PHÁT HIỆN NHÂN TỐ GÂY BỆNH VIÊM NHA CHU Ở Porphyromonas gingivalis BẰNG PHƯƠNG PHÁP REALTIME PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
[\

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÁT HIỆN NHÂN TỐ GÂY BỆNH VIÊM NHA CHU
Ở Porphyromonas gingivalis BẰNG PHƯƠNG PHÁP
REAL-TIME PCR

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: LÊ THỊ THÚY DUNG
Niên khóa: 2006 – 2010

Tháng 7 năm 2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
[\

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÁT HIỆN NHÂN TỐ GÂY BỆNH VIÊM NHA CHU
Ở Porphyromonas gingivalis BẰNG PHƯƠNG PHÁP
REAL-TIME PCR

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. NGUYỄN THỤY DẠ THẢO

LÊ THỊ THÚY DUNG

CN. NGUYỄN DUY KHÁNH

Tháng 7 năm 2010


LỜI CÁM ƠN
Lời cám ơn chân thành nhất xin được gửi đến:
™ Cha mẹ đã nuôi nấng dạy bảo con được như ngày hôm nay.
™ Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ
nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức
cho em trong suốt quá trình học tập tại trường.
™ ThS. Nguyễn Thụy Dạ Thảo và CN. Nguyễn Duy Khánh đã tận tình hướng dẫn
chỉ bảo em thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp.
™ Anh Phan Quốc Việt, chị Hồ Thị Thanh Thủy, anh Nguyễn Văn Hưng và các anh
chị trong công ty cổ phần công nghệ Việt Á đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong thời
gian thực hiện khóa luận.
™ Tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học DH06SH đã gắn bó, chia sẻ, giúp đỡ tôi trong
suốt 4 năm qua.
™ Các bạn trường ĐH Nha Trang, ĐH Khoa Học Tự Nhiên, ĐH Mở đã gắn bó,
động viên, giúp đỡ tôi thực hiện tốt khóa luận.
Tp. HCM, tháng 7 năm 2010
Sinh viên thực hiện
Lê Thị Thúy Dung

i


TÓM TẮT
Bệnh viêm nha chu ảnh hưởng đến phần lớn người dân trên thế giới ở nhiều
mức độ nặng nhẹ khác nhau, ở trường hợp nặng sẽ làm răng đổi màu, hủy hoại răng
dẫn đến mất răng và gây đau đớn. Bệnh chủ yếu được gây ra bởi vi khuẩn
Porphyromonas gingivalis với gene gây bệnh nghiêm trọng nhất là fimA. Do đó,
việc phát hiện sớm tác nhân gây bệnh nhằm giảm sự phát triển bệnh viêm nha chu ở
người trưởng thành cũng như ước định mức độ rủi ro và hỗ trợ điều trị bệnh này.
Các trình tự gene fimA và 16S rRNA được tìm kiếm trên NCBI, sau đó dùng
các phần mềm Annhyb, Clustal X, Bioedit để xác định các đoạn trình tự tương đồng
và thiết kế mồi trên những đoạn tương đồng này dựa trên các nguyên tắc trong việc
thiết kế mồi.
Tiếp theo, khảo sát các đặc tính của hệ primer-probe trên lý thuyết và thực
nghiệm: Trên lý thuyết dùng công cụ BLAST trên NCBI, trong thực nghiệm khảo
sát khả năng hoạt động, nhiệt độ lai, độ đặc hiệu của hệ primer-probe và độ nhạy
của quy trình.
Sau cùng, hệ primer-probe sau khi khảo sát, đạt các điều kiện chuẩn sẽ đưa
quy trình vào ứng dụng trên 30 mẫu bệnh phẩm.
Thiết kế thành công hệ primer-probe cho hai gene 16S rRNA và gene fimA và
các đặc tính của hệ primer-probe đều đạt đúng tiêu chuẩn. Kết quả phát hiện trên các
mẫu bệnh phẩm: khoảng 75% mẫu có nhiễm P. gingivalis với gene fimA (kết quả có
thể tin cậy được).

ii


SUMMARY
The thesis title: “ DETECT FACTOR CAUSES TO PERIODONTAL DISEASE IN

Porphyromonas gingivalis BACTERIA BY REAL-TIME PCR METHOD”
Inflammatory periodontal disease affects the majority of people in the world at
many different levels of severity. In severe cases, it will cause teeth discoloration,
damage teeth lead to tooth loss and cause pain. The disease is mainly caused by the
bacterium Porphyromonas gingivalis with fimA gene that causes the most serious
disease. Therefore, the early detection of infectious agents is to decrease the
development of periodontal inflammation in adults as well as to assess the level of risk
and support to treat this disease.
fimA gene sequences and 16S rRNA gene sequences are searched in the NCBI,
then use the software Annhyb, Clustal X, Bioedit to determine the sequence of
similarity and design primer on these sequences basing on principle of primer design.
Second, survey the characteristics of the primer-probe system in theory and
experiment: In theory, use BLAST tool on NCBI. In experiment, survey the active ability,
hybrid temperature, specificity of primer-probe system and the sensitivity of the process.
Last, the primer-probe system after the survey, reaching the standard conditions,
will push the process to be applied on 30 samples.
Designing successful primer-probe system for the two genes 16S rRNA genes
and fimA genes and characteristics of primer-probe systems have reached standards.
Results found on the disease samples: about 75% of the sample is infected with P.
gingivalis with fimA gene, reliable results.

iii


MỤC LỤC
Trang
Lời cám ơn ........................................................................................................................i
Tóm tắt ............................................................................................................................ ii
Summary ........................................................................................................................ iii
Mục lục ...........................................................................................................................iv

Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................ vii
Danh sách các bảng ..................................................................................................... viii
Danh sách các hình .........................................................................................................ix
Chương 1 MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1.1.

Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1

1.2.

Yêu cầu của đề tài................................................................................................. 1

1.3.

Nội dung thực hiện ............................................................................................... 1

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 2
2.1.

Bệnh viêm nha chu ............................................................................................... 2

2.1.1. Giới thiệu bệnh viêm nha chu................................................................................ 2
2.1.1.1. Khái niệm ........................................................................................................... 2
2.1.1.2. Triệu chứng......................................................................................................... 2
2.1.1.3. Tác nhân gây bệnh .............................................................................................. 3
2.1.1.4. Bệnh viêm nha chu và các bệnh khác của cơ thể ............................................... 4
2.2. Tình hình thế giới ..................................................................................................... 5
2.3. Tình hình trong nước ................................................................................................ 6
2.4. Giới thiệu vi khuẩn Porphyromonas gingivalis ....................................................... 7
2.4.1. Đặc điểm ................................................................................................................ 7

2.4.2. Phân loại khoa học................................................................................................. 8
2.4.3. Cấu trúc bộ gene .................................................................................................... 8
2.4.4. Quá trình biến dưỡng ............................................................................................. 8
2.4.5. Tác nhân gây độc ................................................................................................... 8
2.4.6. Gene 16S rRNA ..................................................................................................... 9
2.4.7. Cơ chế gây bệnh ................................................................................................... 9
2.4.8. Tiến trình co rút nướu và mất xương răng ..........................................................11
iv


2.5. Các phương pháp phát hiện Porphyromonas gingivalis ........................................11
2.5.1. Phương pháp nuôi cấy .........................................................................................11
2.5.2. Phương pháp lai DNA-DNA (checkboard DNA-DNA hybridisation) ...............12
2.5.3. Phương pháp PCR (PCR assays) .........................................................................12
2.5.3.2. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR...........................................................................13
2.5.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR.......................................................14
a. DNA mẫu ..................................................................................................................14
b. Enzyme .....................................................................................................................14
c. Primer và nhiệt độ lai .................................................................................................14
d. Các thành phần khác ..................................................................................................15
¾

Nồng độ dNTP (các deoxynucleotide triphotphat) ................................................15

¾

Nồng độ MgCl2 ......................................................................................................15

¾

Dung dịch đệm .......................................................................................................15

¾

Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR ......................................................................15

2.5.4. Phương pháp real-time PCR và ứng dụng trong phát hiện P. gingivalis ............16
2.5.4.1. Real-time PCR là gì ..........................................................................................16
2.5.4.2. Phương pháp real-time PCR sử dụng probe thủy giải ......................................16
2.5.4.3. Các thành phần của phản ứng Realtime PCR...................................................17
2.5.4.4. Một số điều lưu ý khi thực hiện phản ứng real-time PCR................................18
2.5.5. Sự khác nhau giữa PCR cổ điển và Realtime PCR .............................................21
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................22
3.1.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................................22

3.2.

Vật liệu ...............................................................................................................22

3.2.1. Mẫu ......................................................................................................................22
3.2.2. Hóa chất ...............................................................................................................22
3.2.2.1. Hóa chất dùng để tách chiết DNA ....................................................................22
3.2.2.2. Hóa chất dùng cho phản ứng real-time PCR 25µl ...........................................22
3.2.3. Dụng cụ, thiết bị ..................................................................................................23
3.3.

Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................23

3.3.1. Phương pháp thiết kế primer và probe ................................................................24
3.3.1.1. Nguyên tắc ........................................................................................................24
3.3.1.2. Các phần mềm máy tính được sử dụng ............................................................24
v


3.3.1.3. Phương pháp tiến hành .....................................................................................24
3.3.2. Phương pháp xử lý mẫu bệnh phẩm ....................................................................24
3.3.2.1. Lấy mẫu và bảo quản ........................................................................................24
3.3.2.2. Xử lý mẫu và ly trích DNA ..............................................................................24
3.3.3. Phương pháp real-time PCR ................................................................................25
3.3.4. Phương pháp khảo sát độ nhạy của quy trình......................................................26
3.3.5. Phương pháp khảo sát độ đặc hiệu của hệ primer-probe.....................................26
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................27
4.1. Kết quả ....................................................................................................................27
4.1.1. Kết quả thiết kế primer và probe .........................................................................27
4.1.2. Kết quả khảo sát các đặc tính của hệ primer và probe trên lý thuyết ..................31
4.1.3. Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của hệ primer-probe trên lý thuyết .......................35
4.1.4. Khảo sát khả năng hoạt động của primer-probe ..................................................39
4.1.5. Khảo sát nhiệt độ lai của hệ primer-probe ..........................................................40
4.1.6. Khảo sát độ đặc hiệu của hệ primer-probe ..........................................................42
4.1.7. Khảo sát độ nhạy của quy trình ...........................................................................42
4.1.8. Ứng dụng quy trình trên bệnh phẩm ...................................................................44
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................47
5.1. Kết luận...................................................................................................................47
5.2. Đề nghị ...................................................................................................................47
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................48
PHỤ LỤC

vi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• BLAST : Basic local alignment tool
• bp : Base pair
• CMV: Cytomegalovirus
• DNA: Deoxyribonucleotide Acid
• HBV: Hepatitis B virus
• HCV: Hepatitis C virus
• HPV: Human papiloma virus
• kDa: Kilo Dalton
• LPS : Lipopolysaccharide
• MTB: Mycobacterium tuberculosis
• NCBI: National Center for Biotechnology Information
• Nu: nucleotide
• PCR: Polymerase Chain Reaction
• P.g: Porphyromonas gingivalis
• rRNA: Ribosomal Ribonucleotide Acid

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 4.1 Trình tự primer và probe của gene fimA ........................................................28
Bảng 4.2 Trình tự primer và probe của gene 16S rRNA ..............................................30
Bảng 4.3 Các thông số của hệ primer-probe của gene fimA .........................................32
Bảng 4.4 Các thông số của hệ primer-probe của gene 16S rRNA ................................33
Bảng 4.5 Hetero dimer giữa hai hệ primer-probe của gene fimA và gene 16S rRNA ....33
Bảng 4.6 Kết quả khảo sát nhiệt độ lai hệ primer-probe của gene fimA .......................41

Bảng 4.8 Kết quả khảo sát độ nhạy của hệ primer- probe của gene fimA ....................43
Bảng 4.9 Kết quả khảo sát độ nhạy của hệ primer- probe của gene 16S rRNA ...................44
Bảng 4.10 Kết quả thực nghiệm trên các mẫu bệnh phẩm ...........................................45

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 So sánh giữa răng khỏe (trái) và răng bị viêm nha chu (phải) . ....................... 2
Hình 2.2 Răng bị hở cổ răng do nướu co. ....................................................................... 3
Hình 2.3 Bản đồ tình hình bệnh viêm nha chu trên thế giới. .......................................... 6
Hình 2.4 Porphyromonas gingivalis được chụp dưới kính hiển vi điện tử. ................... 7
Hình 2.5 Nguyên lý hoạt động Taqman probe. ............................................................17
Hình 3.1 Quy trình khảo sát các đặc tính của primer và probe ....................................23
Hình 4.1 Kết quả sắp gióng 6 type của gene fimA trên BioEdit. ..................................27
Hình 4.2 Vùng bảo tồn cao dùng để thiết kế primer xuôi và probe của gene fimA. .....28
Hình 4.3 Vùng thiết kế primer ngược 1 của gene fimA. ...............................................28
Hình 4.4 Vùng thiết kế primer ngược 2 của gene fimA. ...............................................29
Hình 4.5 Vùng thiết kế primer xuôi cho gene 16S rRNA. ...........................................30
Hình 4.6 Vùng thiết kế probe cho gene 16S rRNA. .....................................................31
Hình 4.7 Vùng thiết kế primer ngược cho gene 16S rRNA. ........................................31
Hình 4.8 Một số dạng cấu trúc hetero-dimer của hệ primer-probe của gene fimA. ......32
Hình 4.9 Các dạng cấu trúc self-dimer của hệ primer-probe của gene fimA. ...............32
Hình 4.10 Các dạng cấu trúc self-dimer của hệ primer-probe của gene 16S rRNA. ...33
Hình 4.11 Các dạng cấu trúc hetero-dimer của hệ primer-probe gene 16S rRNA. ......33
Hình 4.12 Cấu trúc kẹp tóc của hệ primer-probe của gene fimA ………………….....34
Hình 4.13 Cấu trúc kẹp tóc của hệ primer-probe của gene 16S rRNA…………….....34
Hình 4.14 Kết quả BLAST trình tự primer xuôi của gene fimA trên NCBI. ................35
Hình 4.15 Kết quả BLAST trình tự probe của gene fimA trên NCBI. .........................36

Hình 4.16 Kết quả BLAST trình tự primer ngược 2 của gene fimA trên NCBI. .........36
Hình 4.17 Kết quả BLAST trình tự primer ngược 1 của gene fimA trên NCBI. .........37
Hình 4.18 Kết quả BLAST trình tự primer xuôi của gene 16S rRNA trên NCBI. .....37
Hình 4.19 Kết quả BLAST trình tự probe của gene 16S rRNA trên NCBI. ...............38
Hình 4.20 Kết quả BLAST trình tự primer ngược của gene 16S rRNA trên NCBI....38
Hình 4.21 Khảo sát khả năng hoạt động của primer và probe của gene 16S rRNA. ...39
Hình 4.22 Khảo sát khả năng hoạt động của primer và probe của gene fimA. .............39
Hình 4.23 Kết quả phản ứng multiplex PCR với hai hệ primer-probe. ........................40
ix


Hình 4.24 Khảo sát nhiệt độ lai của hệ primer – probe của gene fimA. .......................40
Hình 4.25 Khảo sát nhiệt độ lai của hệ primer – probe của gene 16S rRNA. ..............41
Hình 4.26 Chu trình realtime PCR................................................................................42
Hình 4.27 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của hệ primer và probe. ................................42
Hình 4.28 Khảo sát độ nhạy của hệ primer-probe của gene fimA. ...............................43
Hình 4.29 Khảo sát độ nhạy của hệ primer-probe của gene 16S rRNA. ......................43
Hình 4.30 Quy trình phát hiện gene fimA và 16S rRNA của P. gingivalis. .................44

x


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
Bệnh viêm nha chu là một bệnh với tần suất xảy ra thường xuyên, ảnh hưởng hơn

90% dân số thế giới. Bệnh này gây ra bởi sự tương tác của các vi sinh vật gây hại vùng
miệng tồn tại trong các khe hở của nướu mà sự phòng vệ của cơ thể không thể ngăn

chặn được. Các vi khuẩn này gây hủy hoại răng và làm tổn thương nướu, gây đau đớn.
Có nhiều tác nhân gây bệnh viêm nha chu. Trong đó, một số tác nhân gây bệnh thường
gặp là Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Bacteroides
forsythus, Treponema denticola, T. socranskii, và Prevotella intermedia. Những vi
khuẩn này cùng với P. gingivalis thường hiện diện ở cùng vị trí, trong các túi nha chu.
Vi khuẩn P. gingivalis có nhiều yếu tố gây bệnh như

là fimbriae (fimA),

collagenease, hemagglutinins, haemolysin, LPS, proteases, kháng nguyên vỏ. Trong đó
gene fimA có vai trò quan trọng nhất trong việc gây ra bệnh viêm nha chu. Do đó, việc
phát hiện gene fimA có một vai trò quan trọng trong việc theo dõi sự phát triển viêm nha
chu ở người trưởng thành cũng như ước định mức độ rủi ro và hỗ trợ điều trị bệnh này.
Các phương pháp đã được dùng trong chẩn đoán vi khuẩn P. gingivalis như
phương pháp miễn dịch sử dụng kháng thể đặc hiệu để phát hiện kháng nguyên, phương
pháp mẫu dò DNA, phương pháp PCR. Tuy nhiên, các phương pháp này tốn thời gian
và độ nhạy không cao. Gần đây, nhiều báo cáo về việc sử dụng phương pháp real-time
PCR để phát hiện P. gingivalis, đã cho kết quả chính xác cao. Vì vậy, việc thực hiện
thành công đề tài “Phát hiện nhân tố gây bệnh viêm nha chu ở Porphyromonas
gingivalis bằng phương pháp real-time PCR” là rất cần thiết ở Việt Nam giúp cho
việc chẩn đoán bệnh viêm nha chu sớm, nhanh và chính xác.
1.2.

Yêu cầu của đề tài
Thiết kế thành công hệ primer-probe phát hiện nhân tố gây bệnh viêm nha chu

(gene fimA) bằng phương pháp real-time PCR.
1.3.

Nội dung thực hiện

Thiết kế hệ primer – probe đặc hiệu khuếch đại gene fimA và gene 16S rRNA.
Khảo sát các đặc tính của hệ primer – probe: Khả năng hoạt động, nhiệt độ lai,

độ đặc hiệu của hệ primer - probe, độ nhạy của quy trình.
Ứng dụng quy trình trên 30 mẫu bệnh phẩm.


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.

Bệnh viêm nha chu

2.1.1. Giới thiệu bệnh viêm nha chu
2.1.1.1. Khái niệm
Bệnh viêm nha chu là sự viêm của nướu gây chảy máu và để lộ ra nền răng cho
phép vi khuẩn xâm nhiễm vào vùng chân răng nhằm phá hủy răng. Loại phổ biến nhất
của viêm nướu răng được gây ra bởi sự tích lũy vi khuẩn bám vào răng ở người không
chăm sóc tốt răng miệng. Các túi nha chu tạo thành xung quanh răng hình thành các vết
thương làm cho vi khuẩn có thể xâm nhiễm và làm đứt dây chằng của nướu và hủy hoại
vùng xương răng.
Bệnh viêm nướu bắt đầu khi có mảng bám ở tại vùng hoặc dưới rìa có thể nhìn
thấy của nướu. Nếu mảng bám không được lấy ra mỗi ngày bằng việc đánh răng, nó sẽ
cứng và tạo thành vôi răng. Vôi răng kích thích sự xâm nhiễm của vi khuẩn tại nơi bám.
(Trích dẫn bởi />
Hình 2.1 So sánh giữa răng khỏe (trái) và răng bị viêm nha chu (phải) .
( />2.1.1.2. Triệu chứng
Bệnh này biểu hiện qua các dấu hiệu như dễ chảy máu ở nướu khi chải răng, một
số trường hợp nặng đôi khi có chảy máu tự phát, nướu sưng đỏ, phù nề. Nếu không điều
trị tình trạng viêm nướu kéo dài, sẽ dẫn đến tình trạng phá hủy mô và gây viêm nha chu.
Có nhiều thể bệnh viêm nha chu khác nhau nhưng thường biểu hiện qua các dấu hiệu

2


như mất bám dính, thành lập túi nha chu, sưng đau, chảy mủ, tiêu xương ổ răng, răng
lệch lạc, lung lay và cuối cùng là mất răng. Ở giai đoạn này việc điều trị trở nên khó
khăn hơn do khả năng hồi phục của mô nha chu và xương nâng đỡ quanh răng kém
(Stephen, James, 2002).

Hình 2.2 Răng bị hở cổ răng do nướu co.
( />2.1.1.3. Tác nhân gây bệnh
a. Một số vi khuẩn điển hình gây ra bệnh và làm rụng răng
Actinobacillus actinomycetemcomitans và Porphyromonas gingivalis: hai vi
khuẩn này đều gây nên bệnh viêm nha chu, cả hai có trong các túi nha chu trong nướu.
Trong đó mức độ nguy hiểm của P. gingivalis gấp hai lần A. actinomycetemcomitans. P.
gingivalis sản xuất các enzyme như fimbrilin, collagenease, arginine-specific cysteine
proteinase v.v…có thể phá hủy hệ thống miễn dịch và dẫn đến sự phá hủy mô liên kết
của nướu. Các vi khuẩn khác là Bacteroides forsythus, Treponema denticola, T.
socranskii, và P. intermedia cũng gây ra bệnh này (Eberhard J và ctv, 2008).
b. Các nhân tố thuộc nhân khẩu học (Trích dẫn bởi Loc Giang Do, 2001)
¾ Ảnh hưởng của tuổi tác lên sự biểu hiện bệnh
Các nghiên cứu về sự hủy hoại nướu trong các nhóm dân có độ tuổi khác nhau
cho thấy tuổi là một nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến bệnh viêm nha chu (Löe và ctv,
1986). Người ta thường ít nghi ngờ sự phát triển và mức độ nghiêm trọng của bệnh sẽ
tăng theo tuổi nhưng rõ ràng rằng nhiều bệnh được tìm thấy trong các dân số già hơn.
¾ Ảnh hưởng của giới tính lên sự biểu hiện bệnh

3


Nhiều nghiên cứu đã chứng minh sự tiêu hủy mô nướu ở nam cao hơn so với nữ

(Brown, Oliver và Löe, 1990). Lý do về sự khác biệt giới tính này thì không rõ nhưng
người ta cho rằng vấn đề này liên quan đến mức độ chăm sóc răng miệng kém và
thường thấy ở nam (Slade và Spencer, 1995; Albandar và Kingman, 1999).
¾ Ảnh hưởng của tình trạng kinh tế xã hội lên sự biểu hiện bệnh
Tình hình kinh tế xã hội có ảnh hưởng đến việc mắc bệnh viêm nha chu và thực
tế cho thấy bệnh này thường xuất hiện ở những nhóm dân số có mức sống và mức thu
nhập thấp ở các nước phát triển và đang phát triển.
¾ Sự khác nhau giữa các loài lên sự biểu hiện bệnh
Nhiều nghiên cứu cho thấy giữa các loài khác nhau (như loài người hay các loài
động vật khác) thì có mức độ biểu hiện viêm nha chu khác nhau (Beck và ctv, 1990).
Loài là nhân tố không thể thay đổi, và vài sự không nhất quán trong sự biểu hiện bệnh
trong một loài được giải thích bởi sự khác nhau của các nhân tố gây bệnh khác nhau.
2.1.1.4. Bệnh viêm nha chu và các bệnh khác của cơ thể
Trong hai thập kỷ qua, các nghiên cứu về bệnh dịch nhận thấy có mối liên hệ
giữa vấn đề sức khỏe răng miệng kém với bệnh tim mạch, bệnh về hô hấp, bệnh trong
mang thai…Bệnh viêm nha chu góp phần cho sự tiến triển của các bệnh này. Những
người bị bệnh viêm nha chu ở mức độ nghiêm trọng sẽ có nguy cơ cao mắc các bệnh
về tim mạch như xơ vữa động mạch, nhồi máu cơ tim và đột quỵ. Vì thế, việc nhìn
nhận ảnh hưởng của bệnh viêm nha chu như một nhân tố cho các bệnh khác là cần
thiết (Trích dẫn bởi Loc Giang Do, 2001).
a. Viêm nha chu và bệnh về tim mạch
Các nghiên cứu cho thấy viêm nha chu là nhân tố nguy hiểm đến các bệnh về tim
mạch cụ thể là nhồi máu cơ tim và đột quỵ (Mattila và ctv, 1989; 1993; 1995; Beck,
1991; DeStefano và ctv, 1993; Beck và ctv, 1996). Bệnh này có mức độ nguy hiểm
ảnh hưởng đến bệnh tim mạch cũng tương đương hút thuốc, tuổi tác và tiểu đường.
b. Viêm nha chu và bệnh về hô hấp
Sự kết hợp giữa viêm nhiễm nướu và bệnh về hô hấp như viêm phổi, viêm phế
quản kinh niên, tắc nghẽn hô hấp kinh niên vẫn còn là giả thuyết. Vài vi khuẩn Gram
âm Bacilli thường kết hợp với Pneumonia được tìm thấy trong nuôi cấy từ mô nướu
của bệnh nhân viêm nha chu (Slots và ctv, 1988; Slots, Feik và Rams, 1990).

4


c. Bệnh nha chu và mang thai
Nhiều nghiên cứu chỉ ra bệnh viêm nha chu có thể làm tăng nguy cơ trẻ em có
trọng lượng thấp trước sinh (Collins và ctv, 1994). Điều này có thể do ảnh hưởng của
các chất trung gian sinh học trong phản ứng viêm như prostaglandins E2 và
TNF-α. Sản phẩm lipopolysaccharide của vi khuẩn cũng đóng vai trò quan trọng
gây ra sự thay đổi trong mang thai. Offenbacher và ctv (1996) tìm ra rằng ở
những người mẹ bị viêm nha chu có nguy cơ có con trọng lượng thấp trước sinh
cao hơn những người mẹ không bị bệnh.
2.2. Tình hình thế giới
Mặc dù thế giới đã đạt nhiều thành tựu lớn về sức khỏe răng miệng, nhưng
vẫn tồn tại nhiều vấn đề lo ngại trong cộng đồng trên toàn thế giới, đặc biệt trong
những nhóm dân số có mức sống dưới trung bình ở các nước đã và đang phát triển.
Bệnh viêm nha chu rất phổ biến đứng thứ hai trên thế giới sau sâu răng và ảnh
hưởng 30-50% dân số ở Mỹ, nhưng chỉ 10% ở dạng nghiêm trọng. Hơn 50 năm
qua, số người có nguy cơ bị viêm nha chu vẫn tăng cao. Bệnh này ở Israel,
Yemenite, Bắc Phi, châu Á và Địa Trung Hải phổ biến hơn châu Âu. Điều này có
thể do di truyền cũng như hành vi văn hóa xã hội khác nhau (ví dụ như hút thuốc,
vệ sinh răng miệng, việc tiếp cận với vấn đề điều trị răng miệng). Mất răng ở
người lớn phần lớn là do chăm sóc răng miệng kém. Hơn nữa hầu hết trẻ em và
thanh thiếu niên trên thế giới có dấu hiệu của bệnh viêm nha chu. Bệnh này ở mức
độ nghiêm trọng ảnh hưởng khoảng 2% giới trẻ trong suốt thời kỳ dậy thì và có
thể dẫn đến mất răng sớm (Poul Erik Petersen và ctv, 2005).
Thông tin thường xuyên và đáng tin cậy về chăm sóc răng miệng để tránh
mắc bệnh mục xương răng và bệnh viêm nha chu vẫn thiếu ở hầu hết các nước,
đặc biệt trong các nước đang phát triển. Khoảng 15% học sinh ở các nước châu
Mỹ La Tinh bị hư răng và bệnh này lan rộng 5-12% trẻ em từ 6-12 tuổi ở Trung

Đông. Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây từ các nước công nghiệp phát triển
cho thấy sự phát triển của bệnh viêm nha chu gia tăng ảnh hưởng 16-40% trẻ em
6 tuổi và 4-33% trẻ em 12-14 tuổi (theo WHO).

5


Không dữ liệu
Ít hơn 3,5

Nhiều hơn 8,5

Hình 2.3 Bản đồ tình hình bệnh viêm nha chu trên thế giới.
Số người mắc bệnh viêm nha chu trên 100.000 dân. Dữ liệu từ (Death and DALY
estimates for 2004 by cause for WHO Member States )(Persons, all ages)(2009-11-12)

2.3. Tình hình trong nước
Bệnh viêm nha chu là một bệnh rất phổ biến về răng miệng. Bệnh này hay gặp
ở lứa tuổi trung niên, người già và là một trong những nguyên nhân thường gặp của
tình trạng mất răng ở người lớn. Tại Việt Nam, trên 80% dân số có biểu hiện bệnh
với nhiều mức độ khác nhau. Bệnh viêm nha chu là một trong những nguyên nhân
chính gây mất răng cho người bệnh từ khi 30 tuổi trở lên, và cũng là một trong
những nguyên nhân gây hôi miệng.
Khảo sát của Khoa Răng Hàm Mặt Đại học Y Dược TPHCM cho thấy bệnh
nhân tiểu đường có nguy cơ bị viêm nha chu cao gấp 2,8 đến 3,4 lần người không bị
tiểu đường. Ở nhiều người, vi khuẩn gây viêm nướu và viêm nha chu có trong
mảng bám và trong cao răng với số lượng lớn, chờ thời cơ để gây viêm nhiễm. Tuy
nhiên trong trường hợp suy giảm miễn dịch hoặc ở bệnh nhân tiểu đường, dù với số
lượng nhỏ vi khuẩn vẫn có thể gây bệnh nặng, vết loét lan rộng nhanh chóng dễ dẫn
đến tử vong do nhiễm độc máu.

Không những bệnh tiểu đường gây ảnh hưởng lớn đến tình trạng viêm nhiễm
răng miệng, ngược lại nguy cơ mắc bệnh răng miệng cũng tác động đến việc kiểm soát
đường huyết. Khảo sát của Khoa Răng Hàm Mặt Đại học Y Dược cũng ghi nhận 7 trong
9 bệnh nhân tiểu đường sau khi được điều trị viêm nha chu thì đường huyết giảm đáng
kể, có trường hợp đường huyết trở lại bình thường.
6


2.4. Giới thiệu vi khuẩn Porphyromonas gingivalis
2.4.1. Đặc điểm
Porphyromonas gingivalis là một trong 400 loài vi khuẩn tự nhiên khác nhau có
trong khoang miệng. Trong đó, vi khuẩn gây viêm nướu chiếm khoảng 5% và vi khuẩn
gây viêm nha chu chiếm hơn 5%. Giống như các vi khuẩn khác sống trong miệng của
người, P. gingivalis phát triển khá tốt trong môi trường kiềm, độ ẩm 100%. Có vài báo
cáo chỉ ra rằng có từ 1000 đến 1 tỉ vi khuẩn có thể sống trên mỗi bề mặt răng. Tuy nhiên,
việc phân lập P. gingivalis trong khoang miệng đã được chứng minh là khó khăn.
(Stevens 1997).
Porphyromonas gingivalis là vi khuẩn Gram âm, không di động, hình que, kỵ khí
có cấu trúc phức tạp. Xung quanh tế bào P. gingivalis được bao bọc bởi lớp
polysaccharide gọi là vỏ capsules và lớp nhày dày đặc không cố định giúp nó bám dính
vào tế bào chủ. Vỏ capsule này làm cho bề mặt tế bào của nó có tính kỵ nước giúp bảo
vệ tế bào vi khuẩn chống lại hệ thống miễn dịch của tế bào chủ và góp phần làm cho vi
khuẩn bám vào tế bào biểu mô dễ dàng hơn. Lớp vỏ capsule và lớp nhày mặc dù không
cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn nhưng rất quan trọng cho việc tồn tại và xâm
nhiễm của nó trong tế bào chủ.
Vi khuẩn này được coi là nguyên nhân chủ yếu trong sự tấn công và xúc tiến phá
hủy nướu dẫn tới tình trạng viêm nha chu. Cách thức mà nó gây ra bệnh là tấn công
nướu bao quanh răng gây nên phản ứng viêm dẫn tới bong tróc nướu, dần dần vi khuẩn
sẽ ăn mòn xương xung quanh răng khiến răng lung lay và rớt ra. Và trong những năm
gần đây, hiện tượng kháng kháng sinh cũng bắt đầu xuất hiện ở loài vi khuẩn này gây ra

nhiều khó khăn trong quá trình điều trị.

Hình 2.4 Porphyromonas gingivalis được chụp dưới kính hiển vi điện tử.
( />7


2.4.2. Phân loại khoa học
9 Giới: Eubacteria
9 Ngành: Bacteroidetes
9 Lớp: Bacterioides
9 Giống: Porphyromonas
9 Loài: gingivalis
2.4.3. Cấu trúc bộ gene
Bộ gene của P. gingivalis dạng vòng gồm 2015 gene với tổng số 2343479
nucleotide, nhân lên ở vị trí oriC. Trong đó số lượng guanine và cytosine xấp xỉ 49%.
Qua phân tích bộ gene cho thấy loài vi khuẩn này có thể chuyển hóa các loại amino acid
tạo thành các sản phẩm trao đổi chất cuối khác nhau gây hại cho mô nướu của vật chủ,
thông thường là người (theo The Institute for Geneomic Research: Porphyromonas gingivalis).
2.4.4. Quá trình biến dưỡng
Sắt là một nguyên tố góp phần trong sự phát triển của P. gingivalis. Trong quá
trình biến dưỡng, nó sử dụng hemin như một công cụ để vận chuyển sắt vào cơ thể, điều
này là nguyên nhân làm cho nó có màu đen. Vật mang ABC (Ansai và ctv, 2003; Park
và ctv., 2004) được nó sử dụng để mang hem sắt phức tạp vào tế bào. Một số người có
khả năng hấp thu kim loại cao, chẳng hạn như sắt, dẫn đến nguy cơ bị viêm nướu và
viêm nha chu sẽ cao hơn.
Porphyromonas gingivalis sống và phát triển trong tế bào nướu là nhờ các phân
tử bám trên bề mặt của nó. Các phân tử này tác động đến các vi khuẩn khác trong
khoang miệng, các tế bào biểu mô nướu, và các protein ngoại bào. Đồng thời, P.
gingivalis cũng nhận năng lượng từ đường và cacbonhydrat đơn thường có ở miệng.
Một vài ý kiến khác cho rằng nguồn năng lượng chính của P. gingivalis chủ yếu từ

peptide thay vì amino acide đơn. Tuy nhiên, cách thức trao đổi amino acide của P.
gingivalis thì khó để nhận biết, đó là do thành phần amino acid phức tạp của các peptide
hoặc protein. (theo />2.4.5. Tác nhân gây bệnh
Porphyromonas gingivalis có nhiều tác nhân gây độc như fimbriae, collagenease,
hemagglutinins, haemolysin, LPS, proteases, kháng nguyên vỏ. Tất cả các tác nhân này
đều quan trọng trong hấp thu dinh dưỡng và phát triển của P. gingivalis. Tính độc của
nó cũng là sự phối hợp của các tác nhân này (Atsuo Amano, 2007).
8


Trong đó, fimbriae là cấu trúc lông rung có dạng sợi trên bề mặt vi khuẩn và được
xem như tác nhân gây độc quan trọng nhất của P. gingivalis do các hoạt động sinh lý và
miễn dịch của chúng. Fimbriae có tính chất bám dính, tương tác với phân tử nước bọt, các
tế bào biểu mô miệng và vi khuẩn vùng miệng, cũng như khởi đầu sự tiết cytokines của
các tế bào bị xâm nhiễm. Đơn vị chủ yếu của fimbriae là fimbrillin (fimA), có trọng lượng
từ 41 đến 49kDa và được mã hóa bởi gene fimA. Sáu dạng (I-V và Ib) của gene fimA được
mô tả dựa trên sự khác biệt các trình tự nucleotide. Ở người bị viêm nha chu hoặc viêm
nướu, P. gingivalis với fimA+ được phát hiện nhiều hơn hoặc nghiêm trọng hơn P.
gingivalis với fimA-, cho thấy gene fimA của P. gingivalis liên quan đến sự hủy hoại nướu
(Atsuo Amano, 2007; Wu Yan-min và ctv, 2006).
2.4.6. Gene 16S rRNA
Ở vi khuẩn, ribosome được cấu tạo từ hai tiểu đơn vị ribonucleoprotein với hệ số
lắng (Svedberg) lần lượt là 50S và 30S. Tiểu đơn vị lớn chứa hai loại rRNA là 23S
rRNA và 5S rRNA trong đó tiểu đơn vị nhỏ chỉ gồm một loại 16S rRNA.
Gene 16S rRNA có kích thước khoảng 1540 bp, mã hóa cho phân tử 16S rRNA,
một thành phần quan trọng cấu thành nên tiểu đơn vị nhỏ của ribosome.
Ở tất cả các loài vi khuẩn thực (eubacteria) gene 16S rRNA có một đặc điểm rất
đặc biệt đó là chúng mang những vùng bảo tồn cao ở cấp độ nhóm xen kẽ với những
vùng biến động nhưng lại bảo tồn ở cấp độ loài. Sự bảo tồn và biến động ở cấp độ
khác nhau đã làm cho gene này trở thành “một thước đo tiến hóa”, là sự lựa chọn hàng

đầu của các nhà khoa học trong việc định danh và phân loại các vi khuẩn. Không chỉ
được ứng dụng trong lĩnh vực phân loại học, tiến hóa học, hiện nay gene rRNA còn
được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y học (theo K. Greisen và ctv, 1994; Konrad
Sachse, Joachim Frey, 2003).
2.4.7. Cơ chế gây bệnh của P. gingivalis
P. gingivalis sản sinh ra lượng lớn các tác nhân độc gây nên sự xâm nhiễm và
tiêu hủy mô cũng như tấn công hàng rào bảo vệ của tế bào chủ. P. gingivalis tiếp xúc
rất gần với biểu mô trong các túi nha chu và có thể làm tổn thương các dòng tế bào khác
nhau như các tế bào biểu mô, tế bào thuộc màng trong, và nguyên sợi bào. Biểu mô
nướu là biểu mô hình vảy phân tầng có thể phân chia trong miệng, các rãnh nướu và
biểu mô nối, đồng thời là lớp ngăn cách với môi trường bên ngoài. Tế bào biểu mô nướu
là vật mang sơ cấp mầm bệnh nha chu vào trong cơ thể. Biểu mô rãnh trải rộng từ biểu
9


mô miệng đến rãnh nướu của răng. Biểu mô nối là trung gian để răng bám vào nướu,
không keratin hóa. Mép và rãnh của biểu mô nối tiếp xúc với vi khuẩn trong rãnh nướu
và đây là vị trí chủ yếu cho sự phát triển của bệnh viêm nha chu. Sự phát triển của tế bào
biểu mô động vật có vú là một điều kiện quan trọng thúc đẩy vi khuẩn gây bệnh phát
triển và xâm nhập vào hệ thống miễn dịch của tế bào chủ và gây tiêu hủy mô.
Trong nướu, các tế bào biểu mô là tế bào chủ đầu tiên bị xâm nhiễm bởi vi khuẩn
như P. gingivalis và là nơi tương tác của vi khuẩn tại chỗ và vi khuẩn xâm nhiễm gây
bệnh. Tế bào có chức năng đáp ứng miễn dịch cao nên chúng có khả năng nhận dạng,
đáp ứng và loại trừ vi khuẩn xâm nhiễm mà không tổn hại tế bào chủ. Trong màng
nhày miệng có vô số loài vi khuẩn mà bình thường tồn tại hòa hợp với tế bào chủ
(Jenkinson và Lamont, 2005; Marsh, 2006). Nhưng cũng có các vi khuẩn có thể vượt
qua hệ thống hàng rào bảo vệ và ảnh hưởng trực tiếp lên các tế bào chủ nhạy cảm bằng
cách tiết các enzyme (proteases, collagenease, fibrinolysin, phospholipase A) mà có
thể làm thoái hóa các lớp mô xung quanh của nướu gây nên tình trạng phá hủy mô
(Trích dẫn bởi O¨zlem Yilmaz, 2008).

Vi khuẩn ảnh hưởng gián tiếp lên mô nướu sau khi phản ứng trung hòa ngăn
chặn vi khuẩn tấn công vào mô nướu thất bại. Hệ thống bạch cầu/hạch bạch huyết
được hoạt hóa khi xuất hiện sản phẩm của vi khuẩn và kháng thể. Hệ thống miễn dịch
của tế bào được hoạt hóa kích thích sản xuất cytokine và chất trung gian của phản ứng
viêm như prostaglandins E2 (PGE2), chúng lần lượt giải phóng enzyme phá hủy chất
nền ngoại bào và xương (Offenbacher, 1996). Ngoài ra trong quá trình thực bào, chính
polymorphonuclear neutrophils (PMNs) có thể giải phóng vài enzyme gây nên sự hư
hại collagene và đóng góp vào tiêu hủy mô.
Vài cytokine chính và chất trung gian phản ứng viêm được tìm thấy như sau:
a. Interleukin (IL-1): một tiền chất của phản ứng viêm, cytokine đa chức năng
kích thích tái hấp thu xương và sản xuất PGE2, matrix metalloproteinases
(MMP) gây thoái hóa chất nền ngoại bào.
b. Nhân tố gây hoại tử khối u alpha (TNF-α): là một chất trung gian tương tự trong
nhiều hoạt động sinh học như IL-1. Nó được sản xuất bởi bạch cầu và nguyên
sợi bào được kích thích bởi lypopolysaccharide.

10


c. Prostaglandin E2 (PGE2) được giải phóng bởi bạch cầu có vai trò trong sự tái
hấp thu xương và sản xuất metalloproteinases (Offenbacher, Heasman và
Collins, 1993).
Tóm lại, nồng độ mầm bệnh vi khuẩn cao trong tế bào chủ dễ bị tấn công bởi các
vi khuẩn có thể phá vỡ cơ chế bảo vệ, nhân lên nhanh chóng trong mô và hoạt hóa cơ
chế đáp ứng miễn dịch của tế bào. Thành phần sau đó bao gồm bạch cầu và nguyên sợi
bào có thể sinh ra một lượng cytokine phá hủy mô xung quanh. Những thành phần này
có thể gây nên đáp ứng viêm như tái hấp thu xương và phân hủy collagene (Trích dẫn
bởi Loc Giang Do, 2001).
2.4.8. Tiến trình co rút nướu và mất xương răng
Các vi khuẩn trong miệng có khả năng tạo lớp nhớt dày có thành phần là

polysaccharide tạo thành lớp màng bao phủ xung quanh răng. Lớp màng này có thể
làm cho chính các vi khuẩn đó, và bất cứ vật gì bám vào nó một cách chắc chắn trên bề
mặt của răng. Chính tính chất điện hóa của lớp vi màng là nguyên nhân giúp nó bám
vào răng một cách chắc chắn, đồng thời giúp duy trì môi trường hoàn hảo cho vi khuẩn
nhân lên cho đến khi chúng đạt gần 100% khối lượng của mảng bám.
Vi khuẩn bám thành mảng xung quanh răng và sử dụng thức ăn chúng ta ăn vào
đặc biệt là đường. Chúng tiếp tục trao đổi chất và tạo ra sản phẩm dư thừa trong màng
nướu. Những sản phẩm dư thừa này là endotoxin, là nguyên nhân làm cho nướu đỏ và
sưng. Cơ thể tạo ra rất nhiều mạch máu nhỏ mới trong vùng tế bào bị tấn công và xâm
nhiễm bởi các vi khuẩn. Những mạch máu nhỏ này lại bị tấn công bởi vi khuẩn trở nên
mỏng manh và dễ chảy máu.
Tình trạng khởi phát của viêm nha chu gọi là viêm nướu và gây đau đớn nhưng
hầu hết người ta thường lờ đi việc chảy máu. Điều này thường tiếp diễn cho đến giai
đoạn thứ hai là mất xương. Sự mất xương là tiến trình thích nghi để bảo vệ cơ thể khỏi
sự xâm nhiễm của vi khuẩn vào xương gọi là viêm tủy sống.
Khi một người ở trạng thái già yếu, nướu xung quanh răng dường như bị kéo
xuống và để lộ chân răng, vì vậy răng trông dài hơn so với lúc trẻ. Đây là biểu hiện
của bệnh viêm nha chu. Ngày nay chúng ta biết rằng có thể ngăn chặn bệnh này
bằng việc đánh răng.
2.5. Các phương pháp phát hiện Porphyromonas gingivalis
2.5.1. Phương pháp nuôi cấy
11


Nuôi cấy kỵ khí là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất để phát hiện và
định lượng thành phần của mảng nướu, và để xác định tính nhạy cảm của vi khuẩn đối
với thuốc kháng sinh trong invitro. Tuy nhiên, phương pháp này có nhiều trở ngại là
tốn thời gian, công sức và độ nhạy thấp. Điều này là do vi khuẩn gây bệnh trong răng
miệng phát triển chậm hoặc đòi hỏi môi trường phát triển chuyên biệt. (theo Khalil
Boutaga và ctv, 2003)

2.5.2. Phương pháp lai DNA-DNA (checkboard DNA-DNA hybridisation)
Phương pháp lai DNA-DNA là phương pháp lai số lượng lớn DNA mẫu với số
lượng lớn mẫu dò DNA trên màng lai. Nó cho phép phát hiện đồng thời sự hiện diện
của vô số các loài vi khuẩn trong một hoặc nhiều mẫu và đặc biệt ứng dụng trong
nghiên cứu dịch tễ học. Nhưng trong việc phát hiện các vi khuẩn như Actinobacillus
actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, P. endodontalis ,Bacteroides
forsythus, Peptostreptococcus micros và Treponema denticola thì phương pháp này có
độ nhạy và độ đặc hiệu thấp vì khả năng phát hiện DNA của các loài mục tiêu thấp
(theo Jose F. Siqueira và ctv, 2002).
2.5.3. Phương pháp PCR (PCR assays)
PCR là công cụ hữu ích trong phát hiện mầm bệnh gây viêm nha chu. Đây là
phương pháp phát hiện nhanh, hiệu quả và nhận biết được nhiều loài vi khuẩn gây
viêm nha chu khác nhau nhờ vào độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Trong quá trình phản
ứng không xảy ra phản ứng chéo với các đoạn DNA của các vi sinh vật khác trong
miệng. Việc tối ưu hóa các điều kiện trong phản ứng là cần thiết. (theo Ashimoto và
ctv,1996; Khalil Boutaga và ctv, 2003).
2.5.3.1. Định nghĩa
Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) là phương pháp khuếch đại nhanh
các đoạn DNA mà không qua tạo dòng. Phương pháp này được Kary Mullis đưa ra năm
1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988. Phương pháp PCR được thực hiện hoàn toàn trong
các eppendoff và trong thời gian ngắn ta có thể thu nhận rất nhiều bản sao DNA. Kỹ
thuật PCR có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm các tác
nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính của phôi, giải mã di truyền, tạo giống mới
với các đột biến định hướng, nghiên cứu sự tiến hoá của sinh vật ở mức độ phân tử,….

12


2.5.3.2. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một

trình tự đích DNA ban đầu. khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành
hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp primer đặc hiệu
cho đoạn DNA này (theo Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003).
Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của
đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase mà đoạn primer này được kéo
dài để hình thành mạch mới. Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của
DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng
lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể
thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel. Như
vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về
trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ
sung chuyên biệt (theo Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003).
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:
Bước 1: (Biến tính tách đôi sợi DNA, denaturation)
Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử
(94 – 95 0C) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành
2 mạch đơn. Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch
bổ sung mới.
Bước 2: (bắt cặp, annealing)
Trong bước này ở nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các
primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này
dao động trong khoảng 55 – 65 0C.
Bước 3: (kéo dài, elongation – extension)
Nhiệt độ được tăng lên 72 0C giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất.
Dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào primer theo
nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài
của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút.
Sự khuếch đại này có thể được tính như sau:
Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2n
m: Là số bản sao của chuỗi mã hóa.

13