant is suitable; after 1 month culture callus on MS medium
supplemented with different concentrations 1 – 1,5 mg/l BA or TDZ alone or
combinate with 0,1 mg/l IBA haven’t formed somatic embryogenesis yet.
Key words: Jatropha curcas L., callus, embryogenesis.

iii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................. i
TÓM TẮT ....................................................................................................................... ii
SUMMARY .................................................................................................................... iii
MỤC LỤC ...................................................................................................................... iv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................ vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG .......................................................................................... vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH ........................................................................................... vii
Chương 1 MỞ ĐẦU......................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................... 1
1.2. Yêu cầu ....................................................................................................................... 2
1.3. Nội dung thực hiện ..................................................................................................... 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 3
2.1. Nuôi cấy mô ............................................................................................................... 3
2.1.1. Khái niệm ................................................................................................................ 3
2.1.2. Các phương pháp nuôi cấy in vitro ......................................................................... 3
2.1.2.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ..................................................................................... 3
2.1.2.2. Nuôi cấy mô sẹo ................................................................................................... 3
2.1.2.3. Phương pháp nuôi cấy tế bào đơn ........................................................................ 4
2.1.2.4. Nuôi cấy tế bào trần .............................................................................................. 4
2.1.2.5. Nuôi cấy tế bào đơn bội ........................................................................................ 4
2.1.3. Tầm quan trọng của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật ................................. 5
2.1.6. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật .......................................... 5
2.2. Nuôi cấy phát sinh phôi vô tính.................................................................................. 6
2.2.1 Khái niệm ................................................................................................................. 6
2.2.2. Ý nghĩa nuôi cấy phát sinh phôi vô tính .................................................................. 6
2.2.3. Sự hình thành phôi vô tính ...................................................................................... 6
2.2.3. Cơ chế sự trở lại trạng thái tế bào có khả năng sinh phôi từ các tế bào soma: ....... 7
2.2.4. Các kiểu phát sinh phôi vô tính ............................................................................... 8

iv


2.2.4.1. Sự phát sinh phôi vô tính bất định ........................................................................ 8
2.2.4.2. Sự phát sinh đa phôi vô tính ................................................................................. 8
2.2.4.3. Sự phát sinh phôi vô tính do cảm ứng .................................................................. 9
2.2.4.4. Nguồn gốc của phôi vô tính.................................................................................. 9
2.2.5. Những nhân tố ảnh hưởng đến sự hình thành phôi vô tính ..................................... 9
2.2.5.1 Mẫu cấy ................................................................................................................. 9
2.2.5.2. Chất điều hòa tăng trưởng .................................................................................. 10
2.2.5.3. Môi trường nuôi cấy ........................................................................................... 12
2.2.5.4. Nguồn carbohydrate ........................................................................................... 13

2.2.5.5. Sự tương quan giữa độ tuổi của mẫu cấy và sucrose ......................................... 13
2.2.5.6. Thời gian xử lý ................................................................................................... 13
2.2.5.7. Kiểu gene và đặc điểm của mẫu cấy .................................................................. 13
2.2.5.8. Điều kiện môi trường chiếu sáng ....................................................................... 14
2.2.6. Nuôi cấy phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo ............................................................ 14
2.2.6. Những vấn đề thường gặp trong quá trình phát sinh phôi vô tính ........................ 15
2.3. Giới thiệu về cây dầu mè (Jatropha curcas L.) ........................................................ 16
2.3.1. Đặc điểm sinh học ................................................................................................. 16
2.3.1.1. Mô tả ................................................................................................................... 17
2.3.1.2. Điều kiện sinh trưởng và phát triển .................................................................... 17
2.3.1.3. Ưu thế của cây dầu mè ....................................................................................... 17
2.3.1.4. Nguồn gốc cây dầu mè ....................................................................................... 18
2.3.2. Công dụng.............................................................................................................. 18
2.3.3. Thành phần và đặc tính dầu hạt dầu mè ................................................................ 19
2.3.4. Dầu mè và nhiên liệu sinh học .............................................................................. 20
2.3.5. Ảnh hưởng của môi trường đến năng suất hạt ...................................................... 20
2.3.6. Nhân giống ............................................................................................................ 21
2.3.6.1. Phương pháp nhân giống cổ truyền .................................................................... 21
2.3.6.2. Phương pháp nhân giống hiện đại ...................................................................... 22
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................... 24
3.1. Vật liệu ..................................................................................................................... 24
3.1.1. Thời gian và địa điểm ............................................................................................ 24
3.1.2. Đối tượng thí nghiệm............................................................................................. 24
v


3.1.3. Trang thiết bị và dụng cụ ....................................................................................... 24
3.1.4. Hoá chất ................................................................................................................. 24
3.1.4. Điều kiện nuôi cấy ................................................................................................. 26
3.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 26

3.2.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên sự tạo mô sẹo................................ 26
3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của loại mẫu cấy lên sự tạo mô sẹo ...................................... 27
3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng tạo phôi vô tính ....... 28
3.3. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................................ 28
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 29
4.1. Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng lên sự tạo mô sẹo ......................................... 29
4.3. Ảnh hưởng của mẫu cấy lên sự tạo mô sẹo .............................................................. 31
4.4. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên khả năng tạo phôi vô tính .............................. 33
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................... 34
5.1. Kết luận..................................................................................................................... 34
5.2. Đề nghị ..................................................................................................................... 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................. 35
PHỤ LỤC

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D: 2,4-dichlorophenoxy acetic acid
BA 6-benzyladenine
DNA: deoxyribo nucleic acid
IBA: indole-3-butyric acid
MS: Murashige and Skoog
MT: Murashige and Tucker
NAA: α-naphtalene acetic acid
TDZ: thidiazuron (N-phenyl-N-1,2,3-thidiazon-5-ylurea)

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Đặc điểm hóa lý dầu hạt dầu mè .................................................................... 19
Bảng 3.1 Các loại môi trường tạo mô sẹo ..................................................................... 26

Bảng 3.2 Loại mẫu cấy và thành phần môi trường ........................................................ 27
Bảng 3.3 Thành phần môi trường .................................................................................. 28
Bảng 4.1 Thời gian xuất hiện mô sẹo ............................................................................ 29
Bảng 4.2 Bảng trọng lượng trung bình của mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy ....................... 30
Bảng 4.3 Thời gian xuất hiện mô sẹo ............................................................................ 31
Bảng 4.4 Trọng lượng mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy........................................................ 32

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Các giai đoạn phát triển của phôi vô tính ......................................................... 8
Hình 2.2 Cây dầu mè ..................................................................................................... 16
Hình 2.3 Hoa, quả và hạt dầu mè ................................................................................... 18
Hình 3.1 Mẫu lá, cuống lá và thân ................................................................................ 27
Hình 4.2 Mô sẹo từ mẫu cuống lá ................................................................................. 30
Hình 4.3 Mô sẹo từ các loại mẫu cấy ........................................................................... 32

vii


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Với sự phát triển kinh tế - xã hội mạnh mẽ như hiện nay, thế giới
đang phải đối mặt với vấn đề an ninh năng lượng. Nguồn năng lượng hóa
thạch đang đứng trước nguy cơ cạn kiệt.
Cho đến nay, dầu mỏ vẫn đóng vai trò vô cùng quan trọng trong việc cung cấp năng
lượng cho thế giới, nên khi các mỏ dầu có nguy cơ cạn kiệt, nhiều nguồn năng lượng thay
thế đã được đề xuất. Trước tiên phải kể đến than đá. Than đá còn trữ lượng cũng khá lớn.
Nhưng loại năng lượng này có hại cho môi trường do thải ra nhiều khí độc hại. Pin nhiên
liệu hydro, hiện được xem là lựa chọn độc đáo thay thế dầu lửa. Loại pin này chứa hỗn
hợp hóa học hydro và oxy, cung cấp năng lượng sạch, lâu bền và có thể tái sử dụng. Tuy
nhiên hiện nay, giá thành sản xuất loại nhiên liệu này vẫn còn đắt.

Như vậy, để đảm bảo an ninh năng lượng, ngoài việc mỗi quốc gia cần phải sử
dụng tiết kiệm nguồn năng lượng hiện có, bên cạnh đó cần phải tìm ra nguồn năng
lượng mới có thể tái tạo, thân thiện với môi trường, hiệu quả kinh tế cao đáp ứng được
mục tiêu phát triển bền vững.
Năng lượng sinh học là một nguồn năng lượng thay thế đáp ứng được những đòi
hỏi đó, và đã được chú trọng phát triển từ những năm 1980, bao gồm hai sản phẩm
chính là ethanol và dầu diessel sinh học. Dầu diessel sinh học có lợi thế hơn ethanol vì
không làm ảnh hưởng xấu đến an ninh lương thực. Cây dầu mè (Jatropha curcas L.)
như là giải pháp hữu hiệu về nguyên liệu sản xuất diessel sinh học, do cây dễ trồng
và chống chịu tốt, hạt dầu mè có hàm lượng dầu cao, phổ biến từ 35 -40% (NIIR
Board of consultans and Engineers, 2006), loại dầu này thân thiện với môi trường
do không chứa lưu huỳnh.
Ở Việt Nam, cây dầu mè được nhập vào từ rất lâu song cây này vẫn chỉ được trồng
phân tán làm bờ rào ở các gia đình nông thôn và gần đây mới được trồng tập trung.
Trong một vài năm gần đây đã có những nghiên cứu bước đầu về giống, kỹ thuật trồng
và chiết xuất dầu loài cây này. Ngày 19/6/2008, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông
thôn đã có quyết định 1842/QĐ – BNN - LN về phê duyệt đề án “Nghiên cứu, phát triển
và sử dụng sản phẩm cây Cọc rào (Jatropha curcas L.) ở Việt Nam giai đoạn 2008 –

1


2015 và tầm nhìn đến năm 2025”. Đây là yếu tố quan trọng để mở rộng quy mô phát
triển loại cây này.
Tuy nhiên vấn đề cần quan tâm là nguồn giống chất lượng tốt, năng suất cao và số
lượng giống đủ trồng trên quy mô lớn. Nếu chỉ dựa vào nhân giống truyền thống thì
không đáp ứng được, đồng thời có nhiều khuyết điểm như cần một số lượng lớn chồi
làm nguồn vật liệu ban đầu, chiếm diện tích lớn, cây có rễ yếu dễ bị đổ ngã. Hiện nay
nuôi cấy mô tế bào thực vật là công cụ rất tốt cho việc nhân nhanh giống và nghiên cứu

tạo giống mới thông qua gây đột biến, lai protoplast, chuyển gen…Do đó đề tài “Nghiên
cứu phát sinh phôi vô tính trên cây dầu mè Jatropha curcas L.” được thực hiện.
1.2. Yêu cầu
Theo dõi và ghi nhận loại mẫu và tỉ lệ hình thành mô sẹo.
Theo dõi và ghi nhận sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo.
1.3. Nội dung thực hiện
Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên sự tạo sẹo.
Khảo sát sự ảnh hưởng của loại mẫu cấy lên sự tạo sẹo.
Theo dõi và ghi nhận ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sự phát sinh phôi
vô tính từ mô sẹo.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Nuôi cấy mô
2.1.1. Khái niệm
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu
cơ bản và ứng dụng của ngành công nghệ sinh học. Nhờ áp dụng kĩ thuật nuôi cấy mô,
con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần so với tự nhiên. Do
đó tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ, làm rút
ngắn thời gian đưa giống mới vào sản xuất. Hơn nữa dựa vào kĩ thuật nuôi cấy mô có
thể duy trì và bảo quản nhiều giống cây trồng quí hiếm để phục tráng giống cây trồng.
Hệ thống nhân giống vô tính và nuôi cấy mô bắt đầu với một mảnh nhỏ cây trồng
không bị nhiễm vi sinh vật, đặt trong môi trường dinh dưỡng. Chồi mới hay callus mà
mẫu cấy này tạo ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền.
2.1.2. Các phương pháp nuôi cấy in vitro
2.1.2.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Mẫu cấy bao gồm: đỉnh sinh dưỡng, chồi đỉnh, chồi bên, có kích thước khoảng
0,58 - 1 cm. Đây là phương pháp dễ dàng nhất, mẫu sau khi vô trùng và được nuôi cấy

trong môi trường thích hợp cho loại cây đó thì sau một thời gian nuôi cấy tạo thành
một hay nhiều chồi. Sau đó, nuôi cấy trong môi trường có bổ sung chất kích thích sinh
trưởng thì sẽ tạo thành nhiều chồi, rễ, tạo thành cây hoàn chỉnh.
2.1.2.2. Nuôi cấy mô sẹo
Mẫu cấy là những tế bào đỉnh sinh trưởng hay nhu mô được tách ra nuôi cấy trong
môi trường giàu auxin thì mô sẹo được hình thành. Mô sẹo là những tế bào không
phân hóa, thường được tạo ra do quá trình tạo cơ quan, nhất là trong sự tạo rễ. Sự tạo
mô sẹo in vitro, nhờ auxin, thuộc một trong 3 quá trình: sự phản phân hóa của tế bào
nhu mô hoặc sự phân chia của tế bào tượng tầng hoặc sự xáo trộn của các mô phân
sinh sơ khởi. Khối mô sẹo này có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong môi
trường không có chất kích thích sinh trưởng tạo mô sẹo. Nuôi cấy mô sẹo thường được
thực hiện đối với những cây không có khả năng nuôi cấy từ đỉnh sinh trưởng. Cây tái
sinh từ mô sẹo có nhiều chồi hơn so với cây tái sinh từ đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên
mức độ biến dị tế bào soma của phương pháp này rất cao. Mô sẹo được cảm ứng phát
sinh chồi bất định hay phôi vô tính, ít có giá trị trong nhân giống do tần số biến dị cao.
3


2.1.2.3. Phương pháp nuôi cấy tế bào đơn
Những khối sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng, đặt trong máy lắc thì khối
sẹo dưới tác dụng cơ học và hóa học sẽ tách ra nhiều tế bào đơn lẻ gọi là tế bào đơn.
Những tế bào đơn này nuôi cấy trong môi trường đặc biệt thì sẽ tăng sinh khối. Tuy
nhiên trong nhiều trường hợp không cần thiết phải trải qua giai đoạn mô sẹo, mà trực
tiếp sử dụng tế bào nguyên thủy của mẫu cấy để nuôi cấy tế bào đơn thì sẽ nhanh và
tiết kiệm chi phí rất nhiều (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006). Tế bào
đơn được ứng dụng rộng rãi trong việc nuôi cấy để thu nhận các hợp chất thứ cấp.
Hoặc tái sinh cây con hoàn chỉnh thông qua sự phát sinh mô sẹo trên môi trường thạch.
Trong chọn giống cây trồng người ta dựa vào phương pháp này để tạo ra giống mới
bằng cách gây đột biến tế bào đơn bằng hóa chất hay phóng xạ.
2.1.2.4. Nuôi cấy tế bào trần

Tế bào trần (protoplast) là tế bào thực vật bị loại vách bởi một xử lý enzym. Đó là
các tế bào tự do, cô lập, không định hướng, vì không còn chịu sự tương quan trong hệ
thống thực vật (Bùi Trang Việt, 2000). Tế bào trần có khả năng cho phôi vô tính và mở
ra mô hình rất hấp dẫn để theo dõi các quá trình sinh phôi thể hệ từ một tế bào cô lập.
Tế bào trần còn có khả năng tiếp nhận một đoạn DNA hoặc toàn bộ DNA lạ. Khi nuôi
cấy trong môi trường dinh dưỡng thích hợp, các môi trường thường có auxin và
cytokinin nó có thể tái sinh vách tế bào và bắt đầu phân chia. Trong chọn giống cây
trồng người ta lợi dụng hai đặc điểm này để cải tiến giống cây trồng bằng cách cho
dung hợp hai tế bào trần cùng loài hoặc khác loài (do khả năng tiếp nhận không chọn
lọc các vật chất di truyền), đồng thời có thể áp dụng các kỹ thuật chuyển gen vào tế
bào trần (tiêm DNA, hóa thẩm, điện thẩm…). Ngoài ra, chúng ta có thể hoàn toàn nuôi
cấy tế bào trần để thu nhận các sản phẩm thứ cấp giống như nuôi cấy tế bào đơn.
2.1.2.5. Nuôi cấy tế bào đơn bội
Tế bào đơn bội là những tế bào mang bộ nhiễm sắc thể giảm đi một nửa so với tế
bào nguyên thủy. Cây đơn bội được tạo ra từ việc nuôi cấy túi phấn hoặc hạt phấn theo
hai cách: phôi phân hóa trực tiếp từ hạt phấn và phát triển thành cây hoàn chỉnh (trực
tiếp); hoặc hạt phấn phải qua giai đoạn mô sẹo sau đó hình thành phôi hay chồi bất
định rồi phát triển thành cây hoàn chỉnh (gián tiếp). Việc tạo ra thể đơn bội rồi sau đó
nhân đôi số lượng nhiễm sắc thể của các thể đơn bội để tạo ra các cá thể nhị bội đồng
hợp tử giúp rút ngắn thời gian trong các nghiên cứu về di truyền và chọn giống.
4


2.1.3. Tầm quan trọng của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật
Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật có ý nghĩa vô cùng to lớn trong việc
nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời có giá trị đóng góp trực tiếp trong thực
tiễn sản xuất và đời sống.
• Về mặt lý luận sinh học cơ bản
Nuôi cấy mô đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc về bản chất
của sự sống.

o

Thông qua nuôi cấy mô và tế bào, chúng ta có thể tiến hành so sánh những đặc tính

của cơ thể với các hợp phần của chúng khi tách rời khỏi cơ thể; từ đó rút ra quy luật về
mối tương quan của các bộ phận trong cây.
o

Kỹ thuật nuôi cấy mô giúp chúng ta phân biệt được từng giai đoạn theo chu kỳ

phát triển của cá thể một cách cụ thể và chính xác. Điều này tạo thuận lợi cho việc
nghiên cứu các quy luật sinh trưởng, phát triển cùng với mối quan hệ của thực vật
với môi trường bên ngoài. Từ đó có thể thúc đẩy cây trồng phát triển theo chiều
hướng mong muốn.
o

Bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào, chúng ta có thể tìm hiểu và tiến hành

nghiên cứu mối quan hệ khởi đầu giữa kí sinh và kí chủ. Như vậy nhiều vấn đề bệnh lý
được giải quyết một cách cơ bản.
• Về mặt thực tiễn sản xuất
o

Phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để phục tráng và nhân nhanh các giống

cây trồng quý có giá trị kinh tế cao.
o

Kiểm soát được dịch bệnh cây trồng do ta hoàn toàn có thể loại bỏ những cá thể

nhiễm bệnh hay mang mầm bệnh.
o

Kiểm soát được chất lượng giống thông qua kiểm soát kiểu gen của

giống đem vào sản xuất.
o

Kiểm soát được toàn bộ kỹ thuật từ khâu nhân giống đến khâu thu hoạch.

o

Tạo ra sự đồng loạt về giống, từ đó tạo ra sự đồng loạt về sản phẩm.

2.1.6. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật
Theo Bajai (1968) một số cây trồng sản xuất qua nuôi cấy mô đã được tiêu thụ trên
thị trường với giá hàng triệu dollas. Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật bậc cao để cải thiện
cây trồng bao gồm những ứng dụng:
o

Nhân giống vô tính với tốc độ nhanh.
5


o

Tạo cây trồng sạch bệnh và kháng bệnh.

o

Cảm ứngs và tuyển lựa dòng đột biến.

o

Sản xuất cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn.

o

Lai xa qua môi trường nuôi cấy phôi và noãn.

o

Tạo dòng lai xa soma và lai tế bào trần (protoplast).

o

Cố định nitrogen.

o

Cải thiện hiệu quả quang tổng hợp.

o

Bảo quản các nguồn gen (Trần Thị Dung, 2001).

2.2. Nuôi cấy phát sinh phôi vô tính
2.2.1 Khái niệm
Phôi vô tính, phôi soma, phôi sinh dưỡng hay phôi thể hệ đều là cùng một khái
niệm để mô tả một cấu trúc lưỡng cực bất định bao gồm cực chồi và cực rễ, mà dưới

những điều kiện thích hợp thì có thể phát triển thành một cơ thể có chức năng hoàn
chỉnh. Sự hình thành phôi vô tính được coi là một con đường phát triển riêng biệt khác
với con đường phát sinh cơ quan chồi và rễ.
Phôi vô tính rất giống phôi hữu tính (zygotic embryo) ở hình thái, quá trình phát
triển, và sinh lý, nhưng không phải là sản phẩm của sự thụ tinh giữa giao tử đực và
giao tử cái, và vì vậy không có quá trình tái tổ hợp di truyền (genetic recombination),
các phôi vô tính có nội dung di truyền giống hệt với các tế bào soma đã sinh ra nó, nếu
các tế bào này được chuyển gene thì các cây tái sinh là cây chuyển gene.
2.2.2. Ý nghĩa nuôi cấy phát sinh phôi vô tính
Phát sinh phôi vô tính giúp cho công tác vi nhân giống và sản xuất với số lượng lớn
thực vật bằng bioreactor, là kỹ thuật đầy hứa hẹn để nhân giống thực vật và có tiềm năng
sinh trưởng cao và khả năng tối thiểu hóa hay loại bỏ nguy cơ xuất hiện các biến dị. Phôi
vô tính là nguyên liệu cho việc chuyển gen ở thực vật và công nghệ tạo hạt nhân tạo.
Đồng thời kỹ thuật này mở ra nhiều triển vọng mới trong công nghệ nuôi cấy tế bào.

2.2.3. Sự hình thành phôi vô tính
Sự sinh phôi từ tế bào soma là một quá trình, qua đó một hay vài tế bào soma,
trong các điều kiện thực nghiệm (bao gồm việc sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng
thực vật), có thể dấn thân vào một sự phân chia theo một trật tự nhất định để cho một
phôi, theo kiểu giống hay gần giống kiểu sinh phôi từ hợp tử (Bùi Trang Việt, 1994).
Sự hình thành phôi vô tính có thể qua 2 con đường: trực tiếp và gián tiếp.
6


o

Phôi soma trực tiếp: được hình thành từ một tế bào hay một nhóm tế bào mà không

qua giai đoạn tạo callus. Trường hợp này mô cấy có các PEDC (pre - embryogenic
dertermined cell), là những tế bào đã có sẵn chương trình của các gen sinh phôi.

o

Phôi soma gián tiếp: được hình thành chủ yếu từ callus. Do các mô cấy là những tế

bào đã phân hóa không còn khả năng sinh phôi, chúng phải trải qua nhiều lần phân
chia tế bào liên tiếp dưới sự cảm ứng của auxin trong suốt quá trình để được tái lập
trình đi vào con đường sinh phôi (Bùi Trang Việt, 2002).
Sự hình thành phôi trải qua hai bước:
o

Sự biệt hóa các tế bào có khả năng phát sinh phôi thành tế bào phôi. Các tế bào có

khả năng sinh phôi có các đặc tính cơ bản sau: tế bào có kích thước nhỏ, đẳng kính, có
hoạt động biến dưỡng rất mạnh mẽ, cường độ tổng hợp acid ribonucleic cao, nhân và
hạch nhân rất to và đậm màu, đặc biệt là các tế bào này có một lượng lớn các
ribosome, ty thể, hạt tinh bột và có mạng lưới nội chất nhỏ (Ammirato, 1987; Emons,
1994; Thorpe, 1988).
o

Sự phát triển của những tế bào phôi mới hình thành.
Trong quá trình sinh phôi soma của hệ thống huyền phù tế bào cà rốt, người ta ghi

nhận được 4 pha (Fujimura và Komamin, 1980):
o

Pha thứ nhất bắt đầu khi những tế bào đơn hình thành những cụm tế bào có khả

năng sinh phôi trên môi trường có auxin.
o

Pha thứ hai xảy ra khi những cụm tế bào có khả năng sinh phôi này được chuyển

sang môi trường không có auxin. Trong pha này các tế bào tăng sinh chậm và dường
như không có biệt hóa.
o

Pha thứ ba có sự phân bào xảy ra nhanh ở một số cụm tế bào dẫn đến sự hình thành

những phôi hình cầu.
o

Pha thứ tư cây con in vitro phát triển từ phôi hình cầu đã qua giai đoạn phôi hình

trái tim và hình cá đuối.
2.2.3. Cơ chế của sự trở lại trạng thái tế bào có khả năng sinh phôi từ các tế bào
soma:
Trong giai đoạn đầu mô được nuôi cấy trong môi trường có auxin, auxin sẽ khử
phân hóa và làm mất tính hữu cực của tế bào và kích thích chúng phát triển không cân
xứng sau đó.

7


Tiếp đến, mô sẹo trong giai đoạn đầu được chuyển vào môi trường không có hoặc
ít auxin. Trong môi trường này tính hữu cực và sự sinh phôi được cảm ứng với trạng
thái phôi từ hình cầu đến hình tim và trạng thái hình thủy lôi.

Hình 2.1 Các giai đoạn hình thành phôi vô tính
2.2.4. Các kiểu phát sinh phôi vô tính
2.2.4.1. Sự phát sinh phôi vô tính bất định

Các phôi vô tính có thể phát triển từ các tế bào hay các mô sẹo có liên quan của
một số loài thực vật nhiệt đới. Các phôi bất định có thể được tạo trực tiếp từ tế bào đơn
trên bề mặt của phôi non hoặc gián tiếp từ bề mặt của phôi non này.
Phương pháp này được sử dụng trong chương trình di truyền cải tạo giống, chẳng
hạn như: cứu các phôi bị chết non do lai tạo.
2.2.4.2. Sự phát sinh đa phôi vô tính
Hiện tượng này xảy ra khi nuôi cấy các noãn non của thực vật hạt trần. Các khối
mô có khả năng tạo phôi cao, khi được cấy chuyển sang môi trường mới sẽ phát triển
và tăng trưởng thành phôi. Mô có khả năng phát triển thành phôi có thể được phân biệt
với mô không có khả năng phát triển thành phôi do màu trắng của phôi và hóa đỏ khi
nhuộm bằng acetocarmine. Dưới ánh đèn tử ngoại các tế bào phôi có thể phát huỳnh
quang màu xanh lá cây.

8


2.2.4.3. Sự phát sinh phôi vô tính do cảm ứng
Hiện tượng này do sự nuôi cấy lỏng các tế bào và mô sẹo sau khi các mô này chịu
các xử lý đặc biệt đem lại sự cảm ứng khả năng tạo phôi. Người ta đã thực hiện nhiều
nghiên cứu trên nhiều loài thực vật ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau để quan sát khả
năng tạo thành mô sẹo. Trong quá trình phát triển mô sẹo thường xuất hiện 2 loại tế
bào: tế bào xốp (thường khó tái sinh), tế bào chắc (khả năng tái sinh cao). Ở cây dầu
mè, bề mặt mô sẹo tạo phôi có nhiều khối u và có màu kem (Timir baran Jha, 2007).
2.2.4.4. Nguồn gốc của phôi vô tính
Phôi vô tính có nguồn gốc từ một tế bào hay nhiều tế bào vẫn còn là vấn đề chưa
được biết rõ. Một giả thuyết cho rằng mô PEDC (pre – embryogenic determined cell)
sẽ tạo thành phôi có nguồn gốc từ nhiều tế bào, trong khi phôi vô tính thứ cấp có
khuynh hướng là từ tế bào đơn. Hartweck và ctv (1998) nhận thấy rằng phôi vô tính có
nguồn gốc từ một nhóm tế bào của lá mầm phôi hợp tử cây đậu nành, trong khi Polito
và ctv (1989) lại phát hiện phôi phát triển từ phôi vô tính cây đậu nành ở giai đoạn

hình cầu có nguồn gốc từ tế bào đơn. Quan điểm của Edward, 1995 cho rằng các hệ
thống tạo phôi vô tính không thông qua giai đoạn mô sẹo thì phôi vô tính sinh ra có
nguồn gốc từ một tế bào (trích dẫn bởi Dương Tấn Nhựt, 2007).
Khi một tế bào được quyết định để trở nên sinh phôi thì không phải tất cả các tế
bào có khả năng sinh phôi đều phát triển thành phôi vô tính, mà chỉ những tế bào nào
chiếm ưu thế hơn thì mới phát triển thành phôi vô tính. Trong quá trình nuôi cấy, sự
tương tác với các tế bào xung quanh có thể làm ảnh hưởng đến khả năng tạo phôi cũng
như sự phát triển của phôi vô tính.
2.2.5. Những nhân tố ảnh hưởng đến sự hình thành phôi vô tính
Sự hình thành phôi vô tính là một quá trình chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như:
nguồn gốc và tuổi của mẫu cấy, nồng độ và loại chất kích thích sinh trưởng được sử
dụng, môi trường nuôi cấy, nguồn carbohydrate, điều kiện ánh sáng và nhiệt độ…
2.2.5.1 Mẫu cấy
Mỗi loại mẫu cấy có khả năng cảm ứng tạo phôi khác nhau. Thường những tế bào
còn non có khả năng tạo phôi vô tính nhanh và tốt hơn. Tùy mục đích nuôi cấy mà
chọn lựa các bộ phận, các giai đoạn phát triển của cây trồng cho phù hợp. Độ dày của
mẫu cấy cũng là yếu tố có ảnh hưởng đến hiệu quả cảm ứng phát sinh phôi vô tính ở
cây Lily (Lilium longiflorum), các mẫu cấy có độ dày 0,8 - 1,0 mm cho số lượng phôi
9


vô tính cao hơn so với các mẫu cấy có độ dày lần lượt là 0,5 - 0,7 mm và 1,2 - 1,5 mm
(Dương Tấn Nhựt và ctv 2002).
2.2.5.2. Chất điều hòa tăng trưởng
Chất điều hòa tăng trưởng có vai trò rất quan trọng trong quá trình nuôi cấy một
đối tượng nào đó. Đối với quá trình tạo phôi vô tính, nó giữ một vị trí rất quan trọng
trong việc cảm ứng tạo phôi và mỗi chất điều hòa tăng trưởng thì lại có những tác
dụng lên việc tạo phôi khác nhau trên những loài thực vật khác nhau, và ở những nồng
độ khác nhau, điều đó cho thấy có 3 kiểu ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng đối
với phôi:

•

Sự hiện diện của chất điều hòa tăng trưởng là cần thiết trong tất cả các giai đoạn

phát triển của phôi.
•

Chất điều hòa tăng trưởng cần thiết trong giai đoạn cảm ứng, tuy nhiên, sang

giai đoạn phát triển cao hơn thì các chất điều hòa này cần phải được loại bỏ.
•

Sự hình thành phôi vô tính chỉ xuất hiện khi có sự có mặt của chất điều hòa

tăng trưởng, nhưng khi phôi vô tính phát triển sau giai đoạn hình cầu thì sự có mặt của
các chất điều hòa không còn tác dụng nữa.
Auxin và cytokinin là hai chất điều hòa sinh trưởng quan trọng nhất trong việc nuôi
cấy phát sinh phôi vô tính.
Auxin
Đây là yếu tố cần thiết cho sự phát triển phôi, nó có ảnh hưởng khác nhau lên các giai
đoạn khác nhau trong quá trình sinh phôi. Sự hiện diện của auxin cần thiết cho sự thành
lập các tế bào hay nhóm các tế bào có khả năng sinh phôi từ các tế bào cô lập. Tuy nhiên
auxin lại cản sự sinh phôi ở các pha tiếp theo (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên,
2006). Auxin thường thúc đẩy nhanh sự phân chia tế bào và thường tạo tế bào xốp (Evans
và ctv, 1981). Trong pha đầu tiên, auxin có tác dụng kích thích mô tăng sinh nhanh, hình
thành tế bào hay cụm tế bào bị khử phân hóa và mất tính hữu cực. Sau đó lượng auxin sẽ
được giảm hoặc loại bỏ, tính hữu cực của tế bào được cảm ứng trở lại bắt đầu cho sự hình
thành phôi vô tính. Khi một tế bào phôi được thu nhận, sự có mặt của auxin sẽ gây tổn hại
đến sự phát triển bình thường của tế bào phôi vô tính (Halperin và Wetherell, 1964). 2,4D và NAA là hai loại auxin thường được sử dụng hơn 50% và 25% trường hợp cảm ứng
tạo phôi (Evans và ctv, 1983; Litz và Gray, 1992).

10


Một trong những nguyên nhân làm cho auxin có tác dụng đáng kể trong sự phát
sinh phôi là do nó có ảnh hưởng lên sự biểu hiện gene, làm ngừng lại các kiểu biểu
hiện gene tại thời điểm đó của mô cấy để thay thế bằng một chương trình sinh phôi.
Một trong những cơ chế có thể cho phép làm ngưng các biểu hiện của gene là methyl
hóa DNA (Dương Tấn Nhựt, 2007).
Cytokinin
Là chất điều hòa sinh trưởng cần thiết ở một số loài thực vật. nhu cầu cytokinin có
tính chuyên biệt đối với từng loài cũng như từng giai đoạn. nồng độ cytokinin cũng
thay đổi khác nhau trong từng giai đoạn.
Sử dụng cytokinin riêng lẻ để tạo phôi vô tính từ phôi hợp tử non cũng đạt được
những thành công trên các loài, bao gồm cả thực vật hạt kín và thực vật hạt trần
(Dương Tấn Nhựt, 2007). Mặc dù vậy, sự kết hợp của cả auxin và cytokinin cho thấy
nhiều thuận lợi để đạt được hiệu quả cảm ứng phôi tối đa trên một số loài (Cruz và ctv,
1990; Nishi, 1997). Ở Daucus carota cytokinin có vai trò kích thích sự phân chia tế bào
ở pha 2. Tuy nhiên hiện nay, chưa thấy có những nghiên cứu nào về cơ chế tác động
của cytokinin trong cảm ứng tạo phôi. Đã có nhiều nghiên cứu sử dụng TDZ, chất điều
hòa tăng trưởng thuộc nhóm cytokinin, nhằm mục đích cảm ứng tạo phôi vô tính ở một
số thực vật hai lá mầm (Murthy và ctv,1998). Vì vậy trong những năm gần đây việc sử
dụng TDZ đã trở nên phổ biến hơn. Đối với cây hoa lily có thể tạo phôi trực tiếp trên
môi trường MS bổ sung 0,2 mg/l TDZ và 1 mg/l NAA thông qua nuôi cấy lớp mỏng tế
bào của củ con in vitro sau 2 tháng nuôi cấy (Dương Tấn Nhựt và ctv, 2006).
Ngoài ra, acid abscisis cũng có vai trò đáng kể trong nuôi cấy tạo phôi vô tính. Nó
cần thiết cho sự phát triển bình thường của phôi vô tính, và cấu trúc của phôi vô tính
giống với phôi hợp tử. Tuy nhiên acid abscisis có thể làm giảm sự tăng trưởng của
phôi kể từ sau giai đoạn phôi hình tim. Khi phôi đã đạt đến tuổi trưởng thành thì lượng
acid abscisis nội sinh và ngoại sinh trong phôi thường tăng lên (Nguyễn Đức Lượng và

Lê Thị Thủy Tiên, 2006).
Môi trường không có hormone thường được sử dụng cho sự phát triển của phôi vô
tính từ dạng hình cầu cho tới khi phát triển thành cây con. Đôi khi, những nồng độ
thấp của hormone trong môi trường cần cho sự biểu hiện hoặc cho môi trường cần cho
sự phát triển thì có thể có lợi, thậm chí là bắt buộc phải có, tùy theo loài, để kích thích
sự phát triển bình thường của phôi.
11


Tóm lại, để cảm ứng tạo một cấu trúc lưỡng cực cần phải có tín hiệu của một loại
hormone. Ngược lại, để cảm ứng tạo cơ quan thì phải có 2 tín hiệu hormone khác
nhau: đầu tiên là tạo chồi, sau đó tạo rễ, sử dụng hai môi trường khác nhau. Để những
tế bào phôi phát triển bình thường thành những cây con thì cần một môi trường khác,
có hoặc không có hormone.
2.2.5.3. Môi trường nuôi cấy
Gần 70% các nghiên cứu thành công đều nhờ vào sử dụng môi trường MS với hàm
lượng muối khoáng cơ bản (Ammirato, 1983; Thorpe, 1988), vì môi trường này có
chứa hàm lượng nitrate và ammonia cao. Tỉ lệ giữa muối nitrat và ammonia trong môi
trường rất quan trọng trong việc cảm ứng tạo phôi (Niedz,1994). Sucrose là một loại
đường thường được dùng để cung cấp carbohydrat cho sự phát sinh phôi nhất. Sucrose
tốt hơn glucose và fructose trong việc cảm ứng tạo phôi từ mô sẹo của citrus, trong khi
galactose và lactose tốt hơn sucrose. Người ta còn thấy rằng sucrose và auxin có mối
tương tác với nhau (Dương Tấn Nhựt, 2007). Khi môi trường dinh dưỡng không thích
hợp, phôi non có thể ngừng sinh trưởng và có thể chết hay tạo mô sẹo không biệt hóa
hay nẩy mầm khi chưa thuần thục. Polyamine trong môi trường dinh dưỡng có hiệu
quả kích thích đến việc hình thành phôi vô tính (Minocha, 1995). Ngoài ra hàm lượng
các hợp chất hữu cơ khác như: nước dừa, đường, glutamine, casein, tinh chất mạch
nha, photphat, amino acid…có ảnh hưởng rất lớn đến sự hình thành phôi.
Trong nuôi cấy tạo phôi cây có múi thì môi trường MT là môi trường nuôi cấy
thích hợp.

Nồng độ của môi trường: nồng độ của các thành phần trong môi trường cơ bản có
ảnh hưởng đến việc cảm ứng tạo phô vô tính. Hầu hết các nghiên cứu tạo phôi trên môi
trường MS đều cho hiệu quả tạo phôi cao. Nồng độ môi trường càng loãng thì khả
năng tạo phôi càng kém.
Trạng thái vật lý của môi trường: trong hầu hết các nghiên cứu phát sinh phôi vô
tính thì giai đoạn cảm ứng tạo phôi được tiến hành trên môi trường nuôi cấy lỏng tĩnh
hoặc nuôi cấy lỏng lắc (Dương Tấn Nhựt, 2007). Tuy nhiên, trạng thái của môi trường
(bán rắn hay lỏng) thì rất quan trọng trong việc duy trì và làm tăng cường sự phát triển
của phôi vô tính. Sự cảm ứng tạo phôi vô tính của Gossypium klotzschiapum trên môi
trường MS lỏng có bổ sung vitamin B, có chứa các chất điều hòa tăng trưởng cho thấy

12


đạt hiệu quả cao (Yuqiang Sun và ctv, 2003) ở Lilium longiflorum, kết quả tương tự
cũng được phát hiện (Tripulato và ctv, 1997; Dương Tấn Nhựt và ctv, 2002).
2.2.5.4. Nguồn carbohydrate
Được cung cấp chủ yếu từ sucrose ngoài ra còn từ: galactose, lactose, maltose,
glucose và fructose. Đây là nguồn cung cấp năng lượng chính cho việc nuôi cấy tế bào
trong điều kiện vô trùng. Sự kết hợp những chất trên với sucrose đã đẩy mạnh sự cảm
ứng tạo phôi cũng như sự phát sinh hình thái bình thường của phôi.
2.2.5.5. Sự tương quan giữa độ tuổi của mẫu cấy và sucrose
Thường thì độ tuổi (Wetzstein và ctv, 1989) hay giai đoạn phát triển của mẫu cấy
(Karunaratne và ctv, 1991) là một nhân tố quan trọng trong cảm ứng tạo phôi. Do đó,
sự phát triển tối đa hay độ tuổi sinh lý của mẫu cấy là một nhân tố chủ yếu trong cảm
ứng tạo phôi có hiệu quả ở một số loài thực vật. Hơn nữa, nguồn dinh dưỡng cơ bản
cần thiết (sucrose/cacbonhydrate) cho các loại mô thì khác nhau đáng kể tùy vào độ
tuồi phát triển (Monnier, 1990). Bên cạnh đó, sự ảnh hưởng của các chất kích thích
tăng trưởng khác nhau đến các loại mô khác nhau thì phụ thuộc nhiều vào nồng độ
sucrose có trong môi trường nuôi cấy (Thompson và Thorpe, 1987). Một nồng độ

sucrose cao (4 - 6%) được bổ sung ở giai đoạn cảm ứng và phát triển của phôi thì rất
có lợi cho việc tạo phôi ở một số loài thực vật.
2.2.5.6. Thời gian xử lý
Khoảng thời gian mẫu cấy được xử lý với chất điều hòa tăng trưởng là một nhân
tố quan trọng trong việc cảm ứng cũng như hình thành phôi vô tính một cách bình
thường. Khi mẫu cấy được chuyển sang môi trường không có chất điều hòa tăng
trưởng, một khoảng thời gian tối thiểu là 8 ngày rất cần thiết cho việc cảm ứng hình
thành phôi với một hiệu quả rất cao mà không cần quan tâm đến dạng chất điều hòa
tăng trưởng đã sử dụng.
2.2.5.7. Kiểu gene và đặc điểm của mẫu cấy
Bên cạnh loại mẫu cấy và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng, một số các nhân tố
khác cũng có ảnh hưởng đến quá trình hình thành phôi vô tính, có lẽ quan trọng nhất
đó là kiểu gen của thực vật (Merkle và ctv, 1995). Kiểu gene có một ảnh hưởng to lớn
trong việc cảm ứng tạo phôi của hầu hết các loài thực vật, bởi vì sự cảm ứng hình
thành phôi vô tính liên quan đến con đường di truyền tương tụ như sự hình thành phôi
hợp tử. Do đó sự hình thành phôi vô tính phổ biến ở các thực vật có hạt chứ không
13


phải tất cả các thực vật đều có khả năng cảm ứng tạo phôi (Dương Tấn Nhựt, 2007).
Đối với những cây tự thụ phấn, những giống cây khác nhau thì khả năng phát sinh
phôi vô tính cũng có thể khác nhau. Đã có các thí nghiệm khác nhau tiến hành trên các
loài có kiểu gene khác nhau để khảo sát khả năng hình thành phôi vô tính. Chẳng hạn
như ở cây Asparagus, người ta đã quan sát khả năng tạo phôi vô tính trên các giống có
kiểu gen khác nhau (Hisato và Masahiro, 1998). Delbreil và Julien (1994) đã mô tả
những khác biệt quan sát được từ tần suất tạo phôi từ chồi dỉnh của 12 giống
Asparagus có các kiểu gen khác nhau. Những khác biệt về tần suất hình thành phôi ở
các loài đa bội (lưỡng bội, tứ bội) cũng đã được phát hiện (Kunitake và ctv, 1992).
Haensch và ctv (1996) đã quan sát khả năng hình thành phôi vô tính và tái sinh cây ở
những giống Lilium có kiểu gen khác nhau.

Tuổi sinh lý và giai đoạn phát triển của mô cấy cũng rất quan trọng. Ở cây cỏ ba lá,
những mô non hoặc những mô sinh sản thì việc cảm ứng sinh phôi xảy ra nhanh chóng
hơn những mô trưởng thành. Sức sống của mô cấy cũng ảnh hưởng đến sự tạo phôi. Ở
cây vân sam trắng, khả năng hình thành phôi tỷ lệ nghịch với độ tuổi và khả năng nảy
mầm của hạt sử dụng làm mô cấy.
2.2.5.8. Điều kiện môi trường chiếu sáng
Điều kiện môi trường ánh sáng cũng có ảnh hưởng nhất định đến sự tạo phôi vô
tính. Có những loài có nhu cầu ánh sáng cao nhưng cũng có những loài sự hình thành
phôi chỉ xảy ra trong điều kiện tối hoàn toàn. Việc cảm ứng tạo phôi ở cây họ Cà hoàn
toàn cần ánh sáng (Gleddie và ctv, 1983). Ngược lại cảm ứng tạo phôi ở cây Dương
(Michler và ctv, 1991) và Podophyllum (Arumugan và ctv, 1990) hoàn toàn cần điều
kiện tối.. Nhìn chung, chế độ tối đã cho thấy có những ảnh hưởng tốt hơn trong giai
đoạn cảm ứng. Những điều kiện trong tối có thể được tạo bằng cách bao môi trường
nuôi cấy bằng những tấm nhôm mỏng hoặc đặt chúng trong hộp carton.
Loại ánh sáng xanh hay đỏ sẽ thúc đẩy hoặc ức chế sự tạo phôi. Trong việc tạo
phôi cây cà rốt thì ánh sáng đỏ, ánh sáng xanh lục hoặc tối đều có hiệu quả tương tự
nhau, còn ánh sáng xanh hoặc ánh sáng trắng lại ức chế hiệu quả cảm ứng tạo phôi
(Michler và ctv, 1987).
2.2.6. Nuôi cấy phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo
Mô sẹo là đám tế bào không phân hóa, có đặc tính phân chia mạnh, thường
được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan, nhất là trong sự tạo
14


rễ, hoặc do các điều kiện đặc biệt như vết thương, xử lý chất điều hòa sinh
trưởng (Bùi Trang Việt, 2000).
Mô sẹo sử dụng trong nuôi cấy phát sinh phôi vô tính được cảm ứng với chất điều
hòa sinh trưởng, thường dùng auxin để tạo ra các tế bào có khả năng sinh phôi. Tế
bào có khả năng sinh phôi là những tế bào có kích thước nhỏ, đẳng kính, có hoạt
động biến dưỡng mạnh mẽ, cường độ tổng hợp acid ribonucleic cao, thể tích không

bào giảm, tăng thể tích tế bào chất, nhân và hạch nhân rất to và đậm màu, đặc biệt
các tế bào này có một lượng lớn ribosome, ty thể, hạt tinh bột và có mạng lưới nội
chất nhỏ (Dương Tấn Nhựt, 2007).
2.2.6. Những vấn đề thường gặp trong quá trình phát sinh phôi vô tính
Một vài vấn đề thường gặp trong quá trình phát sinh phôi vô tính ở vài loại thực vật
là sự xuất hiện những phôi dị thường. Các lá mầm có thể bị xoắn lại, mô phân sinh chồi
có thể có hình dạng không bình thường hoặc có thể thiếu. Những trường hợp này cần
phải có những thao tác phụ để thúc đẩy sự xuất hiện bình thường và sự phát triển của
phôi bằng cách sử dụng nồng độ từ thấp đến vừa phải các chất điều hòa tăng trưởng
trong môi trường, sử dụng acid abscisic hoặc những cách xử lý thẩm lọc cao, hay bằng
những phương pháp vật lý khác như sự sấy khô (Ammirato, 1983; Parrott, 1988).

Những thực vật được tái sinh từ nuôi cấy mô sẹo và huyền phù tế bào có thể bị biến
dị về hình thái hoặc biến dị ở phần sinh dưỡng. Tuy nhiên, những trường hợp đó ít
xuất hiện ở những cây được tái sinh bởi sự phát sinh phôi vô tính hơn là những cây
được tái sinh từ sự phát sinh cơ quan (Ammirato, 1987; Reisch, 1983). Nếu những cây
được sử dụng nhân lên, thì việc kiểm tra lại kiểu di truyền là rất quan trọng bằng cách
tiến hành kiểm tra độ hữu thụ và chỉ số di truyền cho những đặc điểm tiêu biểu. Nếu
những cây được sử dụng với mục đích sản xuất thì những kiểu biến dị nên được bỏ đi.
Một điều đáng chú ý nữa là sự phát sinh phôi vô tính và sự phát sinh cơ quan thì
không loại trừ nhau. Ví dụ, cỏ ba lá có thể được tái sinh từ phôi vô tính (Phillips và
Collins, 1984). Tuy nhiên khi nuôi cấy trên môi trường thuận lợi cho sự phát triển chồi
thì cũng tạo ra phôi vô tính, sau đó nuôi cấy trên môi trường thuận lợi cho sự nhân lên
của chồi thì đã tạo ra nhiều cây tái sinh hơn so với khi nuôi cấy bình thường.
Vì vậy những phương pháp làm cho phát sinh phôi và làm tái sinh cơ quan được
kết hợp để làm tối ưu hóa khả năng tái sinh cây. Đôi khi trên cùng môi trường thuận
lợi cho sự phát sinh cực chồi của những phôi vô tính cũng là môi trường thích hợp để
15

tái sinh những hợp tử phôi lai khác loài. Từ đó cho thấy đã có một vài đặc điểm tương
tự giữa phôi hợp tử và phôi vô tính.
2.3. Giới thiệu về cây dầu mè (Jatropha curcas L.)
Vị trí phân loại
Giới: Plantae
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Euphorbiacea
Chi: Jatropha
Loài: curcas

Hình 2.2 Cây dầu mè
Jatropha là tên bắt nguồn từ Hi lạp: iatros (bác sĩ) và trophe (thực phẩm) ngụ ý
dược tính của cây. Theo như Correll (1982) curcas là tên cây dầu mè tại vùng
Malabar, Ấn Độ (Nguyễn Văn Hạnh, 2007).
Ở Việt Nam cây này được gọi là cây dầu mè hay cây cọc rào.

16